Summary
Apresentamos a metodologia para o isolamento dos miócitos de urina e como obter traços de tensão ou cálcio simultaneamente com traços de encurtamento de sarcomeros usando fotometria de fluorescência com medições simultâneas de geometria celular digital.
Abstract
A capacidade de isolar miócitos cardíacos adultos permitiu que os pesquisadores estudassem uma variedade de patologias cardíacas no nível de uma única célula. Embora os avanços nas tinturas sensíveis ao cálcio tenham permitido o registro óptico robusto da dinâmica do cálcio de célulaúnica, o registro de sinais robustos de tensão óptica transmembrana permaneceu difícil. Indiscutivelmente, isso se deve à baixa relação único ao ruído, fototoxicidade e fotobranqueamento de corantes potentes tradicionais. Conseqüentemente, as medidas da tensão da única pilha têm sido confinadas por muito tempo à técnica da braçadeira do remendo que quando o padrão de ouro, for tècnica exijindo e baixa taxa de rendimento. No entanto, com o desenvolvimento de novos corantes potentiométricas, respostas ópticas grandes e rápidas às mudanças na tensão podem ser obtidas com pouca ou nenhuma fototoxicidade e fotobranqueamento. Este protocolo descreve em detalhes como isolar miócitos adultos de urina que podem ser usados para encurtamento celular, cálcio e medidas de tensão óptica. Especificamente, o protocolo descreve como usar um tinudura de cálcio ratiometric, um tinuche de cálcio de excitação única e um único tinuche de tensão de excitação. Essa abordagem pode ser usada para avaliar a cardiotoxicidade e a arritgeração de vários agentes químicos. Embora a fototoxicidade ainda seja um problema no nível de célula única, a metodologia é discutida sobre como reduzi-la.
Introduction
A fim de estudar o coração durante estados saudáveis e patológicos, muitas vezes é útil examinar o fenótipo no nível de célula única. Embora os avanços científicos tenham permitido a medição robusta da dinâmica do cálcio de célulaúnica, as medições de tensão óptica de célulaúnica permaneceram escassas1. Indiscutivelmente, isso se deve à baixa relação sinal/ruído (SNR), fototoxicidade e fotobranqueamento de corantes potentes tradicionais2,3. No entanto, os potenciais de ação óptica de miócito isolados foram obtidos2,3,4. Além disso, com os avanços na química e na física de corantes sensíveis à tensão, o SNR melhorou5. Sondas potenciais de membrana mais novas(Tabela de Materiais)respondem a mudanças no potencial de membrana em submilis e têm uma faixa de resposta fluogênica de aproximadamente 25% por 100 mV. Além disso, a excitação/emissão do potencial de membrana (por exemplo, FluoVolt; Tabela de Materiais) utilizado neste protocolo funciona com isotiocianato fluorescena padrão (FITC) ou proteína fluorescente verde (GFP)configurações 6.
Os espectros de excitação/emissão FITC e GFP se sobrepõem aos espectros fluo-4 vinculados ao cálcio7. A aquisição simultânea da fotometria da fluorescência com medidas digitais da geometria da pilha tem sido usada tradicional para a aquisição simultânea de medidas da gordura do cálcio e do celular8. Este protocolo descreve em detalhes como isolar os miócitos de urina e como gravar sinais de cálcio ou tensão usando configurações FITC padrão. Além disso, ele descreve como um simples interruptor em filtros de excitação/emissão na estação de trabalho de imagem pode ser usado para obter medidas de cálcio e encurtamento usando a relação métrica de tintura de cálcio fura-2. Em comparação com fluo-4, fura-2 tem uma maior afinidade com o cálcio e é relativamente resistente ao fotobranqueamento9. Consequentemente, usando uma única estação de trabalho este protocolo permite uma examinação completa do acoplamento singly da excitação-contração do myócito.
Protocol
Todos os métodos e procedimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Case Western Reserve University.
1. Preparação de Soluções, Instrumentos e Coverslips
NOTA: As soluções 1x podem ser usadas por até um mês.
- Faça 10x Krebs-Henseleit buffer HEPES buffer sem cálcio (KHB-HB), adicionando 68,96 g de NaCl, 3,57 g de KCl, 59,58 g de HEPES, 2,18 g de K2HPO4, 3,08 g de MgSO4 e 19,82 g de glicose para 800 mL de água destilada dupla em um frasco de 1.000 mL. Depois que o conteúdo estiver totalmente dissolvido, traga até o volume em um frasco volumétrico de 1.000 mL.
