Summary
ננו הדמיה של דגימות רקמה קלינית יכול לשפר את ההבנה של פתוגנזה מחלה. הרחבת פתולוגיה (ExPath) היא גרסה של התפשטות מיקרוסקופ (Expath), שונה עבור תאימות עם דגימות רקמה קלינית סטנדרטית, כדי לחקור את תצורת הננו-סקאלה של biomolecules באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונאלי עקיפה מוגבלת.
Abstract
בפתולוגיה המודרנית, מיקרוסקופ אופטי ממלא תפקיד חשוב באבחון המחלה על ידי חשיפת מבנים מיקרוסקופיים של דגימות קליניות. עם זאת, מגבלת העקיפה הפיזית הבסיסית מונעת חקירה של אנטומיה ננו-סקאלה ושינויים פתולוגיים עדינים בעת שימוש בגישות הדמיה אופטית קונבנציונאלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וזול, הנקרא פתולוגיה הרחבה (ExPath), עבור הדמיה של ננו-סולם אופטי של סוגים נפוצים של דגימות הרקמה הראשונית קליני, כולל מוקפאו קבוע או formalin מוטבע הרקמה (FFPE) סעיפים. שיטה זו מרחיבה את מגבלת העקיפה האופטית באמצעות שינוי כימי של דגימות הרקמה לתוך רקמת-הידרוג'ל היברידית והרחבת הפיזית אותם באמצעות סולמות מרובים במים טהורים. בשל התרחבות, מולקולות שאינן פתירה בעבר מופרדות ובכך ניתן להבחין באמצעות מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי.
Introduction
חקירת הארגון המולקולרי של רקמות בהקשר תלת מימדי (3D) יכול לספק הבנה חדשה של פונקציות ביולוגיות ופיתוח מחלות. עם זאת, סביבות ננומטרי אלה הם מעבר ליכולות הפתרון של עקיפה מוגבלת של מיקרוסקופים קונבנציונאלי (200-300 ננומטר), שם מרחק מינימלי לפתירה, d מוגדר על ידי d α λ/NA. כאן λ הוא אורך הגל של האור na הוא הפתח המספרי (NA) של מערכת ההדמיה. לאחרונה, הדמיה ישירה של מולקולות בעלי תווית fluorescently התאפשרה על-ידי החדש שפותחו ברזולוציה סופר טכניקות הדמיה1,2,3, כולל ממריצים פליטה מאולצת (ההיסטד), מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-מופעל (PALM), מיקרוסקופ שחזור (סטורם) סטוכסטי, ומיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM). למרות טכניקות הדמיה אלה יש מהפכה הבנה של תפקוד ביולוגי בקנה המידה, בפועל, הם לעתים קרובות להסתמך על ציוד יקר ו/או מיוחדים ועיבוד התמונה שלבים, יכול להיות זמן הרכישה איטי יותר השוואת ל הדמיה אופטית קונבנציונאלי, דורשים fluorophores עם מאפיינים ספציפיים (כגון יכולת מיתוג תמונה ו/או פוטויציבות גבוהה). בנוסף, הוא נשאר אתגר לבצע 3D ברזולוציה סופר הדמיה על דגימות רקמות.
מיקרוסקופ הרחבה (ExM), הוצג לראשונה בשנת 20154, מספק אמצעי חלופי של תכונות ננו הדמיה (< 70 ננומטר) על ידי הרחבה פיזית דגימות שנשמרו מוטבע בתוך הידרו פוליליטי swellable. כאן, מפתח biomolecules ו/או תוויות מעוגנים באתרו לרשת פולימר שניתן isotopically מורחב לאחר עיבוד כימי. מכיוון שהרחבת הגוף מגבירה את הרזולוציה האפקטיבית הכוללת, ניתן לפתור את מולקולות הריבית באמצעות מערכות הדמיה מוגבלות-עקיפה. מאז הפרסום של הפרוטוקול המקורי, שם תוויות פלורסנט מסונתז מותאם אישית היו מעוגנים לרשת פולימר4, אסטרטגיות חדשות שימשו ישירות עוגן חלבונים (חלבון שימור exm, או proExM)5, 6,7,8,9 ו-RNA9,10,11,12 להידרוג'ל, והגדל את ההגדלה הפיזית באמצעות איטרטיבי התרחבות13 או התאמת הכימיה ג'ל8,14,15.
כאן אנו מציגים גרסה מותאמת של proExM, נקרא פתולוגיה הרחבה (ExPath)16, אשר כבר אופטימיזציה עבור תבניות פתולוגיה קלינית. הפרוטוקול ממיר דגימות קליניות, כולל פורמאלין קבוע-פרפין-מוטבע (FFPE), המטאוקסילין ו אאוזין (H & E) ויטראז, וטרי-קפואים רקמות האדם הרכוב על שקופיות זכוכית, למצב תואם ExM. חלבונים מעוגנים אז ההידרוג'ל והומוגון מכני מבוצעת (איור 1)16. עם 4-מקפלים הרחבה ליניארית של דגימות, ברזולוציה ססגוניות (~ 70 nm) תמונות ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית יקוד קונבנציונאלי שיש רק ברזולוציה של ~ 300 ננומטר והוא יכול גם להיות משולב עם טכניקות אחרות סופר ברזולוציה הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים מניות ופתרונות
-
הכן רכיבי פתרון.
