Summary
We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.
Abstract
De mogelijkheid om te isoleren van volwassen cardiale myocyten heeft onderzoekers toegestaan om een verscheidenheid van cardiale pathologieën te bestuderen op het niveau van één cel. Terwijl de vooruitgang in calcium gevoelige kleurstoffen de robuuste optische opname van calcium dynamica in één cel toestaat, is het opnemen van robuuste transmembraan optische spannings signalen moeilijk gebleven. Aantoonbaar, dit is vanwege de lage enkelvoudige ruis verhouding, fototoxiciteit, en fotobleaching van traditionele potentiometrische kleurstoffen. Daarom zijn eencellige spanningsmetingen lang beperkt tot de patch clamp techniek die, terwijl de gouden standaard, technisch veeleisend en lage doorvoer is. Echter, met de ontwikkeling van nieuwe potentiometrische kleurstoffen, grote, snelle optische reacties op veranderingen in spanning kan worden verkregen met weinig tot geen fototoxiciteit en fotobleaching. Dit protocol beschrijft in detail hoe te isoleren van volwassen Murine myocyten die kunnen worden gebruikt voor cellulaire verkorting, calcium, en optische spanning metingen. In het bijzonder wordt in het protocol beschreven hoe een ratiometrische calcium kleurstof, een enkelvoudige excitatie calcium kleurstof en een enkelvoudige excitatie spanningskleur stof moet worden gebruikt. Deze aanpak kan worden gebruikt om te beoordelen van de cardiotoxiciteit en aritmogeniteit van verschillende chemische agentia. Hoewel fototoxiciteit nog steeds een probleem is op het niveau van één cel, wordt de methodologie besproken hoe deze te verminderen.
Introduction
Om het hart te bestuderen tijdens gezonde en pathologische toestanden, is het vaak nuttig om het fenotype op het niveau van één cel te onderzoeken. Terwijl de wetenschappelijke vooruitgang de robuuste meting van de calcium dynamica in één cel heeft toegestaan, zijn optische spanningsmetingen van één cel schaars gebleven1. Aantoonbaar, dit is vanwege de lage signaal ruis verhouding (SRV), fototoxiciteit, en fotobleaching van traditionele potentiometrische kleurstoffen2,3. Niettemin, geïsoleerde myocyten optische actie potentialen zijn verkregen2,3,4. Verder, met vooruitgang in de chemie en de fysica van spannings gevoelige kleurstoffen, heeft de SNR5verbeterd. Nieuwere membraanpotentiaal voelers (tabel van de materialen) reageren op veranderingen in membraanpotentiaal in submilliseconden en hebben een fluorogenic respons bereik van ongeveer 25% per 100 mv. Verder, de excitatie/emissie van de membraanpotentiaal Kit (bijv. FluoVolt; Tabel met materialen) gebruikt in dit protocol werkt met standaard fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) of groen fluorescerende proteïne (GFP)-instellingen6.
De FITC-en GFP-excitatie-/emissierspectra overlappen met de fluo-4 calcium gebonden Spectra7. Gelijktijdige overname van fluorescentie fotometrie met digitale celgeometrie metingen is traditioneel gebruikt voor de gelijktijdige overname van metingen van calcium en cellulaire verkorting8. Dit protocol beschrijft in detail hoe u Murine myocyten isoleert en hoe u calcium-of spannings signalen opneemt met behulp van standaard FITC-instellingen. Daarnaast wordt beschreven hoe een eenvoudige switch in excitatie/emissie filters op het Imaging Workstation kan worden gebruikt om calcium-en inkorten metingen te verkrijgen met behulp van de ratio metrische calcium kleurstof Fura-2. In vergelijking met fluo-4 heeft Fura-2 een hogere affiniteit voor calcium en is relatief resistent tegen fotobleaching9. Hierdoor kan met behulp van een enkel werkstation dit protocol een grondig onderzoek van afzonderlijk myocyten excitatie-contractie koppeling.
Protocol
Alle methoden en procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Case Western Reserve University.
1. voorbereiding van oplossingen, instrumenten en Dekbonnen
Opmerking: 1x-oplossingen kunnen maximaal een maand worden gebruikt.
- Maak 10x Krebs-Henseleit buffer HEPES buffer zonder calcium (KHB-HB) door toevoeging van 68,96 g NaCl, 3,57 g KCl, 59,58 g van HEPES, 2,18 g van K2HPO4, 3,08 g van MgSO4 en 19,82 g glucose tot 800 ml dubbel gedestilleerd water in een 1.000 ml kolf. Als de inhoud volledig is opgelost, breng dan tot het volume in een maatkolf van 1.000 mL.
Opmerking: traditionele Krebs-Henseleit-oplossing maakt gebruik van natriumbicarbonaat als buffer en de oplossing in dit protocol maakt gebruik van Krebs-Henseleit-oplossing met HEPES-buffer. Oplossing is stabiel gedurende 6 maanden indien steriel gefilterd. - Maak de oplossing van 10x Tyrode door 86,51 g NaCl, 0,552 g van NaH2po4, 2,03 g mgcl2, 9,91 g glucose, 4,03 g KCl, 2,65 g CACL2en 35,76 g Hepes toe te voegen aan 800 ml dubbel gedestilleerd water in een 1000 ml kolf. Als de inhoud volledig is opgelost, breng dan tot het volume in een maatkolf van 1000 mL.
