Summary
우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.
Abstract
성인 심장 근세포를 분리하는 능력은 연구원이 단 하나 세포 수준에 있는 심장 병리학의 다양한 공부하는 것을 허용했습니다. 칼슘 에민감한 염료의 발전은 단일 세포 칼슘 역학의 강력한 광학 기록을 허용했지만, 강력한 막간 광 전압 신호의 기록은 여전히 어려웠습니다. 틀림없이, 이것은 낮은 단일 대 소음 비율, 광 독성 및 전통적인 전위 성 염료의 광 표백 때문입니다. 따라서 단일 셀 전압 측정은 오랫동안 패치 클램프 기술에 국한되어 왔으며, 이는 금 본위제이지만 기술적으로 까다롭고 처리량이 낮습니다. 그러나 새로운 전위성 염료의 개발로, 전압 변화에 대한 크고 빠른 광학 반응은 광독성 및 광표백과 거의 또는 전혀 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 단축, 칼슘 및 광학 전압 측정에 사용할 수 있는 성인 뮤린 근세포를 분리하는 방법을 자세히 설명합니다. 구체적으로, 프로토콜은 비율측정 칼슘 염료, 단일 여기 칼슘 염료 및 단일 여기 전압 염료를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 다양한 화학 약제의 심장 독성 및 부정맥성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 광독성은 여전히 단일 세포 수준에서 문제가되지만 방법론은 이를 줄이는 방법에 대해 논의됩니다.
Introduction
건강하고 병리학적인 상태 동안 심장을 연구하기 위해서는 단일 세포 수준에서 표현형을 검사하는 것이 종종 유용합니다. 과학적 진보로 단일 세포 칼슘 역학의 강력한 측정이 허용되었지만 단일 셀 광학 전압 측정은1에거의 남아 있습니다. 틀림없이, 이것은 낮은 신호 대 잡음 비 (SNR), 광 독성 및 전통적인 전위 염료2,3의광 표백 때문입니다. 그럼에도 불구하고, 단리된 근세포 광학 작용 전위는2,3,4. 또한, 화학 및 전압 에민감한 염료의 물리학의 발전과 함께, SNR은5를향상시켰다. 새로운 멤브레인 전위프로브(표)는밀리초 단위로 멤브레인 전위 변화에 반응하며 100 mV당 약 25%의 형광 반응 범위를 갖습니다. 또한, 멤브레인 전위 키트의 여기/방출(예를 들어, FluoVolt; 재료 표) 이 프로토콜에서 사용되는 표준 플루오레세인 이소티오시오야네이트(FITC) 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 설정6.
FITC 및 GFP 여기/방출 스펙트럼은 플루오-4 칼슘 경계 스펙트럼7과겹칩니다. 디지털 세포 기하학 측정과 형광 광도계의 동시 수집은 전통적으로 칼슘 및 세포 단축 측정의 동시 수집에 사용되어 왔다8. 이 프로토콜은 뮤린 근세포분리 방법과 표준 FITC 설정을 사용하여 칼슘 또는 전압 신호를 기록하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이미징 워크스테이션의 여기/방출 필터의 간단한 스위치를 사용하여 비율 메트릭 메트릭 칼슘 염료 fura-2를 사용하여 칼슘 및 단축 측정을 얻을 수 있는 방법을 설명합니다. 플루오-4에 비해 fura-2는 칼슘에 대한 친화력이 높으며 광표백9에상대적으로 내성이 있습니다. 따라서 단일 워크스테이션을 사용하여 이 프로토콜을 사용하면 단독으로 근세포 여기-수축 커플링을 철저히 검사할 수 있습니다.
Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 방법과 절차는 케이스 웨스턴 리저브 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션, 인스트루먼트 및 커버슬립 준비
참고: 최대 한 달 동안 1x 솔루션을 사용할 수 있습니다.
- 68.96 g의 NaCl을 첨가하여 칼슘(KHB-HB)이 없는 10x 크렙스-헨셀레이트 완충제 완충액을 만들어, KCl 3.57 g, HEPES 59.58 g,K2HPO42.18 g, MgSO4 및 19.82 g의 포도당 800 mL에 1,000 mL 플라스크. 내용이 완전히 녹은 후, 1,000 mL 의 부피 플라스크에 부피를 올린다.
참고: 기존의 크렙스 헨셀레이트 용액은 중탄산나트륨을 완충액으로 사용하며, 이 프로토콜의 용액은 HEPES 버퍼가 있는 크렙스 헨셀레이트 용액을 사용합니다. 용액은 멸균 여과된 경우 6개월 동안 안정적입니다. - NaCl 86.51 g, NaH2PO4,MgCl2,포도당 9.91 g, KCl 4.03 g, CaCl2의 2.65 g, HEPES 35.76 g를 증류수 10 0 0 00 mL에 800 mL에 추가하여 10x Tyrode의 용액을 만듭니다. 내용이 완전히 녹은 후 1000 mL 부피 플라스크에 부피를 올바예하십시오.