הערה: ריכוזי פתרונות מקבלים g/mL (w/v אחוזים).- הפוך את פתרונות המניה הבאים: 38% (w/v) נתרן אקריל (SA), 50% (w/v) אקרילאמיד (AA), 2% (w/v) N, N′-מתיונין (Bis), ו 29.2% (w/v) נתרן כלוריד (הנאל). מפזר את התרכובות במים האחרים כפליים (ddH2O). השתמש בסכומים בטבלה 1 כהפניה; פתרונות מוכנים ניתן לשנות בנפח כנדרש. לדוגמה, כדי להפוך 10 mL של 38% (w/v) פתרון SA, להוסיף 1.9 g SA לגליל בוגר 10 mL ולהוסיף ddH2O לנפח של 5 מ ל.
- הכינו 9.4 mL של תמיסת מונומר בריכוז 1.06 x כפי שמוצג בטבלה 1.
הערה: פעולה זו תגרום לריכוז של 1 x לאחר הוספת יוזם, מאיץ ומעכב. ניתן לאחסן את מלאי המונומר ב-4 ° צ' עד 3 חודשים, או ב-20 ° c לאחסון לטווח ארוך. - הכינו את פתרונות המניה הבאים בנפרד ב-ddh2O: 0.5% (w/v) של המעכב 4-הידרוxy-2, 2, 6, 6-טטרמתיד-1-אוקסיל (4ht), המעכב את הגגנציה כדי לאפשר דיפוזיה של הפתרון לרקמות, 10% (v/v) של ה מאתחל הטטרמתיליפילואמין (temed), אשר מאיצה את הדור הרדיקלי על ידי אמוניום פרסולפט (APS), ו 10% (w/v) גישה אשר יוזם את תהליך הגילינג.
הערה: פתרונות מניות של 4HT ו-TEMED יכול להיות מוכן 1 mL ali, ומאוחסן ב-20 ° c לפחות 6 חודשים. APS נמצא לאבד את היעילות לאחר אחסון ארוך טווח והוא מוכן הטוב ביותר בכמויות קטנות (< 0.1 מ ל) מיד לפני הגילינג.
- הכנת מאגר העיכול (50 mM Tris pH 8.0, 25 מ"מ EDTA, 0.5% [w/v] nonionic סורסטנט, 0.8 M הנאל) על ידי שילוב של 25 מ ל של 1 M Tris pH 8 (3.03 g של בסיס טריס 25 מ ל של ddH2O), 25 מ ל של edta (0.5 M pH 8) , 2.25 גרם של הנאאוניסטנט nonionic, ו 23.38 g של הנאל. הוסף ddH2O עבור נפח כולל של 500 mL.
הערה: ניתן לשנות את הפתרון למעלה או למטה לפי הצורך ולאחסנם ב-4 ° c. פרוטאינאז K (ProK) יתווספו מיד לפני שלב העיכול. - הכינו 20 מ"מ תמיסת נתרן ציטראט על ידי שילוב 2.941 g של נתרן ציטראט tribasic dihydrate עם 500 mL של ddH2O והתאמת ה-pH ל8.0 בטמפרטורת החדר (RT). הרחב את נפח המניה לפי הצורך.
- להכין פתרון מניות של 6-((אקרילי) הקסאנואית חומצה, סוכנימידידיל אסתר (אקריל-X, SE; בכורה) AcX), מתחם עיגון. התמוססות AcX ב 500 μL של מסולפוקסיד (DMSO) עבור ריכוז סופי של 10 מ"ג/mL.
הערה: הפתרון יכול להיות מאוחסן בסביבה מיובש ב-20 ° c ב 20 μL. - אם לא נעשה שימוש במאגרים מסחריים זמינים לצורך כתמים, הכן מאגר חסימות. השתמש במאגר חסימה של 5% (v/v) סרום בעלי חיים רגיל ו 0.1% (w/v) nonionic החומרים ב-1x פוספט מאגר מלוחים (PBS) ולבחור את הנסיוב המבוסס על החיה המארחת של הנוגדנים המשני. לדוגמה, כדי להכין את מאגר חסימת 500 mL עבור נוגדנים שהועלו עזים, לשלב 25 מ ל של סרום עז, 0.45 g של nonionic סורסטנט, ו-1x PBS לנפח של 500 mL.
