Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Luminescens levetid billeddannelse af O2 med et frekvens-domæne-baseret kamera system

Published: December 16, 2019 doi: 10.3791/60191
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1,4, 5
1Marine Biological Section, Department of Biology, University of Copenhagen, 2Center for Electromicrobiology, Aarhus University, 3PCO AG, 4Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 5Aarhus University Centre for Water Technology, Section for Microbiology, Department of Bioscience, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver brugen af et nyt, frekvens-Domain luminescens livstids kamera til kortlægning af 2D O2 -distributioner med optiske sensor folier. Kamerasystemet og billedanalyse procedurerne beskrives sammen med forberedelsen, kalibreringen og anvendelsen af sensor folier til visualisering af O2 -mikromiljøet i rhizosfæren af vandplanter.

Abstract

Vi beskriver en metode til at afbilde opløst ilt (O2), i 2D ved høj rumlig (< 50-100 μm) og tidsmæssig (< 10 s) opløsning. Metoden beskæftiger O2 følsomme lysende viser sensor folier (planar optodes) i kombination med en specialiseret kamerasystem til billeddannelse luminescens levetid i frekvens-domæne. Planar optodes fremstilles ved at opløse den O2-følsomme indikatorfarve i en polymer og sprede blandingen på en solid støtte i en defineret tykkelse via kniv belægning. Efter fordampning af opløsningsmidlet anbringes planar optode i tæt kontakt med prøven af interesse-her demonstreret med rødderne af vand planten Littorella uniflora. Den O2 koncentrationsafhængige ændring i luminescens levetid for indikator farven i planar optode er afbildet via bagsiden af den gennemsigtige bære folie og akvarie væggen ved hjælp af et særligt kamera. Dette kamera måler luminescens levetid (μs) via et skift i fase vinklen mellem et moduleret excitation-signal og et emissions signal. Denne metode er bedre end luminescens intensitet Imaging metoder, da signalet er uafhængig af farvestoffet koncentration eller intensitet af excitation kilde, og udelukkende er afhængig af luminescens forfald tid, som er en iboende refereret parameter. Der er derfor ikke behov for yderligere reference farve eller andre henvisnings midler. Vi demonstrerer brugen af systemet til makroskopisk O2 billeddannelse af plante jord stængkugler, men Kamerasystemet kan også nemt kobles til et mikroskop.

Introduction

Fordelingen og dynamikken af opløste gasser og ioner i sedimenter og jord giver vigtige oplysninger om biogeokemiske processer såsom mikrobiel respiration1,2eller radial ilttab fra planterødder3,4,5og det kemiske mikromiljø af mikrober6,7, plante rhisfærer5,8,9 og dyre Burrows10, 11,12. Biologisk og kemisk aktivitet i sådanne diffusions begrænsede miljøer kan skabe stejle stigninger i kemiske substrater eller produkter af biogeokemiske processer. Især, O2 tilgængelighed har en enorm indflydelse på biogeokemiske processer og dermed biologi og økologi i et system13. Derfor, analysere O2 koncentrationer ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning er af afgørende betydning i akvatiske og terrestriske videnskaber. For det første blev der udviklet elektrokemiske og optiske mikrosensorer14,15 til måling af denne vigtige analysand. Senere, 2 dimensionelle (2D) billeddannelse af o2 med planar optodes blev introduceret12,16,17,18,19, som gjorde det muligt visualisering og kvantificering af heterogene O2 fordeling i jord og sedimenter.

Planar O2 optodes består af en O2-følsom indikatorfarve20, som opløses i en egnet polymer21. Indikatoren farvestof er spændt på specifikke optiske bølgelængder og udsender rødt forskudt lys ved afslapning i form af luminescens. I nærværelse af O2, kan den spændte indikatorfarve overføre sin energi til O2 molekyle ved kollision, som omtales som kollisions baseret luminescens dæmper22. Derfor reduceres luminescens intensitet og luminescens levetid med stigende O2 -koncentration23. I et ideelt tilfælde følger ændringen i intensitet og levetid den Stern-Volmer ligning (ligning 1) ved hjælp af enten luminescens intensitet eller levetid i fravær (i0; τ0) eller tilstedeværelse (i, τ) af O2 ved en given koncentration [Q]. Stern-Volmer-konstanten (KSV) er en målestok for optode-følsomheden mod O2; KSV er afhængig af miljøvariabler såsom temperatur og tryk.

1

Registrering af sådanne ændringer i luminescens over en planar sensor folie med et kamerasystem kan bruges til at visualisere de tilsvarende ændringer i O2 fordeling. I første omgang blev der anvendt en simpel luminescens intensitet-baseret O2 -afbildning18. Men, en sådan metode er meget følsom over for eksterne interferenser, som kompromitterer pålideligheden af resultaterne på grund af heterogene belysning, udsving i excitation kilde eller kamera, samt ujævn fordeling af indikatoren farvestof i planar optode.

Nogle af disse begrænsninger kan afhjælpes ved at anvende planar optodes til ratiometrisk billeddannelse17,24, hvor den o2-følsomme indikatorfarve er co-immobiliseret i polymer laget af planar optode med et ufølsomt reference farvestof, der udsender i et andet spektralområde end o2-indikatoren. Baseret på emissions billeder erhvervet i to spektral vinduer, det O2-følsomme emissions signal er divideret med reference signalet, genererer et forhold billede, der er mindre tilbøjelige til ovennævnte interferenser5,17. Metoden kræver brug af et andet farvestof, som ideelt set kan blive ophidset af den samme excitation kilde, men udsender på en anden bølgelængde (uden signifikant spektral overlap), i et andet spektral vindue af kameraet (f. eks, i en anden farvekanal af et RGB-kamera).

Alternativt kan O2 -billeddannelse baseres på kvantificering af o2-afhængig ændring i luminescens levetid for indikatorfarve stoffet, som ikke påvirkes af ujævn belysning eller heterogeniteter i indikator koncentrationen25. Første luminescens levetids baserede O2 -billedbehandlingssystemer var baseret på tidsdomæne målinger med et Gate-able opladet Device (CCD)-kamerasystem26, hvor der anvendes en pulserende excitation-kilde, og luminescens billeder tages over definerede tidsintervaller inden for excitation eller emission af indikatoren8,23,27. Fra sådanne billeder kan luminescens levetid bestemmes og korreleres til den tilsvarende O2 -koncentration i en kalibrering. Efterfølgende kan luminescens livstids billeder for en given prøve, der trykkes mod planar optode, konverteres til billeder af den tilsvarende 2D-fordeling af O2 -koncentrationen. Dette system er blevet anvendt i mange applikationer både i laboratoriet og in situ16,28, men det essentielle Gate-able CCD-kamera er ikke længere kommercielt tilgængeligt.