NOTA: A solução tradicional Krebs Henseleit usa bicarbonato de sódio como um amortecedor e a solução neste protocolo usa a solução Krebs Henseleit com tampão HEPES. A solução é estável por 6 meses se estéril filtrada. - Faça a solução de 10x Tyrode adicionando 86,51 g de NaCl, 0,552 g de NaH2PO4, 2,03 g de MgCl2, 9,91 g de glicose, 4,03 g de KCl, 2,65 g de CaCl2, e 35,76 g de HEPES para 800 mL de água destilada dupla em um frasco de 1000 mL. Depois que o conteúdo estiver totalmente dissolvido, traga até o volume em um frasco volumétrico de 1000 mL.
NOTA: A solução é estável por 6 meses se estéril filtrada. - Faça 1x KHB-HB medindo para fora 100 mL do estoque de 10x e adicionando a 875 mL da água destilada dobro em uma garrafa de 1.000 mL. Coloque o frasco em 37 °C banho de água. Uma vez que a solução atingiu 37 °C, use o NaOH para aumentar o pH para 7,39. Depois de ajustar o pH, traga a solução para o volume em um frasco volumétrico de 1000 mL. Estéril filtrar a solução usando um sistema de filtragem de vácuo.
- Faça a solução de 1x Tyrode medindo 100 mL do estoque de 10x e adicionando a 875 mL de água destilada dupla em um frasco de 1.000 mL. Coloque o frasco em 37 °C banho de água. Uma vez que a solução atingiu 37 °C, use o NaOH para aumentar o pH para 7,39. Depois de ajustar o pH, traga a solução para o volume em um frasco volumétrico de 1.000 mL. Filtro estéril usando um sistema de filtragem de vácuo.
- Faça a solução do Tyrode modificado 1x medindo 100 mL do estoque de 10x e adicionando a 875 mL de água destilada dupla em um frasco de 1.000 mL. Dissolva 3,07 g de L-glutationa reduzida em frasco. Coloque o frasco em 37 °C banho de água. Uma vez que a solução atingiu 37 °C, use o NaOH para aumentar o pH para 7,39. Depois de ajustar o pH, traga a solução para o volume em um frasco volumétrico de 1.000 mL. Estéril filtrar a solução usando um sistema de filtragem de vácuo.
- Faça 100 mM blebbistatin solução de ações, adicionando 855 μL de dimetil sulfoxide (DMSO) para 25 mg de pó. Aliquot em incrementos de 20 μL e armazenar em um freezer -80 °C por até seis meses.
- Faça a parada tampão adicionando 2 g de albumina de soro bovina (BSA) e 1 frasco de estoque de blebbistatin aliquoted para 100 mL de 1x KHB-HB e filtro estéril a solução usando um sistema de filtragem de vácuo.
- Faça o amortecedor do revestimento adicionando 5 mL do soro bovino fetal e 1 frasco do estoque alicitado do blebbistatin a 95 mL de M199 HEPES. Estéril filtrar a solução usando um sistema de filtragem de vácuo.
- Faça a cultura miócito tampão adicionando um frasco 1 do estoque alicitado do blebbistatin e 4 mls penicilin-streptomycin a 396 mL de M199 (25 mM HEPES). Estéril filtrar a solução usando um sistema de filtragem de vácuo.
- Autoclave 2 pares de pinças Dumont, 2 pares de tesouras curvas iris, 2 hemostats, um par de fórceps de cirurgia plástica, 6 suturas de seda trançada preta 4-0 dispostas a serem usadas como um nó cirúrgico de arremesso duplo e quatro taças de 100 mL.
- Esterilizar 22 x 22 mm2 cobres de vidro. Primeiro, coloque um único coverslip em cada poço de uma placa de seis poços. Depois, com a tampa removida, ligue a lâmpada UV do armário de biossegurança e exponha os lábios à luz UV por 1 h.
- Faça a solução de estoque de lamina de trabalho primeiro descongelando a garrafa no gelo. Adicione o conteúdo de uma garrafa para suficiente frio estéril fosfato tampão sisino (PBS) para atingir uma concentração final de 0,04 mg / mL. Aliquot para fora 1.3 μL em tubos autoclaved da centrífuga de 1.5 mL. Armazenar a -80 °C.
NOTA: Cada tubo tem laminado suficiente para uma única placa de seis poços. Evite vários ciclos de degelo de congelamento. - Revestimento esterilizado coverslip primeiramente descongelando a solução de funcionamento da estratificação no gelo. Usando uma pipeta P1000, aspirar 200 μL de laminina. Arraste delicadamente a ponta da pipeta ao longo de uma borda do coverslip para permitir que a ação capilar retire uma quantidade minúscula de estratificação para facilitar o acessório do coverslip à placa de seis poços.