참고: 멸균 여과시 용액은 6개월 동안 안정적입니다. - 10x 스톡의 100mL를 측정하고 1,000mL 플라스크에 875mL의 이중 증류수를 추가하여 1x KHB-HB를 만드십시오. 플라스크를 37°C 수조에 놓습니다. 용액이 37°C에 도달하면 NaOH를 사용하여 pH를 7.39로 증가시다. pH를 조정한 후 1000mL 부피 플라스크에 용액을 부피화하십시오. 진공 여과 시스템을 사용하여 용액을 멸균 필터합니다.
- 10x 스톡의 100mL를 측정하고 1,000mL 플라스크에 875mL의 이중 증류수를 추가하여 1x Tyrode의 솔루션을 만듭니다. 플라스크를 37°C 수조에 놓습니다. 용액이 37°C에 도달하면 NaOH를 사용하여 pH를 7.39로 증가시다. pH를 조정한 후 1,000mL 부피 플라스크에 용액을 부피화하십시오. 진공 여과 시스템을 이용한 멸균 필터.
- 10x 스톡의 100mL를 측정하고 1,000mL 플라스크에 875mL의 이중 증류수를 추가하여 Tyrode의 솔루션을 1x 수정합니다. 플라스크에서 감소된 L-글루타티온 3.07 g을 용해시. 플라스크를 37°C 수조에 놓습니다. 용액이 37°C에 도달하면 NaOH를 사용하여 pH를 7.39로 증가시다. pH를 조정한 후 1,000mL 부피 플라스크에 용액을 부피화하십시오. 진공 여과 시스템을 사용하여 용액을 멸균 필터합니다.
- 855 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 25 mg의 분말에 추가하여 100 mM blebbistatin 스톡 용액을 만듭니다. Aliquot를 20 μL 단위로 꺼내 -80°C 냉동고에 최대 6개월동안 보관하십시오.
- 1x KHB-HB의 100 mL에 소 혈청 알부민 (BSA) 및 aliquoted blebbistatin 스톡 1 바이알을 추가하고 진공 여과 시스템을 사용하여 용액을 멸균하여 정지 버퍼를 만듭니다.
- M199 HEPES의 95 mL에 태아 소 혈청 5 mL과 aliquoted blebbistatin 스톡 1 바이알을 추가하여 도금 완충액을 만듭니다. 진공 여과 시스템을 사용하여 용액을 멸균 필터합니다.
- M199 (25 mM HEPES)의 396 mL에 aliquoted blebbistatin 스톡 1 바이알과 4 mls 페니실린 - 스트렙토 마이신을 추가하여 근세포 배양 완충제를 만듭니다. 진공 여과 시스템을 사용하여 용액을 멸균 필터합니다.
- 오토클레이브 2쌍의 듀몬트 핀셋, 2쌍의 아이리스 커브드 가위, 2쌍의 hemostats, 성형 수술 집게 1쌍, 6개의 검은색 편조 실크 4-0 봉합사, 4개의 100mL 비커.
- 살균 22 x 22mm2 유리 커버립. 첫째, 여섯 개의 우물 접시의 각 우물에 하나의 커버 슬립을 놓습니다. 그 후 뚜껑을 제거한 후 생체 안전 성 캐비닛의 UV 램프를 켜고 커버슬립을 UV 광선에 1 시간 동안 노출시십시오.
- 먼저 얼음에 병을 해동하여 작업 라미닌 재고 솔루션을 확인합니다. 0.04 mg/mL의 최종 농도에 도달하기 위해 충분한 차가운 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에 한 병의 내용체를 추가하십시오. 1.3 μL을 오토클레이브 1.5 mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. -80 °C에서 보관하십시오.
참고 : 각 튜브는 하나의 여섯 웰 플레이트에 대한 충분한 라미닌이 있습니다. 여러 개의 동결 해동 주기를 피하십시오. - 먼저 얼음에 작업 라미닌 용액을 해동하여 코팅 멸균 커버 슬립. P1000 파이펫을 사용하여 200 μL의 라미닌을 흡인합니다. 피펫 팁을 커버슬립의 한 쪽 가장자리를 따라 부드럽게 드래그하여 모세관이 소량의 라미닌을 잡아당겨 6개의 웰 플레이트에 커버슬립 부착을 용이하게 합니다.
- 그런 다음 커버 슬립의 중앙에 남아있는 라미닌을 추방하십시오. 원을 그리며 라미닌 방울을 커버슬립 전체에 펼신다. 37°C 인큐베이터에 적어도 1시간 및 최대 24시간 까지 격리하였다.
2. 랑엔도르프 기구의 준비
참고: 이 프로토콜에 사용된 Langendorff 장치의 개별 구성 요소는 재료 표에나열됩니다.
- 순환 수조를 켭니다. 향수가 37 °C의 온도를 가지게되도록 온도를 설정합니다.
참고: 용액 저장소를 60cm 높이로 설정하면 순환 수분 생성을 41°C로 설정하여 향수를 37°C로 설정해야 합니다. 이전에 보고된 프로토콜과 달리 저장소의 높이는 변경할 필요가 없습니다. - 랑엔도르프 장치를 70% 에탄올로 헹구고 오토클레이브이중 증류수로 2개의 헹구기를 합니다. 헹구고 나면 KHB-HB로 저수지를 채우고 100% 산소로 산소를 공급합니다.
