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Bioengineering

अलग-थलग पड़े मुमूत्र वेंट्रिकुलर माइओसाइट्स की ऑप्टिकल इमेजिंग

Published: January 17, 2020 doi: 10.3791/60196
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3, 3, 1, 3, 3
1Anhui Province Key Laboratory of Hepatopancreatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, Hefei, Anhui, China, 2Central Nodal (Anhui) Bioscience and Technology Research Center, Hefei, Anhui, China, 3Pediatric Cardiac and Thoracic Surgery, University Hospitals Cleveland Medical Center

Summary

हम मूत्र मायोसाइट्स के अलगाव के लिए कार्यप्रणाली प्रस्तुत करते हैं और एक साथ डिजिटल सेल ज्यामिति मापन के साथ फ्लोरेसेंस फोटोमेट्री का उपयोग करके सरकोवर को छोटा करने वाले निशान ों के साथ वोल्टेज या कैल्शियम के निशान कैसे प्राप्त करें।

Abstract

वयस्क हृदय myocytes को अलग करने की क्षमता शोधकर्ताओं को एकल कोशिका स्तर पर हृदय विकृतियों की एक किस्म का अध्ययन करने की अनुमति दी है । जबकि कैल्शियम संवेदनशील रंगों में प्रगति ने एकल कोशिका कैल्शियम गतिशीलता की मजबूत ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग की अनुमति दी है, मजबूत ट्रांसमेब्रेनऑप्टिकल वोल्टेज संकेतों की रिकॉर्डिंग मुश्किल बनी हुई है। यकीनन, यह कम एकल से शोर अनुपात, फोटोटॉक्सिकिटी और पारंपरिक शक्तिशाली रंगों की फोटोब्लीचिंग के कारण है। इसलिए, एकल सेल वोल्टेज माप लंबे समय से पैच क्लैंप तकनीक तक ही सीमित रहे हैं, जबकि सोने का मानक तकनीकी रूप से मांग कर रहा है और कम थ्रूपुट है। हालांकि, उपन्यास शक्तिशाली रंगों के विकास के साथ, वोल्टेज में परिवर्तन के लिए बड़े, तेज ऑप्टिकल प्रतिक्रियाओं को फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग के साथ प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल विस्तार से बताता है कि वयस्क मूत्र मायोसाइट्स को कैसे अलग किया जाए जिसका उपयोग सेलुलर छोटा, कैल्शियम और ऑप्टिकल वोल्टेज मापन के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक रेशियोमेट्रिक कैल्शियम डाया, एक एकल उत्तेजना कैल्शियम रंग, और एक एकल उत्तेजना वोल्टेज रंगका का उपयोग करने के लिए । इस दृष्टिकोण का उपयोग विभिन्न रासायनिक एजेंटों की कार्डियोटॉक्सिकिटी और अतालता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। जबकि फोटोटॉक्सिकिटी अभी भी एकल कोशिका स्तर पर एक मुद्दा है, कार्यप्रणाली पर चर्चा की जाती है कि इसे कैसे कम किया जाए।

Introduction

स्वस्थ और रोग राज्यों के दौरान दिल का अध्ययन करने के लिए, एकल कोशिका स्तर पर फेनोटाइप की जांच करना अक्सर उपयोगी होता है। जबकि वैज्ञानिक प्रगति एकल सेल कैल्शियम गतिशीलता के मजबूत माप की अनुमति दी है, एकल सेल ऑप्टिकल वोल्टेज मापदुर्लभ 1बने हुए हैं । यकीनन, यह शोर अनुपात (SNR), फोटोटॉक्सिसिटी, और पारंपरिक शक्तिशालीरंगों2,3के फोटोब्लीचिंग के लिए कम संकेत के कारण है। फिर भी, अलग माइकोसाइट ऑप्टिकल कार्रवाई क्षमता2,3,4प्राप्त किया गया है । इसके अलावा, रसायन विज्ञान में प्रगति और वोल्टेज संवेदनशील रंगों की भौतिकी के साथ, एसएनआर में5सुधार हुआ है । नई झिल्ली संभावित जांच(सामग्री की तालिका)उप-मिलीसेकंड में झिल्ली क्षमता में परिवर्तन का जवाब देती है और प्रति 100 एमवी लगभग 25% की फ्लोरोजेनिक प्रतिक्रिया सीमा है। इसके अलावा, झिल्ली संभावित किट का उत्तेजना/उत्सर्जन (उदाहरण के लिए, फ्लूओवोल्ट; सामग्री की तालिका) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है मानक फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफईसी) या ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) सेटिंग्स6के साथ काम करता है।

जीएफसी और जीएफपी उत्तेजना/उत्सर्जन स्पेक्ट्रा फ्लोओ-4 कैल्शियम बाउंड स्पेक्ट्रा7के साथ ओवरलैप करते हैं । पारंपरिक रूप से डिजिटल सेल ज्यामिति मापन के साथ फ्लोरेसेंस फोटोमेट्री के एक साथ अधिग्रहण का उपयोग कैल्शियम और सेलुलर छोटा माप8के एक साथ अधिग्रहण के लिए किया गया है । यह प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन करता है कि murine myocytes को कैसे अलग किया जाए और मानक फ़ेसीसी सेटिंग्स का उपयोग करके कैल्शियम या वोल्टेज संकेतों को कैसे रिकॉर्ड किया जाए। इसके अतिरिक्त, यह बताता है कि इमेजिंग वर्कस्टेशन पर उत्तेजना/उत्सर्जन फिल्टर में एक साधारण स्विच का उपयोग अनुपात मीट्रिक कैल्शियम डाया फुरा-2 का उपयोग करके कैल्शियम और छोटा माप प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है । फ्लो-4 की तुलना में, फुरा-2 में कैल्शियम के लिए अधिक आत्मीयता होती है और यहअपेक्षाकृत 9फोटोब्लीचिंग के लिए प्रतिरोधी है। नतीजतन, एक ही वर्कस्टेशन का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल अकेले myocyte उत्तेजना-संकुचन युग्मन की एक पूरी तरह से जांच के लिए अनुमति देता है ।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी तरीकों और प्रक्रियाओं को केस वेस्टर्न रिजर्व यूनिवर्सिटी की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) ने मंजूरी दी है ।