2. הכנת שקופיות רקמות קליניות מהארכיון וטריות עבור ExPath
- המר את הרקמה לתבנית תואמת ExPath. בחר באחד מארבעת השלבים הבאים (2.1.1-2.1.4) בהתבסס על אופן ההכנה של הדגימה: מגלשות FFPE, שקופיות מוכתמות של FFPE, או שקופיות של רקמות קפואות או קבועות מראש בתמיסה מיטבית לחיתוך טמפרטורה (OCT).
הערה: התקנים אלה מבוססים על שלבי שחזור סטנדרטיים עבור דגימות פתולוגיה ואינם ספציפיים לפרוטוקול ExPath.- FFPE דגימות קליניות
- הכינו 30 מ ל של 95% אתנול, 70% אתנול, ו 50% אתנול. למדוד את 30 מ ל של קסילין, 100% אתנול, ו ddH2O.
- מניחים את השקופית עם המדגם ב 50 mL באמצעות מלקחיים ולהוסיף 15 מ ל של קסילין. Cap את הצינור ומניחים אותו אופקית על שייקר מסלולית ב כ 60 rpm ו-דגירה ב RT עבור 3 דקות עבור כל פתרון. . אני חוזר עם השאר 15 מ"ל
- חזור על שלב 2.1.1.2 עם 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול, 50% אתנול ו-ddH2O במקום xylene.
- שקופיות קבועות ומוכתמות
- מניחים את השקופית בצלחת פטרי 100 מ"מ ומכסה עם קסילן. הסר בזהירות את הכיסויים בעזרת להב גילוח. אם הכיסויים לא יוסרו בקלות, החזר את השקופית לקסילין עד שהפתק משתחרר.
- תהליך באמצעות השלבים עבור דגימות FFPE (שלבים 2.1.1.1-2.1.1.3).
הערה: במקרה של H & E שקופיות ויטראז ', הכתמים מסולקים במהלך תהליך ההתרחבות.
- שקופיות רקמות קפואות שאינן קבועות בפתרון OCT
- תקן את הרקמה באצטון ב-20 ° c עבור 10 דקות.
- שטוף את הדגימות עם פתרון PBS 1x 3 פעמים עבור 10 דקות כל אחד ב RT.
- שקופיות של רקמה קלינית שתוקנה בעבר
- מודיית את השקופיות עבור 2 דקות ב-RT כדי להמיס את הפתרון OCT.
- שטוף את המדגם עם פתרון PBS 1x 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
- FFPE דגימות קליניות
- בצע טיפול בחום עבור אחזור אנטיגן על כל הדגימות לאחר ההמרה בפורמט.
- הוסף 20 מ"מ פתרון ציטראט (pH 8 בשעה RT) במיכל עמיד בחום, כגון צנצנת מכתים שקופיות.
הערה: צריך להיות מספיק פתרון כדי לכסות את הרקמה רכוב על השקופית (50 mL עבור צנצנת מכתים שקופית רגילה). - מחממים את התמיסה הציטראט ל 100 ° c במיקרוגל ומניחים את השקופית בתמיסה. מיד להעביר את המיכל לחדר הדגירה והדגירה ב 60 ° c עבור 30 דקות.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. ניתן למקם שקופיות בצלחות פטרי ולכסות ב-1x PBS ולאחסן ב -4 ° c.
- הוסף 20 מ"מ פתרון ציטראט (pH 8 בשעה RT) במיכל עמיד בחום, כגון צנצנת מכתים שקופיות.
- הכתם את המדגם באמצעות הפרוטוקולים הסטנדרטיים של הimmunofluorescence (IF)/אימונוהיסטוכימיה (IHC) מכתים.
הערה: ריכוזי נוגדנים ראשיים ומשניים ומשכי זמן מכתים תלויים בריכוזים המוצעים על ידי היצרן או באמצעות אופטימיזציה לניסוי הספציפי.- השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר גבול סביב הרקמה (s) בשקופית כדי למזער את נפח הפתרון הדרוש כדי לכסות את הרקמה. מקם את השקופית במנה גדולה מספיק כדי להתאים לשקופית. עבור שקופית סטנדרטית בגודל 3 אינץ ', השתמש בצלחת פטרי 100 מ"מ.
הערה: עט ההידרופובי אינו מפריע לפילמור המדגם או לתהליך העיכול. - מודלת את הרקמה עם חסימה מאגר עבור 1 h ב 37 ° צ', 2 h ב RT, או 4 ° צלזיוס ללילה כדי להפחית את הכריכה לא ספציפית.
- דלל את הנוגדנים הראשוניים לריכוז הרצוי בכמות המתאימה של מאגר חסימת מוכן (או מאגר כתמים מועדף אחר). דגירה את הרקמות עם פתרון הנוגדן העיקרי עבור לפחות 3 h ב RT או 37 ° c, או לילה ב 4 ° c.