- Em seguida, expulsar a laminado restante no centro do deslizamento de capa. Em um movimento circular, espalhe a gota de laminado através do coverslip. Coloque em uma incubadora de 37 °C pelo menos 1 h e até 24 h antes do isolamento.
2. Preparação do Aparato langendorff
NOTA: Os componentes individuais do aparelho Langendorff utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
- Ligue o banho de água circulante. Estabeleça a temperatura de modo que o perfusate tenha uma temperatura de 37 °C.
NOTA: Com os reservatórios da solução ajustados a uma altura de 60 cm, o waterbirth circulante precisa de ser ajustado a 41 °C para mandar o perfusate ser 37 °C. Ao contrário dos protocolos previamente relatados, a altura do reservatório não precisa de ser mudada. - Lave o aparelho Langendorff com 70% de etanol seguido por dois enxaguamentos com água destilada dupla autolavada. Após a lavagem, encha o reservatório com KHB-HB e oxigena com 100% de oxigênio.
- Prime o sistema, permitindo khb-hb oxigenado para primeiro fluir em um copo de 100 mL. Uma vez que 50 mL de solução fluiu para o copo, mudar a posição de 3 vias stop-galo para parar o fluxo do reservatório KHB-HB. Despeje 50 mL de KHB-HB oxigenado do copo no reservatório de colagem.
- Deixe o dreno KHB-HB do reservatório de digestão até 5 mL permanece no reservatório de colagem. Ao priming o reservatório da colagem, comute a torneira do batente de 3 vias repetidamente entre reservatórios para permitir que as linhas degas. Depois que o sistema é preparado, recorde usar a armadilha degassing situada sobre a bobina de aquecimento para permitir que todo o ar restante saia do sistema.
- Faça a solução de colagem. Para ratos combinam 100 mg de colagenase tipo II, 100 mL de KHB-HB oxigenado, e 2 frascos do estoque blebbistain. Para camundongos, combinar 100 mg de colagenase tipo II, 40 mL de KHB-HB oxigenado, e 2 frascos do estoque blebbistain. Uma vez misturado, a solução deve ser estável para 1 h.
NOTA: Viabilidade de miócito pode variar entre lotes de colagem tipo II. Aproveite um programa de amostragem de colagem para testar muito antes de encomendar em massa.
3. Isolamento de Miócito
- Injete o animal com 1.000 U de heparina. Espere 5 min.
NOTA: Ratos e ratos de qualquer idade podem ser usados. No entanto, em geral, quanto mais velho ou mais doente o animal, menor o rendimento de miócito. - Sacrifique o animal primeiro anestesiando-o com isoflurane usando o método de queda aberta (1 cc de Isoflurane por volume de 500 cc) antes de eutanásia do animal com uma mistura pentobarbital (150 mg/kg intraperitoneal).
- Rapidamente extirpar o coração, primeiro agarrando a pele acima do processo xifórido. Com a tesoura de íris, faça uma pequena incisão imediatamente abaixo do processo xifórido e puxe a pele para cima em direção à cabeça expondo a pele.
- Pegue o processo xifórico e corte o diafragma expondo a cavidade torácica. Faça uma incisão do alçapão, puxe o esterno para trás usando um hemostat, e use os fórceps curvos para extirpar o coração acima da aorta ascendente e coloque no frio KHB-HB.
- Cannulate o coração usando um microscópio estéreo e fórceps número 5. Certifique-se de que o coração está submerso e a cânula foi preparada antes da excisão cardíaca para evitar embolias. Confirme o posicionamento adequado da cânula visualizando a ponta da cânula aproximadamente 1 mm acima da inserção da aorta no ventrículo.
NOTA: Quanto mais rápido o tempo de canulação, melhor o rendimento do miócito. - Comece o fluxo de KHB-HB girando o stopcock no Langendorff. Ligue a cânula ao Langendorff. Perfuse o coração por 5 min.
NOTA: Uma vez que a perfusão é fornecida por um sistema baseado em gravidade, o fluxo através do coração será uma função da adesão da artéria coronária. - Troque a perfusão do reservatório KHB-HB para o reservatório tampão de digestão. Uma vez que o buffer de digestão atinge o coração, definir um tempora (5 min para o rato ou 15 min para o rato). Certifique-se de recolher o perfusato em um copo estéril de 100 mL. Reencher o reservatório tampão de digestão, conforme necessário com o perfusate até que o tempo de digestão expirou.
- Após a digestão, separe as câmaras do coração com fórceps e a tesoura da íris em um copo estéril de 100 mL. Coloque cada câmara em um poço separado de uma placa de seis poços. Despeje 5 mL de solução de colagem em cada poço.
- Imediatamente começar a picar o tecido cardíaco usando uma tesoura. Os pedaços do tecido devem ser aproximadamente 1 mm3. Usando pipetas de transferência estéreis, triturar suavemente o tecido cardíaco picado. A solução deve ficar turva.