Opmerking: de oplossing is 6 maanden stabiel indien steriel gefilterd. - Maak 1x KHB-HB door 100 mL van de 10x kolf te meten en toe te voegen aan 875 mL dubbel gedestilleerd water in een maatkolf van 1.000 mL. Plaats de kolf in een waterbad van 37 °C. Zodra de oplossing 37 °C heeft bereikt, gebruikt u NaOH om de pH te verhogen naar 7,39. Breng na het afstellen van de pH oplossing op volume in een maatkolf van 1000 mL. Steriel filter de oplossing met behulp van een vacuümfiltratie systeem.
- Maak 1x Tyrode oplossing door het meten van 100 mL van de 10x kolf en het toevoegen aan 875 mL dubbel gedestilleerd water in een maatkolf van 1.000 mL. Plaats de kolf in een waterbad van 37 °C. Zodra de oplossing 37 °C heeft bereikt, gebruikt u NaOH om de pH te verhogen naar 7,39. Breng na het afstellen van de pH oplossing op volume in een maatkolf van 1.000 mL. Steriel filter met een vacuümfiltratie systeem.
- Breng 1x gemodificeerde Tyrode oplossing aan door 100 mL van de 10x kolf te meten en toe te voegen aan 875 mL dubbel gedestilleerd water in een maatkolf van 1.000 mL. Los 3,07 g L-glutathion op, verminderd in de kolf. Plaats de kolf in een waterbad van 37 °C. Zodra de oplossing 37 °C heeft bereikt, gebruikt u NaOH om de pH te verhogen naar 7,39. Breng na het afstellen van de pH oplossing op volume in een maatkolf van 1.000 mL. Steriel filter de oplossing met behulp van een vacuümfiltratie systeem.
- Maak 100 mM blebbistatin voorraadoplossing door 855 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen aan 25 mg poeder. In stappen van 20 μL en bewaar in een vriezer van 80 °C gedurende maximaal zes maanden.
- Maak de stop buffer door 2 g bovine serumalbumine (BSA) en 1 injectieflacon met aliceen blebbistatine kolf toe te voegen tot 100 mL 1x KHB-HB en steriele filter de oplossing met behulp van een vacuümfiltratie systeem.
- Maak een plating buffer door 5 mL foetaal runderserum en 1 injectieflacon met het aliceen blebbistatin kolf toe te voegen aan 95 mL M199 HEPES. Steriel filter de oplossing met behulp van een vacuümfiltratie systeem.
- Maak de myocyten cultuur buffer door een 1 Injectieflacon van de aliciteerde blebbistatin kolf en 4 MLS penicillin-streptomycine toe te voegen aan 396 mL M199 (25 mM HEPES). Steriel filter de oplossing met behulp van een vacuümfiltratie systeem.
- Autoclaaf 2 paar Dumont pincet, 2 paar Iris gebogen schaar, 2 hemostatica, één paar plastische chirurgie pincet, 6 zwart gevlochten zijde 4-0 hechtingen gerangschikt om te worden gebruikt als een chirurgische dubbele-throw Knot, en 4 100 mL bekerglazen.
- Steriliseren 22 x 22 mm2 glazen dekstroken. Plaats eerst een enkele afdekplaat in elke put van een zes put. Nadat het deksel is verwijderd, zet u de UV-lamp van de bioveiligheid Cabinet aan en stelt u de afdek stroken bloot aan UV-licht gedurende 1 uur.
- Maak werken laminine Stock Solution door de fles eerst op ijs te ontdooien. Voeg inhoud van één fles toe aan voldoende koude steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om een eindconcentratie van 0,04 mg/mL te bereiken. Aliquot 1,3 μL in geautoclaveerd 1,5 mL centrifugebuizen. Bewaren bij-80 °C.
Opmerking: elke buis heeft genoeg laminine voor een enkele zes goed plaat. Vermijd meerdere Vries ontdooien cycli. - Mantel gesteriliseerde dekslip door eerst de werkende laminine oplossing op ijs te ontdooien. Zuig met behulp van een P1000 pipet 200 μL laminin. Sleep de pipetpunt voorzichtig langs een rand van de afdekplaat om capillaire actie uit te laten trekken van een minuscule hoeveelheid laminine om de afdek bevestiging aan de zes put te vergemakkelijken.
- Vervolgens verdrijven de resterende laminine in het midden van de dekslip. In een cirkelvormige beweging, verspreid de laminine druppel over de dekslip. Plaats in een incubator van 37 °C ten minste 1 uur en tot 24 uur vóór de isolatie.
2. bereiding van het Langendorff-apparaat
Opmerking: de afzonderlijke onderdelen van het Langendorff-apparaat die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in de lijst met materialen.
- Schakel het circulerende waterbad in. Stel de temperatuur in zodat perfusaat een temperatuur van 37 °C heeft.
Opmerking: met de oplossings reservoirs die zijn ingesteld op een hoogte van 60 cm, moet de circulerende water geboorte worden ingesteld op 41 °c om de perfusaat 37 °c te hebben. In tegenstelling tot eerder gerapporteerde protocollen hoeft de hoogte van het reservoir niet te worden gewijzigd. - Spoel het Langendorff-apparaat af met 70% ethanol, gevolgd door twee spoelen met dubbel gedestilleerd water. Na het spoelen vult u het reservoir met KHB-HB en oxygenaat met 100% zuurstof.