1. समाधान, उपकरण, और कवरस्लिप की तैयारी

नोट: 1x समाधान एक महीने तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. 10x क्रेब्स-हेंसेलिट बफर हेप्स बफर बिना कैल्शियम (KHB-एचबी) के 68.96 ग्राम नैक जोड़कर बनाएं, केसीएल के 3.57 ग्राम, हेप्स के 59.58 ग्राम, के2एचएमओ4के 2.18 ग्राम, एमजीएसओ4 का 3.08 ग्राम और 19.82 ग्राम ग्लूकोज 1,000 मीटर फ्लास्क में डबल आसुत पानी के 800 मीटर तक। सामग्री पूरी तरह से भंग होने के बाद, 1,000 एमएल वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में मात्रा तक लाएं।
    नोट: पारंपरिक क्रेब्स हेनसेलेत समाधान एक बफर के रूप में सोडियम बाइकार्बोनेट का उपयोग करता है और इस प्रोटोकॉल में समाधान हेप्स बफर के साथ क्रेब्स हेनसेलेट समाधान का उपयोग करता है। यदि बाँझ फ़िल्टर किया जाता है तो समाधान 6 महीने के लिए स्थिर है।
  2. 10x टाइरोड का समाधान बनाकर नैल का 86.51 ग्राम, एएच2पीओ4का 0.552 ग्राम, एमजीसीएल2का 2.03 ग्राम, ग्लूकोज का 9.91 ग्राम, केसीएल का 4.03 ग्राम, सीएसीएल2का 2.65 ग्राम और हेप्स का 35.76 ग्राम एचईपीई का समाधान 100 मीटर में डबल डिस्टिल पानी के 800 मीटर तक करें। सामग्री पूरी तरह से भंग होने के बाद, 1000 मिलीआर वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में वॉल्यूम तक लाएं।
    नोट: यदि बाँझ फ़िल्टर किया जाता है तो समाधान 6 महीने के लिए स्थिर है।
  3. 10x स्टॉक के 100 मिलीएल को मापने और 1,000 मीटर फ्लास्क में डबल आसुत पानी के 875 मिलील को जोड़कर 1x KHB-HB बनाएं। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। एक बार समाधान 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाने के बाद पीएच को बढ़ाकर 7.39 करने के लिए नाओएच का उपयोग करें। पीएच को समायोजित करने के बाद, 1000 एमएल वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में मात्रा का समाधान लाएं। बाँझ एक वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली का उपयोग कर समाधान फिल्टर।
  4. 10x स्टॉक के 100 मिलीएल को मापने और 1,000 मिलीआर फ्लास्क में डबल आसुत पानी के 875 मिलील को जोड़कर 1x टाइरोड का समाधान बनाएं। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। एक बार समाधान 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाने के बाद पीएच को बढ़ाकर 7.39 करने के लिए नाओएच का उपयोग करें। पीएच को समायोजित करने के बाद, 1,000 एमएल वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में मात्रा का समाधान लाएं। वैक्यूम फिल्ट्रेशन सिस्टम का उपयोग करके बाँझ फ़िल्टर।
  5. 10x स्टॉक के 100 मिलीएल को मापने और 1,000 मिलीएल फ्लास्क में डबल आसुत पानी के 875 मिलील को जोड़कर 1x संशोधित टाइरोड का समाधान बनाएं। फ्लास्क में एल-ग्लूटाथिएक के 3.07 ग्राम को भंग करें। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। एक बार समाधान 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाने के बाद पीएच को बढ़ाकर 7.39 करने के लिए नाओएच का उपयोग करें। पीएच को समायोजित करने के बाद, 1,000 एमएल वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में मात्रा का समाधान लाएं। बाँझ एक वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली का उपयोग कर समाधान फिल्टर।
  6. 25 मिलीग्राम पाउडर में डाइमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) के 855 माइक्रोन जोड़कर 100 एमएम ब्लेबिस्टिन स्टॉक सॉल्यूशन बनाएं। अलीकोट 20 माइक्रोन वेतन वृद्धि में बाहर और छह महीने तक के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
  7. 1x KHB-HB के 100 मीटर के लिए गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 2 ग्राम और एलिकोहलब्लेज़ ब्लेबिस्टिन स्टॉक की 1 शीशी जोड़कर बफर को रोकें और बाँझ फिल्टर करें समाधान एक वैक्यूम फिल्ट्रेशन सिस्टम का उपयोग करके।
  8. M199 HEPES के 95 मिलील के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम के 5 मिलीएल और aliquoted ब्लेबिस्टटिन स्टॉक की 1 शीशी जोड़कर चढ़ाना बफर बनाओ। बाँझ एक वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली का उपयोग कर समाधान फिल्टर।
  9. एम 199 (25 एमएम हेप्स) के 396 एमएल में एलिकोड ब्लेबिस्टिसिन स्टॉक की एक 1 शीशी और 4 एमएलएस पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़कर मायोसाइट संस्कृति बफर बनाएं। बाँझ एक वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली का उपयोग कर समाधान फिल्टर।
  10. ड्यूमोंट चिमटी के ऑटोक्लेव 2 जोड़े, आइरिस घुमावदार कैंची के 2 जोड़े, 2 हेमोस्टेट, प्लास्टिक सर्जरी संदंश की एक जोड़ी, 6 काले लट रेशम 4-0 टांके एक सर्जिकल डबल फेंक गाँठ के रूप में इस्तेमाल करने की व्यवस्था की, और चार १०० mL beakers ।
  11. बंध्याकरण 22 x 22 मिमी2 ग्लास कवरस्लिप। सबसे पहले, एक छह अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक ही कवरस्लिप रखें। बाद में, ढक्कन हटा दिया के साथ, जैव सुरक्षा कैबिनेट के यूवी लैंप चालू करें और 1 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के लिए कवरस्लिप का पर्दाफाश करें।
  12. पहले बर्फ पर बोतल विगलन द्वारा काम कर टुकड़े टुकड़े स्टॉक समाधान बनाओ । 0.04 मिलीग्राम/mL की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए पर्याप्त ठंड बाँझ फास्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) में एक बोतल की सामग्री जोड़ें। अलीकोट 1.3 माइक्रोन को ऑटोक्लेव ्ड 1.5 मिलीस सेंट्रलाइज ट्यूबमें शामिल किया गया है। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रत्येक ट्यूब एक छह अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त टुकड़े टुकड़े है । कई फ्रीज गल चक्र से बचें।
  13. कोट बर्फ पर काम कर रहे टुकड़े टुकड़े समाधान पहले विगलन द्वारा कवरस्लिप निष्फल । एक P1000 पिपेट का उपयोग करना, एस्पिरेट 200 माइक्रोन लेमिनिन। धीरे-धीरे कवरस्लिप के एक किनारे के साथ पिपेट टिप खींचें ताकि केशिका कार्रवाई को छह अच्छी तरह से प्लेट में कवरस्लिप लगाव की सुविधा के लिए लैमिनिन की मामूली मात्रा खींचने की अनुमति दी जा सके।
  14. फिर, कवरस्लिप के केंद्र में शेष लेमिनिन को निष्कासित करें। एक परिपत्र गति में, कवरस्लिप के पार लेमिनिन ड्रॉपलेट फैलाएं। अलगाव से पहले कम से कम 1 घंटे और 24 घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।

2. लैंगेंडोर्फ उपकरण की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले लैंगेंडोर्फ उपकरण के अलग-अलग घटक सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं।