הערה: יש להניח דגימות במיכל מחולל לחות (כגון צלחת פטרי עם מחיקה לחה) כדי למנוע ייבוש של הרקמה. בדרך כלל, הנוגדנים מדוללים ל-1:100-1:500 ב 200 ל-500 μL של מאגר, בהתאם לגודל הרקמה והנוגדן המשמשים. - שטוף את הרקמה עם מאגר חוסם מוכן (או מאגר כביסה מועדף אחר) 3 פעמים עבור 10 דקות ב RT.
- לדלל נוגדנים משניים (ו 300 nM 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול [DAPI] אם תרצה), במאגר מוכן חסימה (או מאגר כתמים אחרים מועדף) לריכוז של כ 10 μg/mL. מודטת את הרקמה בפתרון נוגדן משני עבור לפחות 1 h ב RT או 37 ° c.
הערה: התזמון עשוי להיות מותאם בהתאם לנוגדנים המשמשים ואת עובי הרקמה. נוגדנים משניים המכילים cyanine צבעים (Cy3, Cy5, אלקסה 647) אינם תואמים לפרוטוקול ExM בעת החלתם מראש-פילמור. הצבעים המוצעים כוללים אלקסה 488 (ירוק), אלקסה 546 (כתום/אדום), ו Atto 647N או CF633 (הרחק-אדום). על DAPI להיות מוחלים מחודש לאחר התרחבות, מכיוון שהוא נשטף במהלך תהליך ההרחבה. - שטוף את הרקמה עם מאגר חוסם מוכן (או מאגר כביסה מועדף אחר) 3 פעמים עבור 10 דקות כל אחד ב RT.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. ניתן למקם שקופיות בצלחות פטרי ולכסות ב-1x PBS ולאחסן ב -4 ° c. - לבצע דימות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ רגיל שדה רחב, מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, או מערכת הדמיה אחרת של הבחירה.
הערה: שלב זה נדרש לקביעת אורך ביולוגי באמצעות מקדם ההרחבה על-ידי השוואת תמונות טרום ושלאחר הרחבה. כדי להקל על הדמיה פוסט-הרחבה, יש לבחור אזורי עניין בקלות, ותמונות בהגדלה הנמוכה והגבוהה יש לאסוף.
- השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר גבול סביב הרקמה (s) בשקופית כדי למזער את נפח הפתרון הדרוש כדי לכסות את הרקמה. מקם את השקופית במנה גדולה מספיק כדי להתאים לשקופית. עבור שקופית סטנדרטית בגודל 3 אינץ ', השתמש בצלחת פטרי 100 מ"מ.
3. באתרו של דגימות
-
דגירה הדגימה בעיגון פתרון.
- להכין את הפתרון עיגון (בדרך כלל 250 μL מספיק כדי לכסות את מקטע הרקמה) על ידי דילול הפתרון מניות AcX ב-1x PBS לריכוז של 0.03 mg/mL עבור דגימות קבוע עם שאינם אלדהיד fixatives או 0.1 mg/mL עבור דגימות קבוע עם מבצעים של אלדהיד , אשר יש פחות אמינים חופשי זמין להגיב עם acx.
- מניחים את השקופית בצלחת פטרי 100 מ"מ ופיפטה את הפתרון לגבי הרקמה. דגירה לפחות 3 h ב RT או לילה ב 4 ° c.
-
מודאת הדגימות. בתמיסה של הגלינג
- הכינו לפחות את הנפח העודף של מ100 הפתרונות. לכל 200 μl, לשלב את הבאים, על מנת: 188 μl של פתרון מונומר, 4 μl של 0.5% 4ht פתרון מניות (1:50 דילול, ריכוז סופי: 0.01%), 4 μl של 10% מניות הפתרון temed (1:50 דילול, ריכוז סופי 0.2%), ו 4 μl של 10% פתרונות מניות APS (1:50 דילול, ריכוז סופי 0.2%).
הערה: יש לעשות באופן מיידי את הפתרון של הגלינג. יש לשמור על הפתרון ב -4 ° c והפתרון APS צריך להתווסף אחרון, כדי למנוע הגלינג מוקדם. - להסיר את הפתרון העודף מתוך מקטע הרקמה ולמקם את השקופית בצלחת פטרי 100 מ"מ. הוסיפו את התמיסה הטרייה והקרה למדגם, ומשם את התערובת על הרקמה למשך 30 דקות ב -4 ° c, כדי לאפשר דיפוזיה של פתרון לתוך הרקמה.
- הכינו לפחות את הנפח העודף של מ100 הפתרונות. לכל 200 μl, לשלב את הבאים, על מנת: 188 μl של פתרון מונומר, 4 μl של 0.5% 4ht פתרון מניות (1:50 דילול, ריכוז סופי: 0.01%), 4 μl של 10% מניות הפתרון temed (1:50 דילול, ריכוז סופי 0.2%), ו 4 μl של 10% פתרונות מניות APS (1:50 דילול, ריכוז סופי 0.2%).
