Summary
임상 조직 견본의 나노 규모 화상 진찰은 질병 병인의 이해를 향상할 수 있습니다. 확장 병리학 (ExPath)은 표준 임상 조직 샘플과의 호환성을 위해 변형 된 확장 현미경 검사법 (ExM)의 버전으로, 기존의 회절 제한된 현미경을 사용하여 생체 분자의 나노 스케일 구성을 탐구합니다.
Abstract
현대 병리학에서 광학 현미경 검사는 임상 표본의 현미경 구조를 밝혀 질병 진단에 중요한 역할을합니다. 그러나, 근본적인 물리적 회절 한계는 기존의 광학 화상 진찰 접근을 사용할 때 나노 규모 해부학 및 미묘한 병리학 적인 변경의 심문을 방지합니다. 여기에서, 우리는 임상 1 차 조직 견본의 일반적인 모형의 나노 규모 광학 화상 진찰을 위한 확장 병리에게 불린 간단하고 저렴한 프로토콜을 기술합니다, 둘 다 고정 된 동결 또는 포르말린 고정 파라핀 내장 (FFPE) 조직을 포함하 섹션. 이 방법은 조직 샘플을 화학적으로 조직 하이드로겔 하이브리드로 변환하고 순수한 물의 여러 비늘에서 등열대로 물리적으로 확장하여 광학 회절 한계를 우회합니다. 확장으로 인해 이전에는 해결할 수 없는 분자가 분리되어 기존의 광학 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.
Introduction
3차원(3D) 맥락에서 조직의 분자 조직을 조사하면 생물학적 기능과 질병 발달에 대한 새로운 이해를 제공할 수 있습니다. 그러나, 이러한 나노 스케일 환경은 최소 한용화 거리, dα/λ NA에 의해 정의되는 종래의 회절 제한 현미경(200−300 nm)의 분해 능을 넘어서는 것이다. 여기서 λ는 빛의 파장이고 NA는 이미징 시스템의 수치 개구부(NA)이다. 최근에는 형광 표지된 분자의 직접 시각화가 새롭게 개발된 초고해상도 이미징 기술1,2,3,자극방출 고갈(STED)을 포함하여 가능해졌으며, 사진 활성화 국소화 현미경 검사법 (PALM), 연속 광학 재건 현미경 검사법 (STORM), 구조화 조명 현미경 검사법 (SIM). 이러한 이미징 기술은 나노 스케일에서 생물학적 기능에 대한 이해에 혁명을 일으켰지만 실제로는 고가의 및 /또는 특수 장비 및 이미지 처리 단계에 의존하는 경우가 많으며, 광 이미징과 같은 특정 특성을 가진 형광단이 필요합니다(예: 광 스위칭 기능 및/또는 높은 광 안정성). 또한, 조직 시편에서 3D 초고해상도 이미징을 수행하는 것은 여전히 과제입니다.
2015년4월에처음 도입된 확장 현미경 검사법(ExM)은 팽창성 폴리전해질 하이드로겔에 내장된 보존된 샘플을 물리적으로 확장하여 나노스케일 기능(&70 nm)을 이미징하는 대체 수단을 제공합니다. 여기서 주요 생체 분자 및/또는 라벨은 화학 처리 후 동위원소로 확장될 수 있는 폴리머 네트워크에 자리에 고정됩니다. 물리적 팽창은 총 유효 해상도를 증가하기 때문에, 관심 있는 분자는 기존의 회절 제한 이미징 시스템을 사용하여 해결될 수 있다. 사용자 정의 합성 형광 라벨이 폴리머 네트워크에 고정 된 원래 프로토콜의 출판 이후4,새로운 전략은 직접 단백질을 고정하는 데 사용되었습니다 (단백질 보존 ExM, 또는 proExM)5, 6,7,8,9 및 RNA9, 10,11,12를 하이드로겔로, 반복을 통해 물리적 배율을 증가시다. 확장13 또는 적응 젤 화학8,14,15.
여기에서 우리는 임상 병리학 형식에 최적화된 확장 병리학 (ExPath)16에게불린 proExM의 적응된 버전을 제시합니다. 이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE), 헤마톡신 및 에오신(H&E) 스테인드, 유리 슬라이드에 장착된 신선 냉동 인간 조직 표본을 포함한 임상 샘플을 ExM과 호환되는 상태로 변환합니다. 단백질은 하이드로겔에 고정되고 기계적 균질화가 수행된다(도1)16. 시료의 4배 선형 팽창을 통해~ ~300 nm 해상도만을 갖는 기존의 공초점 현미경을 사용하여 다중 컬러 초고해상도(~70nm) 이미지를 얻을 수 있으며 다른 초고해상도 이미징 기술과도 결합될 수 있습니다.