For nylig blev et andet luminescens livstids kamerasystem frigivet, som erhverver billeder i frekvens-domæne8. Systemet er afhængig af en kontinuerligt moduleret lyskilde til excitation. Dette kan enten være en sinusformet eller firkantet bølge i stedet for en pulserende excitation, som bruges til billed erhvervelse i tids domænet. Denne graduering resulterer i en moduleret luminescens emission af O2 -indikatorens farvestof, som er fase forskudt af en vinkel, φ, som er afhang af indikatorens luminescens levetid (τ) (Se ligning 2).

2

Ændringen mellem excitation og emission amplitude (dvs. det såkaldte modulations indeks eller dybde (amplitude divideret med den konstante luminescens del)) er også afhængig af luminescens levetid. Så ved at indstille en kendt modulationsfrekvens er den specielle CMOS-billedsensor i kameraet i stand til at måle luminescens levetid i NS til μs-området som beskrevet i detaljer andetsteds 8,29,30. En generel vejledning om Operations princippet kan findes (ved hjælp af følgende link https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).

I den følgende protokol viser vi brugen af det nye kamerasystem til billeddannelse fordelingen af O2 koncentration omkring rødderne af den akvatiske ferskvands plante littorella uniflora i 2D9,31. Vi vil gerne understrege, at denne metode på ingen måde er begrænset til denne applikation. Oxygen-følsomme optodes eller sensor partikler27 i kombination med forskellige billeddannelses metoder har været anvendt i medicinskforskning 32, i bioprinting33, for trykfølsommaling 34,35, eller at studere fotosyntetiske systemer2,36,37, bare for at nævne et par andre anvendelsesområder.

Protocol

1. fabrikation af planar O2 optode

  1. 1,5 mg af det luminescerende O2 -indikatorfarve stof platin (II)-5 opløses, 10, 15, 20-tetrakis-(2, 3, 4, 5, 6-pentafluorphenyl)-Porphyrin (PtTFPP) og 100 mg POLYSTYREN (PS) i 1 g chloroform for at få den såkaldte ' sensor cocktail '.
    Bemærk: cocktailen kan opbevares i et lukket, gastæt hætteglas i et par timer i køleskab og mørke indtil videre brug.
  2. Fastgør en ren, støvfri polyethylenterephthalat (PET) folie (størrelse afhængig af applikationen) på en renset glasplade ved hjælp af et vand eller ethanol (70%) film (figur 1A).
  3. Anbring den rensede kniv belægnings anordning (120 μm) på folien, og Anvend en linje af sensor cocktailen foran enheden med en glas pipette (figur 1B). Træk derefter kniv-belægnings anordningen langsomt og ensartet over PET-folien for at sprede cocktailen jævnt.
    Bemærk: alle materialer og værktøjer skal rengøres grundigt, og fremstillingen skal ske i et støvfrit miljø, såsom en stinkhætte, flow bænk eller under en punkt sugeanordning. For at undgå forskelligartethed i den endelige sensor folie skal trinene efter påføring af sensor cocktail på folien ske hurtigt, da chloroform fordamper hurtigt.
  4. Tør det færdige planar O2-følsomme optode i luften i 1 time og derefter over natten i et varme kabinet ved 50-60 °c, hvilket resulterer i en sidste lagtykkelse efter opløsningsmiddel fordampning på ~ 12 μm. Opbevar de fremstillede optoder i mørke (f. eks. i en papir konvolut) indtil videre brug (figur 1C).
    Bemærk: planar O2 optodes kan opbevares tørt og i mørke i flere måneder til år før brug. En sidste lagtykkelse, der spænder fra 1-20 μm, har vist sig at give gode resultater med tilstrækkeligt luminescens signal og passende responstider.

2. rhizo-sandwich kammer

  1. Rengør to glasplader (24,5 x 14 cm2, tykkelse: 4 mm) med 96% ethanol.
  2. Brug let-helbredelig, akryl-baseret instant klæbemiddel (Se tabel over materialer) til at lime mikroskop slides (76 x 26 mm2, tykkelse: 1 mm) langs kanterne af den første glasplade (dvs. den bageste kammer side), mens efterlader en lang kant åben. Brug en glasscutter til at afkorte mikroskop slides efter behov.
    Forsigtig: skæring glas kan forårsage skarpe kanter og bør håndteres med omhu.
    Bemærk: mikroskop diasene fungerer som afstandsstykker mellem forsiden og bagsiden, og afhængigt af tykkelsen af rødderne og anlæggets størrelse kan flere lag mikroskop slides Limes oven på hinanden.
  3. Skær planar optode i den ønskede form og størrelse for at passe ind i rummet mellem de limede mikroskop slides. Placer den på indersiden af den forreste glasplade med den coatede side opad for at give mulighed for kontakt med prøven af interesse, når den presses mod den.
  4. Tape den ene kant af optode-folien på glaspladen og tilsæt nogle få dråber vand mellem glaspladen og optode-folien (figur 2a). Langsomt sænke folien på disse vanddråber gør det muligt at rette sig ud på glasoverfladen.
  5. Fjern forsigtigt luftbobler fanget i-mellem planar optode og glaspladen ved hjælp af et blødt væv, og undgå ridser af sensor belægningen. Aftør glaspladen tørt, og tape de resterende kanter af optode-folien på glaspladen (figur 2B).
    Bemærk: der skal vælges et bånd med passende vedhæftning under vand.
  6. Sedimentet med en maskestørrelse på 0,5 mm. Anbring en ske med vådt sediment på den første glasplade (figur 2C).
    Bemærk: maskestørrelsen må ikke være større end halvdelen af afstands tykkelsen.
  7. Fordel sedimentet jævnt og Juster det til samme tykkelse som mikroskop glide afstandsstykker ved hjælp af en flad glasplade. Rengør forsigtigt den øvre overflade på mikroskop gliderne for at sikre, at den anden glasplade forsegler kammeret korrekt.
  8. Anvend silicium fedt på mikroskop slide overfladen. Dæk sedimentet med en tynd vand folie, mens du forsigtigt undgår dannelsen af luftbobler.
  9. Vask forsigtigt et enkelt skud af Littorella uniflora og Placer det på sedimentet, med planten blade stikker ud fra den øvre åbne side (figur 2D).
  10. Den anden glasplade placeres med optode fastgjort på sedimentet, og der påføres et forsigtigt Tryk for at bringe optode i tæt kontakt med planterødderne og det omgivende sediment.
    Bemærk: luftbobler, der er fanget i sedimentet, kan fjernes ved at vippe glaspladerne og samtidig samle dem.
  11. Fastgør glaspladerne sammen ved hjælp af klemmer (figur 2E). Tør de ydre kanter med silkepapir. Hold bladene fugtet i hele samlingen af rhizo-sandwich (f. eks. ved hyppig tilsætning af et par dråber vand).
  12. Stram rhizo-sandwich kammer ved hjælp af vinyl elektrisk tape. Forsegle kanterne med modellering ler og derudover tape dem med vinyl elektrisk tape (figur 2F).
    Bemærk: Hvis der er mange luftbobler i sedimentet eller sedimentkerner mellem spacer mikroskopet og den anden glasplade, skal kammeret samles igen, da porevand kan sive ud (Gentag trin 2,4-2,8).
  13. Brug en uigennemsigtig plastik til at dække rhizo-sandwich, men lad en slids i folien for planten blade til at holde ud. Skær et vindue i plastikfolie, så det kan åbnes for eksperimenter ved at udfolde sig. Luk vinduet under akklimatiserings tider ved hjælp af elastikker (figur 2G) for at beskytte optode mod foto blegning, mens planten inkuberet.
    Bemærk: da algevækst potentielt kan forstyrre O2 koncentrationer målt, anbefaler vi at forsøge at minimere det ved hjælp af filtreret vand, forrenset eksperimentelt udstyr og fjernelse af alger ved dannelse.