-
בנו תא בשקופית סביב המדגם (איור 2א) מבלי להפריע לפתרון הגלינג.
- הפוך את הרווחים לחדר הגילינג באמצעות כיסוי דק של חתיכות זכוכית מכוסות בסכין יהלום.
הערה: כדי להקל על הרחבת לאחר הדמיה, מרווחים צריך להיות קרוב עובי הדגימה כדי להפחית את כמות ג'ל ריק מעל הרקמה. מספר 1.5 זכוכית ניתן להשתמש עבור דגימות קליני סטנדרטי (5-10-0 μm). כיסוי חתיכות זכוכית יכול להיות מוערמים עבור דגימות עבות. - אבטח את הרווחים משני צדי הרקמה באמצעות טיפות מים (~ 10 μL).
- הציבו בזהירות מכסה זכוכית מכסה על השקופית, והקפידו להימנע מהשמנה של בועות אוויר על הרקמה (איור 2ב').
- הפוך את הרווחים לחדר הגילינג באמצעות כיסוי דק של חתיכות זכוכית מכוסות בסכין יהלום.
- מודחת המדגם ב 37 ° c בסביבה מחולל לחות (כגון צלחת פטרי סגורה עם ניגוב לח) עבור 2 h.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. ניתן לאחסן את תא השקופיות בתוך צלחת פטרי אטומה ב -4 ° c.
4. לדוגמה העיכול
-
הסר את המכסה של חדר הגילינג על ידי הזזת בעדינות להב תער מתחת לכיסוי ולהרים באיטיות את הכיסויים ממשטח ג'ל. חתוך את ג'ל ריק סביב הרקמה כדי למזער את עוצמת הקול. חותכים את ג'ל סימטרית כדי לעקוב אחר כיוון הג לאחר הומוגון, שכן המדגם יהפוך שקוף.
- לדלל ProK ידי 1:200 בתוך מאגר העיכול (ריכוז סופי 4 U/mL) לפני השימוש. הכינו פתרון מספיק כדי להטביע לחלוטין את הג; באר יחידה של לוח פלסטיק ארבע היטב התרבות תאים דורש לפחות 3 מ ל לכל טוב.
- מודג את המדגם במיכל סגור המכיל את מאגר העיכול עבור 3 h ב 60 ° c. אם המדגם אינו מתנתק מהשקופית במהלך העיכול, השתמש בלהב גילוח כדי להסיר בעדינות את המדגם.
הערה: המדגם צריך להיות שקוע לחלוטין בתוך מאגר העיכול כדי למנוע את הדגימה מייבוש ולהציב מכולה מקורה (תיבת שקופית קטנה, היטב פלסטיק, צלחת פטרי, וכו ') כי ניתן לחתום עם הסרט.
5. מדגם הרחבה והדמיה
- השתמשו במברשת צבע רכה כדי להעביר את הדגימה לתוך 1x PBS במיכל התואם את מערכת ההדמיה הרצויה ומספיק גדול כדי להכיל את הג המורחב במלואו. ודא כי הרקמה ממוקמת עם המדגם-בצד למטה אם הדמיה על מערכת הפוכה או למעלה אם הדמיה על מערכת זקופה כדי למזער את המרחק ממטרת הדמיה למדגם. הפוך את הג באמצעות מברשת צבע רכה במידת הצורך.
הערה: ניתן להשתמש בתאורה מתוך נורית LED כדי להפוך אותם לגלויים בנוזל. תקן 6-באר הצלחת יכול להכיל דגימות שיש להם קוטר מורחב מראש פחות מ 0.6 ס מ. צלחת זכוכית קרקעית היטב יש להשתמש עבור דימות על מערכת הפוכה. - רוחצים את הדגימות ב-1x PBS ב RT עבור 10 דקות. במקרה הצורך, הכתם מחדש את המדגם עם 300 ננומטר DAPI כתהליך העיכול שוטף משם את הכתם DAPI. הסרת PBS וכתם עם 300 ננומטר DAPI מדולל 1 x PBS עבור 20 דקות ב RT, ואחריו 10 דקות לשטוף עם 1 x PBS ב RT.
הערה: ניתן לכסות את הדגימות ב-1x PBS ומאוחסנות ב -4 ° c לפני שממשיכים לשלב הבא. - כדי להרחיב את הדגימות, להחליף את ה-PBS ולשטוף עם נפח עודף של ddH2O (לפחות 10x הנפח ג'ל הסופי) 3-5 פעמים עבור 10 דקות כל אחד, ב RT.
הערה: לאחר השטיפההשלישית אוהרביעית, הרחבת הדגימה צריכה להתחיל במישור. כדי לאחסן, כדי למנוע גידול חיידקי, את ddh2O יכול להיות שיושלם עם 0.002%-0.01% נתרן אזיד (נאן3). במקרה זה, מקדם ההתרחבות הסופי מופחת ב -10%. - לבצע הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ רגיל שדה רחב, מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, או מערכת הדמיה אחרת של הבחירה.