- Het systeem wordt primair door zuurstofrijk khb-HB in een bekerglas van 100 ml te laten stromen. Zodra 50 mL oplossing in het bekerglas is geploegd, schakelt u de 3-weg stop-Cock positie om de stroom van het KHB-HB reservoir te stoppen. Giet 50 ml zuurstofrijk khb-HB uit het bekerglas in het Collagenase reservoir.
- Laat de KHB-HB uit het spijsverterings reservoir afvloeien tot 5 mL in het Collagenase reservoir. Tijdens het priming Collagenase reservoir, schakel de 3-weg stop haan herhaaldelijk tussen reservoirs om de lijnen te Degas. Nadat het systeem is geprimeerd, vergeet niet om de ontgassings trap bovenop de verwarmings spoel te gebruiken, zodat eventuele resterende lucht het systeem kan verlaten.
- Maak de Collagenase-oplossing. Voor ratten combineren 100 mg type II Collagenase, 100 ml zuurstofrijk khb-HB, en 2 flacons van de blebbistain kolf. Voor muizen, combineer 100 mg type II Collagenase, 40 ml van zuurstofrijk khb-HB, en 2 flacons van de blebbistain kolf. Eenmaal gemengd, de oplossing moet stabiel zijn voor 1 h.
Opmerking: de levensvatbaarheid van Myocyte kan variëren tussen type II Collagenase lots. Profiteer van een Collagenase-bemonsteringsprogramma om veel te testen voordat u in bulk bestelt.
3. Myocyte-isolatie
- Injecteer het dier met 1.000 U heparin. Wacht 5 min.
Opmerking: muizen en ratten van elke leeftijd kunnen worden gebruikt. Echter, in het algemeen de oudere of meer zieke het dier, hoe lager de myocyten opbrengst. - Offer het dier door eerst het anesthetiseren met Isofluraan met behulp van de open-drop-methode (1 CC van Isofluraan per 500 cc volume) voor euthanatering van het dier met een pentobarbital mengsel (150 mg/kg intraperitoneaal).
- Snel het hart van de accijns door eerst de vacht boven het xifoïde proces te grijpen. Met de Iris schaar, maak een kleine incisie onmiddellijk onder het xifoïde proces en trek de vacht naar boven naar het hoofd bloot de huid.
- Pak het xifoïde proces en snijd het diafragma bloot de thoracische holte. Maak een val deur incisie, trek het borstbeen terug met behulp van een hemostat, en gebruik de gebogen Tang te accijnzen het hart boven de stijgende aorta en plaats in koude KHB-HB.
- Cannulate het hart met behulp van een stereomicroscoop en nummer 5 Tang. Zorg ervoor dat het hart wordt ondergedompeld en de canule werd voor de hart excisie voorgevuld om emboli te voorkomen. Bevestig de juiste positionering van de canule door de punt van de canule ongeveer 1 mm boven de aorta-insertie in de ventrikel te visualiseren.
Opmerking: hoe sneller de cannulatie tijd, hoe beter de myocyten opbrengst. - Start de stroom van khb-HB door de kraantje op de Langendorff te draaien. Sluit de canule aan op de Langendorff. Parfuseer het hart gedurende 5 minuten.
Opmerking: aangezien perfusie wordt geleverd door een op zwaartekracht gebaseerd systeem, zal de stroom door het hart een functie van coronaire arteriële compliance zijn. - Schakel perfusie van het KHB-HB reservoir naar het verterings buffer reservoir. Zodra de digestie buffer het hart bereikt, stelt u een timer in (5 min voor muis of 15 min voor rat). Zorg ervoor dat u de perfusaat in een steriel 100 ml bekerglas verzamelt. Vul het verterings buffer reservoir zo nodig aan met de perfusaat totdat de verterings tijd is verstreken.
- Scheid na de spijsvertering de kamers van het hart met een tang en de Iris schaar in een steriel 100 mL bekerglas. Plaats elke kamer in een aparte put van een zes goed plaat. Giet 5 mL Collagenase-oplossing in elke put.
- Begin onmiddellijk met het hakken van het hartweefsel met een schaar. Weefsel brokken moeten ongeveer 1 mm3zijn. Gebruik de steriele Transfer pipetten om het fijngehakte hart voorzichtig te tritureren. De oplossing moet troebel worden.
- Zodra de weefsel brokken wit en vederlicht worden, onderzoekt u de cellen met een omgekeerde Microscoop. Als het aantal levensvatbare cellen groter is dan 80%, ga dan verder om de cellen in een conische buis van 50 mL te belasten met behulp van een celzeef van 100 μm. Gebruik een andere buis en zeef voor elke kamer van het hart.
- Als het aantal levensvatbare cellen kleiner is dan 80%, controleert u de tijd die het kostte om te cannuleren. Als de cannulatie tijd meer dan 5 minuten is, probeer dan een ander hart. Zo niet, test dan nieuwe Collagenase-lots via het Collagenase-bemonsteringsprogramma.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 215 x g gedurende 2 min. De pellet moet compact zijn en niet los. Als de pellet los zit, bevat het preparaat veel dode cellen. In een weefselkweek afzuigkap, respendeer de pellet in 10 mL stop buffer.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 215 x g gedurende 2 min. De pellet moet compact zijn en niet los. Als de pellet los zit, bevat het preparaat veel dode cellen.
- Respendeer de cellen in 5 mL plating buffer. Voer een aantal cellen uit. Pas de milliliter van de plating buffer aan om een uiteindelijke myocyten concentratie van 2 x 104 cellen per ml te bereiken.