  1. परिसंचारी जल स्नान चालू करें। तापमान निर्धारित करें ताकि परफ्यूसेट का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस हो।
    नोट: समाधान जलाशयों के साथ 60 सेमी की ऊंचाई तक सेट, परिसंचारी जलजन्म को 41 डिग्री सेल्सियस तक सेट करने की आवश्यकता है ताकि परफ्यूसेट 37 डिग्री सेल्सियस हो सके। पहले रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल के विपरीत, जलाशय की ऊंचाई को बदलने की आवश्यकता नहीं है।
  2. 70% इथेनॉल के साथ लैंगेंडोर्फ उपकरण को कुल्ला करें और इसके बाद ऑटोक्लेव डबल आसुत पानी के साथ दो कुल्ला। कंइंबिंग के बाद, 100% ऑक्सीजन के साथ KHB-एचबी और ऑक्सीजन के साथ जलाशय भरें।
  3. ऑक्सीजनयुक्त केएचबी-एचबी को पहले 100 मीटर बीकर में प्रवाहित करने की अनुमति देकर सिस्टम को प्राइम करें। एक बार समाधान के ५० mL बीकर में प्रवाहित किया गया है, 3 तरह से बंद मुर्गा स्थिति स्विच करने के लिए KHB-एचबी जलाशय से प्रवाह को रोकने के । कोलेजेनेज जलाशय में बीकर से ऑक्सीजनयुक्त केएचबी-एचबी का 50 मिलील डालें।
  4. पाचन जलाशय से KHB-एचबी नाली चलो जब तक 5 मिलीएल कोलेजेनेज जलाशय में रहता है । कोलेजेनेज जलाशय को भड़काते हुए, लाइनों को डिगैस की अनुमति देने के लिए जलाशयों के बीच बार-बार 3-तरह के स्टॉप मुर्गा को स्विच करें। सिस्टम को प्राइम ेड करने के बाद, किसी भी शेष हवा को सिस्टम से बाहर निकलने की अनुमति देने के लिए हीटिंग कॉइल के शीर्ष पर स्थित डिगासिंग ट्रैप का उपयोग करना याद रखें।
  5. कोलेजेनेस का घोल बनाएं। चूहों के लिए 100 मिलीग्राम प्रकार द्वितीय कोलेजेनेज़, ऑक्सीजनयुक्त केएचबी-एचबी के 100 मिलीग्राम और ब्लेबिदाग स्टॉक की 2 शीशियों को मिलाते हैं। चूहों के लिए, 100 मिलीग्राम प्रकार द्वितीय कोलेजेनेस, ऑक्सीजनयुक्त केएचबी-एचबी के 40 मिलीग्राम और ब्लेबिदाग स्टॉक की 2 शीशियों को मिलाएं। एक बार मिश्रित होने के बाद, समाधान 1 घंटे के लिए स्थिर होना चाहिए।
    नोट: Myocyte व्यवहार्यता प्रकार द्वितीय कोलेजेनेज़ लॉट के बीच भिन्न हो सकती है। थोक आदेश से पहले बहुत परीक्षण करने के लिए कोलेजेनेस नमूना कार्यक्रम का लाभ उठाएं।

3. मायोसाइट अलगाव

  1. हेपरिन के 1,000 यू के साथ जानवर इंजेक्ट। 5 मिन रुको।
    नोट: चूहों और किसी भी उम्र के चूहों का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, सामान्य तौर पर पुराने या अधिक रोगग्रस्त जानवर, मायोसाइट उपज कम होता है।
  2. पेंटोबार्बिटल मिश्रण (150 मिलीग्राम/किलोइंट्राटोनियल) के साथ जानवर को इच्छामृत्यु से पहले ओपन-ड्रॉप विधि (500 सीसी की मात्रा के अनुसार आइसोफ्लोरीन के 1 सीसी) का उपयोग करके पहले एनेस्थेटाइजिंग करके जानवर को त्यागें।
  3. तेजी से पहले xiphoid प्रक्रिया के ऊपर फर हथियाने के द्वारा दिल आबकारी । आईरिस कैंची के साथ, xiphoid प्रक्रिया के तुरंत नीचे एक छोटा सा चीरा बनाएं और त्वचा को उजागर करने वाले सिर की ओर फर को ऊपर की ओर खींचें।
  4. xiphoid प्रक्रिया को पकड़ो और छाती गुहा को उजागर डायाफ्राम काट। एक जाल दरवाजा चीरा बनाओ, एक hemostat का उपयोग कर के उरोस्थि वापस खींच, और आरोही महाधमनी और ठंड े KHB-एचबी में जगह के ऊपर दिल आबकारी के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें ।
  5. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप और संख्या 5 संदंश का उपयोग कर दिल को कैन्यूलेट करें। सुनिश्चित करें कि दिल जलमग्न है और कैनुला एम्बोली को रोकने के लिए दिल के उत्तेजन से पहले प्रिमेड किया गया था । वेंट्रिकल में महाधमनी प्रविष्टि से लगभग 1 मिमी ऊपर कैनुला की नोक की कल्पना करके कैनुला की उचित स्थिति की पुष्टि करें।
    नोट: जितनी तेजी से कैनुलेशन समय, माइकोसाइट उपज उतना ही बेहतर होगा।
  6. लैंगेंडोर्फ पर स्टॉपकॉक घुमाकर KHB-HB का प्रवाह शुरू करें। कैनुला को लैंगेंडोर्फ से कनेक्ट करें। 5 मिन के लिए दिल को पर्क्यूपर करें।
    नोट: चूंकि परफ्यूजन को गुरुत्वाकर्षण-आधारित प्रणाली द्वारा आपूर्ति की जाती है, इसलिए दिल के माध्यम से प्रवाह कोरोनरी धमनी अनुपालन का कार्य होगा।
  7. केएचबी-एचबी जलाशय से पाचन बफर जलाशय में स्विच करें। एक बार पाचन बफर दिल तक पहुंचजाता है, एक टाइमर सेट (चूहे के लिए माउस या 15 min के लिए 5 मिन) सेट करें। एक बाँझ 100 मीटर बीकर में परफ्यूसेट इकट्ठा करना सुनिश्चित करें। पाचन बफर जलाशय को फिर से भरें जब तक कि पाचन समय समाप्त नहीं हो जाता, तब तक परफ्यूसेट के साथ आवश्यक हो।
  8. पाचन के बाद, दिल के कक्षों को संदंश और आईरिस कैंची के साथ एक बाँझ 100 मीटर बीकर में अलग करें। प्रत्येक कक्ष को एक छह अच्छी तरह से प्लेट के एक अलग कुएं में रखें। प्रत्येक अच्छी तरह से कोलेजेनेज़ समाधान के 5 mL डालो।
  9. कैंची का उपयोग करके तुरंत दिल के ऊतकों को कीमा बनाना शुरू करें। ऊतक का हिस्सा लगभग 1 मिमी3होना चाहिए। बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, धीरे कीमा बनाया हुआ दिल के ऊतकों को त्रिकोणीय। समाधान बादल बारी बारी चाहिए।
  10. एक बार ऊतक का हिस्सा सफेद और ढंका हो जाता है, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की जांच करें । यदि व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या 80% से अधिक है, तो कोशिकाओं को 100 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करके 50 मीटर शंकुई ट्यूब में तनाव ित करने के लिए आगे बढ़ें। दिल के प्रत्येक कक्ष के लिए एक अलग ट्यूब और छलनी का उपयोग करें।
    1. यदि व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या 80% से कम है, तो उस समय की जांच करें जो इसे रद्द करने में लगा है। यदि कैनुलेशन समय 5 मिन से अधिक है, तो एक और दिल की कोशिश करें। यदि नहीं, तो कोलेजेनेज नमूना कार्यक्रम के माध्यम से नई कोलेजेनेस बहुत सारे परखें।
  11. 2 मिन के लिए 215 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली मार। गोली कॉम्पैक्ट होनी चाहिए और ढीली नहीं होनी चाहिए। यदि गोली ढीली है, तो तैयारी में कई मृत कोशिकाएं होती हैं। एक ऊतक संस्कृति हुड में, बफर को रोकने के 10 मिलील में गोली को फिर से निलंबित करें।
  12. 2 मिन के लिए 215 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली मार। गोली कॉम्पैक्ट होनी चाहिए और ढीली नहीं होनी चाहिए। यदि गोली ढीली है, तो तैयारी में कई मृत कोशिकाएं होती हैं।
  13. चढ़ाना बफर के 5 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। एक सेल गिनती करें। प्रति मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर 2 x 104 कोशिकाओं की अंतिम मायोसाइट एकाग्रता तक पहुंचने के लिए चढ़ाना बफर के मिलीलीटर समायोजित करें।
  14. इनक्यूबेटर से लेमिनिन-कोटेड कवरस्लिप निकालें। लेमिनिन बूंद को एस्पिरेट करें।
  15. प्रत्येक कवरस्लिप पर मायोसाइट निलंबन की प्लेट 200 माइक्रोन। अटैचमेंट की अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (21% ओ2,5% सीओ2)में रखें। 2 घंटे के बाद, असंबद्ध कोशिकाओं को एस्पिरेट करें, संस्कृति मीडिया के 2 मिलील और 4 दिनों तक संस्कृति जोड़ें।

