Summary
Nanoskalige Bildgebung klinischer Gewebeproben kann das Verständnis der Krankheitspathogenese verbessern. Expansionspathologie (ExPath) ist eine Version der Erweiterungsmikroskopie (ExM), modifiziert für die Kompatibilität mit Standard-Klinischen Gewebeproben, um die nanoskalige Konfiguration von Biomolekülen mit herkömmlichen Beugungsmikroskopen zu untersuchen.
Abstract
In der modernen Pathologie spielt die optische Mikroskopie eine wichtige Rolle bei der Krankheitsdiagnose, indem sie mikroskopische Strukturen klinischer Proben aufdeckt. Die grundlegende physikalische Beugungsgrenze verhindert jedoch das Verhören von nanoskaliger Anatomie und subtilen pathologischen Veränderungen bei verwendung herkömmlicher optischer Bildgebungsansätze. Hier beschreiben wir ein einfaches und kostengünstiges Protokoll, die sogenannte Expansionspathologie (ExPath), für die nanoskalige optische Bildgebung gängiger Arten klinischer Primärgewebeproben, einschließlich festgefrorener oder formalinfixierter Paraffingewebe (FFPE) Bereichen. Diese Methode umgeht die optische Beugungsgrenze, indem sie die Gewebeproben chemisch in Gewebe-Hydrogel-Hybride umwandelt und sie in reinem Wasser isisonsisch über mehrere Skalen ausdehnt. Durch die Ausdehnung werden bisher unlösbare Moleküle abgetrennt und können somit mit einem herkömmlichen optischen Mikroskop beobachtet werden.
Introduction
Die Untersuchung der molekularen Organisation von Geweben in einem dreidimensionalen (3D) Kontext kann ein neues Verständnis der biologischen Funktionen und der Krankheitsentwicklung liefern. Diese nanoskaligen Umgebungen liegen jedoch über den Auflösungsfähigkeiten herkömmlicher Beugungsmikroskope (200 bis 300 nm), wobei der minimale lösbare Abstand, d durch d -/NAdefiniert wird. Hier ist die Wellenlänge des Lichts und NA ist die numerische Blende (NA) des Bildgebungssystems. Kürzlich wurde die direkte Visualisierung fluoreszierend markierter Moleküle durch neu entwickelte hochauflösende Bildgebungstechniken1,2,3, einschließlich stimulierter Emissionserschöpfung (STED), ermöglicht. photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM). Obwohl diese bildgebenden Verfahren das Verständnis der biologischen Funktion im Nanomaßstab revolutioniert haben, verlassen sie sich in der Praxis oft auf teure und/oder spezialisierte Geräte und Bildverarbeitungsschritte, können eine langsamere Erfassungszeit haben, verglichen mit konventionelle optische Bildgebung erfordern Fluorophore mit spezifischen Eigenschaften (z. B. Fotowechselfähigkeit und/oder hohe Photostabilität). Darüber hinaus bleibt es eine Herausforderung, 3D-Superauflösungs-Bildgebung an Gewebeproben durchzuführen.
Die Erweiterungsmikroskopie (ExM), die erstmals 2015 eingeführt wurde4, bietet eine alternative Möglichkeit, nanoskalige Merkmale (<70 nm) zu bildgeben, indem konservierte Proben, die in ein anschwellendes Polyelektrolythydrogel eingebettet sind, physisch erweitert werden. Hier bei einem Polymernetzwerk, das nach der chemischen Verarbeitung isotopisch erweitert werden kann, werden wichtige Biomoleküle und/oder Etiketten vor Ort verankert. Da die physikalische Ausdehnung die effektive Gesamtauflösung erhöht, können Moleküle von Interesse dann mit herkömmlichen Beugungs-begrenzten Bildgebungssystemen gelöst werden. Seit der Veröffentlichung des ursprünglichen Protokolls, bei dem kundenspezifische synthetisierte Fluoreszenzetiketten im Polymernetzwerk4verankert wurden, wurden neue Strategien zur direkten Verankerung von Proteinen (Proteinretention ExM oder proExM)verwendet 5, 6,7,8,9 und RNA9,10,11,12 zum Hydrogel, und erhöhen die physikalische Vergrößerung durch iterative Erweiterung13 oder Anpassung der Gelchemie8,14,15.
Hier stellen wir eine angepasste Version von proExM vor, die als Expansionpathologie (ExPath)16bezeichnet wird und für klinische Pathologieformate optimiert wurde. Das Protokoll wandelt klinische Proben, einschließlich formalinfixierter Paraffin-Embedded (FFPE), Hämatoxylin und Eosin (H&E) gebeizte und frisch gefrorene menschliche Gewebeproben, die auf Glasrutschen montiert sind, in einen mit ExM kompatiblen Zustand um. Proteine werden dann am Hydrogel verankert und die mechanische Homogenisierung durchgeführt (Abbildung 1)16. Mit einer 4-fachlinearen Ausdehnung der Proben können mehrfarbige Superauflösungsbilder (ca. 70 nm) mit einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop mit nur einer Auflösung von 300 nm erhalten und auch mit anderen hochauflösenden Bildgebungstechniken kombiniert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von Lagerreagenzien und Lösungen
-
Bereiten Sie Gelierlösungskomponenten vor.