- 산소화 KHB-HB가 먼저 100 mL 비커로 유입될 수 있도록 하여 시스템을 프라이밍합니다. 50mL의 용액이 비커로 유입되면 3방향 스톱 콕 위치를 전환하여 KHB-HB 저장소에서 유입을 중지합니다. 비커에서 산소로 된 KHB-HB 50 mL를 콜라게나제 저장소에 붓습니다.
- KHB-HB가 소화 저장소에서 5 mL가 콜라게나아제 저장소에 남아 있게 하십시오. 콜라게나아제 저수지를 프라이밍하는 동안, 3방향 스톱 콕을 저수지 사이에 반복적으로 전환하여 라인이 탈기할 수 있도록 합니다. 시스템이 프라이밍된 후, 가열 코일 위에 위치한 탈기 트랩을 사용하여 남은 공기가 시스템을 빠져나갈 수 있도록 하십시오.
- 콜라게나아제 용액을 만드세요. 쥐의 경우 타입 II 콜라게나아제 100 mg, 산소화 KHB-HB 100 mL, 그리고 블레비스타인 스톡 2병을 결합합니다. 마우스의 경우, 타입 II 콜라게나아제 100 mg, 산소화 KHB-HB 40 mL, 그리고 블레비스타인 스톡 2병을 결합합니다. 일단 혼합되면 용액은 1 시간 동안 안정되어야합니다.
참고: Myocyte 생존력은 타입 II 콜라게나아제 제비에 따라 다를 수 있습니다. 콜라게나제 샘플링 프로그램을 활용하여 대량 주문하기 전에 많은 테스트를 수행하십시오.
3. 근세포 격리
- 1,000 U의 헤파린으로 동물을 주입하십시오. 5분 기다립니다.
참고: 모든 연령대의 마우스와 쥐를 사용할 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 더 오래될수록 더 많은 병에 걸린 동물, 낮은 근세포 수율. - 펜토바르비탈 혼합물(150 mg/kg 인피증)으로 동물을 안락사시키기 전에 오픈 드롭 방법(500cc 부피당 이소플루란 1cc)을 사용하여 먼저 이소플루란으로 동물을 채취하여 동물을 희생시소합니다.
- 먼저 xiphoid 과정 위의 모피를 잡아 서 신속 하 게 심장을 절제. 홍채 가위를 사용하면 xiphoid 공정 바로 아래에 작은 절개를하고 모피를 피부를 노출하는 머리쪽으로 위로 당깁니다.
- xiphoid 과정을 잡고 흉강을 노출 하는 횡격막을 잘라. 트랩 도어 절개를 하고, 지혈을 사용하여 흉골을 다시 당기고, 곡면 집게를 사용하여 오름차순 대류 위의 심장을 절제하고 차가운 KHB-HB에 놓습니다.
- 스테레오 현미경과 숫자 5 집게를 사용하여 심장을 수있습니다. 심장이 침수되고 캐뉼라가 색전증을 예방하기 위해 심장 절제 전에 준비되었는지 확인하십시오. 대동맥 삽입보다 약 1mm 위의 캐뉼라 끝을 심실로 시각화하여 캐뉼라의 적절한 위치를 확인합니다.
참고 : 캐니어레이션 시간이 빠를수록 근세포 수율이 높아집니다. - 랑엔도르프에서 스톱콕을 회전하여 KHB-HB의 흐름을 시작합니다. 캐뉼라를 랑엔도르프에 연결합니다. 심장을 5 분 동안 사용하십시오.
참고 : 관류는 중력 기반 시스템에 의해 공급되기 때문에, 심장을 통해 흐름은 관상 동맥 준수의 기능이 될 것입니다. - KHB-HB 저장소에서 소화 버퍼 저장소로 관류를 전환합니다. 소화 버퍼가 심장에 도달하면 타이머를 설정합니다(마우스의 경우 5분, 쥐의 경우 15분). 멸균 100 mL 비커에 향수를 수집해야합니다. 소화 시간이 만료될 때까지 소화 버퍼 저장소를 향수와 함께 필요에 따라 보충하십시오.
- 소화 후, 멸균 100 mL 비커에 집게와 홍채 가위로 심장의 챔버를 분리합니다. 각 챔버를 여섯 개의 우물판으로 분리된 우물에 놓는다. 콜라게나아제 용액 5 mL을 각 우물에 붓습니다.
- 즉시 가위를 사용하여 심장 조직을 다듬기 시작합니다. 조직 덩어리는 약 1mm3이어야합니다. 멸균 전달 파이펫을 사용하여 다진 심장 조직을 부드럽게 삼각화합니다. 솔루션은 흐릿해져야 합니다.
- 일단 조직 덩어리가 백색과 깃털이 되면, 반전된 현미경을 사용하여 세포를 검사하십시오. 생존 가능한 세포의 수가 80%를 초과하는 경우, 100 μm 세포 스트레이너를 사용하여 50 mL 원추형 튜브로 세포를 변형시. 심장의 각 챔버에 대해 다른 튜브와 여과기를 사용하십시오.
- 실행 가능한 셀의 수가 80 % 미만이면 캐뉼에 걸린 시간을 확인하십시오. 캐니어레이션 시간이 5 분 이상이면 다른 심장을 시도하십시오. 그렇지 않은 경우, 콜라게나아제 샘플링 프로그램을 통해 새로운 콜라게나아제 제비를 분석한다.
- 215 x g에서 2 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛. 펠릿은 컴팩트하고 느슨하지 않아야합니다. 펠릿이 느슨하면, 준비는 많은 죽은 세포를 포함합니다. 조직 배양 후드에서, 펠릿을 정지 완충제의 10 mL에 다시 중단.
- 215 x g에서 2 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛. 펠릿은 컴팩트하고 느슨하지 않아야합니다. 펠릿이 느슨하면, 준비는 많은 죽은 세포를 포함합니다.
- 도금 버퍼의 5 mL에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 셀 수를 수행합니다. 도금 버퍼의 밀리리터를 조정하여 mL당 2 x 104 셀의 최종 근세포 농도에 도달합니다.
- 인큐베이터에서 라미닌 코팅 커버립을 제거합니다. 라미닌 방울을 흡인.
- 각 커버 슬립에 myocyte 현탁액의 플레이트 200 μL. 37°C 인큐베이터(21%O2,5%CO2)를2시간 동안 부착하여 보관합니다. 2시간 후, 부착되지 않은 세포를 흡인하고, 2 mL의 배양 배지를 추가하고, 최대 4일 동안 배양한다.
4. 후라-2 염료 로딩
- 2 mM fura-2 아세톡시메틸 에스테르 (fura-2 AM) 스톡 용액을 25 μL의 DMSO를 50 μg의 후라-2 AM 분말 (1 바이알)에 첨가하여 만듭니다. 6 μL aliquots로 알리쿼트. 푸라-2 AM의 1 알리쿼트를 가지고 도금 매체의 6 mL에 추가합니다. 혼합 하는 소용돌이.
- 인큐베이터에서 근세포 6개 플레이트 1개제거합니다. 흡인 미디어. 각 우물에 1 mL의 후라-2 용지 혼합물을 추가합니다. 호일로 접시를 덮고 접시를 실온에서 두고 15 분 기다립니다.
- 흡입 후라-2 미디어 혼합물을 각 우물에 Tyrode의 용액의 1 mL을 추가합니다. 호일로 덮습니다. 이미징 전에 염료 세척이 허용되도록 실온에서 20분 동안 기다립니다.
5. 플루오-4 염료 로딩
- 1.82 mM 플루오-4 아세톡시메틸 에스테르 (fluo-4 AM) 스톡 용액을 25 μL의 플루오-4 AM 분말 (1 바이알)에 50 μg에 첨가하여 만듭니다. 8.333 μl aliquots로 알리쿼트. 플루오-4 AM 재고 의 1 aliquot을 가지고 도금 매체의 6 mL에 추가합니다. 혼합 하는 소용돌이.
- 인큐베이터에서 근세포 6개 플레이트 1개제거합니다. 흡인 미디어. 각 우물에 1 mL의 플루오-4 AM 미디어 혼합물을 추가합니다. 호일로 접시를 덮고 접시를 실온에서 두고 15 분 기다립니다.
- 흡인 플루오-4 AM 미디어 혼합물을 각 웰에 Tyrode의 용액 1 mL을 추가합니다. 호일로 덮습니다. 이미징 전에 염료 세척이 허용되도록 실온에서 20분 동안 기다립니다.
6. 막 전위 염료 로딩
- 멤브레인 전위 키트에서 성분 A및 성분 B를 제거합니다. 15 mL 원엽 튜브에서 성분 B 50 μL과 성분 A. 소용돌이 의 5 μL을 혼합합니다. 전압 염료 혼합물을 포함하는 15 mL 원점 튜브에 도금 매체 10 mL를 추가합니다. 혼합 하는 소용돌이.
- 인큐베이터에서 근세포 6개 플레이트 1개제거합니다. 미디어를 흡인합니다. 각 우물에 멤브레인 전위 염료 혼합물 800 μL을 추가합니다. 호일로 접시를 덮고 접시를 실온에서 두고 15 분 기다립니다.
- 흡기 염료 매질 혼합물을 각 웰에 1 mL의 변형-티로드 용액을 첨가한다. 호일로 덮습니다.
7. 광측정 및 충전 결합 장치 녹화
- 현미경, 아크 램프, 하이퍼스위치, 형광 인터페이스 시스템, Myocam 전원 공급 장치, 필드 자극기 및 컴퓨터의 순서로 장비를 켭니다.
- 여기/방출 필터 세트가 이미징 염료에 적합한지 확인합니다.