4. फुरा-2 डाये लोडिंग

  1. 2 एमएम फुरा-2 एसीटोक्सिमेथिल एस्टर (फुरा-2 AM) स्टॉक सॉल्यूशन डीएमएसओ के 25 माइक्रोन जोड़कर 50 माइक्रोन ऑफ फरा-2 एएम पाउडर (1 शीशी) में डालकर 2 एमएम फुरा-2 एसेटोथिल एस्टर (फुरा-2 एएम) स्टॉक सॉल्यूशन बनाएं। अलीकोट 6 μL aliquots में बाहर। फुरा-2 का 1 एलिकोट लें और चढ़ाना मीडियम के 6 mL में जोड़ें । भंवर मिश्रण करने के लिए।
  2. इनक्यूबेटर से मायोसाइट्स की 1 छह अच्छी प्लेट निकालें। एस्पिरेट मीडिया। प्रत्येक अच्छी तरह से फुरा-2 मीडिया मिश्रण के 1 mL जोड़ें। पन्नी के साथ कवर प्लेट, कमरे के तापमान पर थाली छोड़ दें, और 15 न्यूनतम इंतजार करें।
  3. एस्पिरेट फुरा-2 मीडिया मिश्रण और प्रत्येक अच्छी तरह से टायरोड के समाधान के 1 mL जोड़ें। पन्नी के साथ कवर करें। इमेजिंग से पहले रंग धोने के लिए अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 20 न्यूनतम प्रतीक्षा करें।

5. फ्लूओ-4 डी लोडिंग

  1. डीएमएसओ के 25 माइक्रोन को फ्लो-4 एएम पाउडर (1 शीशी) में जोड़कर 1.82 एमएम फ्लू-4 एसेटोक्सिथाइल एस्टर (फ्लोओ-4 एएम) स्टॉक सॉल्यूशन बनाएं। अलीकोट 8.333 माइक्रोन अलीकोट में। फ्लो-4 एएम स्टॉक का 1 एलिकोट लें और चढ़ाना माध्यम के 6 मिलील में जोड़ें। भंवर मिश्रण करने के लिए।
  2. इनक्यूबेटर से मायोसाइट्स की 1 छह अच्छी प्लेट निकालें। एस्पिरेट मीडिया। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए फ्लो-4 AM मीडिया मिश्रण के 1 mL जोड़ें । पन्नी के साथ कवर प्लेट, कमरे के तापमान पर थाली छोड़ दें, और 15 न्यूनतम इंतजार करें।
  3. एस्पिरेट फ्लो-4 AM मीडिया मिश्रण और प्रत्येक अच्छी तरह से टायरोड के समाधान के 1 mL जोड़ें । पन्नी के साथ कवर करें। इमेजिंग से पहले रंग धोने के लिए अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 20 न्यूनतम प्रतीक्षा करें।

6. झिल्ली संभावित रंग लोडिंग

  1. झिल्ली संभावित किट से घटक ए और घटक बी निकालें। 15 मिलीएल शंकुई ट्यूब में, घटक बी के 50 माइक्रोन और घटक ए भंवर के 5 μL को मिलाकर मिलाएं। वोल्टेज डाया मिश्रण युक्त 15 mL शंकुन ट्यूब के लिए चढ़ाना मीडिया के 10 mL जोड़ें । भंवर मिश्रण करने के लिए।
  2. इनक्यूबेटर से मायोसाइट्स की 1 छह अच्छी प्लेट निकालें। मीडिया को एस्पिरेट करें। प्रत्येक अच्छी तरह से झिल्ली संभावित रंग मिश्रण के 800 μL जोड़ें। पन्नी के साथ कवर प्लेट, कमरे के तापमान पर थाली छोड़ दें, और 15 न्यूनतम इंतजार करें।
  3. एस्पिरेट डाया मीडिया मिश्रण और प्रत्येक अच्छी तरह से संशोधित-टायरोड के समाधान के 1 mL जोड़ें । पन्नी के साथ कवर करें।