הערה: כדי למנוע מפני ג ' לים נסחף, עודף נוזל ניתן להסיר מן הבאר. ג ' לים יכולים גם להיות מקיבוע עם 1.5-2% נמוך-להמיס agarose. הכינו 1.5-2% (w/v) ממיסים במים במיכל 2 פי 4 מנפח הפתרון. חמם את הפתרון באמבט מים ב40 ° c או במיקרוגל במשך 10-20-עשרים להמיס את התמיסה. פיפטה את הצמח הנמס. מסביב לקצות הג לאחר התרת הצמח להרדן ב-RT או 4 ° צ', הוסיפו מים למדגם כדי למנוע התייבשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אם הפרוטוקול בוצע בהצלחה (איור 1), דגימות יופיעו כג שטוח ושקוף לאחר המגון מכני הגון (איור 3א) והוא יכול להתרחב בפקטור של 3-4.5 x במים (איור 3ב), מתן רזולוציה אפקטיבית של ~ 70 ננומטר בהתאם לגורם ההתרחבות הסופי ומערכת הדמיה בשימוש5,16. איור 4 מציג תמונות לדוגמה של דגימת כליות ffpe עבה בעובי 5 יקרומטר המעובדות באמצעות הפרוטוקול expath. התרחבות מלאה של דגימות ג הביא גורם התרחבות 4.5 x במים, מתן רזולוציה אפקטיבית של ~ 63 ננומטר כאשר התמונה באמצעות היעד 0.95 NA. הרקמה הראשונה שעובדו מראש עם קסילן להסיר פרפין ומהתייבשות (סעיף 2.1.1), ואחריו אנטיגן-איחזור עם מאגר ציטראט (סעיף 2.2). הרקמה המשוחזרת היה אז מוכתם עם נוגדנים עבור אלפא אקטינב 4 (ACTN4) ו vimentin, יחד עם DAPI להמחיש DNA גרעיני ונבט החיטה ציטינב (WGA), כדי לתייג פחמימות. הדגימה היתה לאחר מכן בתמונה באמצעות מיקרוסקופ הדיסק המסתובב מסתובב (איור 4a, B, D). הרקמות טופלו בעקבות הפרוטוקול הנ ל והורחב לחלוטין במים (איור 4ג, E). באופן דומה, איור 5 מראה תמונות לדוגמה of H & E מוכתם רקמת שד רגילה (איור 5א) כי טופלה עם קסילן (סעיף 2.1.2) כדי להסיר את הזכוכית המכסה ולאחר מכן טיפל כמדגם ffpe (סעיף 2.1.1). במהלך המגון, הכתם H & E מסולק מן הרקמה. לאחר הרחבת תמונות של מדגם DAPI ויטראז ' שהתקבלו על מיקרוסקופ מסתובב בדיסק (איור 5ב) לעומת תמונות טרום התרחבות מצביעים על מקדם הרחבה של 5.1, מתן רזולוציה אפקטיבית של ~ 43 nm כאשר התמונה עם העדשה NA 1.15.
ניתן לראות נתונים לדוגמה עבור פרוסות כליות מוקפאות שלא תוקנו באמצעות פרוטוקול ExPath באיור 6. הרקמה היה קבוע לראשונה אצטון קר (סעיף 2.1.3) ומוכתם עם ACTN4, vimentin, DAPI, ו-WGA. השוואת טרום התרחבות (לא מוצג) ותמונות שלאחר ההרחבה מציינות גורם התרחבות של 4.5. נתונים השוואה מתוך הדגימות אצטון קבוע כליות קפוא על זה של דגימות FFPE (איור 4ג, E) מראה כי יש ירידה באיכות של ACTN4 הצביעת במדגם ffpe המורחבת, אשר עשוי להיות בשל השפלה של האנטיגניות בשל שיטת הקיבוע16.