- Uma vez que os pedaços do tecido se tornam brancos e plumosos, examine as pilhas usando um microscópio invertido. Se o número de células viáveis for superior a 80%, prossiga para esticar as células em um tubo cônico de 50 mL usando um filtro de células de 100 μm. Use um tubo diferente e filtro para cada câmara do coração.
- Se o número de células viáveis for inferior a 80%, verifique o tempo necessário para se cannular. Se o tempo de cannulação é mais de 5 min, tente outro coração. Se não, ensaio novos lotes colagem através do programa de amostragem de colagem.
- Pelotas as células por centrífuga em 215 x g por 2 min. A pelota deve ser compacta e não solta. Se a pelota estiver solta, a preparação contém muitas células mortas. Em uma capa da cultura do tecido, resuspenda a pelota em 10 mL do amortecedor de parada.
- Pelotas as células por centrífuga em 215 x g por 2 min. A pelota deve ser compacta e não solta. Se a pelota estiver solta, a preparação contém muitas células mortas.
- Resuspenda as células em 5 mL de tampão de revestimento. Realizar uma contagem celular. Ajuste os mililitros de tampão de revestimento para alcançar uma concentração final de miócito de 2 x 104 células por mL.
- Retire os lábios revestidos de laminado da incubadora. Aspirar a gota de laminado.
- Placa 200 μL de suspensão de miócito em cada deslizamento de capa. Coloque em uma incubadora de 37 °C (21% O2,5% CO2)para 2 h para permitir o apego. Após 2 h, aspirar as células não anexadas, adicionar 2 mL de mídia cultural, e cultura por até 4 dias.
4. Carregamento de tine Fura-2
- Faça uma solução de estoque de 2 m fura-2 acetoximethyl ester (fura-2 AM), adicionando 25 μL de DMSO a 50 μg de pó de fura-2 AM (1 frasco). Aliquot em 6 μL aliquots. Tome 1 aliba de fura-2 AM e adicione a 6 mL de revestimento médio. Vórtice para misturar.
- Retire 1seis pratos de miócitos da incubadora. Mídia aspirate. Adicione 1 mL de fura-2 mistura de mídia para cada poço. Placa de cobertura com papel alumínio, deixe a placa à temperatura ambiente, e esperar 15 min.
- Aspirate fura-2 mistura de mídia e adicionar 1 mL da solução do Tirode para cada bem. Cubra com papel alumínio. Espere 20 min à temperatura ambiente para permitir a lavagem de tine antes da imagem.
5. Carregamento de corantes Fluo-4
- Faça uma solução de estoque de 1,82 m fluo-4 acetoximethyl ester (fluo-4 AM), adicionando 25 μL de DMSO a 50 μg de pó fluo-4 AM (1 frasco). Aliquot em 8.333 μL alíquotas. Tome 1 alibado de estoque fluo-4 AM e adicione a 6 mL de revestimento médio. Vórtice para misturar.
- Retire 1seis pratos de miócitos da incubadora. Mídia aspirate. Adicione 1 mL de fluo-4 am mistura de mídia para cada poço. Placa de cobertura com papel alumínio, deixe a placa à temperatura ambiente, e esperar 15 min.
- Aspirate fluo-4 AM mistura de mídia e adicionar 1 mL da solução do Tirode para cada bem. Cubra com papel alumínio. Espere 20 min à temperatura ambiente para permitir a lavagem de tine antes da imagem.
6. Carregamento potencial da tintendência da membrana
- Remover componente A e componente B do kit potencial de membrana. Em um tubo cônico de 15 mL, combine 50 μL do componente B e 5 μL do componente A. Vortex para misturar. Adicione 10 mL de mídia de revestimento para o tubo cônico de 15 mL contendo a mistura de tinpa de tensão. Vórtice para misturar.
- Retire 1seis pratos de miócitos da incubadora. Aspiratee a mídia. Adicione 800 μL da mistura potencial da tinlidade da membrana a cada poço. Placa de cobertura com papel alumínio, deixe a placa à temperatura ambiente, e esperar 15 min.
- A mistura de mídia de tine aspirado aspirataria e adiciona 1 mL da solução do Tiroda modificado a cada poço. Cubra com papel alumínio.
7. Fotometria e carga acoplado device recordings
- Ligue o equipamento na seguinte ordem: microscópio, lâmpada de arco, hiperswitch, sistema de interface de fluorescência, fornecimento de energia Myocam, estimulador de campo e computador.
- Certifique-se de que os conjuntos de filtros de excitação/emissão são apropriados para o tinuoso de imagem.