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Protocol
1. 주식 시약 및 솔루션 준비
-
겔화 용액 성분을 준비합니다.
참고: 용액 농도는 g/mL(w/v%)으로 제공됩니다.- 다음 재고 솔루션을 확인: 38% (w/v) 나트륨 아크릴산염 (SA), 50% (w/v) 아크릴아미드 (AA), 2% (w/v) N,N′,N′-메틸렌네비사크릴라미드 (비스), 그리고 29.2% (w/v) 염화나트륨 (NaCl). 이중 탈이온수(ddH 2O)에화합물을 용해시켰다. 표 1의 양을 참조로 사용합니다. 준비된 솔루션은 필요에 따라 볼륨을 확장 하거나 축소할 수 있습니다. 예를 들어 38%(v) SA 용액의 10mL를 만들려면 1.9gSA를 그라디드 10mL 실린더에 추가하고 5mL의 부피에 ddH2O를추가합니다.
- 표 1에나타낸 바와 같이 1.06x 농도로 9.4 mL의 단량액을 준비한다.
참고: 이는 이니시에이터, 가속기 및 억제제의 첨가 후 1배 농도를 초래할 것이다. 단량체 스톡은 최대 3개월 동안 4°C또는 -20°C에서 장기간 보관할 수 있습니다. - 다음 주식 용액을 ddH2O에서 별도로 준비: 억제제 4-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피리딘-1-옥실(4HT)의 0.5% (w/v) 개시자 tetramethylethylenediamine (TEMED), 이는 암모늄 persulfate에 의해 급진적 인 생성을 가속화 (APS), 및 10 % (w / v) 겔화 과정을 시작하는 APS.
참고: 4HT 및 TEMED의 스톡 솔루션은 1 mL aliquots로 제조되고 -20°C에서 적어도 6개월 동안 보관될 수 있다. APS는 장기간 보관 후 효능을 상실하는 것으로 밝혀졌으며 겔화 직전에 소량(&0.1 mL)으로 가장 잘 준비됩니다.
- 소화 버퍼 (50 mM Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% [w/v] 난비계면활성제, 0.8 M NaCl)을 결합하여 1 M Tris pH 8 (3.03 g의 트리스 베이스 25 mL의 ddH2O), 25 mL 의 EDH (5MH 5MA) , 2.25 g의 난오계면활성제, 23.38 g의 NaCl. 총 부피 500mL에 ddH2O를 추가합니다.
참고: 이 용액은 필요에 따라 확장 또는 축소할 수 있으며 4°C에서 보관할 수 있습니다. 단백질분해제 K(ProK)는 소화 단계 직전에 첨가됩니다. - 구연산나트륨 2.941 g과 ddH2O500 mL를 결합하고 실온(RT)에서 pH를 8.0으로 조정하여 구연산나트륨 용액 20mM을 준비합니다. 필요에 따라 재고량을 조정합니다.
- 육수 용액을 6-(아크릴로일)아미노)헥사노산, 수치니미딜 에스테르(아크릴로일-X, SE) AcX), 앵커링 화합물. 10 mg/mL의 최종 농도를 위해 무수 디메틸 설폭화물(DMSO)의 500 μL에 AcX를 용해시.
참고: 용액은 20 μL aliquots에서 -20°C에서 건조된 환경에 저장될 수 있다. - 면역 염색을 위해 시판가능한 버퍼를 사용하지 않는 경우 차단 버퍼를 준비합니다. 1x 인산완충식염수(PBS)에서 5% (v/v) 정상 동물 혈청 및 0.1% (v)의 난오계면활성제의 차단 완충제를 사용하고 이차 항체의 숙주 동물에 기초하여 혈청을 선택한다. 예를 들어, 염소에서 제기된 항체에 대해 500 mL 차단 완충제를 제조하려면 염소 혈청 25 mL, 요온 계면 활성제 0.45 g, 1x PBS를 500 mL의 부피로 결합합니다.
2. ExPath를 위해 보관되고 갓 준비된 임상 조직 슬라이드 준비
- 조직을 ExPath 호환 형식으로 변환합니다. 시편이 어떻게 준비되었는지에 따라 다음 네 단계 중 하나를 선택하십시오: FFPE 슬라이드, 스테인드 FFPE 슬라이드 또는 최적 절삭 온도(OCT) 용액에서 고정되지 않거나 고정되지 않은 냉동 조직 슬라이드.