איור 1: סכמטית של זרימת העבודה של ההרחבה (ExPath). טרום עיבוד של שקופיות רקמה קלינית בארכיון מבוצעת לראשונה בהתבסס על פורמט האחסון. דגימות מוכתמות לאחר מכן באמצעות פרוטוקולי חיסוני קונבנציונלי ותמונות טרום התרחבות מתקבלים. לאחר מכן, הדגימות מטופלות עם אקרילי-X SE (AcX) כדי לעגן חלבונים להידרוג'ל. ב באתרו הפלוניזציה מראש לפני המגון מכני באמצעות פרוטטינואז K (ProK). לאחר מכן ניתן להרחיב דגימות ב-ddH2O לפני הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תא גלגנציה לדגימות פתולוגיה. (א) שני מרווחים, כגון שתי חתיכות של כיסוי #1 0.5 זכוכית לחתוך עם סכין יהלום, ממוקמים משני צדי הרקמה לאחר המסלקת את המדגם בפתרון הגלינג ב 4 ° c. הרווחים צריכים להיות עבים יותר מאשר פרוסות הרקמה, כדי למנוע דחיסה של המדגם. (ב) מכסה, כגון פיסת זכוכית מכסה #1 0.5, משמש לכיסוי המדגם לפני הדגירה ב-37 ° c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דוגמה להרחבת המדגם. A 5 יקרומטר כליה עבה לדוגמה לכתוב המגון, (א) טרום ו (ב) פוסט התרחבות ב ddh2O מוצג. ריבועים הרשת הם 5 מ"מ x 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות הנציג מתוך 5 יקרומטר עבה דגימות כליות ffpe. (A) תמונה שלפני הרחבה. (ב) הוגדל לפני התרחבות תמונת האזור המתואר בלוח A ו-(ג) התמונה המקבילה שלאחר ההרחבה של אותו אזור מעניין לאחר שהדוגמא הורחבה במלואו במים. (ד) תמונה מוגדלת של אזור העניין המתואר בלוח B ו-(ה) התמונה שלאחר התרחבות המקבילה של אותו אזור מעניין לאחר שהדוגמא הורחבה במלואו במים. פיצוח, עיוותים, ואובדן של מטרות שכותרתו יכול להיות תוצאה של עיגון מספיק ו/או הומוזציה (F, G). כל התמונות הושגו באמצעות מיקרוסקופ הדיסק המסתובב מסתובב עם 20x (NA 0.95; טבילה מים) מטרה (a-E, G) או 10X (NA 0.5) המטרה (F). כחול, DAPI; ירוק, vimentin; אדום, אלפא-אקב 4 (ACTN4); מגנטה, WGA. סרגל שורות משנה = 100 יקרומטר (A, F, G, ברים בקנה מידה צהוב מציינים תמונות שלאחר הרחבה); 50 יקרומטר (ב), 50 יקרומטר (C, הרחבת גודל פיזי לאחר 225 יקרומטר; גורם ההרחבה 4.5); 25 יקרומטר (D); 25 יקרומטר (E, הרחבת הגודל הפיזי post 112.5 יקרומטר; גורם הרחבה 4.5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות הנציג מ H &Amp; E מוכתם רקמת שד נורמלית. (א) ברייטפילדהתמונה של מורחב מראש ה& E רקמה ויטראז נלקח עם 40x (0.95 NA) המטרה. (ב) תמונת dapi שלאחר ההרחבה של אותו אזור מעניין לאחר שהדוגמא הורחבה במלואו במים. התמונה הושגה על מיקרוסקופ הדיסק מסתובב קונפוקלית וקד באמצעות 40x (NA 1.15; טבילה מים) המטרה. קנה מידה ברים = 10 יקרומטר (A, הסרגל הצהוב בקנהמידה מציין תמונות שלאחרהרחבה) ו 2 יקרומטר (ב, בגודל הפיזי post הרחבה 50.1 יקרומטר; גורם הרחבה 5.1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תוצאות הנציג של דגימות כליות טריים קפואים לאחר התרחבות, שהתקבלו על מיקרוסקופ הדיסק מסתובב עם 40 x (NA 1.15; טבילה מים) המטרה. כחול = vimentin; = אלפא-אקא2 (ACTN4); אדום = קולגן IV; אפור = DAPI. סרגל קנה מידה = 10 יקרומטר (הרחבת הגודל הפיזי לאחר 45 יקרומטר; גורם הרחבה 4.5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| רכיב | ריכוז מניות | נפח מניות (mL) | ריכוז סופי | הסכום הסופי ל -10 מ"ל |
| סודיום אקרילי | 0.380 g/mL | 2.25 | 0.086 g/mL | 0.86 גרם |
| אקרילאמיד | 0.500 g/mL | 0.50 | 0.025 g/mL | 0.25 גרם |
| N, N′-מתיונין אקרילאמיד | 0.020 g/mL | 0.50 | 0.001 g/mL | 0.10 גרם |
| נתרן כלוריד | 0.292 g/mL | 4.00 | 0.117 g/mL | 1.17 גרם |
| PBS | 10x | 1.00 | 1x | 1x |
| מים | 1.15 | |||
| סה כ נפח | 9.40 |
שולחן 1: רכיבי פתרון מונומר. כל הריכוזים ניתנים במונחים של g/mL (w/v) למעט PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ExPath16, גרסה של proExM5 שניתן להחיל על הסוגים הנפוצים ביותר של דגימות ביופסיה קלינית בשימוש פתולוגיה, כולל ffpe, H & E ויטראז ', ויצורים קפואים טריים על שקופיות זכוכית. המרת עיצוב, שליפת אנטיגן, וכתמים חיסוני של הדגימות לעקוב אחר פרוטוקולים בשימוש נפוץ שאינם ספציפיים ExPath. בניגוד לפרוטוקול proExM המקורי9, expath מסתמך על ריכוז גבוה יותר של edta במאגר העיכול, אשר משפר את הרחבת הרקמות הקבועות של formalin, כפי שמתואר במחקר expath המקורי16. הפרוטוקול אומת ב-5-10-למעלה מדגימות קליניות בעובי16, אבל יכול להיות גם להחיל על דגימות רקמה עבה יותר עם שינוי מסוים. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם: 1) העיתוי של צעדי הגלוציה; 2) הכיוונון של תא הגלוציה; 3) פרמטרים לדוגמה הומוגון; ו-4) טיפול בג.