3. rhizo-sandwich kammer inkubation

  1. Placer rhizo-sandwich kammeret i en vandtank (32 x 7 x 28 cm3) i en lidt skrå position for at tilskynde til rodvækst mod planar optode.
  2. Fyld vandbeholderen med nok vand til helt at nedsænkes plante bladene.
  3. Etablere en 14 h lys, 10 h mørk cyklus for akklimatisering af planten ved hjælp af en tids kontrolleret lampe. Placer en luft-sten eller en vandpumpe i tanken for at sikre beluftning og blanding af vandet (figur 2H).

4. billeddannelse

  1. Opsætning af Imaging
    1. Fjern plastfolie, der dækker planar optode i rhizo-sandwich kammeret. Placer kammeret med glasvæggen med optode opretstående mod akvariet væggen. Brug en spacer til at trykke rhizo-sandwich kammer mod akvariet væggen.
      Bemærk: den samlede tykkelse af akvariet væggen plus rhizo-sandwich kammer væggen bør ikke blive for tyk, dog, glastykkelser til Aquaria vægge for luminescens billeddannelse anbefales med > 1 cm, for at reducere rumlig Cross-Talk ved at øge dæmpningen af scattered lys. Det er vigtigt, at bruge det samme materiale til begge glasvægge (samme ildfaste indeks), for at minimere lysspredning på materialets grænseflade; da dette ville føre til et sløret billede samt12.
    2. Placer det frekvens-domænebaserede luminescens livstids kamera, der er udstyret med en objektiv (Se tabel over materialer) foran akvariet og det område af interesse (rødder af vand planten littorella uniflora, som er i direkte kontakt med planar Optode) (figur 3).
      Bemærk: kameraet kan placeres på et laboratorie stativ for at give mulighed for nem højdejustering af kameraet. Placeringen af laboratoriet står skal mærkes og holdes fast. Derudover kan kameraet være tapede til laboratoriet stå for at undgå utilsigtet bevægelse af kameraet under eksperimentet.
    3. Skru et egnet emissions filter til billeddannelse PtTFPP som indikatorfarve (Se tabel over materialer) på kameraets mål for at fjerne slutninger fra excitation source.
      Bemærk: skrue-on filtre er ideelle, men firkantede filtre kan også anvendes med enten en passende adapter, eller ved omhyggelig tape dem til målet.
    4. Tilslut en LED excitation kilde (Se tabel over materialer) til modulation og Dark Gate output af kameraet.
      Bemærk: førstnævnte leverer modulations signalet til lyskilden, mens sidstnævnte slukker lyset under billedsensoren. Tilslut LED-excitation-kilden og kameraet til en computer. Baggrundslyset bør minimeres under billed udlæsningen ved enten at mørklægge hele lokalet eller sætte en tæt, sort klud over hele set-up. I sidstnævnte tilfælde er det vigtigt at sikre tilstrækkelig ventilation for at undgå opvarmning af kameraet.
    5. Fastgør lysguiden i LED-excitation-kilden, og Placer den for jævnt at belyse planar optode-folien, der dækker området af interesse.
      Bemærk: i den anvendte LED-excitation-kilde er det muligt at skifte mellem 3 forskellige lysdioder (460 nm, 528 nm, 625 nm), hvis intensitet kan justeres via kontrol softwaren.
  2. Indstillinger og kamera betjening
    Bemærk: for de beskrevne eksperimenter brugte vi et frekvens-domæne-baseret Lifetime-kamera i kombination med et dedikeret modul til livstids scanning i en kommercielt tilgængelig softwarepakke (Se tabel over materialer).
    1. Vælg kameraet i den valgte software før brug.
      Bemærk: software-og kamera driverne skal installeres før billeddannelse efter producentens retningslinjer.
    2. Åbn LED-styringssoftwaren (igen installeret før eksperimentet påbegyndes), og vælg den passende lysdiode (her: 528 nm) ved at afkryde standby. Indstil LED-intensiteten efter behov (her til 30%). Sørg for, at LYSDIODEN udløses af den eksterne TTL; Dette gøres ved at afkryde analog og Sync for lysdioden.
      Bemærk: LED-intensiteten skal justeres individuelt, da for høj laser effekt kan føre til accelereret billed blegning af indikatoren eller reference farve.
    3. Fokuser kameraet og Juster blændens blænde manuelt (i den nuværende undersøgelse anvendes f = 2,8).
      Bemærk: det er vigtigt at fokusere kameraet på planar optode og ikke på akvariet glas; Dette kan sikres ved at tage et billede med en lineal for skalering, og fokusere på skyggen af linealen på optode, snarere end på den faktiske lineal.
    4. Angiv følgende parametre i softwarens kamera Kontrolpanel: intern modulations kilde; sinusbølge for output bølgeform; yderligere fase prøvetagning (ja) 8 fase prøver, faserækkefølge modsat, Tap på A + B udlæser; 5 kHz modulationsfrekvens.
      Bemærk: disse parametre påvirker billedkvaliteten og kan ændres, hvis det er nødvendigt. Producenten af kameraet giver retningslinjer for de enkelte parametre (kameraproducenten frigiver retningslinjer og opdateringer, når softwaren bliver opdateret).
    5. Tag et referencebillede før eksperimenter.