참고: 이들은 병리학 견본을 위한 표준 복구 단계를 기반으로 하고 ExPath 프로토콜에 특정하지 않습니다.- FFPE 임상 샘플
- 95% 에탄올, 70% 에탄올 및 50% 에탄올30 mL을 준비합니다. 자일렌 30 mL, 100% 에탄올 및 ddH2O를 측정합니다.
- 포셉을 사용하여 50 mL 원추형의 샘플로 슬라이드를 놓고 자일렌 15 mL를 추가합니다. 튜브를 캡하고 궤도 셰이커에 수평으로 놓고 약 60rpm으로 놓고 각 용액에 대해 RT에서 3 분 동안 배양하십시오. 나머지 15 mL 자일렌을 반복합니다.
- 100% 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, 50% 에탄올 및 ddH 2O를 자일렌 대신에 반복단계2.1.2.
- 스테인드 및 마운트 영구 슬라이드
- 슬라이드를 100mm 페트리 접시에 놓고 자일렌으로 덮습니다. 면도날을 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 커버슬립을 쉽게 제거하지 않으면 커버슬립이 풀릴 때까지 슬라이드를 자일렌으로 되돌려 주세요.
- FFPE 샘플에 대한 단계를 사용하여 프로세스 (단계 2.1.1.1-2.1.1.3).
참고: H&E 스테인드 슬라이드의 경우 확장 과정에서 얼룩이 제거됩니다.
- OCT 용액의 고정되지 않은 냉동 조직 슬라이드
- 조직을 -20 °C에서 10 분 동안 아세톤으로 고정하십시오.
- RT에서 각각 10분 동안 1x PBS 용액으로 샘플을 3회 세척합니다.
- 이전에 고정, 냉동 임상 조직 슬라이드
- RT에서 2분 동안 슬라이드를 인큐베이션하여 OCT 용액을 녹입니다.
- RT에서 각각 5분 동안 1x PBS 용액으로 샘플을 3회 세척합니다.
- FFPE 임상 샘플
- 포맷 변환 후 모든 샘플에서 항원 검색을 위한 열처리를 수행합니다.
- 슬라이드 염색 용기와 같은 내열 용기에 20mMM 구연산액(RT의 pH 8)을 넣습니다.
참고: 슬라이드에 장착 된 조직을 덮을 수있는 충분한 해결책이 있어야합니다 (표준 슬라이드 염색 항아리의 경우 50 mL). - 구연산액을 전자레인지에서 100°C로 가열하고 슬라이드를 용액에 놓습니다. 용기를 즉시 인큐베이션 챔버로 옮기고 60°C에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 슬라이드는 페트리 접시에 넣고 1x PBS로 덮고 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
- 슬라이드 염색 용기와 같은 내열 용기에 20mMM 구연산액(RT의 pH 8)을 넣습니다.
- 표준 면역 형광 (IF)/면역 성 화학 (IHC) 염색 프로토콜을 사용 하 여 샘플을 염색.
참고: 특정 1차 및 2차 항체 농도 및 염색 기간은 제조업체가 제안한 농도 또는 특정 실험에 대한 최적화에 따라 달라집니다.- 소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주위에 경계를 그려 조직을 덮는 데 필요한 용액의 부피를 최소화하십시오. 슬라이드를 슬라이드에 맞을 만큼 충분히 큰 접시에 놓습니다. 표준 3인치 슬라이드의 경우 100mm 페트리 접시를 사용하십시오.
참고: 소수성 펜은 샘플의 중합이나 소화 과정을 방해하지 않습니다. - 비특이적 결합을 줄이기 위해 37°C에서 1시간, RT에서 2시간 또는 4°C로 밤새 차단 완충액으로 조직을 배양합니다.
- 준비된 차단 완충제(또는 다른 바람직한 염색 완충제)의 적당한 양에서 원하는 농도로 1차 항체를 희석한다. 1차 항체 용액으로 조직을 RT 또는 37°C에서 3시간 이상 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
참고: 시료는 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 가습 용기(예: 젖은 물티슈가 있는 페트리 접시)에 보관해야 합니다. 전형적으로, 항체는 사용된 조직 크기 및 항체에 따라 완충액의 200-500 μL에서 1:100-1:500으로 희석되었다. - 준비된 차단 완충제(또는 기타 바람직한 세척 완충제)로 티슈를 RT에서 10분 동안 3회 세척한다.