HINWEIS: Lösungskonzentrationen werden in g/mL (w/v Prozent) angegeben.- Herstellung folgender Lagerlösungen: 38% (w/v) Natriumacrylat (SA), 50% (w/v) Acrylamid (AA), 2% (w/v) N,N-Methylenbisacrylamid (Bis) und 29,2% (w/v) Natriumchlorid (NaCl). Lösen Sie die Verbindungen in doppelt entionisiertem Wasser (ddH2O). Verwenden Sie die Beträge in Tabelle 1 als Referenz; vorbereitete Lösungen können bei Bedarf nach oben oder unten skaliert werden. Um beispielsweise 10 ml einer 38 % (w/v) SA-Lösung herzustellen, fügen Sie 1,9 g SA zu einem abgestuften 10 ml-Zylinder hinzu und fügen ddH2O zu einem Volumen von 5 ml hinzu.
- Bereiten Sie 9,4 ml Monomerlösung mit einer Konzentration von 1,06x vor, wie in Tabelle 1dargestellt.
HINWEIS: Dies führt zu einer 1x Konzentration nach Zugabe des Initiators, Beschleunigers und Inhibitors. Der Monomerbestand kann bei 4 °C für bis zu 3 Monate oder bei -20 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden. - Bereiten Sie die folgenden Stammlösungen separat in ddH2O vor: 0,5% (w/v) des Inhibitors 4-Hydroxy-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-oxyl (4HT), was die Gelatine ungehemmt, um die Diffusion der Gelierlösung in Gewebe zu ermöglichen, 10% (v/v) der Initiator Tetramethylethylendiamin (TEMED), das die radikale Bildung durch Ammoniumpersulfat (APS) und 10% (w/v) APS beschleunigt, das den Gelierprozess initiiert.
HINWEIS: Lagerlösungen von 4HT und TEMED können in 1 ml Aliquots hergestellt und bei -20 °C für mindestens 6 Monate gelagert werden. APS hat festgestellt, dass Wirksamkeit nach langzeitlagerung verlieren und ist am besten in kleinen Mengen (<0,1 ml) unmittelbar vor dem Gelieren zubereitet.
- Vorbereitung des Verdauungspuffers (50 mM Tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5% [w/v] nichtionisches Tensid, 0,8 M NaCl) durch Kombination von 25 ml von 1 M Tris pH 8 (3,03 g Tris-Basis in 25 ml ddH2O), 25 ml EDTA (0,5 M pH 8) , 2,25 g nichtionisches Tensid und 23,38 g NaCl. DdH2O für ein Gesamtvolumen von 500 ml hinzufügen.
HINWEIS: Die Lösung kann bei Bedarf nach oben oder unten skaliert und bei 4 °C gelagert werden. Proteinase K (ProK) wird unmittelbar vor dem Verdauungsschritt zugegeben. - Bereiten Sie 20 mM Natriumcitratlösung vor, indem Sie 2,941 g Natriumcitrat-Tribasisdihydrat mit 500 ml ddH2O kombinieren und den pH-Wert bei Raumtemperatur (RT) auf 8,0 einstellen. Skalieren Sie das Lagervolumen nach Bedarf.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 6-((acryloyl)amino)hexanoic säure, succinimidylester (acryloyl-X, SE; AcX), die Verankerungsmasse. AcX in 500 l wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) für eine Endkonzentration von 10 mg/ml auflösen.
HINWEIS: Die Lösung kann in einer ausgetrockneten Umgebung bei -20 °C in 20 L Aliquots gelagert werden. - Wenn Sie keine kommerziell verfügbaren Puffer für die Immunfärbung verwenden, bereiten Sie den Sperrpuffer vor. Verwenden Sie einen Sperrpuffer von 5% (v/v) normales Tierserum und 0,1% (w/v) nichtionisches Tensid in 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) und wählen Sie das Serum basierend auf dem Wirtstier der sekundären Antikörper aus. Um beispielsweise 500 ml Sperrpuffer für Antikörper vorzubereiten, die in Ziegen angehoben werden, kombinieren Sie 25 ml Ziegenserum, 0,45 g nichtionisches Tensid und 1x PBS mit einem Volumen von 500 ml.
2. Herstellung archivierter und frisch zubereiteter klinischer Gewebefolien für ExPath
- Konvertieren Sie das Gewebe in ein ExPath-kompatibles Format. Wählen Sie je nach Herstellung der Probe einen der vier folgenden Schritte (2.1.1-2.1.4): FFPE-Dias, gebeizte FFPE-Dias oder unfixierte oder fixierte gefrorene Gewebeschlitten in optimaler Schnitttemperaturlösung (OCT).