7. फोटोमेट्री और चार्ज युग्मित डिवाइस रिकॉर्डिंग

  1. निम्नलिखित क्रम में उपकरण चालू करें: माइक्रोस्कोप, आर्क लैंप, हाइपरस्विच, फ्लोरेसेंस इंटरफेस सिस्टम, मायोकैम पावर सप्लाई, फील्ड उत्तेजक और कंप्यूटर।
  2. सुनिश्चित करें कि उत्तेजना/उत्सर्जन फिल्टर सेट इमेजिंग रंग के लिए उपयुक्त हैं ।
    नोट: फुरा-2 340 एनएम और 380 एनएम प्रकाश पर उत्साहित है। यह प्रकाश के 510 एनएम पर उत्सर्जित करता है। फ्लूओ-4 और वोल्टेज झिल्ली रंग प्रकाश के 485 एनएम पर उत्साहित हैं और प्रकाश के 520 एनएम पर उत्सर्जित करते हैं।
  3. वैक्यूम चालू करके सिस्टम को प्राइम करें, पूरी तरह से नली क्लैंप खोलें, और धीरे-धीरे प्रत्येक 60 मिलीग्राम सिरिंज को कई गुना में उपयोग किया जा रहा है। कैल्शियम रिकॉर्डिंग के लिए टायरोड के समाधान का उपयोग करें। वोल्टेज रिकॉर्डिंग के लिए संशोधित टाइरोड के समाधान का उपयोग करें।
  4. परफ्यूजन ट्यूबिंग पर रोलर क्लैंप को समायोजित करके हीटर चालू करें और प्रवाह सेट करें। 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर रिकॉर्डिंग करें।
  5. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें। सुनिश्चित करें कि पैरामीटर सही इमेजिंग रंग के लिए निर्धारित कर रहे हैं।
  6. अंधेरे में पन्नी को छह कुएं की प्लेट से निकालकर पेसिंग चैंबर में कवरस्लिप रखें। सुनिश्चित करें कि इस चरण के दौरान उत्तेजक बंद है। 10x उद्देश्य का उपयोग कर myocytes पर ध्यान केंद्रित करें।
  7. एक बार ध्यान में, 1 हर्ट्ज, 0.2 वी पर क्षेत्र उत्तेजक द्वारा पेसिंग शुरू धीरे-धीरे 1:1 पेसिंग प्राप्त होने तक वोल्टेज में वृद्धि करें। फिर वोल्टेज को तब तक बढ़ाएं जब तक कि 1.5x सीमा तक पहुंच न जाए।
    नोट: क्योंकि उत्तेजना संकुचन युग्मन तापमान निर्भर है, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को रिकॉर्डिंग से पहले 15 min के लिए व्याप्त किया गया है । यह मायोसाइट्स को कमरे के तापमान से 37 डिग्री सेल्सियस तक वापस जाने के सदमे से उबरने के साथ-साथ शिथिल संलग्न कोशिकाओं को दूर तैरने की अनुमति देता है।
  8. 10x उद्देश्य से 40x उद्देश्य के लिए स्विच करें। एक सेल पर ध्यान केंद्रित करें जो 1:1 पेसिंग का पालन कर रहा है। प्लास्टिक के रंगों को समायोजित करें ताकि केवल एक कोशिका देखने के क्षेत्र में हो।
  9. सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, ब्याज बॉक्स के क्षेत्र को अच्छी तरह से परिभाषित सरकोरेस पर रखें। उत्तेजना प्रकाश शुरू करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें। तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग करना, एक पर्याप्त SNR प्राप्त करने के लिए तदनुसार तीव्रता सेटिंग समायोजित करें ।

Representative Results

चित्रा 1ए लैंगेंडोर्फ उपकरण को दिखाता है। ऑक्सीजनेटर केएचबी-एचबी जलाशय में है। कोलेजेनेज सॉल्यूशन बीच 60 मिलीआर सिरिंज जलाशय में है। डिगासिंग लाइन खाली 60 मिलीस सिरिंज जलाशय से जुड़ी हुई है। एक सफल अलगाव के बाद, अधिकांश कोशिकाओं को रॉड के आकार और स्ट्रेटेड होना चाहिए। एक 40x उद्देश्य के तहत, अधिकांश मायोसाइट्स में स्पष्ट स्ट्राइशन दिखाई देने चाहिए। चित्रा 1बी, सी स्वस्थ चूहा myocytes के उदाहरण दिखाता है। एक बार अलग होने के बाद, कोशिकाओं को उनके आकृति विज्ञान और विद्युत गुणों को बनाए रखते हुए 4 दिनों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है।

उत्तेजना-संकुचन युग्मन को मापने के लिए, कोशिकाओं को फिर एक गर्म पेसिंग कक्ष में रखा जाता है। क्योंकि मायोसाइट्स तापमान में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं, रिकॉर्डिंग से पहले कवरस्लिप को कक्ष में 15 न्यूनतम के लिए समतुल्य करने की अनुमति देना महत्वपूर्ण है। फ्लोरेसेंस रिकॉर्डिंग के लिए, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 75 डब्ल्यू ज़ेनन-आर्क बल्ब द्वारा उत्पन्न होता है। ज़ेनन-आर्क बल्ब एक हल्के स्पेक्ट्रम का उत्पादन करते हैं जो प्राकृतिक सूरज की रोशनी की नकल करता है। प्रकाश की तीव्रता और तरंगदैर्ध्य को तटस्थ घनत्व/उत्सर्जन फाइलर्स द्वारा नियंत्रित किया जाता है । उत्तेजना प्रकाश तो उद्देश्य के माध्यम से myocyte के लिए गुजरता है । उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य तो एक फोटोमल्टीचर ट्यूब द्वारा एकत्र किया जाता है। यहां वर्णित प्रणाली का उपयोग करते हुए, उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर दोनों को मैन्युअल रूप से बदलने की आवश्यकता है।

दूसरी ओर छोटा एक चार्ज युग्मित डिवाइस सेंसर द्वारा प्राप्त किया जाता है। वास्तविक समय में प्रति सेकंड 1,000 बार मापने, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर एक अच्छी तरह से हल किया गया ट्रिशन पैटर्न बनाने के लिए ब्याज के क्षेत्र के भीतर लाइनों का औसत करता है। इसके बाद एक फास्ट फोरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) की गणना की जाती है। पावर स्पेक्ट्रम के भीतर चोटी औसत सरकोवर अंतर का प्रतिनिधित्व करती है। पेसिंग के दौरान सरकोवर स्पेसिंग में बदलाव की साजिश रची जाती है और बाद में मात्रा निर्धारित की जाती है ।

चित्रा 2 कैल्शियम और छोटा एक C57/B6 माउस myocyte कैल्शियम साये fura-2 के साथ भरी हुई से दर्ज निशान से पता चलता है । पेसिंग प्रोटोकॉल पेसिंग प्रोटोकॉल में संशोधन है , जो पहले10,11वर्णित था . स्वस्थ माउस myocytes को अपने आराम दिल की दर 10 हर्ट्ज पर पुस्तक में सक्षम होना चाहिए । चित्रा 3 एक C57/B6 चूहों और उनके ट्रांसजेनिक (टीजी) लिटरमेट्स जो एक बिंदु उत्परिवर्तन एक पोटेशियम चैनल में पेश किया था से प्राप्त कलाकारों की टुकड़ी औसत डेटा की मात्रा है । सूचना 10 हर्ट्ज पेसिंग पर छूट समय के अलावा समूहों के बीच कोई अंतर नहीं है।