- 희석 보조 항체 (및 300 nM 4′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] 원하는 경우), 준비 된 차단 버퍼 (또는 다른 바람직한 염색 완충제) 약 10 μg/mL의 농도로. 이차 항체 용액에서 조직을 RT 또는 37°C에서 적어도 1시간 동안 배양한다.
참고: 타이밍은 사용되는 항체 및 조직의 두께에 따라 조절될 수 있다. 시안 염료를 함유하는 이차 항체(Cy3, Cy5, Alexa 647)는 사전 중합을 적용했을 때 ExM 프로토콜과 호환되지 않는다. 제안된 염료로는 알렉사 488(녹색), 알렉사 546(주황색/빨간색), Atto 647N 또는 CF633(원색)이 있습니다. DAPI는 확장 프로세스 중에 세척되기 때문에 확장 후 다시 적용해야 합니다. - 준비된 차단 완충제(또는 기타 바람직한 세척 완충제)로 조직을 RT에서 각각 10분 동안 3회 세척한다.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 슬라이드는 페트리 접시에 넣고 1x PBS로 덮고 4 °C에서 보관할 수 있습니다. - 기존의 광시야 현미경, 공초점 현미경 또는 기타 선택 된 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다.
참고: 이 단계는 확장 전 및 후 이미지를 비교하여 확장 계수를 사용하여 생물학적 길이를 결정하는 데 필요합니다. 확장 후 이미징을 용이하게 하기 위해 쉽게 식별할 수 있는 관심 영역을 선택하고 저배율과 높은 배율모두에서 이미지를 수집해야 합니다.
- 소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주위에 경계를 그려 조직을 덮는 데 필요한 용액의 부피를 최소화하십시오. 슬라이드를 슬라이드에 맞을 만큼 충분히 큰 접시에 놓습니다. 표준 3인치 슬라이드의 경우 100mm 페트리 접시를 사용하십시오.
3. 시편의 시투 중합
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고정 용액에 시편을 배양합니다.
- 알데히드 고정제로 고정된 시료의 경우 1x PBS로 AcX 스톡 솔루션을 0.03 mg/mL로 희석하거나 알데히드 고정제로 고정된 시료의 경우 0.1 mg/mL의 농도로 고정 용액을 준비합니다(일반적으로 250 μL은 조직 부분을 덮기에 충분합니다). , AcX와 반응할 수 있는 자유 아민이 적습니다.
- 슬라이드를 100mm 페트리 접시에 놓고 고정 용액을 조직 위에 파이펫합니다. RT에서 3시간 이상 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
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겔화 용액에서 샘플을 배양합니다.
- 겔화 용액의 적어도 100 배 과잉 볼륨을 준비하십시오. 200 μL당, 다음을 결합하여, 단량제 용액 188 μL, 0.5% 4HT 스톡 용액 4 μL(1:50 희석, 최종 농도: 0.01%), 10% TEMED 스톡 솔루션 4μL(1:50 희석, 최종 농도 0.2%), 10% APS 스톡 솔루션 4 μL(1:50 APS 스톡 솔루션) 희석, 최종 농도 0.2%).
참고: 겔화 용액은 사용하기 직전에 만들어야합니다. 용액은 4 °C에서 유지되어야하며 APS 용액은 조기 겔링을 방지하기 위해 마지막으로 첨가해야합니다. - 조직 섹션에서 여분의 용액을 제거하고 100mm 페트리 접시에 슬라이드를 놓습니다. 시료에 신선하고 차가운 겔화 용액을 추가하고 4 °C에서 30 분 동안 조직에 혼합물을 배양하여 용액을 조직으로 확산시도록하십시오.
- 겔화 용액의 적어도 100 배 과잉 볼륨을 준비하십시오. 200 μL당, 다음을 결합하여, 단량제 용액 188 μL, 0.5% 4HT 스톡 용액 4 μL(1:50 희석, 최종 농도: 0.01%), 10% TEMED 스톡 솔루션 4μL(1:50 희석, 최종 농도 0.2%), 10% APS 스톡 솔루션 4 μL(1:50 APS 스톡 솔루션) 희석, 최종 농도 0.2%).
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겔화 용액을 방해하지 않고 샘플 주위의슬라이드(그림 2A)에 챔버를 시공합니다.
- 다이아몬드 나이프를 사용하여 커버 유리의 조각을 얇게 절단하여 겔링 챔버용 스페이서를 만듭니다.