HINWEIS: Diese basieren auf Standard-Wiederherstellungsschritten für Pathologieproben und sind nicht spezifisch für das ExPath-Protokoll.- KLINISCHE FFPE-Proben
- Bereiten Sie 30 ml 95% Ethanol, 70% Ethanol und 50% Ethanol vor. Messen Sie 30 ml Xylol, 100% Ethanol und ddH2O.
- Legen Sie die Folie mit der Probe in einem 50 ml konischen mit Zangen und fügen Sie 15 ml Xylol hinzu. Das Rohr verkapseln und horizontal auf einen Orbital-Shaker bei ca. 60 U/min legen und bei RT für 3 min für jede Lösung inkubieren. Wiederholen Sie dies mit dem restlichen 15 ml Xylol.
- Wiederholen Sie Schritt 2.1.1.2 mit 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, 50% Ethanol und ddH2O anstelle von Xylol.
- Befleckte und montierte Permanentschlitten
- Legen Sie die Rutsche in eine 100 mm Petrischale und decken Sie sie mit Xylol ab. Entfernen Sie den Coverslip vorsichtig mit einer Rasierklinge. Wenn der Coverslip nicht leicht entfernt werden kann, kehren Sie die Folie zum Xylol zurück, bis sich der Abdeckungsslip löst.
- Verfahren unter Verwendung der Schritte für FFPE-Beispiele (Schritte 2.1.1.1-2.1.1.3).
HINWEIS: Bei H&E-Buntrutschen werden die Flecken während des Expansionsprozesses eliminiert.
- Unfixierte gefrorene Gewebegrutschen in OCT-Lösung
- Fixieren Sie das Gewebe in Aceton bei -20 °C für 10 min.
- Waschen Sie die Proben mit 1x PBS-Lösung 3 mal für jeweils 10 min bei RT.
- Zuvor fixierte, gefrorene klinische Geweberutschen
- Inkubieren Sie die Dias für 2 min bei RT, um die OCT-Lösung zu schmelzen.
- Waschen Sie die Probe mit 1x PBS-Lösung 3 mal für jeweils 5 min bei RT.
- KLINISCHE FFPE-Proben
- Führen Sie die Wärmebehandlung für Antigenabruf auf allen Proben nach der Formatkonvertierung durch.
- 20 mM Citratlösung (pH 8 bei RT) in einen hitzebeständigen Behälter geben, z. B. ein Gleitfärbeglas.
HINWEIS: Es sollte genügend Lösung vorhanden sein, um das auf dem Dia montierte Gewebe zu bedecken (50 ml für ein Standard-Gleitfärbeglaschen). - Erhitzen Sie die Citratlösung auf 100 °C in der Mikrowelle und legen Sie den Schlitten in die Lösung. Den Behälter sofort in eine Inkubationskammer geben und 30 min bei 60 °C brüten.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Dias können in Petrischalen platziert und mit 1x PBS abgedeckt und bei 4 °C gelagert werden.
- 20 mM Citratlösung (pH 8 bei RT) in einen hitzebeständigen Behälter geben, z. B. ein Gleitfärbeglas.
- Stain die Probe mit Standard-Immunfluoreszenz (IF)/Immunhistochemie (IHC) Färbung Protokolle.
HINWEIS: Spezifische Primär- und Sekundärantikörperkonzentrationen und Färbedauern hängen von den vom Hersteller vorgeschlagenen Konzentrationen oder von der Optimierung für das spezifische Experiment ab.- Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um eine Grenze um die Gewebeabschnitte auf dem Dia zu ziehen, um das Volumen der Lösung zu minimieren, die zur Abdeckung des Gewebes erforderlich ist. Legen Sie die Folie in eine Schüssel, die groß genug ist, um die Folie zu passen. Verwenden Sie für ein Standardmäßiges 3-Zoll-Dia eine 100-mm-Petrischale.
HINWEIS: Der hydrophobe Pen stört weder die Polymerisation der Probe noch den Verdauungsprozess. - Inkubieren Sie das Gewebe mit Sperrpuffer für 1 h bei 37 °C, 2 h bei RT oder 4 °C über Nacht, um die unspezifische Bindung zu reduzieren.
- Primäre Antikörper gegen die gewünschte Konzentration in der entsprechenden Menge des vorbereiteten Sperrpuffers (oder eines anderen bevorzugten Färbepuffers) verdünnen. Inkubieren Sie das Gewebe mit der primären Antikörperlösung mindestens 3 h bei RT oder 37 °C oder über Nacht bei 4 °C.
HINWEIS: Die Proben sollten in einen befeuchteten Behälter (z. B. eine Petrischale mit einem feuchten Tuch) gelegt werden, um das Austrocknen des Gewebes zu verhindern. In der Regel wurden Antikörper je nach Gewebegröße und verwendetem Antikörper auf 1:100 bis 1:500 in 200 bis 500 l Puffer verdünnt. - Waschen Sie das Gewebe mit vorbereiteten Sperrpuffer (oder anderen bevorzugten Waschpuffer) 3 mal für 10 min bei RT.