      Bemærk: Dette kan gøres enten ved at afbilde en kalibreringsstandard (et luminescerende farvestof med en kendt levetid (NS eller μs)) eller ved at bruge LED'S reflekterede lys. I sidstnævnte tilfælde skal emissions-Long Pass-filteret fjernes fra målsætningen, og den kendte levetid kan indstilles til 1 ns.
    6. Juster eksponeringstiden i kalibrerings afsnittet i den dedikerede billedbehandlingssoftware, indtil ROI-statistikken (i bunden af dette panel) for det normaliserede luminescens intensitets billede er i intervallet 0,68-0,72.
      Bemærk: nu er reference levetiden (f. eks. 1 NS) givet som input til softwaren.
    7. Tryk på Capture reference for at starte købet af en reference måleserie.
      Bemærk: når du er færdig, lagres Referencedataene, og der kan foretages enten enkelt-eller tidsforskudt måling på prøverne.
  3. Kalibrering af O2 optode
    1. Placer et stykke af en planar O2-følsom optode i et (lille) glas akvarium. Fastgør planar optode på glasvæggen i kalibrerings kammeret som beskrevet tidligere (se punkt 2,3). Placer kalibrerings akvariet foran kameraet. Sørg for selv belysning ved LYSDIODEN, samt at optode fylder hele synsfeltet.
      Bemærk: planar optode skal være fra det samme stykke folie eller fremstillet af den samme sensor cocktail som den folie, der anvendes i det egentlige eksperiment.
    2. Fyld akvariet med det samme flydende medium som anvendt i forsøgene.
      Bemærk: brug af forskellige medier til kalibreringer og eksperimenter kan påvirke målingen (f. eks. ved at ændre sensor respons og/eller O2 opløselighed). Således bør kalibrering ske i samme medium, og ved samme temperatur som det egentlige eksperiment. Temperaturudsving vil påvirke luminescens signalet og bør undgås. Hvis temperaturen imidlertid ikke kan holdes stabil, skal der foretages en temperatur udligning ved at kalibrere den O2-følsomme optode (flere punkter) ved forskellige (relevante) temperaturer og efterfølgende genberegning af værdierne.
    3. Koncentrationen af O2 i kalibrerings akvariet justeres ved at skyllevandet med en luft/N2 -gasblanding af kendt O2 -koncentration ved hjælp af en gasblandings anordning. Sørg for, at vandet er godt ækvibreret med den brugte gasblanding ved at udluftning i tilstrækkelig lang tid (afhænger af strømningshastigheden og størrelsen af akvariet).
      Bemærk: Vi anbefaler, at du overvåger O2 -niveauet i kalibrerings akvariet med en ekstern, kalibreret o2 -sensor med temperaturkompensation (f. eks. ved hjælp af en fiberoptisk eller elektrokemisk O2 -sensor).
    4. Tag en række billeder ved forskellige O2 koncentrationer i kalibrerings kammeret.
      Bemærk: der skal måles mindst fem forskellige O2 -koncentrationer for at sikre en passende kurve, der passer til de erhvervede kalibreringsdata. Det er vigtigt at måle ved 0 hPa (anoxic betingelser), og derefter distribuere de andre værdier over det dynamiske område af din specifikke indikatorfarve. Her brugte vi PtTFPP som O2-følsom indikatorfarve immobiliseret i en polystyren matrix. Billeder blev taget ved 0, 48, 102, 156 og 207 hPa; 207 hPa svarer til 100% luft mætning ved den givne saltholdighed og tryk.
  4. Billedbehandling af prøven
    1. Placer prøven foran kameraet, og sørg for en jævn belysning.
    2. Sluk lyset, som forsyner anlægget med bestråling (og alle andre lyskilder), lige før det opkøber anlæggets luminescens levetids billede. Juster anskaffelses tiden baseret på intensitets billedet for at sikre, at signalet hverken er overmættet eller for svagt til et godt signal til støj (S/N)-forhold i livstids bestemmelsen.
    3. Udsætte anlægget for varierende lysforhold (f. eks lys/mørke) og erhverve et sæt af billeder.
    4. Tænd lyset i rummet for at erhverve et strukturelt billede.
      Bemærk: når baggrundslyset tændes, måler kameraet ikke et realistisk livstids billede. Dog viser intensitets billedet nu hele synsfeltet, som det ses gennem den halvgennemsigtig optode.
    5. Tag et billede med en lineal eller ens i synsfeltet for at muliggøre senere skalering af de erhvervede billeder.

5. data analyse

  1. Eksporter fase levetiden og intensitets billeder direkte fra den dedikerede billedbehandlingssoftware ved hjælp af den makro, der leveres af kameraproducenten.
  2. Udføre yderligere billedanalyse ved hjælp af en frit tilgængelig billedanalyse software (Se tabel over materialer).
  3. Åbn fase levetids billeder af kalibreringen i billedanalyse softwaren, og bestem middelværdien for hele billedet ved hjælp af funktionen measure. De målte levetid afbildes i forhold til de kendte O2 -koncentrationer for at bestemme kalibreringsfunktionen (figur 4A).
  4. Beregn τ0/τ fra alle data (τ0 er den målte fase levetid i fravær af O2). Disse værdier i forhold til de kendte O2 -koncentrationer (figur 4B).
  5. Bestem parametrene KSV og f fra kalibrerings plottet ved hjælp af den forenklede to-site model for dynamisk kollisions dæmpning (ligning 3)38,39 hvor [Q] er O2 koncentrationen. Definer funktionen Tilpas i dataanalyse softwaren, som derefter bestemmer KSV og f.