참고 : Fura-2는 340 nm 및 380 nm의 빛으로 흥분됩니다. 그것은 빛의 510 nm에서 방출한다. Fluo-4 및 전압 멤브레인 염료는 485 nm의 빛에서 흥분되고 520 nm의 빛에서 방출됩니다. - 진공을 켜고 호스 클램프를 완전히 열고 매니폴드에 사용되는 각 60 mL 주사기를 부드럽게 떨어 뜨림으로써 시스템을 프라이밍합니다. 칼슘 기록의 경우 Tyrode의 용액을 사용하십시오. 전압 레코딩의 경우 수정된 Tyrode 의 솔루션을 사용합니다.
- 관류 튜브의 롤러 클램프를 조정하여 히터를 켜고 흐름을 설정합니다. 36 ± 1 °C에서 녹음을합니다.
- 수집 소프트웨어를 엽니다. 올바른 이미징 염료에 대한 매개 변수가 설정되어 있는지 확인합니다.
- 어둠 속에서, 여섯 웰 플레이트에서 호일을 제거하고 간격 챔버에 커버 슬립을 배치합니다. 이 단계에서 자극자가 꺼져 있는지 확인합니다. 10x 목표를 사용하여 근세포에 초점을 맞춥니다.
- 일단 초점이 맞으면 1Hz에서 필드 자극에 의해 진도를 시작하고, 0.2 V. 1:1 속도달성될 때까지 전압을 서서히 증가시다. 그런 다음 임계값이 1.5배 도달할 때까지 전압을 늘립니다.
참고: 여기 수축 커플링은 온도에 따라 달라지므로 기록하기 전에 세포가 15분 동안 교전되었는지 확인하십시오. 이것은 근세포가 37 °C로 다시 실온에서 가는 충격에서 복구할 수 있을 뿐만 아니라 느슨하게 부착된 세포가 멀리 떠있을 수 있게 합니다. - 10x 목표에서 40배 목표로 전환합니다. 1:1 간격을 따르는 셀에 초점을 맞춥니다. 하나의 셀만 시야에 있도록 플라스틱 음영을 조정합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 관심 영역을 잘 정의된 sarcomeres에 놓습니다. 수집 소프트웨어를 시작하여 여기 표시등을 시작합니다. 중립 밀도 필터를 사용하여 적절한 SNR을 얻으려면 그에 따라 강도 설정을 조정합니다.
Representative Results
그림 1A는 랑겐도르프 장치를 나타낸다. 산소 공급기는 KHB-HB 저장소에 있습니다. 콜라게나아제 용액은 중간 60 mL 주사기 저장소에 있다. 탈기 라인은 빈 60 mL 주사기 저장소에 연결됩니다. 성공적인 격리 후, 세포의 대부분은 막대 모양과 줄무늬해야한다. 40x 목표하에서 대부분의 근세포는 명확한 줄무늬를 볼 수 있어야 합니다. 그림 1B, C는 건강한 쥐 근세포의 예를 나타낸다. 일단 단리되면, 세포는 그들의 형태및 전기적 특성을 유지하면서 4 일까지 배양될 수 있습니다.
여기 수축 커플링을 측정하기 위해, 세포는 가열 된 진도 챔버에 배치됩니다. 근세포는 온도 변화에 민감하기 때문에 기록하기 전에 커버슬립이 챔버에서 15분 동안 평형되도록 하는 것이 중요합니다. 형광 기록의 경우, 여기 파장은 75W 크세논 아크 전구에 의해 생성된다. 제논 아크 전구는 자연 광선을 모방하는 광 스펙트럼을 생성합니다. 빛과 파장의 강도는 중립 밀도/방출 파일러에 의해 제어됩니다. 여기 빛은 다음 근세포에 목표를 통과. 방출 파장은 광증관에 의해 수집된다. 여기에 설명된 시스템을 사용하여 여기 필터와 방출 필터를 수동으로 변경해야 합니다.
반면에 단축은 전하 결합 장치 센서에 의해 얻어진다. 초당 최대 1,000회까지 실시간으로 측정하는 수집 소프트웨어는 관심 영역 내의 평균 라인을 수행하여 잘 해결된 줄무늬 패턴을 만듭니다. 그런 다음 빠른 푸리에 변환(FFT)이 계산됩니다. 전력 스펙트럼 내의 피크는 평균 sarcomere 간격을 나타냅니다. 그런 다음 간격 동안 sarcomere 간격의 변경 사항이 플롯되고 이후에 정량화됩니다.
도 2는 칼슘 염료 후라-2가 적재된 C57/B6 마우스 근세포로부터 기록된 칼슘 및 쇼트닝 트레이스를 나타낸다. 속도 프로토콜은 앞서설명한 10,11의페이징 프로토콜의 수정이다. 건강한 마우스 근세포는 그들의 안정 심박수 10 Hz에서 진행될 수 있어야 합니다. 그림 3은 칼륨 채널로 도입된 점 돌연변이를 가진 C57/B6 마우스 및 그들의 형질전환(TG) 리터메이트로부터 얻은 앙상블 평균 데이터의 정량화이다. 10Hz 간격의 이완 시간을 제외하고는 그룹 간에 차이가 없습니다.
이중 여기 염료인 fura-2와 달리 전압 염료와 플루오-4는 표준 FITC 여기 및 방출 스펙트럼(494/506 nm)으로 여기/방출 작업을 하는 단일 파장 여기 염료입니다. 따라서, 이 필터 세트를 사용하여 칼슘 및 사르카망 단축 또는 전압 및 사르카망 단축의 기록을 얻을 수 있다.
그림 4A는 C57/B6 마우스 근세포에서 기록된 전압 추적을 10Hz에서 보여줍니다. 칼슘 신호에 비해 단일 셀 전압 추적은 진폭이 작고 사용 가능한 신호를 얻기 위해 후처리가 필요합니다. 도 4B는 도 4A의 AP로부터 이루어진 앙상블 평균 동작 전위(AP)를 나타낸다. 그림 4C,D는 낮은 패스 버터워스 또는 사비츠키-골레이 디지털 필터가 적용된 후 앙상블 평균 AP를 나타낸다. 실제 데이터를 왜곡하지 않도록 신호를 필터링할 때주의해야 합니다. 그림 4B-D의AP 모양의 미묘한 차이를 확인합니다.
도 5는 1Hz에서 진행된 쥐 근세포로부터 기록된 흔적을 나타낸다. 칼슘 신호보다 낮은 전압 신호 이외에 수축 역학도 다릅니다. 이는 칼슘이 완충칼슘을 완충하는 반면 전압 염료는 그렇지 않기 때문이다.
칼슘 과도(그림3)와마찬가지로 근세포는 광학 작용 전위 지속 시간(APD)의 속도 의존적 변화를 입증했습니다(그림6). fura-2 트레이스는 정량화되기 전에 평균으로 앙상블되었지만, 전압 트레이스는 Savitzky-Golay 다항식 스무딩 필터(너비 5, 주문 2)로 필터링한 후 평균 및 정량화되었습니다.
도 6 및 도 7에서정량화된 바와 같이, APD에서의 진도 유도 변화를 입증하는 것 외에도, 그들은 또한 AP의 약물 유도 연장을 입증했다. 4 Hz 속도에서, 4-아미노피리딘을 가진 과도 외전류(Ito)의농도 의존적 봉쇄는 APD의 연장을 초래하였다.
마지막으로, 세포 독성을 피하기 위해주의를 기울여야합니다. 그림 8은 20s 레코딩의 마지막 11s입니다. 그림 8의빨간색 화살표로 표시, 청색광에 근세포의 장기간 노출은 트리거 된 활동으로 이어집니다.
그림 1: 일정한 압력 랑엔도르프 장치. (A)각 구성 요소가 흰색 문자로 표시된 Langendorff 장치입니다. (B)고립된 스프라그-다울리 쥐 근세포는 10배 의 목적을 통해 보았다. (C)40배 의 목적을 통해 본 분리된 쥐 근세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 후라-2를 사용하여 C57/B6 근교에서 기록된 대표적인 칼슘 및 사르코레 단축 흔적. 1, 2, 4, 10, 0.5 및 0.75Hz에서 기록된 칼슘 및 사르카망 단축 추적은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: C57/B6 야생형(WT) 및 형질전환(TG) 마우스로부터 기록된 사르코레 쇼트닝, 피크 칼슘, 이완 시간 및 재섭취 시간의 정량화. (A)사모레 쇼트닝. (B)칼슘을 피크. (C)단축 추적의 기준선으로 90%로 정의된 이완 시간입니다. (D)칼슘 흔적의 기준선으로 90% 복귀로 정의된 재섭취 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: C57/B6 마우스 근세포에서 기록된 광학 동작 전위는 10Hz에서 진행되었습니다. (A)1초 의 필터링되지 않은 추적. (B)앙상블 평균 광학 동작 전위. (C)로우패스 버터워스 필터가 적용된 후 앙상블 평균 광학 작용 전위. (D)사비츠키-골레이 폴리노미리얼 스무딩 필터를 적용한 후 앙상블 평균 광학 작용 전위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 스프라그-다울리 쥐 근세포에서 기록된 대표적인 칼슘, 전압 및 사르코레 단축 흔적은 1Hz에서 진행되었다. (A)플루오-4를 사용하여 1Hz 간격으로 기록된 칼슘 및 사르코레 단축 트레이스. (B)전압 염료를 사용하여 1Hz 간격으로 기록된 전압 및 사르코메르 단축 트레이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 스프라그-다울리 쥐 근세포에서 기록된 광학 작용 전위는 1, 2 및 4Hz 간격으로 진행되었다. (A)1Hz 간격으로 기록된 필터링된 추적. (B)2Hz 간격으로 기록된 필터링된 추적. (C)4Hz 간격으로 기록된 필터링된 추적. (D)행동 전위 지속 시간 10, 기준선으로 10% 복귀로 측정. (E)동작 전위 기간 50, 기준선으로 50% 복귀로 측정. (F)동작 전위 지속 시간 90, 기준선으로 90% 복귀로 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 4Hz 간격으로 기록된 스프라그-다울리 래트 광학 작용 전위에 대한 4-아미노피리딘의 효과. (A)용액에 4-아미노피리딘이 없는 4Hz 페이스로 기록된 앙상블 평균 트레이스. (B)용액에서 1 μM 4-아미노피리딘과 함께 4Hz 속도에서 기록된 앙상블 평균 트레이스. (C)용액에서 10 μM 4-아미노피리딘과 함께 4 Hz 속도에서 기록된 앙상블 평균 트레이스. (D)행동 전위 지속 시간 10, 기준선으로 10% 복귀로 측정. (E)동작 전위 기간 50, 기준선으로 50% 복귀로 측정. (F)동작 전위 지속 시간 90, 기준선으로 90% 복귀로 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 전압 염료는 20초 연속 광 노출 후 스프라그-다울리 쥐 근세포에서 광독성을 유도했다. 빨간색 화살표는 세포 독성 이벤트를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
심장 근세포를 분리할 수 있다는 것은 심장 생리학, 병리학 및 독성학을 이해하는 데 사용할 수 있는 강력한 방법입니다. 상기 프로토콜에서, 우리는 단일 심장 근세포를 얻기 위해 일정한 중력 압력 Langendorff 장치를 활용하는 방법을 설명했다. 그 후 형광측정 시스템을 사용하여 칼슘과 단축 또는 전압을 동시에 획득하고 트레이스를 단축하는 방법을 설명합니다.
칼슘 염료 사이의 역학이 다르기 때문에 어떤 염료를 선택해야 할지 주의해야 합니다. 이 프로토콜을 위해, 사용된 fura-2 와 플루오-4 둘 다 AM 에스테르로 설계되어 세포내 에스테르가 AM 군을 절단하고 세포에 염료를 가두는 시간을 허용하기 위해 세척 단계를 필요로 했다. 후라-2와 플루오-4 둘 다 높은 친화도 칼슘 염료로 간주되지만, fura-2에 대한 Kd는 플루오-49에대한 345 nM에 비해 145 nM이다. 또한, 후라-2는 비메트릭이다. 이 때문에 세포내 칼슘 수치를9,12로정량화하는데 사용할 수 있다. 한편 플루오-4는 단일파 칼슘 프로브이다. fluo-4를 사용하면 더 밝은 형광 신호를 생성할 수 있다는 장점이 있습니다. 칼슘 염료가 사용되는 칼슘 염료에 관계없이, 칼슘 염료에 비해, 멤브레인 전압 프로브는 낮은 SNR을 갖는다.
그림 4 및 그림 5에나타난 바와 같이, 칼슘 트레이스와 비교한 전압 트레이스는 진폭이 더 작다. 소프트웨어의 디지털 추적 필터링을 사용하여 SNR을 증가시키고 데이터를 정량화할 수있습니다(그림 4 및 그림 7). 일단 정량화되면, 칼슘 과도 및 광학 APD는 빠른 속도 주파수에서 그들의 기간을 단축, 복원을 보여줍니다(그림 2, 그림 3, 그림 6,및 그림 7). 빠른 속도 주기 동안 더 짧은 APD는 확장기 도중 심실 충진을 위한 충분한 시간을 허용하기 위하여 필요합니다. 이 현상의 변화는13,14,15,16의위험증가를 나타내는 것으로 생각된다. APD에 있는 변경은 질병에 기인할 수 있는 동안, 또한 화학제품에 기인할 수 있습니다. 도 7에도시된 바와 같이, 우세한 뮤린 이극화 칼륨 전류가, Ito는차단되고, 광학 APD는 더 길어진다.
여전히, 전압 에민감한 염료와 함께 이전에보고 된 바와 같이, 빛의 강도와 기간은 APD2,5,17을변경할 수 있습니다 . 이는 반응성 산화종(ROS)의 생성의 결과로 여겨진다5. 이전에는 기록 용액에 항산화제를 첨가하면 전압에 민감한 염료 세포 독성을 방지할 수 있는 것으로 나타났습니다5. 그 결과, 티로드의 용액에 항산화 L-글루타티온(10 mM)을 첨가했습니다. 그림 8에 도시된 것은 1Hz 속도에서 얻은 20s 레코딩의 마지막 11s입니다. 빨간색 화살표로 표시된 대로 APD의 변경은 15s까지 기록으로 발생하지 않았습니다. 따라서, 수정 된 Tyrode의 솔루션은 광독성을 방지하지 않았지만 크게 지연. 수정된 Tyrode 의 용액을 사용하여 낮은 조명 강도 설정을 사용하고 기록 지속 시간을 5s 미만으로 유지하면 APD에서 염료로 인한 변경을 방지할 수 있습니다. 이는 광독성을 피하기 위해 주의를 기울이지 않으면 데이터가 탈분극 후 조기 또는 지연을 유발하는 것으로 잘못 해석될 수 있기 때문에 중요합니다. 청색광에 대한 노출을 제한하는 것 외에도 데이터의 잘못된 해석을 방지하기 위해 취할 수 있는 추가적인 예방 조치가 있습니다.
첫 번째는 1~1개의 간격을 따르는 세포에서만 기록하고 1.75 μm보다 크거나 같은 나머지 사르카망 길이를 가지고 있는 것입니다. 1.75 μm 컷오프는 고든 외18에 의해 관찰에서 취해져 서사커 길이가 이 양 이하이되면 긴장이 급격히 감소합니다. 그럼에도 불구 하 고, 특정 병 리 휴식 sarcomere 길이에 상당한 변경 귀 착될 수 있습니다. 표현형이 실재하고 격리의 아티팩트가 아니라는 것을 확인하려면 다음과 같은 문제 해결 방법을 취해야 합니다.
근세포가 지속적으로 1:1 간격을 따르지 않거나, 1.75 μm 이하의 사르코메르 길이를 가지거나, 무거운 막 이블빙을 하거나, 격리에서 살아남지 못하는 경우, 가장 먼저 확인하는 것은 심장을 수분화하는 데 걸린 시간입니다. 캐넨화 시간이 길수록 수율이 낮아집니다. 긴 통조림 시간이 필요한 경우 심장을 심전도용액(19)에배치하여 생존력을 향상시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 콜라게나제는 효소이기 때문에, 특정 로트의 활성 및 특이성은 시간이 지남에 따라 변화한다. 전체 수익률이 양호한 시기에도 불구하고 점진적으로 악화되면 새로운 로트를 분석해야 합니다. 당사의 프로토콜은 5초 의 기록에 최적화되었지만 더 긴 전압 추적이 필요한 경우 추가 중성 밀도 필터를 구입해야 합니다. 프로토콜에 설명된 시스템은 투과된 빛을 37%, 50%, 75%, 90%, 95%까지 줄이는 중립 밀도 필터와 함께 제공됩니다.
요약하면, 우리는 칼슘, 전압 및 sarcomere 단축 측정에 사용된 성인 뮤린 심실 근세포의 격리를 허용하는 방법론을 기술했습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 원고의 주의 깊은 교정에 대한 다나 모르겐스테른에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
| 1 liter volumetric flask | Fisher Scientific | 10-205F | |
| 100 ml beaker | Fisher Scientific | FB-100-100 | |
| 100 ml graduated cylinder | Fisher Scientific | 08 562 5C | |
| 1000 ml flask | Fisher Scientific | FB-500-1000 | |
| 2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods | Radnoti, LLC | 159951-2 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
| 40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm) | IonOptix | MSCP1-40 (b) | |
| 60-mL syringe, BD Luer-Lok tip | BD | 309650 | |
| Aortic Metal Cannulae | Harvard Apparatus | 73-0112 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| C-6 Standard Heating Circulator | Chemyx | A30006 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510500 | |
| Cell framing adapter | IonOptix | CFA300 | |
| CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V100022 | |
| CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V25022 | |
| CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS | Labratory Product Sales, Inc | V50022 | |
| CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater | IonOptix | TEMPC2 | |
| Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks | Cole-Parmer | EW-30600-23 | |
| Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way | Cole-Parmer | EW-30600-12 | |
| Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip | Cole-Parmer | EW-30600-01 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
| Corning Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro | IonOptix | CPUD7M | |
| DMSO | Fisher Scientific | 50980367 | |
| Dumont Tweezers Style 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
| FHD Rapid Change Stimulation Chamber | IonOptix | FHDRCC1 | |
| Fluo-3/4 Optics Package | IonOptix | IonOP-Fluo | |
| Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card) | IonOptix | FSI700 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Hemostat, Curved 5-1/2" | Amazon | B00GGAAPD0 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310500 | |
| HyperSwitch dual excitation light source | IonOptix | HSW400 | |
| Inverted Motic Fluorescence Microscope | IonOptix | MSCP1-40 (a) | |
| IonWizard Core + Analysis | IonOptix | IONWIZ | |
| Iris Scissors, curved | Amazon | B018KRRMY6 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-100 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP3661 | |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds | SouthernAnesthesiaSurgical Inc. | SP116-EA | |
| M199 Media | Fisher Scientific | 12 340 030 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | MP021914215 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP2131 | |
| MyoCam-S Digital CCD video system | IonOptix | MCS100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | MYP100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358212 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | 56-754-9250GM | |
| Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter | Radnoti, LLC | 140143-025 | |
| Photomultiplier sub-system | IonOptix | PMT400 | |
| PMT Acquisition add-on | IonOptix | PMTACQ | |
| Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap | Radnoti, LLC | 158830 | |
| Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir | Radnoti, LLC | 120141-025 | |
| Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti, LLC | 120149RC | |
| Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-214 | |
| Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-217 | |
| Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-219 | |
| Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-226 | |
| Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-209 | |
| Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-210 | |
| Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-213 | |
| Sarcomere Length Recording add-on | IonOptix | SARACQ | |
| T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75" | Amazon | B00JDWRBGC | |
| VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers | Amazon | B07QMZC94J | |
| Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform | IonOptix | ISO100 |
References
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