- Sekundärantikörper (und 300 nM 4,6-Diamidino-2-Phenylindole [DAPI] auf Wunsch) in vorbereiteten Sperrpuffer (oder einem anderen bevorzugten Färbepuffer) auf eine Konzentration von ca. 10 g/ml verdünnen. Inkubieren Sie das Gewebe in der sekundären Antikörperlösung mindestens 1 h bei RT oder 37 °C.
HINWEIS: Das Timing kann abhängig von den verwendeten Antikörpern und der Dicke des Gewebes angepasst werden. Sekundäre Antikörper, die Cyaninfarbstoffe (Cy3, Cy5, Alexa 647) enthalten, sind bei Anwendung der Vorpolymerisation nicht mit dem ExM-Protokoll kompatibel. Empfohlene Farbstoffe sind Alexa 488 (grün), Alexa 546 (orange/rot) und Atto 647N oder CF633 (far-red). DAPI muss nach der Erweiterung erneut angewendet werden, da es während des Erweiterungsprozesses weggewaschen wird. - Waschen Sie das Gewebe mit vorbereiteten Sperrpuffer (oder anderen bevorzugten Waschpuffer) 3 mal für 10 min jeweils bei RT.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Dias können in Petrischalen platziert und mit 1x PBS abgedeckt und bei 4 °C gelagert werden. - Führen Sie fluoreszierende Bildgebung mit einem herkömmlichen Weitfeldmikroskop, einem konfokalen Mikroskop oder einem anderen Bildgebungssystem Ihrer Wahl durch.
HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, um die biologische Länge anhand des Expansionsfaktors zu bestimmen, indem Bilder vor und nach der Erweiterung verglichen werden. Um die Bildgebung nach der Erweiterung zu erleichtern, sollten leicht identifizierbare Bereiche von Interesse ausgewählt und Bilder mit niedriger und hoher Vergrößerung gesammelt werden.
- Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um eine Grenze um die Gewebeabschnitte auf dem Dia zu ziehen, um das Volumen der Lösung zu minimieren, die zur Abdeckung des Gewebes erforderlich ist. Legen Sie die Folie in eine Schüssel, die groß genug ist, um die Folie zu passen. Verwenden Sie für ein Standardmäßiges 3-Zoll-Dia eine 100-mm-Petrischale.
3. In Situ Polymerisation von Proben
-
Inkubieren Sie die Probe in Verankerungslösung.
- Bereiten Sie die Verankerungslösung (in der Regel 250 l ist genug, um den Gewebeabschnitt abzudecken) durch Verdünnen der AcX-Stammlösung in 1x PBS auf eine Konzentration von 0,03 mg/ml für Proben, die mit Nicht-Aldehyd-Fixativen oder 0,1 mg/ml für Proben mit Aldehyd-Fixativen fixiert sind, vor. , die weniger freie Adern zur Verfügung haben, um mit AcX zu reagieren.
- Legen Sie das Dia in eine 100 mm Petrischale und pipette die Verankerungslösung über dem Gewebe. Mindestens 3 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
-
Inkubieren Sie die Proben in Gelierlösung.
- Bereiten Sie mindestens 100-fach überschüssiges Volumen der Gelierlösung vor. Kombinieren Sie die folgenden 188 l Monomerlösung, 4 l 0,5% 4HT Stammlösung (1:50 Verdünnung, Endkonzentration: 0,01%), 4 l 10% TEMED-Stammlösung (1:50 Verdünnung, Endkonzentration 0,2%) und 4 l 10% APS-Stammlösung (1:50 Verdünnung, Endkonzentration 0,2%).
HINWEIS: Gelling-Lösung sollte unmittelbar vor der Verwendung gemacht werden. Die Lösung sollte bei 4 °C gehalten werden und die APS-Lösung sollte zuletzt hinzugefügt werden, um eine vorzeitige Gelierung zu verhindern. - Entfernen Sie überschüssige Lösung aus dem Gewebeabschnitt und legen Sie das Dia in eine 100 mm Petrischale. Fügen Sie der Probe eine frische, kalte Gelierlösung hinzu und inkubieren Sie die Mischung auf dem Gewebe 30 min bei 4 °C, um eine Diffusion der Lösung in das Gewebe zu ermöglichen.
- Bereiten Sie mindestens 100-fach überschüssiges Volumen der Gelierlösung vor. Kombinieren Sie die folgenden 188 l Monomerlösung, 4 l 0,5% 4HT Stammlösung (1:50 Verdünnung, Endkonzentration: 0,01%), 4 l 10% TEMED-Stammlösung (1:50 Verdünnung, Endkonzentration 0,2%) und 4 l 10% APS-Stammlösung (1:50 Verdünnung, Endkonzentration 0,2%).
-
Konstruieren Sie eine Kammer auf der Rutsche um die Probe(Abbildung 2A), ohne die Gelierlösung zu stören.