3

  1. Åbn de erhvervede prøve billeder i billedanalyse softwaren for at konvertere de afbildet levetid til O2 koncentrationer ved hjælp af de fastsatte parametre KSV, f og τ0.
    Bemærk: som en alternativ tilgang kan de erhvervede kalibrerings fasers levetids værdier (figur 4A) også anvendes direkte. I dette tilfælde bruges en eksponentiel pasform ved hjælp af funktionen kurvetilpasning til kalibrering.
  2. Åbn billedet med linealen ved siden af billedanalyse softwaren, og mål en kendt distance ved hjælp af måleværktøjet. Angiv denne måling som global skala under set Scale.

Representative Results

Som et eksempel på anvendelsen af det nye billedbehandlingssystem viser vi 2D O2 -billeddannelse af en kompleks biologisk prøve (dvs. rhizosfæren af vand planten littorella uniflora).

For det første beskriver metoden fabrikation af en planar sensor film, en såkaldt planar optode. Som det ses i figur 1, er en sådan optode lavet af et tyndt lag af en optisk indikator i en polymermatrix, der spredes på en gennemsigtig støtte. Ved at følge den beskrevne protokol opnås en homogen sensor film med en ensartet tykkelse, som defineret af hullet i kniv belægnings anordningen. Hvis den producerede optode har en ujævn sensor materiale fordeling (f. eks huller i belægningen, viser striber, eller farvestoffer aggregater (dette kan evalueres visuelt, og visuelt ved hjælp af en UV-lampe)), skal protokollen gentages, og alle materialer skal rengøres grundigt ved hjælp af acetone.

Når planar optode er tilberedt, kan prøven bringes i tæt kontakt med det følende lag af planar optode, som vist her med planar optode integreret i et rhizo-sandwich kammer, hvor rødderne af et anlæg i en omgivende sediment matrix kan placeres i tæt kontakt med planar optode (figur 2). Hvis det tilberedes korrekt, skal rhizo-sandwich kammeret let kunne flyttes fra et akvarium (inkubation) til det andet (måling). Hvis det ikke er konstrueret korrekt, kan rhizo-sandwich kammeret være instable, tabe sediment eller indeholde luftbobler. Visuel undersøgelse af rhizo-sandwich kammeret umiddelbart efter montering anbefales derfor.

Den givne protokol giver mulighed for frekvens-domænebaseret luminescens livstids afbildning af prøven i kontakt med planar optode ved hjælp af det frekvens-domænebaserede luminescens levetids kamera. Flere detaljer om dette kamerasystem, såsom tilstanden af billed erhvervelse og videnskabelige komplementære metal-oxid-halvleder (scmos) kameraegenskaber er givet i de seneste publikationer8,29.

Selve opsætningen er ret enkel og omfatter kun kameraet, der styrer en lyskilde (i dette tilfælde en LED-excitation-kilde) og prøven med optode (figur 3). Sørg for, at alle dele er korrekt tilsluttet, og at prøven belyses ensartet. Baggrundslyset skal undgås under præforme målinger.

Forud for billeddannelse af prøven skal optode kalibreres. Som det ses i figur 4A, aftager den målte luminescens levetid med stigende O2 -koncentration efter en kvasieksponentiel nedbrydning. Dette forhold kan også beskrives ved hjælp af den forenklede to-site model (figur 4B og ligning 3). I det givne eksempel blev de parametre, der var nødvendige for efterfølgende beregning af O2 -koncentrationen, fulgt. τ0 = 56,26 μs, KSV = 0,032 hPa-1 og f = 0,86.

Udførelse af en kalibrering er også en ideel måde at teste, at systemet fungerer korrekt. Hvis alle komponenter er installeret som beskrevet her (eller inden for producentens retningslinjer), skal den målte levetid vise den samme O2 -afhængighed, som det ses i figur 4. For den samme kombination af O2 -sensor materialer (polymer og farvestof) skal den målte τ0 desuden være i samme område (± et par μs) målt her (hovedsageligt påvirket af forsøgstemperaturen). Hvis der ikke kan opnås en lignende kalibreringskurve, skal du sikre dig, at alle trin er fulgt korrekt. Sommetider optode er ved et uheld fastgjort med den følsomme side vender glasvæggen i stedet for prøven, eller de erhvervede billeder er over-eller undereksponeret.

Med kalibrerings parametrene er det muligt at bestemme O2 -koncentrationen ved at afbilde luminescens levetid (τ). Dette påvises i figur 5A, B, hvor fordelingen af O2 koncentrationen i rhizosfæren af littorella uniflora blev afbildet i mørke og efter lys eksponering til 500 μmol fotoner m-2 s-1 for 12 h, hhv. På grund af den fotosyntetiske aktivitet af planten, O2 koncentrationen i rhizosfæren steg efter lys eksponering. Udover livstids billeder kan også "strukturelle" billeder erhverves under ekstern belysning, samtidig med at billedbehandlings geometrien fastholdes. På denne måde kan O2 billeder præcist korreleres til det strukturelle billede (figur 5C), tværsnit eller regioner af interesse. Som et eksempel, O2 koncentrations profiler på tværs af en enkelt rod blev udvundet fra billedet erhvervet i mørke og lys, henholdsvis (figur 5D).