참고: 이미징 포스트 확장을 용이하게하기 위해, 스페이서는 조직 위의 빈 젤의 양을 줄이기 위해 조직 표본에 두께에 근접해야합니다. 번호 1.5 유리는 표준 임상 샘플 (5−10 μm)에 사용할 수 있습니다. 두꺼운 샘플을 위해 커버 유리 조각을 적층 할 수 있습니다. - 물방울(~10 μL)을 사용하여 조직의 양쪽에 스페이서를 고정합니다.
- 뚜껑 유리 뚜껑을 슬라이드 위에 조심스럽게 놓고 기포가 조직에 끼지 않도록하십시오(그림 2B).
- 다이아몬드 나이프를 사용하여 커버 유리의 조각을 얇게 절단하여 겔링 챔버용 스페이서를 만듭니다.
- 습한 환경(예: 젖은 물티슈로 닫힌 페트리 접시)에서 37°C에서 시료를 2시간 동안 배양합니다.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 슬라이드 챔버는 4°C에서 밀봉된 페트리 접시 내부에 보관될 수 있다.
4. 샘플 소화
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커버슬립 아래에 면도날을 부드럽게 밀어 내고 커버슬립을 젤 표면에서 천천히 들어 올려 겔링 챔버의 뚜껑을 제거합니다. 부피를 최소화하기 위해 티슈 주위에 빈 젤을 다듬습니다. 균질화 후 겔의 배향을 추적하기 위해 젤을 비대칭으로 자르고, 샘플이 투명해지기 때문에.
- 사용 전에 소화 완충제(최종 농도 4 U/mL)에서 ProK를 1:200씩 희석하십시오. 젤을 완전히 잠글 수있는 충분한 용액을 준비하십시오. 4웰 플라스틱 세포 배양 플레이트의 단일 웰은 웰당 적어도 3 mL을 필요로 합니다.
- 60°C에서 3시간 동안 소화 완충액을 포함하는 밀폐용기에 샘플을 인큐베이션한다. 시료가 소화 중에 슬라이드에서 분리되지 않으면 면도날을 사용하여 샘플을 부드럽게 제거합니다.
참고: 시편은 시료가 건조되는 것을 방지하기 위해 소화 버퍼에 완전히 잠겨 필름으로 밀봉 할 수있는 덮인 용기 (작은 슬라이드 상자, 플라스틱 우물, 페트리 접시 등)에 놓아야합니다.
5. 견본 확장 및 화상 진찰
- 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 원하는 이미징 시스템과 호환되는 용기에 시편을 1x PBS로 옮기고 완전히 확장된 젤을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큽합니다. 조직이 뒤집힌 시스템에 이미징하는 경우 또는 업라이트 시스템에 이미징하는 경우 시료 측을 아래로 배치하여 이미징 목표에서 샘플까지의 거리를 최소화해야 합니다. 필요한 경우 부드러운 페인트 브러시로 젤을 뒤집습니다.
참고: LED의 측면 조명을 사용하여 액체에 표시할 수 있습니다. 표준 6웰 플레이트는 직경이 0.6cm 미만인 시료를 수용할 수 있습니다. 유리 바닥 우물 플레이트는 반전 된 시스템에서 이미징에 사용해야합니다. - 샘플을 RT에서 1x PBS로 10분 동안 세척합니다. 원하는 경우, 소화 과정이 DAPI 얼룩을 씻어 내면서 300 nM DAPI로 샘플을 다시 염색하십시오. 300 nM DAPI로 PBS를 제거하고 RT에서 20 분 동안 1x PBS로 희석 한 다음 RT에서 1x PBS로 10 분 세척하십시오.
참고: 시료는 1x PBS로 덮고 다음 단계로 진행하기 전에 4°C에서 보관할 수 있습니다. - 샘플을 확장하려면 PBS를 교체하고 RT에서 각각 10 분 동안 ddH2O (최종 젤 부피의 최소 10 배)의 초과 부피로 3-5 회 세척하십시오.
참고: 3rd 또는 4세척 후, 표본의 확장은 고원에 시작해야합니다. 저장을 위해, 세균 성장을 방지하기 위해, ddH2O는 0.002%-0.01% 나트륨 아지드(NaN3)로보충될 수 있다. 이 경우 최종 확장 계수는 가역적으로 10% 감소합니다. - 기존의 광시야 현미경, 공초점 현미경 또는 기타 선택 된 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다.