- Machen Sie Abstandshalter für die Gelierkammer, indem Sie Teile aus Deckglas mit einem Diamantmesser dünn schneiden.
HINWEIS: Um die Bildgebung nach der Expansion zu erleichtern, sollten die Abstandshalter in der Dicke der Gewebeprobe nahe sein, um die Menge an Leeregel über dem Gewebe zu reduzieren. Die Nummer 1,5 Glas kann für klinische Standardproben verwendet werden (5 x 10 m). Abdeckung Glasstücke können für dickere Proben gestapelt werden. - Sichern Sie die Abstandshalter auf beiden Seiten des Gewebes mit Wassertröpfchen (ca. 10 l).
- Legen Sie vorsichtig einen Deckel Glasdeckel über die Rutsche, um sicherzustellen, dass Luftblasen über dem Gewebe zu vermeiden (Abbildung 2B).
- Machen Sie Abstandshalter für die Gelierkammer, indem Sie Teile aus Deckglas mit einem Diamantmesser dünn schneiden.
- Inkubieren Sie die Probe bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung (z. B. einer geschlossenen Petrischale mit einem feuchten Tuch) für 2 h.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Schiebekammer kann bei 4 °C in einer versiegelten Petrischale gelagert werden.
4. ProbeVerdauung
-
Entfernen Sie den Deckel der Gelierkammer, indem Sie eine Rasierklinge sanft unter den Deckelschieben schieben und den Deckelrutsch langsam von der Geloberfläche heben. Schneiden Sie das leere Gel um das Gewebe, um das Volumen zu minimieren. Schneiden Sie das Gel asymmetrisch, um die Ausrichtung des Gels nach der Homogenisierung zu verfolgen, da die Probe transparent wird.
- ProK vor Gebrauch im Verdauungspuffer (Endkonzentration 4 U/ml) um 1:200 verdünnen. Bereiten Sie genügend Lösung, um das Gel vollständig zu tauchen; ein einzelner Brunnen einer Vier-Well-Kunststoff-Zellkulturplatte benötigt mindestens 3 ml pro Brunnen.
- Inkubieren Sie die Probe in einem geschlossenen Behälter, der den Verdauungspuffer für 3 h bei 60 °C enthält. Wenn sich die Probe während der Verdauung nicht vom Dia löst, verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Probe vorsichtig zu entfernen.
HINWEIS: Die Probe sollte vollständig in einen Verdauungspuffer getaucht werden, um zu verhindern, dass die Probe austrocknet, und in einen überdachten Behälter (kleiner Schiebekasten, Kunststoffbrunnen, Petrischale usw.) gelegt werden, der mit Folie versiegelt werden kann.
5. Probenerweiterung und Bildgebung
- Verwenden Sie einen weichen Pinsel, um die Probe in 1x PBS in einem Behälter zu übertragen, der mit dem gewünschten Bildgebungssystem kompatibel ist und groß genug ist, um das vollständig erweiterte Gel aufzunehmen. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe bei der Bildgebung auf einem invertierten System oder bei Bildgebung auf einem aufrechten System mit der Probenseite nach unten platziert wird, um den Abstand vom Bildgebungsobjektiv zur Probe zu minimieren. Drehen Sie das Gel bei Bedarf mit einem weichen Pinsel um.
HINWEIS: Die Seitenbeleuchtung einer LED kann verwendet werden, um sie in Flüssigkeit sichtbar zu machen. Eine Standard-6-Well-Platte kann Proben aufnehmen, die einen vordehnbaren Durchmesser von weniger als 0,6 cm haben. Eine Glasboden-Brunnenplatte sollte für die Bildgebung auf einem invertierten System verwendet werden. - Waschen Sie die Proben in 1x PBS bei RT für 10 min. Falls gewünscht, färben Sie die Probe erneut mit 300 nM DAPI, während der Verdauungsprozess den DAPI-Fleck wegwärt. Entfernen Sie PBS und Färben Sie mit 300 nM DAPI in 1x PBS für 20 min bei RT verdünnt, gefolgt von einer 10 min Waschen mit 1x PBS bei RT.
HINWEIS: Die Proben können mit 1x PBS abgedeckt und bei 4 °C gelagert werden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. - Um die Proben zu erweitern, ersetzen Sie die PBS und waschen Sie mit einem überschüssigen Volumen von ddH2O (mindestens 10x das endgültige Gelvolumen) 3 x 5 mal für 10 min pro Jahr, bei RT.
HINWEIS: Nach dem3. oder4. Waschen sollte die Ausdehnung des Exemplars auf Hochebene beginnen. Zur Speicherung, um bakterielles Wachstum zu verhindern, kann das ddH2O mit 0,002 % bis 0,01 % Natriumazid (NaN3) ergänzt werden. In diesem Fall wird der endgültige Expansionsfaktor um 10% umgekehrt. - Führen Sie Fluoreszenz-Bildgebung mit einem herkömmlichen Weitfeldmikroskop, einem konfokalen Mikroskop oder einem anderen Bildgebungssystem Ihrer Wahl durch.