फुरा-2 के विपरीत जो एक दोहरी उत्तेजना रंग है, वोल्टेज रंग और फ्लो-4 एकल तरंगदैर्ध्य उत्तेजना रंग ों जिनका उत्तेजना/उत्सर्जन मानक FITC उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम (494/506 एनएम) के साथ काम कर रहे हैं । इसलिए, कैल्शियम और सरकोरे छोटा करने या वोल्टेज और सरकोरे छोटा करने की रिकॉर्डिंग इस फिल्टर सेट का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है।

चित्रा 4ए C57/B6 माउस माइकोसाइट से दर्ज की गई वोल्टेज ट्रेसिंग को 10 हर्ट्ज पर रिकॉर्ड करता है । कैल्शियम संकेतों की तुलना में, एकल सेल वोल्टेज ट्रेसिंग आयाम में छोटे है और एक useable संकेत प्राप्त करने के लिए पोस्ट प्रसंस्करण की जरूरत है । चित्रा 4बी एक पहनावा औसत कार्रवाई क्षमता (एपी) चित्रा 4एमें एपीएस से बना दिखाता है । चित्रा 4सी, डी एक कम पास Butterworth या एक Savitzky-Golay डिजिटल फिल्टर लागू किया गया था के बाद एक पहनावा औसत एपी से पता चलता है । वास्तविक डेटा को विकृत न करने के लिए संकेत को फ़िल्टर करते समय देखभाल की जानी चाहिए। चित्रा 4बी-डीमें एपीएस के आकार में सूक्ष्म अंतर पर ध्यान दें।

चित्रा 5 चूहा myocytes से दर्ज निशान से पता चलता है 1 हर्ट्ज पर पुस्तक । वोल्टेज सिग्नल कैल्शियम सिग्नल से कम होने के अलावा, संकुचन गतिज भी अलग हैं। इसका कारण यह है कि कैल्शियम रंग बफर कैल्शियम जबकि वोल्टेज रंग नहीं है।

कैल्शियम क्षणिक(चित्रा 3)के साथ के रूप में, myocytes उनके ऑप्टिकल कार्रवाई क्षमता अवधि (एपीडी) के रूप में अच्छी तरह से(चित्रा 6)में निर्भर परिवर्तन पेसिंग का प्रदर्शन किया । जबकि फुरा-2 निशान मात्रा निर्धारित होने से पहले औसत कलाकारों की टुकड़ी थे, वोल्टेज निशान एक Savitzky-Golay पॉलीनोमियल चौरसाई फिल्टर (चौड़ाई 5, आदेश 2) के साथ फ़िल्टर किया गया इससे पहले कि कलाकारों की टुकड़ी का औसत और मात्रा निर्धारित किया जा रहा है ।

के रूप में चित्रा 6 और चित्रा 7में मात्रा, APD में पेसिंग प्रेरित परिवर्तन का प्रदर्शन करने के अलावा, वे भी एपी के दवा प्रेरित दीर्घीकरण का प्रदर्शन किया । 4 हर्ट्ज पेसिंग पर, 4-aminopyridine के साथ क्षणिक जावक वर्तमान (Ito)की एकाग्रता निर्भर नाकाबंदी के परिणामस्वरूप एपीडी का लंबाई हो गई।

अंत में, साइटोटॉक्सिकिसिटी से बचने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। चित्रा 8 एक 20 एस रिकॉर्डिंग के अंतिम 11 एस है । चित्रा 8में लाल तीर द्वारा इंगित, नीली रोशनी के लिए माइओसाइट्स के लंबे समय तक जोखिम ट्रिगर गतिविधि की ओर जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: लगातार दबाव लैंगेंडोर्फ उपकरण। (A)सफेद अक्षरों में लेबल किए गए प्रत्येक घटक के साथ लैंगेंडोर्फ उपकरण। (ख)अलग-थलग पड़े स्प्राग-डाले रैट माइओसाइट्स को 10x उद्देश्य के माध्यम से देखा गया। (ग)अलग चूहा myocytes एक 40x उद्देश्य के माध्यम से देखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि कैल्शियम और sarcomere छोटा C57/B6 myoyctes से दर्ज की गई fura-2 का उपयोग कर निशान । कैल्शियम और सरकोरे के निशान 1, 2, 4, 10, 0.5 और 0.75 हर्ट्ज दर्ज किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सरकोरे छोटा, पीक कैल्शियम, विश्राम समय, और एक C57/B6 जंगली प्रकार (WT) और ट्रांसजेनिक (टीजी) चूहों से दर्ज समय फिर से लेना की मात्रा । (A)सरकोरे छोटा। (ख)पीक कैल्शियम। (ग)छूट समय को छोटा करने वाले निशान के आधार रेखा पर 90% रिटर्न के रूप में परिभाषित किया गया है। (घ)कैल्शियम ट्रेस के बेसलाइन पर 90% रिटर्न के रूप में परिभाषित समय को फिर से लेना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ऑप्टिकल कार्रवाई क्षमता एक C57/B6 माउस myocyte से दर्ज की गई 10 हर्ट्ज पर पुस्तक । (A)1 सेकंड अनफ़िल्टर्ड ट्रेस। (ख)पहनावा औसत ऑप्टिकल कार्रवाई क्षमता । (ग)एक लोपास बटरवर्थ फिल्टर लागू होने के बाद पहनावा औसत ऑप्टिकल कार्रवाई क्षमता। (घ)एक Savitzky-Golay पॉलीनोमियल चौरसाई फिल्टर लागू किया गया था के बाद पहनावा औसत ऑप्टिकल कार्रवाई क्षमता । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि कैल्शियम, वोल्टेज, और सरकोरे छोटे निशान स्प्राग-Dawley चूहा myocytes से दर्ज की गई 1 हर्ट्ज पर पुस्तक । (A)फ्लो-4 का उपयोग करके 1 हर्ट्ज पेसिंग पर दर्ज किए गए कैल्शियम और सरकोवर के निशान को छोटा करना। (ख)वोल्टेज और सरकोरे ने वोल्टेज डाया का उपयोग करके 1 हर्ट्ज पेसिंग पर दर्ज किए गए निशानों को छोटा किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: स्प्राग-डावले चूहा माइओसाइट्स से दर्ज ऑप्टिकल एक्शन क्षमता 1, 2 और 4 हर्ट्ज पेसिंग पर पुस्तक है। (A)1 हर्ट्ज पेसिंग पर फ़िल्टर किया गया ट्रेस। (ख)2 हर्ट्ज पेसिंग पर फ़िल्टर किया गया ट्रेस। (ग)4 हर्ट्ज पेसिंग में फ़िल्टर किया गया ट्रेस। (D)कार्रवाई संभावित अवधि 10, बेसलाइन पर 10% वापसी के रूप में मापा जाता है । (ई)कार्रवाई संभावित अवधि 50, बेसलाइन पर 50% रिटर्न के रूप में मापा गया। (एफ)कार्रवाई संभावित अवधि 90, बेसलाइन पर 90% रिटर्न के रूप में मापा गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: स्प्राग-डाले चूहा ऑप्टिकल एक्शन क्षमता पर 4-aminopyridine का प्रभाव 4 हर्ट्ज पेसिंग में दर्ज की गई। (A)सांकेबल औसत ट्रेस 4 हर्ट्ज पेसिंग में दर्ज नहीं है, जिसमें कोई 4-Aminopyridine समाधान में नहीं है । (ख)सांकेबल ्ड ने सॉल्यूशन में 1 माइक्रोन 4-अमीनोपिरिडिन के साथ 4 हर्ट्ज पेसिंग में दर्ज किया । (ग)सांकेबल्ड एवरेज ट्रेस ने समाधान में 10 माइक्रोन 4-अमीनोपिरिडिन के साथ 4 हर्ट्ज पेसिंग में दर्ज किया । (D)कार्रवाई संभावित अवधि 10, बेसलाइन पर 10% वापसी के रूप में मापा जाता है । (ई)कार्रवाई संभावित अवधि 50, बेसलाइन पर 50% रिटर्न के रूप में मापा गया। (एफ)कार्रवाई संभावित अवधि 90, बेसलाइन पर 90% रिटर्न के रूप में मापा गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: लगातार प्रकाश जोखिम के 20 एस के बाद स्प्राग-डाले चूहा माइओसाइट्स में वोल्टेज डाइस प्रेरित फोटोटॉक्सिकिटी। लाल तीर साइटोटॉक्सिक घटनाओं का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