참고: 젤이 표류하는 것을 방지하기 위해, 과잉 액체는 우물에서 제거 될 수있다. 젤은 또한 1.5-2% 저용융 아가로즈로 고정화될 수 있습니다. 용액의 부피의 2-4배인 용기에 물에 1.5-2%(v) 저용융 아가로스를 준비합니다. 용액을 용액을 용액을 녹이려면 40°C 수조 또는 전자레인지에서 10-20s로 데우면 됩니다. 젤의 가장자리 주위에 녹은 아가로오스를 피펫. 아가로즈가 RT 또는 4°C에서 경화하도록 허용한 후, 시료에 물을 추가하여 탈수를 방지합니다.
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Representative Results
프로토콜이 성공적으로 수행된경우(그림 1),샘플은 기계적 균질화 후 평평하고 투명한 겔로 나타나며(그림3A)물 속에서 3−4.5배의 비율로 확장할 수 있음(그림3B) ~70nm의 유효 분해능을 제공하는 최종 팽창계수 및 이미징 시스템은5,16을사용한다. 도 4는 ExPath 프로토콜을 사용하여 처리된 5 μm 두께의 FFPE 신장 샘플의 예시를 나타낸다. 겔화 된 샘플의 전체 팽창은 물에서 4.5 배 확장 인자를 초래하여 0.95 NA 목표를 사용하여 이미지 화 할 때 ~ 63 nm의 효과적인 분해능을 제공합니다. 조직은 먼저 파라핀을 제거하고 재수화(섹션 2.1.1)를 제거하기 위해 자일렌으로 사전 처리되었고,이어서 구연산염 완충액을 가진 항원 회수(섹션 2.2)를 하였다. 회수된 조직은 핵 DNA 및 밀 배아 글루티닌(WGA)을 시각화하기 위해 DAPI와 함께 알파 액티닌 4(ACTN4) 및 비멘틴에 대한 항체로 염색한 후 탄수화물에 라벨을 붙였다. 시편을 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 촬영한후(도 4A, B, D). 조직은 위의 프로토콜에 따라 처리되었고 물에서 완전히 팽창하였다(도4C,E). 유사하게, 도 5는 커버 글래스를 제거한 후 FFPE 샘플로 처리한 후 자일렌(섹션 2.1.2)으로 처리한 H&E 염색된 정상 유방 조직(도5A)의예를 나타낸다(섹션 2.1.1). 균질화 중에 H&E 얼룩이 조직에서 제거됩니다. 방적 디스크 공초점현미경(그림 5B)에서얻어진 DAPI 염색 샘플의 후 팽창 이미지는 사전 팽창 이미지와 비교하여 5.1의 팽창 계수를 나타내며, 이미지화시 ~43 nm의 효과적인 분해능을 제공합니다. NA 1.15 렌즈.
ExPath 프로토콜을 사용하여 처리된 고정되지 않은 냉동 신장 슬라이스에 대한 예는 도 6에서볼 수 있습니다. 조직은 먼저 차가운 아세톤 (섹션 2.1.3)에 고정하고 ACTN4, vimentin, DAPI 및 WGA로 염색되었습니다. 사전 확장(도시되지 않음)과 확장 후 이미지를 비교하면 확장 계수가 4.5임을 나타냅니다. 아세톤 고정 냉동 신장 샘플에서 FFPE 샘플의 비교 데이터(그림 4C, E)는항원성의 저하로 인해 발생할 수 있는 확장된 FFPE 샘플에서 ACTN4 염색의 품질이 저하된다는 것을 보여줍니다. 고정 방법16으로인해 .
그림 1: 확장 병리학(ExPath) 워크플로의 개략적. 임상적으로 보관된 조직 슬라이드의 전처리는 먼저 저장 형식에 기초하여 수행된다. 샘플은 종래의 면역 염색 프로토콜을 사용하여 염색되고 사전 확장 이미지가 수득됩니다. 샘플은 하이드로겔에 단백질을 고정시키기 위해 아크릴로일-X SE(AcX)로 처리됩니다. 체내 중합은 단백질아제 K(ProK)를 사용하여 기계적 균질화 이전에 미리 형성된다. 샘플은 이미징 전에 ddH2O에서 확장될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 병리학 견본을 위한 겔화 약실. (A)다이아몬드 나이프로 절단된 #1.5 커버 글래스 2개와 같은 2개의 스페이서가 4°C에서 겔화 용액으로 샘플을 인큐베이션한 후 조직의 양쪽에 놓습니다. 스페이서는 샘플의 압축을 방지하기 위해, 조직 조각보다 두껍게해야합니다. (B)#1.5 커버 유리의 조각과 같은 뚜껑은 37°C에서 배양 전에 시료를 덮는데 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 샘플 확장의 예. 5 μm 두께의 신장 샘플 후 균질화,(A)사전 및(B)ddH2O에서의 사후 팽창이 도시되어 있다. 그리드 사각형은 5mm x 5mm입니다.