HINWEIS: Um das Driften von Gelen zu verhindern, kann überschüssige Flüssigkeit aus dem Brunnen entfernt werden. Gele können auch mit 1,5 bis 2% niedrigschmelzender Agarose immobilisiert werden. Bereiten Sie 1,5 x 2 % (w/v) niedrigschmelzende Agarose in Wasser in einem Behälter vor, der das 2-4-fache des Lösungsvolumens beträgt. Erwärmen Sie die Lösung in einem 40 °C Wasserbad oder in einer Mikrowelle für 10 bis 20 s, um die Lösung zu schmelzen. Pipette die geschmolzene Agarose um die Ränder des Gels. Nachdem Sie die Agarose bei RT oder 4 °C aushärten lassen, wasserin die Probe geben, um Eine Austrocknung zu verhindern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wenn das Protokoll erfolgreich durchgeführt wurde (Abbildung 1), werden proben nach der mechanischen Homogenisierung als flaches und transparentes Gel angezeigt (Abbildung 3A) und können sich um den Faktor 3 x 4,5x in Wasser ausdehnen (Abbildung 3B), eine effektive Auflösung von 70 nm in Abhängigkeit vom endgültigen Erweiterungsfaktor und dem verwendeten Bildgebungssystem5,16. Abbildung 4 zeigt Beispielbilder einer 5 x m dicken FFPE-Nierenprobe, die mit dem ExPath-Protokoll verarbeitet wurde. Die vollständige Erweiterung der gegelten Proben führte zu einem 4,5-fachen Expansionsfaktor im Wasser, was eine effektive Auflösung von 63 nm bei einer Bildabbilder mit einem 0,95 NA-Objektiv ergab. Das Gewebe wurde zunächst mit Xylol vorverarbeitet, um Paraffin zu entfernen und rehydriert (Abschnitt 2.1.1), gefolgt von Antigen-Retrieval mit dem Citratpuffer (Abschnitt 2.2). Das zurückgewonnene Gewebe wurde dann mit Antikörpern für Alpha-Actinin 4 (ACTN4) und Vimentin befleckt, zusammen mit DAPI zur Visualisierung von Kern-DNA und Weizenkeimagglutinin (WGA), um Kohlenhydrate zu kennzeichnen. Die Probe wurde dann mit einem konfokalen Mikroskop der Spinnscheibe abgebildet (Abbildung 4A,B,D). Gewebe wurden nach dem obigen Protokoll behandelt und in Wasser vollständig erweitert (Abbildung 4C,E). In ähnlicher Weise zeigt Abbildung 5 Beispielbilder von H&E-gefärbtem normalem Brustgewebe (Abbildung 5A), das mit Xylol (Abschnitt 2.1.2) behandelt wurde, um das Deckglas zu entfernen und dann als FFPE-Probe behandelt wurde (Abschnitt 2.1.1). Bei der Homogenisierung wird der H&E-Fleck aus dem Gewebe eliminiert. Nachder Erweiterungsbilder der DAPI-Buntprobe, die auf einem konfokalen Mikroskop der Spinnscheibe(Abbildung 5B) im Vergleich zu Vorerweiterungsbildern gewonnen wurde, weisen auf einen Expansionsfaktor von 5,1 hin, was eine effektive Auflösung von 43 nm ergibt, wenn sie mit ein NA 1.15-Objektiv.
Beispieldaten für nicht fixierte gefrorene Nierenscheiben, die mit dem ExPath-Protokoll verarbeitet werden, sind in Abbildung 6zu sehen. Das Gewebe wurde zuerst in kaltem Aceton (Abschnitt 2.1.3) fixiert und mit ACTN4, Vimentin, DAPI und WGA gefärbt. Der Vergleich von Vorerweiterungsbildern (nicht dargestellt) und Post-Expansion-Bildern weist auf einen Expansionsfaktor von 4,5 hin. Vergleichsdaten der acetonfixierten gefrorenen Nierenproben mit denen der FFPE-Proben (Abbildung 4C,E) zeigen, dass die Qualität der ACTN4-Färbung in der erweiterten FFPE-Probe verringert wird, was auf eine Verschlechterung der Antigenität zurückzuführen sein kann. aufgrund der Fixierungsmethode16.
Abbildung 1: Schematic des Erweiterungspathologie-Workflows (ExPath). Die Vorverarbeitung von klinisch archivierten Gewebedias erfolgt zunächst auf Basis des Speicherformats. Die Proben werden dann mit herkömmlichen Immunstainierungsprotokollen gefärbt und Vorerweiterungsbilder erhalten. Die Proben werden dann mit Acryloyl-X SE (AcX) behandelt, um Proteine am Hydrogel zu verankern. Die In-situ-Polymerisation wird vor der mechanischen Homogenisierung mit Proteinase K (ProK) vorgeformt. Die Proben können dann in ddH2O vor der Bildgebung erweitert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gelationskammer für Pathologieproben. (A) Zwei Abstandshalter, wie z. B. zwei Stücke #1,5-Abdeckungsglas, das mit einem Diamantmesser geschnitten wurde, werden nach dem Inkubieren der Probe in Gelierlösung bei 4 °C auf beiden Seiten des Gewebes platziert. Die Abstandshalter sollten dicker sein als die Gewebescheiben, um eine Kompression der Probe zu verhindern. (B) Ein Deckel, z. B. ein Stück #1,5-Abdeckungsglas, wird verwendet, um die Probe vor der Inkubation bei 37 °C abzudecken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispiel für die Probenerweiterung. Gezeigt wird eine 5 m dicke Nierenprobe nach der Homogenisierung (A) Vor- undB) nach der Ausdehnung in ddH2O. Gitterquadrate sind 5 mm x 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse aus 5 m dicken FFPE-Nierenproben. (A) Vorerweitertes Bild. (B) Vergrößertes Vorerweiterungsbild des skizzierten Interessenbereichs in Den Panels A und (C) das entsprechende Nachexpansionsbild desselben Interessenbereichs, nachdem die Probe vollständig in Wasser erweitert wurde. (D) Vergrößertes Bild des skizzierten Interessenbereichs in Panel B und (E) das entsprechende Nachexpansionsbild desselben Interessenbereichs, nachdem die Probe vollständig in Wasser erweitert wurde. Risse, Verzerrungen und der Verlust von markierten Zielen können das Ergebnis einer unzureichenden Verankerung und/oder Homogenisierung sein (F,G). Alle Bilder wurden mit einem konokalen Mikroskop mit einem 20x (NA 0.95; Wasser immersion) Objektiv (A-E,G) oder 10x (NA 0.5) Objektiv (F) erhalten. Blau, DAPI; grün, vimentin; rot, Alpha-Actinin 4 (ACTN4); Magenta, WGA. Skalenbalken = 100 m (A,F,G, gelbe Skalenbalken zeigen Nach-Erweiterungsbilder an); 50 m (B), 50 m (C, physikalische Größe nach Ausdehnung 225 m; Expansionsfaktor 4,5); 25 m (D); 25 m (E, physische Größe nach Derexpansion 112,5 m; Expansionsfaktor 4,5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse aus H&E-gefärbtem normalem Brustgewebe. (A) Hellfeldbild des vorexpandierten H&E-Gebeingewebes, das mit einem 40x (0,95 NA) Objektiv aufgenommen wurde. (B) DAPI-Bild nach der Erweiterung derselben Interessenregion, nachdem die Probe vollständig in Wasser erweitert wurde. Das Bild wurde auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x (NA 1.15; Water Immersion) Objektiv erhalten. Skalenbalken = 10 m (A, der gelbe Maßstabsbalken zeigt Post-Expansion-Bilder) und 2 m (B, physische Größe nach Erweiterung 50,1 m; Expansionsfaktor 5,1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse von frischen gefrorenen Nierenproben nach Derexpansion, die auf einem Konfokalmikroskop der Spinnscheibe mit einem 40-fachen (NA 1.15; Wassereintauchen) objektiv erhalten werden. Blau = vimentin; grün = Alpha-Actinin 4 (ACTN4); rot = Kollagen IV; grau = DAPI. Scale bar = 10 'm (physische Größe nach Dererweiterung 45 'm; Expansionsfaktor 4.5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| teil | Lagerkonzentration | Lagervolumen (mL) | Endgültige Konzentration | Endbetrag pro 10 ml |
| Natriumacrylat | 0,380 g/ml | 2.25 | 0,086 g/ml | 0,86 g |
| Acrylamid | 0,500 g/ml | 0.50 | 0,025 g/ml | 0,25 g |
| N,N-Methylenbisacrylamid | 0,020 g/ml | 0.50 | 0,001 g/ml | 0,10 g |
| natriumchlorid | 0,292 g/ml | 4.00 | 0,117 g/ml | 1,17 g |
| Pbs | 10x | 1.00 | 1x | 1x |
| wasser | 1.15 | |||
| Gesamtvolumen | 9.40 |
Tabelle 1: Komponenten der Monomerlösung. Alle Konzentrationen werden in g/mL (w/v) mit Ausnahme von PBS angegeben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier stellen wir das ExPath-Protokoll16vor, eine Variante von proExM5, die auf die häufigsten Arten von klinischen Biopsieproben angewendet werden kann, die in der Pathologie verwendet werden, einschließlich FFPE, H&E-Färbung und frisch gefroreneNproben auf Glasdias. Formatkonvertierung, Antigenabruf und Immunostainierung der Proben folgen häufig verwendeten Protokollen, die nicht exPath spezifisch sind. Im Gegensatz zum ursprünglichen proExM-Protokoll9setzt ExPath auf eine höhere Konzentration von EDTA im Verdauungspuffer, was die Ausdehnung von formal infixiertem Gewebe verbessert, wie in der ursprünglichen ExPath-Studie16gezeigt. Das Protokoll wurde in 5 x 10 m dicken klinischen Proben16validiert, könnte aber auch auf dickere Gewebeproben mit einigen Modifikationen angewendet werden. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind: 1) das Timing der Gelationsschritte; 2) Einrichtung der Gelationskammer; 3) Parameter für die Probenhomogenisierung; und 4) Handhabung des Gels.