Figure 1
Figur 1: fabrikation af en planar O2 optode. A) en PET-folie er fastgjort på en glasplade, og kniv belægnings anordningen anbringes på folien. B) den forberedte sensor cocktail SPREDES på PET-folien som en tynd linje foran kniv-belægnings anordningen. C) kniven-belægnings anordningen flyttes nedad for at sprede sensor cocktailen som en tynd film på PET-folien, som efter fordampning af opløsningsmidlet resulterer i en klar til brug planar optode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Fig. 2: Rhizo-sandwich kammer samling med integration af en planar O2 optode. A) optode fastgøres på en af glaspladerne ved hjælp af en vandfilm. (B) optode klæbes fast til pladen med elektrisk tape. C) sedimentet fyldes i den modsatte plade med de vedlagte afstandsstykker (dvs. mikroskop glider). D) planterødderne anbringes på det jævnt spredte sediment. (E) rhizo-sandwich kammeret er lukket og midlertidigt fastgjort med klemmer. F) fuldt lukket og samlet rhizo-sandwich kammer. G) for at beskytte optode mod lys eksponering ved inkubations lampen og for at undgå algevækst anbringes et plastik dæksel over det samlede rhizo-sandwich kammer. H) rhizo-sandwich kammeret inkuberet i et akvarium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: billedbehandlings opsætning, der indeholder det frekvens-domænebaserede luminescens levetids kamera, med målet fokuseret på prøven med optode bagfra via det gennemsigtige akvarium og rhizo-sandwich kammervæggene. Lysføringen af LED-excitation-kilden er positioneret til at belyse prøven jævnt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: kalibreringskurver for planar O2 optode. A) forskellige livstider for phosphorescens målt ved de respektive O2 -koncentrationer i det vandfyldte kalibrerings kammer. B) et agterstavns plot af kalibreringsdata, som er monteret ved hjælp af den forenklede to-site model for dynamisk kollisions dæmpning (ligning 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: livstids afbildning af O2 -fordelingen i rhizosfæren af vand planten littorella uniflora. A) O2 fordeling efter at have holdt anlægget under lys i 12 timer ved ca. 500 μmol fotoner m-2 s-1. B) O2 fordeling efter at have holdt planten i mørke i 1 time.C) strukturelt billede af planterødderne som set gennem planar optode. D) tværsnits-O2 -koncentrations profil (placeringen indikeres af den gule linje i panel A og B) efter 12 timer i lys (rød) og 1 time i mørke (sort). Tilpasset med tilladelse fra (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. luminescence Lifetime Imaging af kemiske sensorer-en sammenligning mellem tid-domæne og frekvens-domænebaserede kamerasystemer. Analytisk kemi. 91 (5), 3233-3238, Doi: 10.1021/ACS. analchem. 8b05869 (2019)). Ophavsret (2019) det amerikanske kemikalie selskab. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne protokol er hele arbejdsstrømmen fra optode Preparation til O2 billedanalyse dækket. Ved at følge denne protokol, kan kemiske billeder opnås ved hjælp af den nye frekvens-domæne-baserede luminescens levetid kamera. Afhængigt af applikationen kan planar optodes fremstilles i forskellige størrelser og lagtykkelse af sensor laget, der spænder fra robuste 50-100 μm tykke planar optodes af flere tiendedele af kvadratcentimeter til mikroskop Cover glider med < 1 μm tykke sensor lag6,40. Potentialet ved denne metode blev påvist med en bestemt anvendelse, men er ikke kun begrænset til O2 billeddannelse i plante rhisfærer12,28.

Denne metode har flere fordele i forhold til ren luminescens intensitetsbaserede kemiske billedbehandlings metoder. Luminescens levetid Imaging er ikke, eller i det mindste langt mindre, påvirket af ujævn belysning, ujævn optode tykkelse, og foto blegning25. Denne metode undgår også brugen af et yderligere reference farvestof, som er almindelig i ratiometrisk billeddannelse17,37. I sammenligning med andre Lifetime baserede kamerasystemer, såsom almindeligt anvendte gated time-Domain kameraer8,26, den nye kamerasystem og protokol præsenteret her kan levere sammenlignelige resultater. I en nylig publikation blev de analytiske karakteristika for disse to systemer sammenlignet, og det konstateredes, at det frekvens-domænebaserede luminescens livstids kamerasystem i det mindste kan sammenlignes med den udgåede tid-domænebaserede forgænger8.

Vi har præsenteret den enkleste O2 optode kun består af en indikator i en polymermatrix. Udover flere andre mulige O2 indikatorer20 , der kan anvendes tilsætningsstoffer kan medtages, dvs spredning agenter såsom TiO2 eller Diamond Powder2 at øge sensor signal samtidig reducere gennemsigtigheden af optode. Yderligere farvestoffer kan også bruges til at forbedre signal intensiteten via energioverførsel41.

For planar optode fabrikation anbefaler vi at bruge et hul i kniv-belægnings anordningen på 75-120 μm til at give en endelig sensor lagtykkelse på ca. 7,5 til 12 μm efter fordampning af opløsningsmiddel (ca. 10% af det anvendte hul), når den beskrevne sensor cocktail sammensætning anvendes. Dette er et godt kompromis mellem signalintensitet, som kan ændres ved højere farvestof lastning, eller ved at vælge indikator og reference farvestoffer af højere lysstyrke, og responstid. En forøgelse af lagtykkelsen resulterer i en stigning i responstid, da det tidsrum, der kræves, for at analytten kan nå en termodynamisk ligevægt i det følende lag med de omgivende medier, stiger12.

Optodes, som beskrevet her, reagerer på ændringer i O2 koncentrationen inden for få sekunder17 , mens der stadig er et tilstrækkeligt stærkt luminescens signal. Ultratynde sensor belægninger med sub-sekund responstider kan realiseres med spin-coating6. Hvis støtte-eller kniv belægnings anordningen ikke er velrengjort, kan det resultere i inhomogene sensor lag. Også, når cocktailen ikke er helt homogen eller anvendes for hurtigt efter spredning foran belægningen anordning sådan et uønsket resultat kan observeres. Derfor, det kan have brug for nogle praksis til at forberede optimale optodes.

Metoden kan bruges til at billed prøver, som kan sættes i tæt kontakt til optode, såsom visse Marine dyr42, biofilm6 og jord31 bare for at nævne nogle få. Vi præsenterer en standalone setup ved hjælp af et mål, men kameraet kan nemt kobles til et mikroskop for højere opløsning kemisk billeddannelse43.

Mens tids domænebaseret luminescens levetid Imaging aktiveret undertrykkelse af baggrunden fluorescens26, dette er et problem, når du bruger den nye frekvens-domæne-baserede kamerasystem8. På grund af den kontinuerlige billed erhvervelse, vil dette kamera optage enhver baggrunds fluorescens af prøven, der kan blive ophidset af den valgte LED og udsender i det valgte spektral vindue som defineret af emissions filteret på kameraets mål. Dette vil resultere i en tilsyneladende lavere levetid og dermed i falske aflæsninger. Hvis du arbejder med prøver med en signifikant iboende fluorescens overlapning med O2 sensor excitation og emission, er det vigtigt at anvende en ekstra optisk isolering på toppen af optode, ved belægning et ekstra lag indeholdende Carbon Black2,17. Således vil kun luminescens udsendt fra planar optode nå kameraet. For at kontrollere baggrunds luminescens kan der tages et billede uden optode, som så udelukkende ville vise prøvens iboende luminescens. Det er også muligt at tilføje spredning agenter såsom TiO2 eller Diamond Powder2,44, til sensoren cocktail, at øge luminescens intensitet af indikatoren farvestof. Dette kan dog også føre til hurtigere foto blegning og TiO2 er en kendt foto-katalysator, som kan forringe foto stabilitet af et farvestof41. Et andet aspekt at overveje, er baggrundslys. Ved billeddannelse af luminescens levetid skal baggrundslyset undgås så effektivt som muligt. Derfor kræver denne billedbehandlings metode, at opsætningen placeres i et mørkt miljø, og at enhver ekstern lyskilde skal slukkes midlertidigt under billed anskaffelsen.