- Verwijder de afdek stroken met laminin coating uit de incubator. Aspireren de laminine druppel.
- Plaat 200 μL myocyten suspensie op elke dekslip. Plaats in een incubator van 37 °C (21% O2,5% co2) voor 2 uur om bevestiging toe te staan. Na 2 h, aspireren de niet-aangehechte cellen, voeg 2 mL cultuur media, en cultuur voor maximaal 4 dagen.
4. Fura-2 kleurstof laden
- Maak een 2 mM Fura-2 acetoxymethyl Ester (Fura-2 AM) stockoplossing door toevoeging van 25 μL DMSO aan 50 μg Fura-2 AM poeder (1 injectieflacon). In 6 μL aliquots. Neem 1 aliquot Fura-2 AM en voeg toe aan 6 mL beplating medium. Vortex om te mengen.
- Verwijder 1 6 goed plaat van myocyten uit de incubator. Aspirate media. Voeg 1 mL Fura-2 media mengsel toe aan elk goed. Afdekplaat met folie, laat de plaat bij kamertemperatuur en wacht 15 min.
- Aspirate Fura-2 media mengsel en voeg 1 mL Tyrode oplossing toe aan elke put. Afdekking met folie. Wacht 20 minuten bij kamertemperatuur om de kleurstof te laten wassen vóór de beeldvorming.
5. fluo-4 kleurstof laden
- Maak een 1,82 mM fluo-4 acetoxymethyl Ester (fluo-4 AM) stockoplossing door 25 μL DMSO toe te voegen aan 50 μg fluo-4 AM poeder (1 injectieflacon). In 8,333 μL aliquots. Neem 1 aliquot fluo-4 AM voorraad en voeg toe aan 6 mL beplating medium. Vortex om te mengen.
- Verwijder 1 6 goed plaat van myocyten uit de incubator. Aspirate media. Voeg 1 mL fluo-4 AM media mengsel toe aan elk goed. Afdekplaat met folie, laat de plaat bij kamertemperatuur en wacht 15 min.
- Aspirate fluo-4 AM media mengsel en voeg 1 mL Tyrode oplossing aan elke put. Afdekking met folie. Wacht 20 minuten bij kamertemperatuur om de kleurstof te laten wassen vóór de beeldvorming.
6. membraanpotentiaal kleurstof belasting
- Verwijder component A en component B uit de membraanpotentiaal Kit. Combineer in een conische buis van 15 mL 50 μL van component B en 5 μL component A. Vortex om te mengen. Voeg 10 mL uitplatings media toe aan de conische buis van 15 mL die het voltage kleurstof mengsel bevat. Vortex om te mengen.
- Verwijder 1 6 goed plaat van myocyten uit de incubator. De media te aspireren. Voeg aan elk goed 800 μL van het membraanpotentiaal kleurstof mengsel toe. Afdekplaat met folie, laat de plaat bij kamertemperatuur en wacht 15 min.
- Aspirate Dye media mengsel en voeg 1 mL van gemodificeerde-Tyrode oplossing voor elke put. Afdekking met folie.
7. photometrie en opladen gekoppelde Apparaatopnames
- Schakel de apparatuur in de volgende volgorde: Microscoop, Arc lamp, hyperswitch, fluorescentie interface systeem, Myocam voeding, veld stimulator, en computer.
- Zorg ervoor dat de excitatie/emissie filter sets geschikt zijn voor de Imaging Dye.
Opmerking: Fura-2 is enthousiast over 340 nm en 380 nm licht. Het zendt uit op 510 Nm licht. Fluo-4 en de voltage membraan kleurstof zijn opgewonden op 485 nm licht en stoten bij 520 nm licht. - Het systeem prikken door het vacuüm in te schakelen, de slangklem volledig te openen en elke spuit van 60 mL die in de variëteit wordt gebruikt zachtjes te plunderen. Voor calcium opnames gebruikt u de oplossing van Tyrode. Voor spannings opnamen gebruikt u de oplossing van gemodificeerde Tyrode.
- Zet de kachel aan en stel de stroom in door de roller Clamp op de perfusie slang aan te passen. Maak opnames bij 36 ± 1 °C.
- Open de verwervings software. Zorg ervoor dat de parameters zijn ingesteld voor de juiste Imaging kleurstof.
- In het donker, verwijder de folie van de zes goed plaat en plaats een dekslip in de pacing kamer. Zorg ervoor dat de stimulator is uitgeschakeld tijdens deze stap. Focus op de myocyten met behulp van de 10x doelstelling.
- Eenmaal in focus, beginnen pacing door veld te stimuleren op 1 Hz, 0,2 V. Verhoog geleidelijk de spanning tot 1:1 pacing wordt verkregen. Verhoog vervolgens de spanning tot 1,5 x de drempel is bereikt.
Opmerking: omdat excitatie-contractie koppeling temperatuur afhankelijk is, moet u ervoor zorgen dat de cellen gedurende 15 minuten voor de opname zijn geperfectiongebruikt. Dit maakt het mogelijk om myocyten te herstellen van de schok van het gaan van kamertemperatuur terug naar 37 ° c evenals losjes aangesloten cellen om weg te zweven. - Overschakelen van de 10x-doelstelling naar de 40x-doelstelling. Concentreer u op een cel die een 1:1 pacing volgt. Pas de plastic tinten aan zodat slechts één cel zich in het gezichtsveld bevindt.