NOTA: Fura-2 está animado em 340 nm e 380 nm de luz. Ele emite a 510 nm de luz. Fluo-4 e a tintendência de membrana de tensão são excitadas em 485 nm da luz e emitem-se em 520 nm da luz. - Prime o sistema girando sobre o vácuo, abrindo inteiramente a braçadeira da mangueira, e mergulhando delicadamente cada seringa de 60 mL que está sendo usada no reluzido. Para gravações de cálcio usar a solução do Tirode. Para gravações de tensão, use a solução do Tirode modificado.
- Ligue o aquecedor e ajuste o fluxo ajustando a braçadeira do rolo na tubulação da perfusão. Faça gravações a 36 ± 1 °C.
- Abra o software de aquisição. Certifique-se de que os parâmetros são definidos para o corante de imagem correto.
- No escuro, retire a folha da placa de seis poços e coloque um coverslip na câmara de ritmo. Certifique-se de que o estimulador está desligado durante esta etapa. Concentre-se nos miócitos usando o objetivo 10x.
- Uma vez em foco, começar a andar de campo estimulante em 1 Hz, 0,2 V. Aumentar gradualmente a tensão até 1:1 ritmo é obtido. Em seguida, aumentar a tensão até 1,5 x o limiar é atingido.
NOTA: Como o acoplamento de excitação-contração é dependente da temperatura, certifique-se de que as células foram perfundidas por 15 min antes da gravação. Isso permite que os miócitos se recuperem do choque de ir da temperatura ambiente de volta para 37 °C, bem como células vagamente ligadas para flutuar para longe. - Mude do objetivo 10x para o objetivo 40x. Concentre-se em uma célula que está seguindo um ritmo 1:1. Ajuste as máscaras plásticas assim que somente uma pilha está no campo de vista.
- Usando o software, coloque a área de caixa de interesse em sarcomeres bem definidos. Inicie o software de aquisição para iniciar a luz de excitação. Usando os filtros de densidade neutra, ajuste a configuração de intensidade de acordo para obter uma REEm adequada.
Representative Results
A Figura 1A mostra o aparelho langendorff. O oxigenador está no reservatório KHB-HB. A solução de colagem está no reservatório médio de seringas de 60 mL. A linha de degasenjofização está conectada ao reservatório vazio de 60 mL. Após uma isolação bem sucedida, a maioria das pilhas devem ser haste dada forma e striated. um objetivo 40x, a maioria dos miócitos deve ter estrias claras visíveis. A Figura 1B,C mostra exemplos de miócitos de ratos saudáveis. Uma vez isoladas, as células podem ser cultivadas até 4 dias, mantendo sua morfologia e propriedades elétricas.
Para medir o acoplamento da excitação-contração, as pilhas são coloc então em uma câmara de ritmo aquecida. Porque os miócitos são sensíveis às mudanças na temperatura, é importante permitir que o coverslip equilibra para 15 min na câmara antes da gravação. Para gravações de fluorescência, o comprimento de onda de excitação é gerado por uma lâmpada de arco xenon 75 W. As lâmpadas xenon-arco produzem um espectro de luz que imita a luz solar natural. A intensidade da luz e do comprimento de onda são controladas por filers neutros da densidade/emissão. A luz da excitação passa então através do objetivo ao myocyte. O comprimento de onda de emissão é então coletado por um tubo fotomultiplicador. Usando o sistema descrito aqui, os filtros de excitação e emissão precisam ser alterados manualmente.
Encurtamento, por outro lado, é obtido por um sensor de dispositivo acoplado de carga. Medindo em tempo real até 1.000 vezes por segundo, o software de aquisição executa uma média das linhas dentro de uma área de interesse para criar um padrão de estrias bem resolvido. Uma rápida transformação fourier (FFT) é então calculada. O pico dentro do espectro de potência representa o espaçamento médio de sarcomere. Mudanças no espaçamento de sarcomer durante o espaçamento são então traçadas e posteriormente quantificadas.
A Figura 2 mostra traços de cálcio e encurtamento registrados a partir de um miócito de camundongo C57/B6 carregado com a pele de tinua de cálcio-2. O protocolo de estimulação é uma modificação dos protocolos de estimulação descritos anteriormente10,11. Os miócitos saudáveis do rato devem poder ser passeados em sua frequência cardíaca de descanso 10 Hz. Figura 3 é quantificação de dados em média ensembled obtidos de ratos c57/B6 e seus littermates transgênicos (TG) que tiveram uma mutação do ponto introduzida em uma canaleta do potássio. Observe que não há diferença entre os grupos, exceto para o tempo de relaxamento em 10 Hz ritmo.