कार्डियक माइओसाइट्स को अलग करने में सक्षम होना एक शक्तिशाली तरीका है जिसका उपयोग कार्डियक फिजियोलॉजी, पैथोलॉजी और विष विज्ञान को समझने के लिए किया जा सकता है। उपरोक्त प्रोटोकॉल में, हमने एक विधि का वर्णन किया जो एकल कार्डियक माइओसाइट्स प्राप्त करने के लिए निरंतर गुरुत्वाकर्षण दबाव लैंगेंडोर्फ तंत्र का उपयोग करती है। बाद में, फ्लोरेसेंस फोटोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके, हम वर्णन करते हैं कि कैसे एक साथ कैल्शियम और छोटा या वोल्टेज और छोटा निशान प्राप्त करें।

कैल्शियम रंगों के बीच विभिन्न गतिज के कारण, देखभाल की जानी चाहिए जिस पर चयन करने के लिए रंगे। इस प्रोटोकॉल के लिए, दोनों fura-2 और फ्लोओ-4 इस्तेमाल किया AM esters के साथ इंजीनियर थे एक धोने के कदम की आवश्यकता के लिए इंट्रासेलुलर esterases समय के लिए अनुमति देने के लिए AM समूह क्लीव और सेल में रंगे जाल । जबकि दोनों फुरा-2 और फ्लोओ-4 उच्च आत्मीयता कैल्शियम रंग माना जाता है, फुरा-2 के लिए केडी फ्लो-49के लिए ३४५ एनएम की तुलना में १४५ एनएम है । इसके अलावा फुरा-2 रेशियोमेट्रिक है। इस वजह से, इसका उपयोग इंट्रासेलर कैल्शियम के स्तर9,12को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। दूसरी ओर फ्लो-4 एक ही तरंग कैल्शियम जांच है। फ्लो-4 का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह एक उज्जवल फ्लोरेसेंस संकेत पैदा करता है। कैल्शियम के रंगे की तुलना में कैल्शियम डाया का उपयोग किया जाता है, झिल्ली वोल्टेज जांच में कम एसएनआर होता है।

जैसा कि चित्र 4 और चित्रा 5में दिखाया गया है, कैल्शियम के निशान की तुलना में वोल्टेज के निशान आयाम में छोटे होते हैं। सॉफ्टवेयर के डिजिटल ट्रेस फ़िल्टरिंग का उपयोग करके, एसएनआर को बढ़ाना और डेटा(चित्रा 4 और चित्रा 7)की मात्रा निर्धारित करना संभव है। एक बार मात्रा निर्धारित होने के बाद, कैल्शियम ट्रांसिएंट्स और ऑप्टिकल एपीडी दोनों क्षतिपूर्ति का प्रदर्शन करते हैं, तेजी से पेसिंग आवृत्तियों पर उनकी अवधि को छोटा करते हैं(चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 6,और चित्रा 7)। डायस्टोल के दौरान वेंट्रिकुलर भरने के लिए पर्याप्त समय देने के लिए तेजी से पेसिंग चक्र ों के दौरान छोटे एपीडी आवश्यक हैं। इस घटना में परिवर्तन को13, 14,15,16के जोखिम में वृद्धि का संकेत माना जाता है . जबकि एपीडी में परिवर्तन बीमारी के कारण हो सकता है, वे भी रसायनों के कारण हो सकता है । जैसा कि चित्र 7में दिखाया गया है, जब प्रमुख मूत्र पोटेशियम वर्तमान को पुनर्ध्रुवीकृत करता है, तो मुझे अवरुद्ध कर दिया जाता है, ऑप्टिकल एपीडी लंबा हो जाता है।

फिर भी, जैसा कि पहले वोल्टेज संवेदनशील रंगों के साथ बताया गया था, प्रकाश तीव्रता और अवधि एपीडी2,5,17को बदल सकती है। यह प्रतिक्रियाशील ऑक्सीडेटिव प्रजातियों (ROS)5की पीढ़ी का परिणाम माना जाता है । पहले, यह दिखाया गया है कि रिकॉर्डिंग समाधान में एंटीऑक्सीडेंट के अलावा वोल्टेज संवेदनशील रंग साइटोटॉक्सिकिटी5को रोक सकता है। नतीजतन, हमने टाइरोड के समाधान में एंटीऑक्सीडेंट एल-ग्लूटाथिएक (10 एमएम) जोड़ा। चित्रा 8 में दिखाया गया है एक 20 एस रिकॉर्डिंग के अंतिम 11 एस 1 हर्ट्ज पेसिंग पर प्राप्त की है । जैसा कि लाल तीरों द्वारा इंगित किया गया है, एपीडी में परिवर्तन रिकॉर्डिंग में 15 एस तक नहीं होते थे; इसलिए, जबकि संशोधित टाइरोड के समाधान ने फोटोटॉक्सिकिटी को नहीं रोका, इसमें काफी देरी हुई। संशोधित टाइरोड के समाधान का उपयोग करना, कम प्रकाश तीव्रता सेटिंग का उपयोग करना और रिकॉर्डिंग की अवधि को 5 एस के तहत रखना, एपीडी में किसी भी रंग प्रेरित परिवर्तन से बचना संभव है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि फोटोटॉक्सिकिटी से बचने के लिए ध्यान रखने के बिना, डेटा को ध्रुवीकरण के बाद जल्दी या देरी के कारण के रूप में गलत तरीके से समझा जा सकता है। नीली रोशनी के संपर्क को सीमित करने के अलावा, डेटा की गलत व्याख्या को रोकने के लिए अतिरिक्त सावधानियां बरती जा सकती हैं।