- Met behulp van de software, plaats het gebied van de interesse vak op goed gedefinieerde sarcomeres. Start de acquisitie software om het excitatie lampje te starten. Pas met behulp van de filters met neutrale dichtheid de intensiteits instelling dienovereenkomstig aan om een adequate SRV te verkrijgen.
Representative Results
Figuur 1A toont het Langendorff-apparaat. De oxygenator bevindt zich in het KHB-HB reservoir. De Collagenase-oplossing bevindt zich in het middelste 60 mL spuit reservoir. De ontgassings leiding is aangesloten op het lege 60 mL spuit reservoir. Na een succesvolle isolatie moeten de meeste cellen staafvormig en striated zijn. Onder een 40x-doelstelling moeten de meeste myocyten duidelijke strepen zichtbaar hebben. Figuur 1B, C toont voorbeelden van gezonde rat myocyten. Eenmaal geïsoleerd, kunnen cellen tot 4 dagen worden gekweekt met behoud van hun morfologie en elektrische eigenschappen.
Om de excitatie-contractie koppeling te meten, worden de cellen vervolgens in een verwarmde pacing kamer geplaatst. Omdat myocyten gevoelig zijn voor temperatuurveranderingen, is het belangrijk dat de dekslip gedurende 15 minuten in de kamer wordt geëlekkt voordat de opname wordt opgenomen. Voor fluorescentie-opnames wordt de excitatie golflengte opgewekt door een 75 W Xenon-Arc bulb. Xenon-Arc lampen produceren een lichtspectrum dat natuurlijk zonlicht nabootst. De intensiteit van het licht en de golflengte worden beheerst door neutrale dichtheid/emissie-Filers. Het excitatie lampje gaat dan door het doel naar de Myocyte. De Emissiegolflengte wordt vervolgens verzameld door een fotomultiplicator buis. Met behulp van het hier beschreven systeem moeten zowel de excitatie-als de emissie filters handmatig worden gewijzigd.
Inkorten aan de andere kant wordt verkregen door een opgeladen apparaatsensor. In realtime meten tot 1.000 keer per seconde voert de verwervings software een gemiddelde van de lijnen binnen een interessegebied uit om een goed opgelost strepen-patroon te maken. Vervolgens wordt een snelle Fourier-transformatie (FFT) berekend. De piek binnen het vermogensspectrum vertegenwoordigt de gemiddelde afstand tussen de sarcomere. Veranderingen in de afstand van de sarcomere tijdens pacing worden vervolgens uitgezet en vervolgens gekwantificeerd.
Figuur 2 toont calcium en inkorten sporen opgenomen van een C57/B6 muis myocyten geladen met de calcium kleurstof Fura-2. Het pacing-protocol is een wijziging van de pacing-protocollen die eerder10,11werden beschreven. Gezonde muis myocyten moeten in staat zijn om te worden tempo op hun rust hartslag 10 Hz. Figuur 3 is kwantificering van ensembled gemiddelde gegevens verkregen van een C57/B6 muizen en hun transgene (TG) littermates die een puntmutatie geïntroduceerd in een kalium kanaal. Let op, er is geen verschil tussen de groepen met uitzondering van de ontspannings tijd bij 10 Hz pacing.
In tegenstelling tot Fura-2, dat een dubbele excitatie kleurstof is, zijn de spannings kleurstof en fluo-4 enkele golflengte excitatie kleurstoffen waarvan de excitatie/emissie werken met standaard FITC excitatie en emissiespectrum (494/506 nm). Daarom kunnen opnames van calcium en sarcomere verkorting of spanning en sarcomere verkorting worden verkregen met behulp van deze Filterset.
Figuur 4a toont een spannings tracering opgenomen van een C57/B6 muis myocyten tempo bij 10 Hz. vergeleken met calcium signalen zijn enkele spanningstraceringen kleiner in amplitude en hebben nabewerking nodig om een bruikbaar signaal te verkrijgen. Figuur 4B toont een ensembled middeloud actie potentieel (AP) dat is gemaakt op de APS in Figuur 4A. Figuur 4C, D toont een ensembled gemiddelde AP na een lage doorgang Butterworth of een Savitzky-Golay digitaal filter werd toegepast. Zorg moet worden genomen bij het filteren van het signaal als niet te verstoren van de echte gegevens. Let op de subtiele verschillen in de vorm van de APs in Figuur 4B-D.
Afbeelding 5 toont sporen opgenomen van Rat myocyten tempo op 1 Hz. Naast het spanningssignaal dat lager is dan het calcium signaal, zijn ook de contractie kinetiek verschillend. Dit komt omdat calcium kleurstoffen buffer calcium terwijl voltage kleurstoffen niet.
Net als bij de calcium Transient (Figuur 3) vertoonden myocyten afhankelijke veranderingen in de mogelijke duur van de optische actie (apd) (Figuur 6). Terwijl de Fura-2 sporen waren ensembled gemiddeld voordat ze werden gekwantificeerd, werden de spannings sporen gefilterd met een Savitzky-Golay polynoom smoothing filter (breedte 5, orde 2) voordat ze worden ensembled gemiddeld en gekwantificeerd.