Der wichtigste Parameter für dieses Protokoll ist das Timing der Gelationsschritte. Wenn die Gelierlösung vorzeitig polymerisiert, wird die Probe nicht ausreichend in der Gelmatrix verankert. Unzureichende Verankerung und vorzeitige Gelation können Verzerrungen verursachen, die Ausdehnung begrenzen und zum Verlust von Zielmolekülen führen (Abbildung 4F,G). Die Einleitung der Gelation ist temperaturabhängig, daher ist es wichtig, die Mischgelierlösung bei 4 °C zu halten, bevor sie auf die Zielprobe gestellt wird. Der Initiator, APS, sollte frisch zubereitet und unmittelbar vor dem Auftragen der Gelierlösung hinzugefügt werden. APS ist bei RT nicht stabil und kann nach frostigen Tauzyklen an Wirksamkeit verlieren. Unzureichende Verankerung kann auch das Ergebnis einer reduzierten Reaktivität der Verankerungsmasse AcX sein, die nach langzeitiger Lagerung oder nach Kontakt mit Wasser an Aktivität verlieren kann. Es wurde festgestellt, dass AcX seine Aktivität nach 6 Monaten Lagerung in einer ausgetrockneten Umgebung bei -20 °C aufhält. Wenn eine vorzeitige Gelation nicht die vermutete Ursache für Verzerrungen ist, kann eine neue Lagerlösung von AcX vorbereitet werden.
Während des Aufbaus der Gelationskammer können Luftblasen unter dem Deckel des Glasdeckels eingeschlossen werden. Wenn sich diese Blasen auf der Oberseite der Probe befinden oder direkt berühren, können sie zu Verzerrungen führen. Sie können von der Probe weg bewegt werden, indem mehr Gelierlösung durch die Seite der Kammer hinzugefügt wird. Um Luftblasen zu verhindern, kann ein kleiner Tropfen Gelierlösung auf dem Deckel abgelagert werden, bevor er über das Gewebe gelegt wird.
Die Probenverdauung ist abhängig von Zeit, Temperatur sowie Gewebeeigenschaften wie Dicke und Gewebetyp. Unzureichende Verdauung kann auch verzerrungen und zu einem Expansionsfaktor führen, der kleiner ist als erwartet. Bei Verdacht auf eine unvollständige Verdauung kann die Verdauungszeit und/oder ProK-Konzentration erhöht werden, insbesondere bei dickeren Geweben. ProK kann auch im Laufe der Zeit Aktivität verlieren. Um seine Aktivität zu erhalten, sollte ProK bei -20 °C gelagert werden und kann in kleinere Volumina eingewiesen werden, um freie Tauzyklen zu vermeiden.
Beim Umgang mit homogenisierten Proben ist Vorsicht geboten, insbesondere wenn sie vollständig erweitert werden. Wenn die Probe schwer zu lokalisieren ist, wenn sie in Flüssigkeit getaucht wird, kann die Beleuchtung des Behälters aus verschiedenen Winkeln einfallendes Licht streuen, um eine Visualisierung des Gels zu ermöglichen. Voll expandierte Gele sind zerbrechlich und können während der Handhabung brechen. Die Verwendung von weichen Bürsten und Plastikspachteln wird empfohlen, um die erweiterten Gele zu übertragen.
Das ExPath-Protokoll bietet eine kostengünstige Alternative zu aktuellen super-resolution Imaging- und Elektronenmikroskopie-Techniken, um nanoskalige Strukturen in klinischen Biopsieproben zu behören. Obwohl ProK eine gleichmäßige Erweiterung der Probe nach der Homogenisierung ermöglicht, verhindert der Verlust von Proteinen die Abfrage anderer Interessenziele nach der Ausdehnung. Das Protokoll kann jedoch problemlos in jedem regulären Nasslabor ausgeführt werden. Am wichtigsten ist, dass die Abbildung von nanoskaligen Merkmalen an herkömmlichen Weitfeld- oder Konfokalmikroskopen durchgeführt werden kann, die häufig in Biologielabors und bildgebenden Kerneinrichtungen zu finden sind.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YZ und OB sind zwei der Erfinder, die Patentschutz für eine Teilmenge der hier beschriebenen Technologien angemeldet und erhalten haben (US-Patente US20190064037A1, WO2018157074A1 und WO2018157048A1).
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Faculty Start-up Fund der Carnegie Mellon University (YZ) und den NIH Director es New Innovator Award (DP2 OD025926-01 bis YZ) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