도 4: 5 μm 두께의 FFPE 신장 샘플에서 대표적인 결과. (A)미리 확장된 이미지. (b)패널 A 및(C)에서관심 있는 윤곽영역의 확대 된 사전 팽창 이미지는 샘플이 완전히 물에 팽창 된 후 동일한 관심 영역의 해당 포스트 확장 이미지. (D)패널 B 및(E)에관심 있는 윤곽영역의 확대된 이미지는 샘플이 물에서 완전히 팽창된 후 동일한 관심 영역의 해당 포스트 확장 이미지. 라벨이 붙은 대상의 균열, 왜곡 및 손실은 부적절한 앵커링 및/또는균질화(F,G)의결과일 수 있습니다. 모든 이미지는 20x(NA 0.95; 수분 침지)목표(A-E,G)또는 10x(NA 0.5) 대물(F)을 가진 방적 디스크 공초점 현미경을 사용하여 수득하였다. 블루, DAPI; 녹색, 비멘틴; 빨간색, 알파 액티닌 4 (ACTN4); 마젠타, WGA. 배율 막대 = 100 μm(A, F, G,노란색 눈금 막대는 확장 후 이미지를 나타냅니다); 50 μm(B),50 μm(C,물리적 크기 포스트 확장 225 μm; 팽창 계수 4.5); 25 μm(D); 25 μm(E,물리적 크기 후 팽창 112.5 μm; 팽창 계수 4.5). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: H&E 염색된 정상 유방 조직에서 대표적인 결과. (A)40배(0.95 NA) 목적으로 촬영한 H&E 염색 된 조직의 브라이트필드 이미지. (B)시료가 물에 완전히 팽창된 후 동일한 관심 영역의 후 팽창 DAPI 이미지를. 영상은 40x(NA 1.15; 수몰입) 대물렌즈를 사용하여 방적 디스크 공초점 현미경으로 수득하였다. 스케일 바 = 10 μm(A,노란색 눈금 막대는 확장 후 이미지를 나타냅니다) 및 2 μm(B,물리적 크기 포스트 확장 50.1 μm; 팽창 계수 5.1). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 40x(NA 1.15; 수몰입) 목적으로 방적 디스크 공초점 현미경상에서 수득된 팽창 후 신선한 냉동 신장 샘플의 대표적인 결과. 파란색 = 비멘틴; 녹색 = 알파 액티닌 4 (ACTN4); 빨간색 = 콜라겐 IV; 회색 = DAPI. 스케일 바 = 10 μm (물리적 크기 포스트 확장 45 μm; 팽창 계수 4.5). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | 재고 농도 | 재고 량(mL) | 최종 농도 | 10 mL당 최종 금액 |
| 아크릴산 나트륨 | 0.380 g/mL | 2.25 | 0.086 g/mL | 0.86 g |
| 아크릴아미드 | 0.500 g/mL | 0.50 | 0.025 g/mL | 0.25 g |
| N,N′-메틸렌비사릴라미드 | 0.020 g/mL | 0.50 | 0.001 g/mL | 0.10 g |
| 염화나트륨 | 0.292 g/mL | 4.00 | 0.117 g/mL | 1.17 g |
| Pbs | 10배 | 1.00 | 1x | 1x |
| 물 | 1.15 | |||
| 총 볼륨 | 9.40 |
표 1: 단량체 용액의 구성 요소. 모든 농도는 PBS를 제외한 g/mL(w/v)으로 제공됩니다.
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Discussion
여기에서는 FFPE, H&E 스테인드 및 유리 슬라이드에 새로 얼어붙은 시편을 포함하여 병리학에 사용되는 가장 일반적인 유형의 임상 생검 샘플에 적용할 수 있는 proExM5의 변형인 ExPath 프로토콜16을제시합니다. 견본의 포맷 변환, 항원 회수 및 면역 염색은 ExPath에 특이적이지 않은 일반적으로 사용되는 프로토콜을 따릅니다. 원래 proExM 프로토콜9와는 달리, ExPath는 원래 ExPath 연구16에서입증 된 바와 같이, 포르말린 고정 조직의 확장을 향상 소화 버퍼에 EDTA의 높은 농도에 의존한다. 이 프로토콜은 5-10 μm 두께의 임상 시편16에서검증되었지만, 일부 변형을 통해 두꺼운 조직 샘플에도 적용될 수 있었다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 겔화 단계의 타이밍; 2) 겔화 챔버의 설치; 3) 샘플 균질화에 대한 매개 변수; 및 4) 젤의 취급.