Kort sagt er luminescens livstids Imaging en robust kemisk billedbehandlings metode, der kan tilpasses til mange forskellige anvendelser. Denne protokol (Se afsnit 1-5) dækker alle de væsentlige trin til at generere en O2 billede og bruger den aktuelt mest fleksible frekvens-domæne luminescens levetid Imaging system, som kan erstatte den ophørte gated tids domæne kamera til 2D O2 Imaging med planar optodes.

Disclosures

Forfatteren Gerhard Holst er ansat i PCO AG, som fremstiller det kamerasystem, der anvendes i denne artikel. PCO AG bidrog finansielt til offentliggørelsen og omkostningerne ved åben adgang til denne artikel.

Acknowledgments

Vi takker Sofie Lindegaard Jakobsen (Københavns Universitet) og Lars Borregaard Pedersen (Aarhus Universitet) for teknisk assistance. Finansieringen af denne undersøgelse blev hentet fra et avanceret tilskud fra Sapere-Aude fra den uafhængige forskningsfond Danmark (DFF-1323-00065B; MK), projekttilskud fra den uafhængige forskningsfond Danmark | Naturvidenskab (DFF-8021-00308B; MK) & tekniske og produktionsteknikker (DFF-8022-00301B og DFF-4184-00515B; ), Danmarks National Research Foundation (DNRF136) og Poul Due Jensen Foundation (KK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air pump with air stone and water pump Local aquarium store
Chloroform Sigma Aldrich 67-66-3
DC4 silicone compound Dow Corning GmbH 2793695
Gas mixer Vögtlin Instruments GmbH red-y compact meter GCM This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices
Glass plates and aquaria Local aquarium or hardware store
ImageJ Software ImageJ Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Knife-coating device