Ao contrário fura-2, que é um corantes de excitação dupla, o corantes de tensão e fluo-4 são corantes de excitação de comprimento de onda único cuja excitação / emissão de trabalho com excitação FITC padrão e espectro de emissão (494/506 nm). Portanto, gravações de cálcio e sarcomere encurtamento ou tensão e encurtamento sarcomere podem ser obtidas usando este conjunto de filtro.
A Figura 4A mostra um rastreamento de tensão gravado a partir de um miócito de camundongo C57/B6 passeado a 10 Hz. Em comparação com sinais de cálcio, traçações de tensão de célula única são menores em amplitude e precisam de pós-processamento para obter um sinal utilizável. Figura 4B mostra um potencial de ação média ensembled (AP) feito a partir do APs na Figura 4A. Figura 4C,D mostra um AP média ensembled depois de um butterworth passagem baixa ou um filtro digital Savitzky-Golay foi aplicado. O cuidado deve ser tomado ao filtrar o sinal para não distorcer os dados reais. Observe as diferenças sutis na forma dos APs na Figura 4B-D.
A figura 5 mostra traços registrados de miócitos de rato passeados a 1 Hz. Além do sinal de tensão ser menor do que o sinal de cálcio, a cinética contração são diferentes também. Isso ocorre porque as tinturas de cálcio tampão cálcio, enquanto corantes de tensão não.
Tal como acontece com o transitório de cálcio (Figura 3), miócitos demonstraram ritmo mudanças dependentes em sua duração potencial de ação óptica (APD) também (Figura 6). Enquanto os traços fura-2 foram combinados em média antes de serem quantificados, os traços de tensão foram filtrados com um filtro de suavização polinomial Savitzky-Golay (largura 5, ordem 2) antes de serem combinados em média e quantificados.
Como quantificado na Figura 6 e Figura 7, além de demonstrar mudanças induzidas por ritmo na APD, eles também demonstraram prolongamento induzido por drogas da AP. Em 4 Hz ritmo, concentração bloqueio dependente da corrente externa transitória (Ia)com 4-aminopyridine resultou em prolongamento da APD.
Finalmente, deve ser tomado cuidado para evitar a citotoxicidade. A figura 8 é os últimos 11 s de uma gravação de 20. Indicado pelas setas vermelhas na Figura 8,a exposição prolongada de miócitos à luz azul leva à atividade desencadeada.
Figura 1: Constante pressão langendorff aparelho. (A)O aparelho Langendorff com cada componente rotulado em letras brancas. (B)Isolado sprague-dawley rato miócitos visto através de um objetivo 10x. (C)Miócitos de rato isolados vistos através de um objetivo 40x. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Rastreamentos representativos de cálcio e sarcomere de encurtamento registrados a partir de mioíctos C57/B6 usando fura-2. Cálcio e sarcomere encurtando traços registrados em 1, 2, 4, 10, 0,5 e 0,75 Hz. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Quantificação de encurtamento de sarcomere, pico de cálcio, tempo de relaxamento e tempo de recaptação registrado a partir de um tipo selvagem C57/B6 (WT) e camundongos transgênicos (TG). (A)Encurtamento de Sarcomere. (B) Pico de cálcio. (C) Tempo de relaxamento definido como 90% de retorno à linha de base do rastreamento de encurtamento. (D)Tempo de recaptação definido como 90% de retorno à linha de base do rastreamento de cálcio. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Potencial de ação óptica registrado a partir de um miócito do mouse C57/B6 passeado a 10 Hz. (A)1 segundo de rastreamento não filtrado. (B) Ensembled média de potencial de ação óptica. (C)Ensembled média de potencial de ação óptica após um filtro Butterworth lowpass foi aplicado. (D)Ensembled média de potencial de ação óptica após um filtro de suavização polinomial Savitzky-Golay foi aplicado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Representante de cálcio, tensão e sarcomere encurtando traços registrados a partir de miócitos de rato Sprague-Dawley passeados em 1 Hz. (A) Cálcio e sarcomere encurtando traços registrados em 1 Hz ritmo usando fluo-4. (B) Voltagem e sarcomere encurtando traços registrados em 1 Hz andando usando o tinuismo de tensão. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Potenciais de ação óptica registrados a partir de miócitos de rato Sprague-Dawley passeados em 1, 2 e 4 Hz ritmo. (A)Rastreamento filtrado registrado em 1 Hz andando. (B) Rastreamento filtrado registrado em 2 Hz andando. (C)Rastreamento filtrado registrado em 4 Hz andando. (D)Duração potencial de ação 10, medida como 10% de retorno à linha de base. (E)Duração potencial de ação 50, medida como 50% de retorno à linha de base. (F)Duração potencial de ação 90, medida como 90% de retorno à linha de base. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 7: Os efeitos de 4-aminopyridine em sprague-dawley rato óptica ação potenciais registrados em 4 Hz ritmo. (A)Traço em média ensembled gravado em 4 Hz que andam sem 4-Aminopyridine na solução. (B) Traço em média gravado em 4 Hz ritmo com 1 μM 4-Aminopyridine na solução. (C)Traço em média gravado em 4 Hz ritmo com 10 μM 4-Aminopyridine na solução. (D)Duração potencial de ação 10, medida como 10% de retorno à linha de base. (E)Duração potencial de ação 50, medida como 50% de retorno à linha de base. (F)Duração potencial de ação 90, medida como 90% de retorno à linha de base. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 8: A tinua de tensão induzida fototoxicidade em miócitos de rato Sprague-Dawley após 20 s de exposição contínua à luz. Setas vermelhas indicam eventos citotóxicos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Discussion
Ser capaz de isolar miócitos cardíacos é um método poderoso que pode ser usado para entender a fisiologia cardíaca, patologia e toxicologia. No protocolo acima, descrevimos um método que utiliza um aparelho de Langendorff de pressão de gravidade constante para obter míócitos cardíacos únicos. Posteriormente, usando o sistema de fotometria de fluorescência, descrevemos como adquirir simultaneamente cálcio e encurtamento ou tensão e encurtamento de traços.
Por causa da cinética diferente entre tinturas de cálcio, o cuidado deve ser tomado em que corantes para selecionar. Para este protocolo, tanto o fura-2 quanto o fluo-4 utilizadoforam projetados com ésteres am, necessitando de um passo de lavagem para permitir tempo de esterases intracelulares para apegar o grupo AM e prender o corante na célula. Enquanto ambos fura-2 e fluo-4 são considerados de alta afinidade tinturas de cálcio, o Kd para fura-2 é de 145 nM em comparação com o 345 nM para fluo-49. Além disso, fura-2 é ratiométrica. Devido a isso, ele pode ser usado para quantificar os níveis intracelulares de cálcio9,12. Fluo-4, por outro lado, é uma única onda de subprovação de cálcio. A vantagem de usar fluo-4 é que produz um sinal de fluorescência mais brilhante. Independentemente de qual tine de cálcio é usado, em comparação com o tinulado de cálcio, as sondas de tensão da membrana têm uma SNR mais baixa.
Como mostrado na Figura 4 e Figura 5, traços de tensão em comparação com traços de cálcio são menores em amplitude. Usando a filtragem digital de rastreamento do software, é possível aumentar o SNR e quantificar os dados(Figura 4 e Figura 7). Uma vez quantificados, tanto os transientes de cálcio quanto os APDs ópticos demonstram restituição, encurtando sua duração em frequências de ritmo mais rápidas(Figura 2, Figura 3, Figura 6e Figura 7). ApDs mais curtos durante ciclos de ritmo mais rápidos são necessários para permitir tempo suficiente para o enchimento ventricular durante a diastole. Acredita-se que as alterações nesse fenômeno sejam indicativas de um aumento no risco de arrythmias13,14,15,16. Enquanto alterações na APD podem ser causadas por doenças, elas também podem ser causadas por produtos químicos. Como mostrado na Figura 7, quando a murine predominante repolarizando a corrente de potássio,eu,é bloqueado, a APD óptica torna-se mais longo.
Ainda assim, conforme relatado anteriormente com corantes sensíveis à tensão, intensidade e duração da luz podem alterar a APD2,5,17. Acredita-se que este seja o resultado da geração de espécies oxidativas reativas (ROS)5. Anteriormente, tem sido demonstrado que a adição de antioxidantes à solução de gravação pode prevenir a citotoxicidade sensível ao tine de tensão5. Como resultado, adicionamos o antioxidante L-glutationa (10 mM), à solução do Tyrode. Mostrado na Figura 8 é o último 11 s de uma gravação de 20 anos obtida em 1 Hz ritmo. Como indicado pelas setas vermelhas, as alterações na APD não ocorreram até 15 s na gravação; Portanto, embora a solução do Tirode modificado não tenha evitado a fototoxicidade, ela a atrasou significativamente. Usando a solução do Tirode modificado, usando uma configuração de baixa intensidade de luz e mantendo a duração da gravação para menos de 5 s, é possível evitar qualquer corante induzida alterações na APD. Isso é importante porque, sem tomar cuidado para evitar a fototoxicidade, os dados podem ser mal interpretados como causando precoce ou atrasado após despolarizações. Além de limitar a exposição à luz azul, há precauções adicionais que podem ser tomadas para evitar a má interpretação dos dados.
O primeiro é registrar somente das pilhas que seguem um a um que anda e têm um comprimento de resting o sarcomere maior do que ou igual a 1.75 μm. O corte de 1,75 μm é retirado da observação de Gordon et al.18 de que a tensão diminui rapidamente uma vez que o comprimento dos sarcomeros está abaixo desse valor. No entanto, certas patologias podem resultar em alterações significativas no comprimento do sarcomero em repouso. Para ter certeza de que o fenótipo é real e não um artefato do isolamento, as seguintes abordagens de tiro de problemas devem ser tomadas.
Se os miócitos não estão constantemente seguindo 1:1 ritmo, têm comprimentos de sarcomere abaixo de 1,75 μm, blebbing membrana pesada, ou não sobreviver ao isolamento, a primeira coisa a verificar é o tempo que levou para cannular o coração. Quanto maior o tempo de cannulação, menor será o rendimento. Se um longo tempo de canulação é necessário, a viabilidade pode ser melhorada, colocando o coração em uma solução cardioplégica19. No entanto, porque a colagem é uma enzima, a atividade e especificidade de um lote específico mudam ao longo do tempo. Se os rendimentos totais se tornam progressivamente mais maus apesar dos bons tempos da cannulação, os lotes novos devem ser acensados. Embora nosso protocolo tenha sido otimizado para gravações de 5 s, se traços de tensão mais longos forem necessários, filtros adicionais de densidade neutra precisarão ser comprados. O sistema descrito no protocolo vem com filtros de densidade neutra que reduzem a luz transmitida em 37%, 50%, 75%, 90% e 95%.
Em resumo, descrevimos uma metodologia que permitia o isolamento de miócitos ventriculares de urina adulta que foram utilizados para medições de cálcio, tensão e encurtamento de sarcomeros.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dana Morgenstern por uma análise cuidadosa do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
| 1 liter volumetric flask | Fisher Scientific | 10-205F | |
| 100 ml beaker | Fisher Scientific | FB-100-100 | |
| 100 ml graduated cylinder | Fisher Scientific | 08 562 5C | |
| 1000 ml flask | Fisher Scientific | FB-500-1000 | |
| 2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods | Radnoti, LLC | 159951-2 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
| 40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm) | IonOptix | MSCP1-40 (b) | |
| 60-mL syringe, BD Luer-Lok tip | BD | 309650 | |
| Aortic Metal Cannulae | Harvard Apparatus | 73-0112 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| C-6 Standard Heating Circulator | Chemyx | A30006 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510500 | |
| Cell framing adapter | IonOptix | CFA300 | |
| CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V100022 | |
| CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V25022 | |
| CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS | Labratory Product Sales, Inc | V50022 | |
| CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater | IonOptix | TEMPC2 | |
| Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks | Cole-Parmer | EW-30600-23 | |
| Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way | Cole-Parmer | EW-30600-12 | |
| Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip | Cole-Parmer | EW-30600-01 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
| Corning Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro | IonOptix | CPUD7M | |
| DMSO | Fisher Scientific | 50980367 | |
| Dumont Tweezers Style 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
| FHD Rapid Change Stimulation Chamber | IonOptix | FHDRCC1 | |
| Fluo-3/4 Optics Package | IonOptix | IonOP-Fluo | |
| Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card) | IonOptix | FSI700 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Hemostat, Curved 5-1/2" | Amazon | B00GGAAPD0 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310500 | |
| HyperSwitch dual excitation light source | IonOptix | HSW400 | |
| Inverted Motic Fluorescence Microscope | IonOptix | MSCP1-40 (a) | |
| IonWizard Core + Analysis | IonOptix | IONWIZ | |
| Iris Scissors, curved | Amazon | B018KRRMY6 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-100 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP3661 | |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds | SouthernAnesthesiaSurgical Inc. | SP116-EA | |
| M199 Media | Fisher Scientific | 12 340 030 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | MP021914215 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP2131 | |
| MyoCam-S Digital CCD video system | IonOptix | MCS100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | MYP100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358212 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | 56-754-9250GM | |
| Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter | Radnoti, LLC | 140143-025 | |
| Photomultiplier sub-system | IonOptix | PMT400 | |
| PMT Acquisition add-on | IonOptix | PMTACQ | |
| Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap | Radnoti, LLC | 158830 | |
| Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir | Radnoti, LLC | 120141-025 | |
| Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti, LLC | 120149RC | |
| Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-214 | |
| Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-217 | |
| Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-219 | |
| Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-226 | |
| Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-209 | |
| Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-210 | |
| Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-213 | |
| Sarcomere Length Recording add-on | IonOptix | SARACQ | |
| T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75" | Amazon | B00JDWRBGC | |
| VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers | Amazon | B07QMZC94J | |
| Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform | IonOptix | ISO100 |
References
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