पहला कोशिकाओं से केवल रिकॉर्ड करना है जो एक से एक पेसिंग का पालन करते हैं और 1.75 माइक्रोन से अधिक या बराबर आराम करने वाली सरकोवर लंबाई होती है। १.७५ μm कटऑफ गॉर्डन एट अल द्वारा अवलोकन से लिया जाता है ।18 कि तनाव तेजी से गिरावट आती है एक बार sarcomere लंबाई इस राशि से नीचे है । फिर भी, कुछ विकृतियों के परिणामस्वरूप सरकोरे लंबाई को आराम करने में महत्वपूर्ण परिवर्तन हो सकते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि फेनोटाइप वास्तविक है और अलगाव का एक विरूपण साक्ष्य नहीं है, निम्नलिखित परेशानी शूटिंग दृष्टिकोण लिया जाना चाहिए।

यदि मायोसाइट्स लगातार 1:1 पेसिंग का पालन नहीं कर रहे हैं, तो 1.75 माइक्रोन से नीचे की सरकोरे लंबाई है, भारी झिल्ली ब्लबिंग, या अलगाव से बच नहीं पाते हैं, जांचने के लिए पहली बात यह है कि दिल को कैन्युलेट करने में लगने वाला समय है। कैनुलेशन का समय जितना लंबा होगा, पैदावार जितनी कम होगी। यदि एक लंबे कैनुलेशन समय की आवश्यकता है, तो दिल को कार्डियोप्लेजिक सॉल्यूशन19में रखकर व्यवहार्यता में सुधार किया जा सकता है। बहरहाल, क्योंकि कोलेजन एक एंजाइम है, गतिविधि और समय के साथ एक विशिष्ट बहुत परिवर्तन की विशिष्टता । यदि समग्र पैदावार उत्तरोत्तर अच्छा कैनुलेशन समय के बावजूद बदतर हो जाते हैं, तो नए लॉट को परख दिया जाना चाहिए। जबकि हमारे प्रोटोकॉल को 5 एस रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित किया गया था, यदि लंबे समय तक वोल्टेज निशान की आवश्यकता है, तो अतिरिक्त तटस्थ घनत्व फिल्टर खरीदे जाने की आवश्यकता होगी। प्रोटोकॉल में वर्णित प्रणाली तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ आती है जो संचारित प्रकाश को 37%, 50%, 75%, 90%, और 95% तक कम करती है।

संक्षेप में, हमने एक पद्धति का वर्णन किया है जिसने वयस्क मूत्र वेंट्रिकुलर माइओसाइट्स के अलगाव के लिए अनुमति दी थी जिसका उपयोग कैल्शियम, वोल्टेज और सरकोवर छोटा माप के लिए किया जाता था।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक प्रूफरीडिंग के लिए दाना मोर्गेनस्टर्न का शुक्रिया अदा करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25 Liter Water Jacketed Reservoir Radnoti, LLC 120142-025
1 liter volumetric flask Fisher Scientific 10-205F
100 ml beaker Fisher Scientific FB-100-100
100 ml graduated cylinder Fisher Scientific 08 562 5C
1000 ml flask Fisher Scientific FB-500-1000
2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods Radnoti, LLC 159951-2
4-Aminopyridine Sigma-Aldrich 275875
40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm) IonOptix MSCP1-40 (b)
60-mL syringe, BD Luer-Lok tip BD 309650
Aortic Metal Cannulae Harvard Apparatus 73-0112
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9703-100
C-6 Standard Heating Circulator Chemyx A30006
CaCl2 Fisher Scientific BP510500
Cell framing adapter IonOptix CFA300
CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12 Labratory Product Sales, Inc V100022
CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12 Labratory Product Sales, Inc V25022
CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS Labratory Product Sales, Inc V50022
CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater IonOptix TEMPC2
Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks Cole-Parmer EW-30600-23
Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way Cole-Parmer EW-30600-12
Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip Cole-Parmer EW-30600-01
Collagenase Type II Worthington LS004177
Corning Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 07-201-432
Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro IonOptix CPUD7M
DMSO Fisher Scientific 50980367
Dumont Tweezers Style 5 Amazon B00F70ZDEQ
FHD Rapid Change Stimulation Chamber IonOptix FHDRCC1
Fluo-3/4 Optics Package IonOptix IonOP-Fluo
Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card) IonOptix FSI700
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15-140-122
Glucose Fisher Scientific D16-1
Hemostat, Curved 5-1/2" Amazon B00GGAAPD0
HEPES Fisher Scientific BP310500
HyperSwitch dual excitation light source IonOptix HSW400
Inverted Motic Fluorescence Microscope IonOptix MSCP1-40 (a)
IonWizard Core + Analysis IonOptix IONWIZ
Iris Scissors, curved Amazon B018KRRMY6
K2HPO4 Fisher Scientific P288-100
KCl Fisher Scientific BP3661
L-Glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds SouthernAnesthesiaSurgical Inc. SP116-EA
M199 Media Fisher Scientific 12 340 030
MgCl2 Fisher Scientific MP021914215
MgSO4 Fisher Scientific BP2131
MyoCam-S Digital CCD video system IonOptix MCS100
MyoPacer Field Stimulator IonOptix MYP100
NaCl Fisher Scientific BP358212
NaH2PO4 Fisher Scientific 56-754-9250GM
Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter Radnoti, LLC 140143-025
Photomultiplier sub-system IonOptix PMT400
PMT Acquisition add-on IonOptix PMTACQ
Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap Radnoti, LLC 158830
Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir Radnoti, LLC 120141-025
Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber Radnoti, LLC 120149RC
Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in. Fisher Scientific 14-171-214
Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in. Fisher Scientific 14-171-217
Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in. Fisher Scientific 14-171-219
Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in. Fisher Scientific 14-171-226
Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in. Fisher Scientific 14-171-209
Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in. Fisher Scientific 14-171-210
Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in. Fisher Scientific 14-171-213
Sarcomere Length Recording add-on IonOptix SARACQ
T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75" Amazon B00JDWRBGC
VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers Amazon B07QMZC94J
Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform IonOptix ISO100

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रिऐक्शन इश्यू 155 माइकोसाइट एंजाइमैटिक आइसोलेशन ऑप्टिकल एक्शन क्षमता कैल्शियम उत्तेजना-संकुचन युग्मन कार्रवाई संभावित अवधि
अलग-थलग पड़े मुमूत्र वेंट्रिकुलर माइओसाइट्स की ऑप्टिकल इमेजिंग
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Han, S., Klos, M., Morgenstern, S.,… More

Han, S., Klos, M., Morgenstern, S., Ahmad, R., Pua, I., Suresh, S., Hicks, K., Devaney, E. Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes. J. Vis. Exp. (155), e60196, doi:10.3791/60196 (2020).

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