הפרמטר הקריטי ביותר עבור פרוטוקול זה הוא התזמון של שלבי הגלציה. המדגם לא יהיה מעוגן מספיק. למטריצת ג'ל עיגון מספיק מוקדמת gelation יכול לגרום לעיוותים, להגביל את התפשטות, ולגרום לאובדן של מולקולות היעד (איור 4F, G). הייזום של הגגנציה הוא תלוי בטמפרטורה, ולכן חשוב לשמור על פתרון הגילינג המעורב ב -4 ° c לפני הצבת המטרה. היוזם, APS, צריך להיות טרי מוכן והוסיף מיד לפני החלת הפתרון הגלינג. APS הוא לא יציב ב-RT והוא יכול לאבד את היעילות לאחר שעברו מחזורים להפשיר הקפאת. עיגון מספיק יכול להיות גם תוצאה של תגובתיות מופחתת של מתחם עיגון, AcX, אשר יכול לאבד פעילות לאחר לטווח ארוך אחסון או אחרי מגע עם מים. AcX נמצא לשמור על פעילות לאחר 6 חודשים של אחסון בסביבה מיובש ב-20 ° c. אם הגלציה מוקדמת אינה הגורם החשוד לעיוות, ניתן להכין פתרון מניות חדש של AcX.
במהלך הכיוונון של החדר gelation, בועות אוויר יכול להיות לכוד מתחת למכסה זכוכית מכסה. אם הבועות האלה מובילות או נוגעות ישירות למדגם, הם יכולים לגרום לעיוותים. הם יכולים להיות מועברים מן הדגימה על ידי הוספת פתרון הגלינג יותר דרך הצד של החדר. כדי לסייע במניעת בועות אוויר, ניתן להפקיד טיפה קטנה של פתרון הגלינג על המכסה לפני הצבת הרקמה.
העיכול לדוגמה תלוי בזמן, בטמפרטורה ובתכונות הרקמה, כגון עובי וסוג הרקמה. עיכול מספיק יכול גם לגרום לעיוותים ולגרום לגורם התרחבות קטן מהצפוי. אם מדובר בעיכול שאינו מושלם, ניתן להגדיל את זמן העיכול ו/או את ריכוז הפרוק, במיוחד במקרה של רקמות עבות יותר. ProK יכול גם לאבד את הפעילות לאורך זמן. כדי לשמר את פעילותה, ProK צריך להיות מאוחסן ב-20 ° c וניתן לצוטט לתוך אמצעי אחסון קטנים יותר כדי למנוע מחזורי הפשרה חופשית.
יש לנקוט בטיפול בדגימות הומוגניים, במיוחד כאשר מורחבות במלואה. אם הדגימה קשה לאתר כאשר שקוע בתוך נוזל, מאיר את המיכל מזוויות שונות יכול לפזר את האור במקרה כדי לאפשר ויזואליזציה של ג'ל. ג'ל מורחב לחלוטין הם שבירים יכול לשבור במהלך הטיפול. השימוש במברשות רכות ושפכטלים מפלסטיק מומלץ להעביר את הג המורחב.
פרוטוקול ExPath מספק חלופה חסכונית הדמיה סופר ברזולוציה וטכניקות אלקטרון מיקרוסקופ לחקור מבנים ננו-סקאלה בדגימות ביופסיה קלינית. למרות ProK מספק גם התרחבות של המדגם לאחר הומוגון, אובדן חלבונים מונע חקירה של מטרות אחרות של עניין לאחר התרחבות. עם זאת, ניתן לבצע בקלות את הפרוטוקול בכל מעבדה רטובה רגילה. החשוב ביותר, הדמיה של תכונות ננו בקנה מידה ניתן לבצע על השדה הרגיל או מיקרוסקופים קונפוקלית אשר נמצאים בדרך כלל מעבדות ביולוגיה ומתקנים ליבות הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YZ ו-OB הם שני ממציאים אשר הגישו והשיגו הגנה על פטנט על תת-ערכה של הטכנולוגיות המתוארות כאן (פטנטים בארה ב US20190064037A1, WO2018157074A1, ו WO2018157048A1).
Acknowledgments
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי קרן הסטארט-up של הפקולטה מאוניברסיטת קרנגי מלון (YZ) ו-NIH החדש של מנהל משנה פרס (DP2 OD025926-01 עד YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