Zoals gekwantificeerd in Figuur 6 en Figuur 7, naast het demonstreren van pacing geïnduceerde veranderingen in apd, ze ook aangetoond drug geïnduceerde verlenging van de AP. Bij een pacing van 4 Hz resulteerde concentratieafhankelijke blokkade van de voorbijgaande uitwendige stroom (Ito) met 4-aminopyridine in verlenging van de APD.
Tot slot moet worden gezorgd om cytotoxiciteit te voorkomen. Figuur 8 is de laatste 11 s van een 20 s-opname. Aangegeven door de rode pijlen in Figuur 8leidt langdurige blootstelling van myocytes aan blauw licht tot geactiveerde activiteit.
Figuur 1: constante druk Langendorff-apparatuur. A) het Langendorff-apparaat met elk van de in witte letters gelabelde componenten. B) geïsoleerde Sprague-Dawley rat myocyten bekeken door middel van een 10x doelstelling. C) geïsoleerde rat myocyten, bekeken door middel van een 40x doelstelling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve calcium en sarcomere inkorten sporen opgenomen van C57/B6 myoyctes met behulp van Fura-2. Calcium en sarcomere inkorten sporen opgenomen op 1, 2, 4, 10, 0,5 en 0,75 Hz. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: kwantificering van sarcomere verkorting, piek calcium, ontspannings tijd en heropname tijd opgenomen uit een C57/B6 wild type (WT) en transgene (TG) muizen. A) sarcomere verkorting. B) piek calcium. C) ontspannings tijd gedefinieerd als 90% terug naar baseline van de inkorten tracering. D) heropname tijd gedefinieerd als 90% terugkeer naar baseline van het calcium spoor. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: optische actiepotentiaal opgenomen van een C57/B6 muis myocyten tempo op 10 Hz. A) 1 seconde ongefilterd spoor. B) Ensembled middeloud optisch actiepotentiaal. C) Ensembled middeloud optisch actiepotentiaal na toepassing van een lowpass Butterworth-filter. D) Ensembled middeloud optisch actiepotentiaal na toepassing van een Savitzky-Golay-polynoom smoothing-filter. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatief calcium, voltage en sarcomere verkorting van de sporen die zijn opgenomen bij Sprague-Dawley rat myocyten op 1 Hz. A) bijeenpacing van 1 Hz met behulp van fluo-4 worden de sporen van calcium en sarcomere verkort. B) spanning en sarcomere verkorting van de sporen opgenomen bij een pacing van 1 Hz met behulp van de spannings kleurstof. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: optische actie potentialen opgenomen van Sprague-Dawley rat myocyten tempo op 1, 2 en 4 Hz pacing. A) gefilterd spoor, opgenomen bij een pacing van 1 Hz. B) gefilterde sporen die bij een pacing van 2 Hz zijn geregistreerd. C) gefilterde sporen opgenomen bij een pacing van 4 Hz. D) actiepotentiaal duur 10, gemeten als 10% terug naar Baseline. E) actiepotentiaal duur 50, gemeten als 50% terug naar Baseline. F) actiepotentiaal duur 90, gemeten als 90% terug naar Baseline. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: de effecten van 4-aminopyridine op Sprague-Dawley rat optische actie potentialen opgenomen op 4 Hz pacing. A) Ensembled gemiddeld spoor opgenomen op 4 Hz pacing zonder 4-aminopyridine in de oplossing. B) Ensembled gemiddeld spoor geregistreerd bij een pacing van 4 Hz met 1 μM 4-aminopyridine in de oplossing. C) Ensembled gemiddeld spoor opgenomen bij een pacing van 4 Hz met 10 μM 4-aminopyridine in de oplossing. D) actiepotentiaal duur 10, gemeten als 10% terug naar Baseline. E) actiepotentiaal duur 50, gemeten als 50% terug naar Baseline. F) actiepotentiaal duur 90, gemeten als 90% terug naar Baseline. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: voltage Dye geïnduceerde fototoxiciteit bij Sprague-Dawley rat myocyten na 20 s van continue blootstelling aan licht. Rode pijlen geven cytotoxische gebeurtenissen aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Het kunnen isoleren van cardiale myocyten is een krachtige methode die kan worden gebruikt om cardiale fysiologie, pathologie en toxicologie te begrijpen. In het bovenstaande protocol hebben we een methode beschreven die een constante zwaartekracht druk Langendorff-apparaat gebruikt om enkele cardiale myocyten te verkrijgen. Daarna beschrijven we, met behulp van het fluorescentie fotometrischsysteem, hoe we gelijktijdig calcium en inkorten of spanning en inkorten sporen kunnen verkrijgen.
Vanwege de verschillende kinetiek tussen calcium kleurstoffen moet er op worden gelet welke kleurstof u moet selecteren. Voor dit protocol werden zowel de Fura-2 als de fluo-4 gebruikt met am-esters die een Wash-stap noodzakelijk maken om intracellulaire esterasen tijd te geven om de am-groep te klieven en de kleurstof in de cel te vangen. Terwijl zowel Fura-2 als fluo-4 worden beschouwd als hoge affiniteit calcium kleurstoffen, is de Kd voor Fura-2 145 nM vergeleken met de 345 nM voor fluo-49. Verder is Fura-2 ratiometrisch. Hierdoor, het kan worden gebruikt voor het kwantificeren van intracellulaire calcium niveaus9,12. Fluo-4 aan de andere kant is een enkele golf calcium sonde. Het voordeel van het gebruik van fluo-4 is dat het een helderder fluorescentie signaal produceert. Ongeacht welke calcium kleurstof wordt gebruikt, in vergelijking met de calcium kleurstof, membraan spannings voelers hebben een lagere SNR.
Zoals weergegeven in Figuur 4 en Figuur 5, zijn spannings sporen vergeleken met calcium sporen kleiner in amplitude. Met de digitale traceer filtering van de software is het mogelijk om de SRV te verhogen en de gegevens te kwantificeren (Figuur 4 en Figuur 7). Eenmaal gekwantificeerd, tonen zowel calcium transiënten als optische Apd's restitutie, verkorting van hun duur bij snellere tempo frequenties (Figuur 2, Figuur 3, Figuur 6en Figuur 7). Kortere Apd's tijdens snellere pacing cycli zijn nodig om voldoende tijd te geven voor ventriculaire vulling tijdens diastole. Veranderingen in dit fenomeen worden beschouwd als indicatief voor een toename van het risico van hartritme13,14,15,16. Hoewel veranderingen in APD kunnen worden veroorzaakt door ziekte, kunnen ze ook worden veroorzaakt door chemicaliën. Zoals getoond in Figuur 7, wanneer de overheersende Murine repolariserende kalium stroom, Ito, wordt geblokkeerd, wordt de optische apd langer.
Nog steeds, zoals eerder gerapporteerd met spannings gevoelige kleurstoffen, lichtintensiteit en duur kunnen de APD2,5,17veranderen. Dit wordt verondersteld te zijn het resultaat van de generatie van reactieve oxidatieve soorten (ROS)5. Eerder is aangetoond dat de toevoeging van antioxidanten aan de opname oplossing spannings gevoelige kleurstof cytotoxiciteit5kan voorkomen. Als gevolg hiervan hebben we de antioxidant L-glutathion (10 mM) toegevoegd aan de oplossing van Tyrode. Afgebeeld in Figuur 8 is de laatste 11 s van een 20 s opname verkregen bij 1 Hz pacing. Zoals aangegeven door de rode pijlen, kwamen er geen wijzigingen in de APD tot 15 s in de opname; Daarom, terwijl de gemodificeerde Tyrode oplossing geen fototoxiciteit voorkwam, vertraagde het deze aanzienlijk. Met behulp van gemodificeerde Tyrode oplossing, met een lage lichtintensiteit instelling en het houden van de duur van de opname tot onder 5 s, is het mogelijk om te voorkomen dat elke kleurstof veroorzaakte wijzigingen in APD. Dit is belangrijk omdat zonder de zorg om fototoxiciteit te vermijden, de gegevens verkeerd geïnterpreteerd kunnen worden als vroegtijdige of vertraagde na depolarisaties. Naast het beperken van de blootstelling aan blauw licht, zijn er extra voorzorgsmaatregelen die kunnen worden genomen om verkeerde interpretatie van de gegevens te voorkomen.
De eerste is om alleen op te nemen van cellen die volgen één tot één pacing en hebben een rust sarcomere lengte groter dan of gelijk aan 1,75 μm. De 1,75 μm cutoff is afkomstig van de waarneming door Gordon et al.18 die spanning snel daalt als de sarcomere lengte lager is dan dit bedrag. Niettemin, bepaalde pathologieën kunnen resulteren in aanzienlijke veranderingen in rust sarcomere lengte. Om er zeker van te zijn dat het fenotype reëel is en niet een artefact van de isolatie, moeten de volgende probleemoplossing benaderingen worden genomen.
Als myocyten consequent niet volgen 1:1 pacing, hebben sarcomere lengtes onder 1,75 μm, zware membraan blebbing, of niet overleven de isolatie, het eerste ding om te controleren is de tijd die het kostte om het hart te cannuleren. Hoe langer de cannulatie tijd, hoe lager de opbrengst zal zijn. Als een lange cannulatie tijd nodig is, kan de levensvatbaarheid worden verbeterd door het hart te plaatsen in een cardioplegische oplossing19. Niettemin, omdat de Collagenase een enzym is, de activiteit en specificiteit van een specifieke partij veranderen in de tijd. Als de totale opbrengsten geleidelijk erger worden ondanks goede cannulatie tijden, moeten nieuwe partijen worden getest. Terwijl ons protocol werd geoptimaliseerd voor 5 s opnames, als langere spannings sporen nodig zijn, zullen extra neutrale dichtheids filters moeten worden aangeschaft. Het in het protocol beschreven systeem wordt geleverd met filters met een neutrale dichtheid die het verzonden licht reduceren met 37%, 50%, 75%, 90% en 95%.
Samengevat, we beschreven een methodologie die toegestaan voor de isolatie van volwassen Murine ventriculaire myocyten die werden gebruikt voor calcium, spanning, en sarcomere verkorting van metingen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Dana Morgenstern voor het zorgvuldig naleden van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
| 1 liter volumetric flask | Fisher Scientific | 10-205F | |
| 100 ml beaker | Fisher Scientific | FB-100-100 | |
| 100 ml graduated cylinder | Fisher Scientific | 08 562 5C | |
| 1000 ml flask | Fisher Scientific | FB-500-1000 | |
| 2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods | Radnoti, LLC | 159951-2 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
| 40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm) | IonOptix | MSCP1-40 (b) | |
| 60-mL syringe, BD Luer-Lok tip | BD | 309650 | |
| Aortic Metal Cannulae | Harvard Apparatus | 73-0112 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| C-6 Standard Heating Circulator | Chemyx | A30006 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510500 | |
| Cell framing adapter | IonOptix | CFA300 | |
| CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V100022 | |
| CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V25022 | |
| CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS | Labratory Product Sales, Inc | V50022 | |
| CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater | IonOptix | TEMPC2 | |
| Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks | Cole-Parmer | EW-30600-23 | |
| Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way | Cole-Parmer | EW-30600-12 | |
| Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip | Cole-Parmer | EW-30600-01 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
| Corning Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro | IonOptix | CPUD7M | |
| DMSO | Fisher Scientific | 50980367 | |
| Dumont Tweezers Style 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
| FHD Rapid Change Stimulation Chamber | IonOptix | FHDRCC1 | |
| Fluo-3/4 Optics Package | IonOptix | IonOP-Fluo | |
| Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card) | IonOptix | FSI700 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Hemostat, Curved 5-1/2" | Amazon | B00GGAAPD0 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310500 | |
| HyperSwitch dual excitation light source | IonOptix | HSW400 | |
| Inverted Motic Fluorescence Microscope | IonOptix | MSCP1-40 (a) | |
| IonWizard Core + Analysis | IonOptix | IONWIZ | |
| Iris Scissors, curved | Amazon | B018KRRMY6 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-100 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP3661 | |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds | SouthernAnesthesiaSurgical Inc. | SP116-EA | |
| M199 Media | Fisher Scientific | 12 340 030 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | MP021914215 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP2131 | |
| MyoCam-S Digital CCD video system | IonOptix | MCS100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | MYP100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358212 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | 56-754-9250GM | |
| Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter | Radnoti, LLC | 140143-025 | |
| Photomultiplier sub-system | IonOptix | PMT400 | |
| PMT Acquisition add-on | IonOptix | PMTACQ | |
| Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap | Radnoti, LLC | 158830 | |
| Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir | Radnoti, LLC | 120141-025 | |
| Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti, LLC | 120149RC | |
| Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-214 | |
| Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-217 | |
| Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-219 | |
| Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-226 | |
| Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-209 | |
| Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-210 | |
| Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-213 | |
| Sarcomere Length Recording add-on | IonOptix | SARACQ | |
| T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75" | Amazon | B00JDWRBGC | |
| VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers | Amazon | B07QMZC94J | |
| Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform | IonOptix | ISO100 |
References
- Hagen, B. M., Boyman, L., Kao, J. P., Lederer, W. J. A comparative assessment of fluo Ca2+ indicators in rat ventricular myocytes. Cell Calcium. 52 (2), 170-181 (2012).
- Schaffer, P., Ahammer, H., Muller, W., Koidl, B., Windisch, H. Di-4-ANEPPS causes photodynamic damage to isolated cardiomyocytes. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 426 (6), 548-551 (1994).
- Hardy, M. E., Lawrence, C. L., Standen, N. B., Rodrigo, G. C. Can optical recordings of membrane potential be used to screen for drug-induced action potential prolongation in single cardiac myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 54 (2), 173-182 (2006).
- Tian, Q., et al. Optical action potential screening on adult ventricular myocytes as an alternative QT-screen. Cellular Physiology and Biochemistry. 27 (3-4), 281-290 (2011).
- Warren, M., et al. High-precision recording of the action potential in isolated cardiomyocytes using the near-infrared fluorescent dye di-4-ANBDQBS. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (4), 1271-1281 (2010).
- FluoVolt™ Membrane Potential Kit. ThermoFisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0009668_FluoVolt_Membrane_Potential_Kit_UG.pdf (2018).
- Fluorescence SpectraViewer. ThermoFisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2019).
- Calcium and Contractility in Isolated Myocytes. IonOptix. , Available from: http://www.ionoptix.com/product/myocyte-calcium-and-contractility-recording-system/ (2019).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Davis, J., et al. Diastolic dysfunction and thin filament dysregulation resulting from excitation-contraction uncoupling in a mouse model of restrictive cardiomyopathy. The Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (3), 446-457 (2012).
- Ren, J., Davidoff, A. J. Diabetes rapidly induces contractile dysfunctions in isolated ventricular myocytes. The American Journal of Physiology. 272, 1 Pt 2 148-158 (1997).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Goldhaber, J. I., et al. Action potential duration restitution and alternans in rabbit ventricular myocytes: the key role of intracellular calcium cycling. Circulation Research. 96 (4), 459-466 (2005).
- Weiss, J. N., et al. The dynamics of cardiac fibrillation. Circulation. 112 (8), 1232-1240 (2005).
- Baher, A., et al. Short-term cardiac memory and mother rotor fibrillation. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (1), 180-189 (2007).
- Kleber, A. G., Rudy, Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias. Physiological Reviews. 84 (2), 431-488 (2004).
- McPheeters, M. T., Wang, Y. T., Werdich, A. A., Jenkins, M. W., Laurita, K. R. An infrared optical pacing system for screening cardiac electrophysiology in human cardiomyocytes. PLoS ONE. 12 (8), 0183761 (2017).
- Gordon, A. M., Huxley, A. F., Julian, F. J. The variation in isometric tension with sarcomere length in vertebrate muscle fibres. The Journal of Physiology. 184 (1), 170-192 (1966).
- Li, Y., et al. Three Preservation Solutions for Cold Storage of Heart Allografts: A Systematic Review and Meta-Analysis. The Journal of Artificial Organs. 40 (5), 489-496 (2016).