이 프로토콜에 대한 가장 중요한 매개 변수는 겔화 단계의 타이밍입니다. 겔화 용액이 조기에 중합되면, 샘플은 겔 매트릭스에 충분히 고정되지 않을 것이다. 부적절한 앵커링 및 조기 겔화는 왜곡을 일으키고, 확장을 제한하며, 표적 분자의 손실을 초래할 수있다(그림 4F,G). 겔화의 개시는 온도에 따라 달라지므로 표적 시편에 놓기 전에 혼합 겔링 용액을 4°C로 유지하는 것이 중요합니다. 이니시에이터, APS는 겔화 용액을 적용하기 전에 신선하게 제조되고 즉시 첨가되어야 한다. APS는 RT에서 안정적이지 않으며 동결 해동 주기를 겪은 후 효능을 잃을 수 있습니다. 불충분한 앵커링은 또한 장기간 보관 후 또는 물과접촉한 후 활성을 잃을 수 있는 앵커링 화합물, AcX의 반응성 감소의 결과일 수 있다. AcX는 -20°C에서 건조된 환경에서 6개월 간 보관한 후 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌습니다. 조기 겔화가 왜곡의 의심되는 원인이 아닌 경우 AcX의 새로운 재고 솔루션을 준비 할 수 있습니다.
겔화 챔버를 설정하는 동안 기포가 커버 유리 뚜껑 아래에 갇힐 수 있습니다. 이러한 기포가 샘플 위에 있거나 직접 닿으면 왜곡이 발생할 수 있습니다. 그들은 챔버의 측면을 통해 더 많은 겔화 용액을 추가하여 시편에서 멀리 이동할 수 있습니다. 기포를 방지하기 위해, 겔화 용액의 작은 방울은 조직 위에 배치하기 전에 뚜껑에 증착 될 수있다.
견본 소화는 시간, 온도, 및 조직 성질, 예: 두께 및 조직 모형에 달려 있습니다. 부적절한 소화는 또한 왜곡을 일으키고 예상보다 작은 팽창 계수를 초래할 수 있습니다. 불완전한 소화가 의심되는 경우에, 소화 시간 및/또는 ProK 사격량은, 특히 두꺼운 조직의 경우에 증가될 수 있습니다. ProK는 또한 시간이 지남에 따라 활동을 잃을 수 있습니다. 활성을 보존하기 위해 ProK는 -20 °C에 보관해야 하며 자유 해동 주기를 피하기 위해 더 작은 부피로 aliquoted할 수 있습니다.
균질화된 시료를 취급할 때, 특히 완전히 팽창할 때는 주의를 기울여야 합니다. 시편이 액체에 잠겨 있을 때 찾기 어려운 경우 용기를 다른 각도에서 비추면 입사광이 산란되어 겔을 시각화할 수 있습니다. 완전히 확장된 젤은 깨지기 쉽고 취급 중에 파손될 수 있습니다. 팽창 된 젤을 옮기려면 부드러운 브러시와 플라스틱 주걱을 사용하는 것이 좋습니다.
ExPath 프로토콜은 임상 생검 표본에서 나노 스케일 구조를 심문하는 현재의 초고해상도 이미징 및 전자 현미경 기술에 대한 비용 효율적인 대안을 제공합니다. ProK는 균질화 후 시료의 균균일한 확장을 제공하지만, 단백질의 손실은 확장 후 관심있는 다른 표적의 심문을 방지합니다. 그러나, 프로토콜은 임의의 일반 습식 실험실에서 용이하게 수행될 수 있다. 가장 중요한 것은, 나노 규모의 특징의 화상 진찰은 생물학 실험실 및 화상 진찰 핵심 시설에서 일반적으로 찾아내는 전통적인 광시야 또는 공초점 현미경에서 수행될 수 있습니다.
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Disclosures
YZ 및 OB는 여기에 기재된 기술의 하위 집합에 대해 특허 보호를 출원하고 획득한 발명자 중 2명입니다(미국 특허 US20190064037A1, WO2018157074A1 및 WO201815704A1 및 WO201815704A1).
Acknowledgments
이 작품은 카네기 멜론 대학에서 학부 창업 기금에 의해 지원되었다 (YZ) 및 NIH 이사의 새로운 혁신 상 (DP2 OD025926-01 YZ에).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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