BYK-GARDNER GMBH byk.com		 2021 This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.
LED lamp, Reflector PAR38 Megaman MM17572
LED LEDHUB Omicon Laserage, Germany Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential
LOCTITE AA 3494 Henkel AG & Co. KGaA NA Acrylic-based instant adhesive
NIS Elements AR Software Nikon Inc Software package used for image acquisition
pco.flim PCO AG, Germany Frequency domain based luminescence lifetime camera
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) Frontier Scientific PtT975 O2 indicator
polyethylene terephthalate (PET) foil Goodfellow 320-992-72 Such foils might also be found from other providers and serve as solid support
Polystyrene (PS) Sigma Aldrich 9003-53-6 Polymer matrix
Schott RG610 filter www.uviroptics.com Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective
Vinyl electrical tape Scotch, Super 33+ NA
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor delivered with the camera Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glud, R. N., Kühl, M., Kohls, O., Ramsing, N. B. Heterogeneity of oxygen production and consumption in a photosynthetic microbial mat as studied by planar optodes. Journal of Phycology. 35 (2), 270-279 (1999).
  2. Moßhammer, M., Strobl, M., Kühl, M., Klimant, I., Borisov, S. M., Koren, K. Design and Application of an Optical Sensor for Simultaneous Imaging of pH and Dissolved O2 with Low Cross-Talk. ACS Sensors. 1 (6), 681-687 (2016).
  3. Jensen, S. I., Kühl, M., Glud, R. N., Jørgensen, L. B., Priemé, A. Oxic microzones and radial oxygen loss from roots of Zostera marina. Marine Ecology Progress Series. , 49-58 (2005).
  4. Larsen, M., Santner, J., Oburger, E., Wenzel, W. W., Glud, R. N. O2 dynamics in the rhizosphere of young rice plants (Oryza sativa L.) as studied by planar optodes. Plant and Soil. 390 (1-2), 279-292 (2015).
  5. Brodersen, K. E., Koren, K., Moßhammer, M., Ralph, P. J., Kühl, M., Santner, J. Seagrass-Mediated Phosphorus and Iron Solubilization in Tropical Sediments. Environmental Science and Technology. 51, 14155-14163 (2017).
  6. Kühl, M., Rickelt, L. F., Thar, R. Combined imaging of bacteria and oxygen in biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 73 (19), 6289-6295 (2007).
  7. Sønderholm, M., et al. Tools for studying growth patterns and chemical dynamics of aggregated Pseudomonas aeruginosa exposed to different electron acceptors in an alginate bead model. npj Biofilms and Microbiomes. 3, 1-11 (2018).
  8. Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S. M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytical Chemistry. 91 (5), 3233-3238 (2019).
  9. Brodersen, K. E., Koren, K., Lichtenberg, M., Kühl, M. Nanoparticle-based measurements of pH and O2 dynamics in the rhizosphere of Zostera marina L.: effects of temperature elevation and light-dark transitions. Plant, Cell & Environment. 39 (7), 1619-1630 (2016).
  10. Zhu, Q., Aller, R. C., Fan, Y. High-Performance Planar pH Fluorosensor for Two-Dimensional pH Measurements. in Marine Sediment and Water. Environmental Science & Technology. 39, 8906-8911 (2005).
  11. Murniati, E., Gross, D., Herlina, H., Hancke, K., Glud, R. N., Lorke, A. Oxygen imaging at the sediment-water interface using lifetime-based laser induced fluorescence (τLIF) of nano-sized particles. Limnology and Oceanography: Methods. 14 (8), 506-517 (2016).
  12. Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils - a review. Analytica Chimica Acta. , 9-42 (2015).
  13. Glud, R. N. Oxygen dynamics of marine sediments. Marine Biology Research. 4 (4), 243-289 (2008).
  14. Revsbech, N. P., Jorgensen, B. B., Blackburn, T. H. Oxygen in the Sea Bottom Measured with a Microelectrode. Science. 207 (4437), 1355-1356 (1980).
  15. Klimant, I., Meyer, V., Kuhl, M. Fiberoptic oxygen microsensors, a new tool in aquatic biology. Limnology and Oceanography. 40 (6), 1159-1165 (1995).
  16. Glud, R. N., Tengberg, A., Kühl, M., Hall, P. O. J., Klimant, I., Holst, G. An in situ instrument for planar O2 optode measurements at benthic interfaces. Limnology and Oceanography. 46 (8), 2073-2080 (2001).
  17. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9, 348-360 (2011).
  18. Glud, R., Ramsing, N., Gundersen, J., Klimant, I. Planar optrodes:a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
  19. Frederiksen, M. S., Glud, R. N. Oxygen dynamics in the rhizosphere of Zostera marina: A two-dimensional planar optode study. Limnology and Oceanography. 51 (2), 1072-1083 (2006).
  20. Quaranta, M., Borisov, S. M., Klimant, I. Indicators for optical oxygen sensors. Bioanalytical Reviews. 4, 115-157 (2012).
  21. Koren, K., Hutter, L., Enko, B., Pein, A., Borisov, S. M., Klimant, I. Tuning the dynamic range and sensitivity of optical oxygen-sensors by employing differently substituted polystyrene-derivatives. Sensors and Actuators B: Chemical. 176 (100), 344-350 (2013).
  22. Borisov, S. M. Fundamentals of Quenched Phosphorescence O2 Sensing and Rational Design of Sensor Materials. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , 1, Chapter 1 1-18 (2018).
  23. Wang, X., Wolfbeis, O. S. Optical methods for sensing and imaging oxygen: materials, spectroscopies and applications. Chemical Society Reviews. 43, 3666-3761 (2014).
  24. Ehgartner, J., Wiltsche, H., Borisov, S. M., Mayr, T. Low cost referenced luminescent imaging of oxygen and pH with a 2-CCD colour near infrared camera. The Analyst. 139 (19), 4924 (2014).
  25. Meier, R. J., Fischer, L. H., Wolfbeis, O. S., Schäferling, M. Referenced luminescent sensing and imaging with digital color cameras: A comparative study. Sensors and Actuators B: Chemical. 177, 500-506 (2013).
  26. Holst, G., Kohls, O., Klimant, I., König, B., Kühl, M., Richter, T. A modular luminescence lifetime imaging system for mapping oxygen distribution in biological samples. Sensors and Actuators B. 51, 163-170 (1998).
  27. Moßhammer, M., Brodersen, K. E., Kühl, M., Koren, K. Nanoparticle- and microparticle-based luminescence imaging of chemical species and temperature in aquatic systems: a review. Microchimical Acta. , 1-28 (2019).
  28. Koren, K., Kühl, M. CHAPTER 7. Optical O2 Sensing in Aquatic Systems and Organisms. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. 1, 145-174 (2018).
  29. Chen, H., Holst, G., Gratton, E. Modulated CMOS camera for fluorescence lifetime microscopy. Microscopy Research and Technique. 78, 1075-1081 (2015).
  30. Franke, R., Holst, G. A. Frequency-domain fluorescence lifetime imaging system (pco.flim) based on a in-pixel dual tap control CMOS image sensor. Proceedings of SPIE 93281, Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues XIII. , 1-19 (2015).
  31. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  32. Schreml, S., et al. 2D luminescence imaging of physiological wound oxygenation. Experimental dermatology. 20 (7), 550-554 (2011).
  33. Trampe, E., et al. Functionalized Bioink with Optical Sensor Nanoparticles for O2 Imaging in 3D-Bioprinted Constructs. Advanced Functional Materials. 1804411, 1804411 (2018).
  34. Gouterman, M. Oxygen Quenching of Luminescence of Pressure Sensitive Paint for Wind Tunnel Research. Journal of Chemical Education. 74 (6), 697 (1997).
  35. Fischer, L. H., et al. Referenced dual pressure- and temperature-sensitive paint for digital color camera read out. Chemistry. 18 (49), 15706-15713 (2012).
  36. Fabricius-Dyg, J., Mistlberger, G., Staal, M., Borisov, S. M., Klimant, I., Kühl, M. Imaging of surface O2 dynamics in corals with magnetic micro optode particles. Marine Biology. 159 (7), 1621-1631 (2012).
  37. Koren, K., Jakobsen, S. L., Kühl, M. In-vivo imaging of O2 dynamics on coral surfaces spray-painted with sensor nanoparticles. Sensors and Actuators B: Chemical. 237, 1095-1101 (2016).
  38. Carraway, E. R., Demas, J. N., DeGraff, B. A., Bacon, J. R. Photophysics and Photochemistry of Oxygen Sensors Based on Luminescent Transition-Metal Complexes. Analytical Chemistry. 63 (4), 337-342 (1991).
  39. Klimant, I., Ruckruh, F., Liebsch, G., Stangelmayer, A., Wolfbeis, O. S. Fast response oxygen micro-optodes based on novel soluble ormosil glasses. Mikrochimica Acta. 131, 35-46 (1999).
  40. Askaer, L., Elberling, B., Glud, R. N., Kühl, M., Lauritsen, F. R., Joensen, H. P. Soil heterogeneity effects on O2 distribution and CH4 emissions from wetlands: In situ and mesocosm studies with planar O2 optodes and membrane inlet mass spectrometry. Soil Biology and Biochemistry. 42 (12), 2254-2265 (2010).
  41. Mayr, T., Borisov, S. M., Abel, T., Enko, B., Waich, K. Light Harvesting as a Simple and Versatile Way to Enhance Brightness of Luminescent Sensors. Analytical Chemistry. 81, 6541-6545 (2009).
  42. Kühl, M., et al. Microenvironmental Ecology of the Chlorophyll b-Containing Symbiotic Cyanobacterium Prochloron in the Didemnid Ascidian Lissoclinum patella. Frontiers in microbiology. 3, 1-18 (2012).
  43. Dalfen, I., Dmitriev, R. I., Holst, G., Klimant, I., Borisov, S. M. Background-Free Fluorescence-Decay-Time Sensing and Imaging of pH with Highly Photostable Diazaoxotriangulenium Dyes. Analytical Chemistry. 91 (1), 808-816 (2019).
  44. Chatni, M. R., Maier, D. E., Porterfield, D. M. Evaluation of microparticle materials for enhancing the performance of fluorescence lifetime based optrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 141, 471-477 (2009).

Tags

Kemi sensor planar optode phosphorescens opløst stof Imaging rhizosphere sediment
Luminescens levetid billeddannelse af O<sub>2</sub> med et frekvens-domæne-baseret kamera system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moßhammer, M., Scholz, V. V.,… More

Moßhammer, M., Scholz, V. V., Holst, G., Kühl, M., Koren, K. Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System. J. Vis. Exp. (154), e60191, doi:10.3791/60191 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter