Summary
Vi præsenterer metoden til isolering af murine myocytter og hvordan man får spænding eller calcium spor samtidig med sarcomere afkortning af spor ved hjælp af fluorescens fotometri med samtidige digitale celle geometri målinger.
Abstract
Evnen til at isolere voksne hjerte myocytter har tilladt forskerne at studere en række kardielle patologier på enkelt celleniveau. Mens fremskridt i calcium følsomme farvestoffer har tilladt den robuste optiske optagelse af enkelt celle calcium dynamik, registrering af robuste transmembran optiske spændings signaler har været vanskeligt. Velsagtens, dette er på grund af den lave single-to-støj ratio, fototoksicitet, og foto blegning af traditionelle potentiometriske farvestoffer. Derfor har enkelt celle spændings målinger længe været begrænset til patch clamp teknik, som mens guldstandarden, er teknisk krævende og lav gennemløb. Men med udviklingen af nye potentiometriske farvestoffer, store, hurtige optiske reaktioner på ændringer i spænding kan opnås med lidt at ingen fototoksicitet og foto blegning. Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan man isolerer voksne murine myocytter, som kan bruges til cellulære forkortelse, calcium, og optisk spænding målinger. Specifikt, protokollen beskriver, hvordan man bruger en ratiometrisk calcium farvestof, en enkelt-excitation calcium farvestof, og en enkelt excitation spændings farvestof. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at vurdere kardiotoksicitet og arytmogenicitet af forskellige kemiske agenser. Selv om fototoksicitet stadig er et problem på enkelt celleniveau, diskuteres metoden om, hvordan den skal reduceres.
Introduction
For at studere hjertet under sunde og patologiske tilstande, er det ofte nyttigt at undersøge fænotype på enkelt celleniveau. Mens videnskabelige fremskridt har tilladt den robuste måling af enkelt celle calcium dynamik, enkelt celle optisk spænding målinger er forblevet knappe1. Formentlig, dette er på grund af den lave signal til støj ratio (SNR), fototoksicitet, og foto blegning af traditionelle potentiometriske farvestoffer2,3. Ikke desto mindre, isolerede nekrotiske optiske handlings potentialer er opnået2,3,4. Yderligere, med fremskridt i kemi og fysik af spændings følsomme farvestoffer, SNR har forbedret5. Nyere membran potentielle sonder (tabel over materialer) reagerer på ændringer i membranpotentialet i sub-millisekunder og har et fluorogent respons område på ca. 25% pr. 100 mv. Yderligere, excitation/emission af membran potentielle Kit (f. eks, FluoVolt; Tabel over materialer) anvendes i denne protokol virker med standard fluorescein isothiocyanat (FITC) eller grøn fluorescerende protein (GFP) indstillinger6.
Den FITC og GFP excitation/emission spektre overlapper med fluo-4 calcium bundet Spectra7. Samtidig erhvervelse af fluorescens fotometri med digitale celle geometri målinger traditionelt er blevet anvendt til samtidig erhvervelse af calcium og cellulære afkortning målinger8. Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan man isolerer murine myocytter, og hvordan man registrerer calcium-eller spændings signaler ved hjælp af standard FITC-indstillinger. Derudover beskriver den, hvordan en simpel switch i excitation/emission filtre på Imaging arbejdsstation kan bruges til at opnå calcium og afkortning målinger ved hjælp af forholdet metriske calcium farvestof Fura-2. Sammenlignet med fluo-4 har Fura-2 en højere affinitet for calcium og er relativt modstandsdygtig over for foto blegning9. Derfor, ved hjælp af en enkelt arbejdsstation denne protokol giver mulighed for en grundig undersøgelse af enkeltvis nekrotiske excitation-sammentrækning kobling.
Protocol
Alle metoder og procedurer, der er beskrevet i denne protokol, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepleje og-anvendelse (IACUC) i case Western reserve University.
1. forberedelse af løsninger, instrumenter og Dæksedler
Bemærk: 1x-løsninger kan bruges i op til en måned.
- Lav 10x Krebs-Henseleit buffer HEPES buffer uden calcium (KHB-HB) ved tilsætning af 68,96 g NaCl, 3,57 g KCl, 59,58 g af HEPES, 2,18 g af K2HPO4, 3,08 g mgso4 og 19,82 g glucose til 800 ml dobbeltdestilleret vand i en 1.000 ml kolbe. Når indholdet er helt opløst, skal der fyldes op til volumen i en 1.000 mL målekolbe.
Bemærk: traditionel Krebs Henseleit løsning bruger natriumbicarbonat som en buffer og opløsningen i denne protokol bruger Krebs Henseleit løsning med HEPES buffer. Opløsningen er stabil i 6 måneder, hvis den er sterilfiltreret. - Gør 10x Tyrode opløsning ved at tilføje 86,51 g NaCl, 0,552 g af NaH2po4, 2,03 g mgcl2, 9,91 g glucose, 4,03 g KCl, 2,65 g af CaCl2, og 35,76 g af Hepes til 800 ml dobbeltdestilleret vand i en 1000 ml kolbe. Når indholdet er helt opløst, skal der fyldes op til volumen i en 1000 mL målekolbe.
Bemærk: opløsningen er stabil i 6 måneder, hvis den er sterilfiltreret. - Der fyldes 1x KHB-HB ved at måle 100 mL af 10x bestanden og tilsættes 875 mL dobbeltdestilleret vand i en 1.000 mL kolbe. Placer kolben i 37 °C vandbad. Når opløsningen er nået op på 37 °C, skal du bruge NaOH til at øge pH-værdien til 7,39. Efter justering af pH-værdien bringes opløsningen til volumen i en 1000 mL målekolbe. Steril Filter opløsningen ved hjælp af et vakuum filtreringssystem.
- Der foretages 1x Tyrode opløsning ved at måle 100 mL af 10x bestanden og tilsætte 875 mL dobbeltdestilleret vand i en 1.000 mL kolbe. Placer kolben i 37 °C vandbad. Når opløsningen er nået op på 37 °C, skal du bruge NaOH til at øge pH-værdien til 7,39. Efter justering af pH-værdien bringes opløsningen til volumen i en 1.000 mL målekolbe. Steril filter ved hjælp af et vakuum filtreringssystem.
- Foretag 1x modificeret Tyrode opløsning ved at måle 100 mL af 10x bestanden og tilføje 875 mL dobbeltdestilleret vand i en 1.000 mL kolbe. 3,07 g L-Glutathion opløses i kolbe. Placer kolben i 37 °C vandbad. Når opløsningen er nået op på 37 °C, skal du bruge NaOH til at øge pH-værdien til 7,39. Efter justering af pH-værdien bringes opløsningen til volumen i en 1.000 mL målekolbe. Steril Filter opløsningen ved hjælp af et vakuum filtreringssystem.
- Lav 100 mM blebbistatin stamopløsning ved tilsætning af 855 μL dimethylsulfoxid (DMSO) til 25 mg pulver. I intervaller på 20 μL og opbevares i en-80 °C fryser i op til seks måneder.
- Gør stop buffer ved tilsætning af 2 g bovin serumalbumin (BSA) og 1 hætteglas med aliciteret blebbistatin-lager til 100 mL 1x KHB-HB og steril Filter opløsningen ved hjælp af et vakuum filtreringssystem.
- Lav plating buffer ved tilsætning af 5 mL føtal bovint serum og 1 hætteglas med det aliciterede blebbistatin-lager til 95 mL M199 HEPES. Steril Filter opløsningen ved hjælp af et vakuum filtreringssystem.
- Lav nekrotiske Culture buffer ved at tilføje et 1 hætteglas med det aliciterede blebbistatin-lager og 4 MLS penicillin-streptomycin til 396 ml M199 (25 mm Hepes). Steril Filter opløsningen ved hjælp af et vakuum filtreringssystem.
- Autoclave 2 par Dumont pincet, 2 par iris buet saks, 2 hemostats, et par plastikkirurgi pincet, 6 sorte flettet silke 4-0 suturer arrangeret til at blive brugt som en kirurgisk dobbelt-kaste knude, og 4 100 mL bægre.
- Steriliser 22 x 22 mm2 glas dæksedler. Først placere en enkelt dækglas i hver brønd af en seks brønd plade. Bagefter, med låget fjernet, tænde UV-lampe af biosikkerhed kabinet og udsætte dæksedlerne til UV-lys for 1 h.
- Gør arbejdet laminat stamopløsning ved først optøning flasken på is. Tilsæt indholdet af en flaske til tilstrækkelig kold steril fosfat-bufferet saltvand (PBS) for at nå en endelig koncentration på 0,04 mg/mL. 1,3 μl til autoklaveres 1,5 ml centrifugeglas. Opbevares ved-80 °C.
Bemærk: hvert rør har nok Laminin til en enkelt seks brønd plade. Undgå flere fryse tø cyklusser. - Coat steriliseret dækglas ved først optøning af arbejder Laminin opløsning på is. Brug en P1000-pipette til at aspirere 200 μL Laminin. Træk forsigtigt pipettespidsen langs den ene kant af dæksedlen for at tillade kapillar handling at trække en minuscule mængde Laminin ud for at lette dækglas fastgørelse til seks brønd pladen.
- Derefter, udvise den resterende Laminin i midten af coverslip. I en cirkulær bevægelse, sprede Laminin dråbe på tværs af coverslip. Placer den i en 37 °C-inkubator mindst 1 time og op til 24 timer før isoleringen.
2. klargøring af Langendorff-apparatet
Bemærk: de enkelte komponenter i Langendorff-apparatet, der anvendes i denne protokol, er opført i tabel over materialer.
- Tænd det cirkulerende vandbad. Indstil temperatur, så perfusat har en temperatur på 37 °C.
Bemærk: med opløsningen reservoirer sat til en højde på 60 cm, den cirkulerende vand fødsel skal indstilles til 41 °c at have af være 37 °c. I modsætning til tidligere rapporterede protokoller, er højden af reservoiret ikke behøver at blive ændret. - Langendorff-apparatet skylles med 70% ethanol efterfulgt af to skyller med autoklaveres dobbeltdestilleret vand. Efter skylning fyldes reservoiret med KHB-HB og oxygenat med 100% ilt.
- Prime systemet ved at tillade oxygeneret KHB-HB til første flow i en 100 mL bægerglas. Når 50 mL opløsning er strøet ind i bægerglasset, skal du skifte 3-vejs stop-Dick-positionen for at stoppe strømmen fra KHB-HB-reservoiret. Hæld 50 mL oxygeneret KHB-HB fra bægerglasset ind i kollagenase-reservoiret.
- Lad KHB-HB dræne fra fordøjelsesbeholderen, indtil 5 mL forbliver i kollagenase reservoir. Mens priming kollagenase reservoir, skifte 3-vejs stophanen gentagne gange mellem reservoirer for at tillade linjerne at Degas. Når systemet er blevet primet, skal du huske at bruge afgasnings fælden placeret oven på varme spolen for at tillade eventuel resterende luft at forlade systemet.
- Gør kollagenase-opløsningen. For rotter kombinere 100 mg type II collagenase, 100 mL oxygenerede KHB-HB, og 2 hætteglas af blebbipletten bestand. For mus, kombinere 100 mg type II collagenase, 40 mL oxygenerede KHB-HB, og 2 hætteglas af blebbipletten bestand. Når den er blandet, skal opløsningen være stabil i 1 time.
Bemærk: Myocyt levedygtighed kan variere mellem type II kollagenase partier. Udnyt en kollagenase prøveudtagningsprogram til at teste en masse før bulk bestilling.
3. isolering af myocyte
- Injicer dyret med 1.000 e heparin. Vent 5 min.
Bemærk: mus og rotter i alle aldre kan anvendes. Men generelt den ældre eller mere syge dyret, jo lavere nekrotiske udbytte. - Ofrer dyret ved først at bedøve det med isofluran ved hjælp af Open-drop metoden (1 CC isofluran pr. 500 cc volumen) før euthanizing dyret med en pentobarbital blanding (150 mg/kg intraperitoneal).
- Hurtigt punktafgiftspligtige hjertet ved først at snuppe pels over xiphoid processen. Med iris saks, lave et lille snit umiddelbart under xiphoid proces og trække pels opad mod hovedet udsætter huden.
- Grib xiphoid processen og skær membranen udsætter brysthulen. Lav en fælde dørsnit, træk brystbenet tilbage ved hjælp af en hemostat, og brug de buede pincet til at punktafgifts give hjertet over opstigende aorta og sted i kold KHB-HB.
- Bannulere hjertet ved hjælp af et stereomikroskop og nummer 5 pincet. Sørg for, at hjertet er nedsænket og kanylen blev primet før hjertets excision for at forhindre emboli. Bekræft korrekt positionering af kanylen ved at visualisere spidsen af kanylen ca. 1 mm over aorta indsættelse i ventrikel.
Bemærk: jo hurtigere kanyle tiden er, jo bedre er myocyt-udbyttet. - Start strømmen af KHB-HB ved at rotere stophanen på Langendorff. Tilslut kanylen til Langendorff. Perfuse hjertet i 5 min.
Bemærk: da perfusion leveres af et tyngdekraften-baseret system, vil strømmen gennem hjertet være en funktion af koronararterie overholdelse. - Skift perfusion fra KHB-HB reservoir til fordøjelses buffer reservoiret. Når fordøjelses bufferen når hjertet, indstille en timer (5 min for mus eller 15 min for rotte). Sørg for at samle perfusatet i et sterilt 100 mL bægerglas. Genfyld fordøjelses buffer beholderen efter behov med perfusatet, indtil Fordøjelsestiden er udløbet.
- Efter fordøjelsen adskilles hjertets kamre med tang og iris saks i et sterilt 100 mL bægerglas. Placer hvert kammer i en separat brønd af en seks brønd plade. Hæld 5 mL kollagenaseopløsning i hver brønd.
- Begynd straks at hakde hjertevævet ved hjælp af en saks. Vævs klumper skal være ca. 1 mm3. Ved hjælp af sterile overførings pipetter, forsigtigt udriv det hakkede hjerte væv. Opløsningen skal blive uklar.
- Når vævs klumper bliver hvide og feathery, undersøge cellerne ved hjælp af et inverteret mikroskop. Hvis antallet af levedygtige celler er større end 80%, skal du fortsætte med at belaste cellerne i et 50 mL konisk rør ved hjælp af en 100 μm cellefilter. Brug et andet rør og si for hvert kammer i hjertet.
- Hvis antallet af levedygtige celler er mindre end 80%, skal du kontrollere den tid, det tog at kanyle. Hvis kanyle tiden er over 5 min, så prøv et andet hjerte. Hvis ikke, assay nye kollagenase partier gennem kollagenase prøveudtagningsprogram.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 215 x g i 2 min. Pellet skal være kompakt og ikke løs. Hvis pellet er løs, præparatet indeholder mange døde celler. I en vævskultur hætte, resuspension pellet i 10 mL stop buffer.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 215 x g i 2 min. Pellet skal være kompakt og ikke løs. Hvis pellet er løs, præparatet indeholder mange døde celler.
- Cellerne opslæmmes i 5 mL plating buffer. Udføre et celleantal. Juster milliliter af plating buffer til at nå en endelig nekrotiske koncentration af 2 x 104 celler pr. ml.
- Tag Laminin-belagte dæksedler ud af inkubatoren. Aspirer laminatet dråbe.
- Plade 200 μl nekrotiske suspension på hver dækseddel. Placeres i en 37 °C inkubator (21% O2,5% Co2) i 2 timer for at tillade fastgørelse. Efter 2 h, aspirere de uforknyttede celler, tilsæt 2 mL kultur medier og kultur i op til 4 dage.
4. Fura-2 farvestof lastning
- Lav en 2 mM Fura-2 acetoxymethylester (Fura-2 AM) stamopløsning ved at tilsætte 25 μL DMSO til 50 μg Fura-2 AM pulver (1 hætteglas). Alikvot ud i 6 μL aliquoter. Tag 1 alikvot af Fura-2 am og tilsæt til 6 ml plating medium. Vortex til at blande.
- Fjern 1 6 brønd plade af myocytter fra inkubator. Aspirere medier. Tilsæt 1 mL Fura-2-medie blanding til hver brønd. Dækplade med folie, lad pladen stå ved stuetemperatur, og vent 15 min.
- Aspirate Fura-2 medie blanding og tilsæt 1 mL Tyrode opløsning til hver brønd. Dæk med folie. Vent 20 minutter ved stuetemperatur for at tillade farve udskylningen før billeddannelse.
5. lastning af fluo-4-farvestof
- Lav en 1,82 mM fluo-4 acetoxymethylester (fluo-4 AM) stamopløsning ved at tilsætte 25 μL DMSO til 50 μg fluo-4 AM pulver (1 hætteglas). Alikvot ud i 8,333 μL aliquoter. Tag 1 alikvot af fluo-4 am Stock og tilsæt til 6 ml plating medium. Vortex til at blande.
- Fjern 1 6 brønd plade af myocytter fra inkubator. Aspirere medier. Tilsæt 1 mL fluo-4 AM medie blanding til hver brønd. Dækplade med folie, lad pladen stå ved stuetemperatur, og vent 15 min.
- Sug fluo-4 AM medie blandingen og tilsæt 1 mL Tyrode opløsning til hver brønd. Dæk med folie. Vent 20 minutter ved stuetemperatur for at tillade farve udskylningen før billeddannelse.
6. membran potentiel farve ladning
- Fjernkomponent A og komponent B fra membran potentiellet. I et 15 mL konisk rør kombineres 50 μL af komponent B og 5 μL af komponent A. vortex til mix. Der tilsættes 10 mL overfladebelægning til det 15 mL koniske rør, som indeholder spændings farveblandingen. Vortex til at blande.
- Fjern 1 6 brønd plade af myocytter fra inkubator. Aspirere medierne. Tilsæt 800 μL af membranen potentiel farveblanding til hver brønd. Dækplade med folie, lad pladen stå ved stuetemperatur, og vent 15 min.
- Aspirere farvestof medie blanding og tilsæt 1 mL modificeret-Tyrode opløsning til hver brønd. Dæk med folie.
7. fotometri og opladning af koblede enheds optagelser
- Tænd for udstyret i følgende rækkefølge: mikroskop, Arc-lampe, hyperswitch, fluorescens grænseflade system, Myocam strømforsyning, felt stimulator og computer.
- Sørg for, at excitation/emission filtersæt er passende for Imaging farvestof.
Bemærk: Fura-2 er spændt på 340 nm og 380 nm af lys. Det udsender ved 510 nm af lys. Fluo-4 og spændings membran farvestof er spændt på 485 nm af lys og udsender ved 520 nm af lys. - Prime systemet ved at tænde for vakuum, helt åbne slangeklemmen og forsigtigt kaste hver 60 mL sprøjte, der anvendes i Manifold. For calcium optagelser bruger Tyrode opløsning. For spændings optagelser brug modificeret Tyrode løsning.
- Tænd for varmelegeme, og Indstil strømmen ved at justere rulleklemmen på perfusions slangen. Lav optagelser ved 36 ± 1 °C.
- Åbn anskaffelses softwaren. Sørg for, at parametrene er indstillet til det korrekte billedbehandlings farvestof.
- I mørket fjernes folien fra de seks brønd plader og placeres en dækseddel i pacing kammeret. Sørg for, at stimulatoren er slukket i dette trin. Fokuser på myocytterne ved hjælp af 10x-målsætningen.
- Når du er i fokus, start pacing ved felt stimulerende ved 1 Hz, 0,2 V. gradvist øge spændingen indtil 1:1 pacing opnås. Derefter øge spændingen indtil 1.5 x tærsklen er nået.
Bemærk: fordi excitation-sammentrækning kobling er temperaturafhængig, skal du sørge for cellerne er blevet perfbrugt til 15 min før optagelse. Dette giver mulighed for myocytter til at inddrive fra chok af at gå fra stuetemperatur tilbage til 37 °C samt løst vedhæftede celler til at flyde væk. - Skift fra 10x-målsætningen til 40x-målsætningen. Fokuser på en celle, der følger en 1:1 pacing. Juster plastik nuancer, så kun én celle er i synsfeltet.
- Brug af softwaren, placere området af interesse boks på veldefinerede sarcomeres. Start erhvervelse software til at indlede excitation lys. Brug filtrene neutral tæthed til at justere intensitetsindstillingen i overensstemmelse hermed for at opnå et passende SNR.
Representative Results
Figur 1A viser Langendorff-apparatet. Oxygenatoren er i KHB-HB reservoir. Kollagenase opløsningen er i midten 60 ml sprøjte reservoir. Afgasnings linjen er forbundet til det tomme 60 mL sprøjte reservoir. Efter en vellykket isolation, de fleste af cellerne skal være stang formet og Striated. Under en 40x mål, skal de fleste myocytter have klare striber synlige. Figur 1B, C viser eksempler på raske rotte myocytter. Når isoleret, celler kan dyrkes op til 4 dage samtidig bevare deres morfologi og elektriske egenskaber.
For at måle excitation-sammentrækning kobling, cellerne placeres derefter i en opvarmet pacing kammer. Da myocytter er følsomme over for ændringer i temperaturen, er det vigtigt at lade dæksedlen ækvibrere i 15 minutter i kammeret før optagelsen. For fluorescens optagelser genereres excitation bølgelængden af en 75 W xenon-Arc pære. Xenon-Arc-pærer producerer et lysspektrum, der efterligner naturligt sollys. Intensiteten af lyset og bølgelængden styres af neutrale tæthed/emission filers. Den excitation lys derefter passerer gennem målet til myocyte. Udlednings bølgelængden opsamles derefter af et Photomultiplier-rør. Ved hjælp af det system, der er beskrevet her, skal både excitation-og emissions filtrene ændres manuelt.
Afkortning på den anden side opnås ved en opladning koblet enhed sensor. Ved at måle i realtid op til 1.000 gange i sekundet udfører anskaffelses softwaren et gennemsnit af linjerne inden for et område af interesse for at skabe et godt løst riller mønster. Derefter beregnes en fast Fourier transformation (FFT). Toppen inden for effekt spektret repræsenterer den gennemsnitlige sarcomere-afstand. Ændringer i sarcomere afstanden under pacing afbildes derefter og efterfølgende kvantificeres.
Figur 2 viser calcium og afkortning af spor indspillet fra en C57/B6 mus nekrotiske lastet med calcium farvestof Fura-2. Pacing protokollen er en ændring af pacing protokoller beskrevet tidligere10,11. Sunde mus myocytter bør være i stand til at være tempo ved deres hvilepuls 10 Hz. figur 3 er kvantificering af ensembled gennemsnitlige data opnået fra en C57/B6-mus og deres transgene (TG) littermates, som havde en punkt mutation introduceret i en kalium kanal. Bemærk der er ingen forskel mellem grupperne undtagen afslapnings tiden ved 10 Hz pacing.
I modsætning til Fura-2, som er en dual excitation farvestof, spændings farvestof og fluo-4 er enkelt bølgelængde excitation farvestoffer, hvis excitation/emission arbejde med standard FITC excitation og emission spektrum (494/506 nm). Derfor kan optagelser af calcium og sarcomere afkortning eller spænding og sarcomere afkortning opnås ved hjælp af dette filter sæt.
Figur 4a viser en spændings sporing, der er optaget fra et C57/B6-muse-nekrotiske-tempo ved 10 Hz. sammenlignet med calcium signaler er enkelt celle spændings sporinger mindre i amplitude og har brug for efter behandling for at opnå et brugbart signal. Figur 4B viser et ensembled gennemsnitligt aktionspotentiale (AP) fremstillet af ApS i figur 4A. Figur 4C, D viser en ensembled gennemsnitlig AP efter en low pass Butterworth eller et Savitzky-golay digitalt filter blev anvendt. Der skal udvises forsigtighed ved filtrering af signalet for ikke at forvride de reelle data. Bemærk de subtile forskelle i formen af APs i figur 4B-D.
Figur 5 viser spor, som er optaget fra rotte myocytter i et tempo på 1 Hz. Ud over at spændings signalet er lavere end calcium signalet, er sammentrækning kinetikken også forskellige. Dette er fordi calcium farvestoffer buffer calcium mens spændings farvestoffer ikke.
Som med det forbigående calcium (figur 3) udviste myocytter en pacing af afhængige ændringer i deres optiske aktions potentielle varighed (APD) samt (figur 6). Mens Fura-2 spor blev ensembled gennemsnit, før de blev kvantificeret, blev spændings sporene filtreret med et Savitzky-golay polynomium udjævningen filter (bredde 5, orden 2), før de blev ensembled i gennemsnit og kvantificeret.
Som kvantificeret i figur 6 og figur 7viste de ud over at påvise pacing INDUCEREDE ændringer i APD også lægemiddelinduceret forlængelse af AP. Ved 4 Hz pacing resulterede koncentrationsafhængig blokade af den forbigående udadgående strøm (Itil) med 4-aminopyridin i forlængelse af APD.
Endelig skal der udvises forsigtighed for at undgå cytotoksicitet. Figur 8 er de sidste 11 s af en 20 s optagelse. Indikeret med de røde pile i figur 8, fører langvarig udsættelse af myocytter til blåt lys til udløst aktivitet.
Figur 1: det konstante Tryk på Langendorff-apparatet. A) Langendorff-apparatet med hver bestanddel mærket med hvidt bogstaver. B) isolerede Sprague-dawley-rotte myocytter set gennem et 10x-mål. C) isolerede rotte myocytter set gennem en 40x-målsætning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativ calcium og sarcomere afkortning af spor indspillet fra C57/B6 myoyctes ved hjælp af Fura-2. Calcium og sarcomere afkortning af spor optaget ved 1, 2, 4, 10, 0,5 og 0,75 Hz. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kvantificering af sarcomere-forkortelse, Peak calcium, afslapningstid og optagelsestid, der er registreret fra en C57/B6 Wild type (WT) og transgene (TG) mus. A) afkortelse af sarcomere. B) peak calcium. (C) afslapningstid defineret som 90% vende tilbage til baseline af afkortning spor. D) reoptagelsestid defineret som 90% tilbage til baseline for calcium sporet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: optisk aktions potentiel optaget fra en C57/B6-mus med nekrotiske på 10 Hz. (A) 1 sekund ufiltreret spor. B) det gennemsnitligt optiske aktionspotentiale. C) et gennemsnitligt optisk aktionspotentiale, efter at der blev anvendt et Lowpass Butterworth-filter. D) ensemdet gennemsnitligt optisk aktionspotentiale efter en Savitzky-golay polynomium udjævningen filter blev anvendt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentativ calcium, spænding, og sarcomere afkortning spor indspillet fra Sprague-Dawley rotte myocytter tempo ved 1 Hz. A) calcium og sarcomere afkortning af spor registreret ved 1 Hz pacing med fluo-4. (B) spænding og sarcomere afkortning af spor optaget ved 1 Hz pacing ved hjælp af spændings farvestoffet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: optiske aktionspotentialer optaget fra Sprague-Dawley rotte myocytter i tempo ved 1, 2 og 4 Hz pacing. (A) filtreret spor registreret ved 1 Hz pacing. B) filtreret spor registreret ved 2 Hz pacing. C) filtreret spor registreret ved 4 Hz pacing. D) aktions potentiel varighed 10, målt som 10% tilbage til baseline. E) aktions potentiel varighed 50, målt som 50% tilbage til baseline. F) aktions potentiel varighed 90, målt som 90% tilbage til baseline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: virkningerne af 4-aminopyridin på Sprague-Dawley rotte optiske action potentialer optaget ved 4 Hz pacing. (A) det gennemsnitlige spor, der blev registreret ved 4 Hz pacing uden 4-Aminopyridin i opløsningen. B) det gennemsnitligt aflede spor registreret ved 4 Hz pacing med 1 μM 4-Aminopyridin i opløsningen. C) det gennemsnitligt spor, som blev registreret ved 4 Hz pacing med 10 μM 4-Aminopyridin i opløsningen. D) aktions potentiel varighed 10, målt som 10% tilbage til baseline. E) aktions potentiel varighed 50, målt som 50% tilbage til baseline. F) aktions potentiel varighed 90, målt som 90% tilbage til baseline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: spændings farvestof induceret fototoksicitet i Sprague-Dawley rotte myocytter efter 20 s kontinuerlig lyseksponering. Røde pile indikerer cytotoksiske hændelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
At være i stand til at isolere hjertemyocytter er en kraftfuld metode, der kan bruges til at forstå hjertets fysiologi, patologi og toksikologi. I ovenstående protokol, vi beskrev en metode, der udnytter en konstant tyngdekraften tryk Langendorff apparat til at opnå enkelt hjerte myocytter. Bagefter, ved hjælp af fluorescens fotometri system, vi beskriver, hvordan man samtidig erhverve enten calcium og afkortning eller spænding og afkortning spor.
På grund af de forskellige kinetik mellem calcium farvestoffer, skal der udvises forsigtighed, som farvestof til at vælge. For denne protokol, både Fura-2 og fluo-4 anvendes blev manipuleret med am estere nødvendiggør en vask trin for at give mulighed for intracellulære esteraser tid til at kløve am-gruppen og fælde farvestof i cellen. Mens både Fura-2 og fluo-4 betragtes som høj affinitet calcium farvestoffer, Kd for Fura-2 er 145 nM sammenlignet med 345 nM for fluo-49. Desuden er Fura-2 ratiometrisk. På grund af dette, det kan bruges til at kvantificere intracellulære calcium niveauer9,12. Fluo-4 på den anden side er en enkelt bølge calcium sonde. Fordelen ved at bruge fluo-4 er, at den giver et lysere fluorescens signal. Uanset hvilke calcium farvestof anvendes, sammenlignet med calcium farvestof, membranspænding sonder har en lavere SNR.
Som vist i figur 4 og figur 5er spændings spor sammenlignet med calcium spor mindre i amplitude. Ved hjælp af softwarens digitale sporings filtrering er det muligt at forøge SNR og kvantificere dataene (figur 4 og figur 7). Når de er kvantificeret, udviser både calcium transienter og optiske Apd'er tilbagegivelse, hvilket forkorter deres varighed ved hurtigere pacing (figur 2, figur 3, figur 6og figur 7). Kortere Apd'er under hurtigere pacing cyklusser er nødvendige for at give tilstrækkelig tid til ventrikel fyldning under diastole. Ændringer i dette fænomen menes at være tegn på en stigning i risikoen for rytmeforstyrrelser13,14,15,16. Mens ændringer i APD kan være forårsaget af sygdom, kan de også være forårsaget af kemikalier. Som vist i figur 7, når den fremherskende murine repolariserende kalium strøm, jegtil, er blokeret, den optiske APD bliver længere.
Stadig, som rapporteret tidligere med spændings følsomme farvestoffer, lysintensitet og varighed kan ændre APD2,5,17. Dette menes at være resultatet af genereringen af reaktive oxidativ arter (ros)5. Tidligere, det har vist sig, at tilsætning af antioxidanter til optagelsen løsning kan forhindre spændings følsomt farvestof cytotoksicitet5. Som et resultat, vi tilføjede antioxidant L-Glutathion (10 mM), at Tyrode løsning. Vist i figur 8 er de sidste 11 s af en 20 s optagelse opnået ved 1 Hz pacing. Som det fremgår af de røde pile, forekom ændringer i APD ikke før 15 s i optagelsen; Derfor, mens den modificerede Tyrode løsning ikke forhindrede fototoksicitet det forsinket det betydeligt. Ved hjælp af modificeret Tyrode løsning, ved hjælp af en lav lysstyrkeindstilling og holde varigheden af optagelsen til under 5 s, er det muligt at undgå enhver farve induceret ændringer i APD. Dette er vigtigt, fordi uden at passe på at undgå fototoksicitet, dataene kunne misfortolkes som forårsager tidligt eller forsinket efter depolariseringer. Ud over at begrænse eksponeringen for blåt lys, er der yderligere forholdsregler, der kan træffes for at forhindre fejlfortolkning af dataene.
Den første er kun at optage fra celler, der følger en til en pacing og har en hvile sarcomere længde større end eller lig med 1,75 μm. Den 1,75 μm cutoff er taget fra observation af Gordon et al.18 at spændinger hurtigt falder, når sarcomere længde er under dette beløb. Ikke desto mindre, visse patologier kan resultere i betydelige ændringer i hvile sarcomere længde. For at være sikker på, at Fænotypen er reel og ikke en artefakt af isolationen, bør følgende problemer skydning tilgange tages.
Hvis myocytter konsekvent ikke følger 1:1 pacing, har sarcomere længder under 1,75 μm, tung membran blebbing, eller ikke overleve isolationen, den første ting at kontrollere er den tid, det tog at kanyle hjertet. Jo længere kanyle tiden er, jo lavere vil udbyttet være. Hvis der kræves en lang kanyle tid, kan levedygtigheden forbedres ved at placere hjertet i en kardioplegisk opløsning19. Ikke desto mindre, fordi kollagenase er et enzym, aktivitet og specificitet af et bestemt parti ændre sig over tid. Hvis de samlede udbytter gradvist bliver værre trods gode kanyle tider, nye partier skal være analyseret. Mens vores protokol blev optimeret til 5 s optagelser, hvis der er behov for længere spændings spor, skal der købes yderligere neutrale tætheds filtre. Det system, der er beskrevet i protokollen, leveres med neutrale tætheds filtre, der reducerer det transmitterede lys med 37%, 50%, 75%, 90% og 95%.
Sammenfattende beskrev vi en metode, der tillod isolering af voksne murine ventrikulære myocytter, der blev brugt til calcium, spænding og sarcomere afkortning målinger.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dana Morgenstern for omhyggelig korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
| 1 liter volumetric flask | Fisher Scientific | 10-205F | |
| 100 ml beaker | Fisher Scientific | FB-100-100 | |
| 100 ml graduated cylinder | Fisher Scientific | 08 562 5C | |
| 1000 ml flask | Fisher Scientific | FB-500-1000 | |
| 2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods | Radnoti, LLC | 159951-2 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
| 40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm) | IonOptix | MSCP1-40 (b) | |
| 60-mL syringe, BD Luer-Lok tip | BD | 309650 | |
| Aortic Metal Cannulae | Harvard Apparatus | 73-0112 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| C-6 Standard Heating Circulator | Chemyx | A30006 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510500 | |
| Cell framing adapter | IonOptix | CFA300 | |
| CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V100022 | |
| CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V25022 | |
| CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS | Labratory Product Sales, Inc | V50022 | |
| CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater | IonOptix | TEMPC2 | |
| Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks | Cole-Parmer | EW-30600-23 | |
| Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way | Cole-Parmer | EW-30600-12 | |
| Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip | Cole-Parmer | EW-30600-01 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
| Corning Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro | IonOptix | CPUD7M | |
| DMSO | Fisher Scientific | 50980367 | |
| Dumont Tweezers Style 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
| FHD Rapid Change Stimulation Chamber | IonOptix | FHDRCC1 | |
| Fluo-3/4 Optics Package | IonOptix | IonOP-Fluo | |
| Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card) | IonOptix | FSI700 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Hemostat, Curved 5-1/2" | Amazon | B00GGAAPD0 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310500 | |
| HyperSwitch dual excitation light source | IonOptix | HSW400 | |
| Inverted Motic Fluorescence Microscope | IonOptix | MSCP1-40 (a) | |
| IonWizard Core + Analysis | IonOptix | IONWIZ | |
| Iris Scissors, curved | Amazon | B018KRRMY6 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-100 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP3661 | |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds | SouthernAnesthesiaSurgical Inc. | SP116-EA | |
| M199 Media | Fisher Scientific | 12 340 030 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | MP021914215 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP2131 | |
| MyoCam-S Digital CCD video system | IonOptix | MCS100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | MYP100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358212 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | 56-754-9250GM | |
| Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter | Radnoti, LLC | 140143-025 | |
| Photomultiplier sub-system | IonOptix | PMT400 | |
| PMT Acquisition add-on | IonOptix | PMTACQ | |
| Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap | Radnoti, LLC | 158830 | |
| Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir | Radnoti, LLC | 120141-025 | |
| Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti, LLC | 120149RC | |
| Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-214 | |
| Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-217 | |
| Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-219 | |
| Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-226 | |
| Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-209 | |
| Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-210 | |
| Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-213 | |
| Sarcomere Length Recording add-on | IonOptix | SARACQ | |
| T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75" | Amazon | B00JDWRBGC | |
| VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers | Amazon | B07QMZC94J | |
| Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform | IonOptix | ISO100 |
References
- Hagen, B. M., Boyman, L., Kao, J. P., Lederer, W. J. A comparative assessment of fluo Ca2+ indicators in rat ventricular myocytes. Cell Calcium. 52 (2), 170-181 (2012).
- Schaffer, P., Ahammer, H., Muller, W., Koidl, B., Windisch, H. Di-4-ANEPPS causes photodynamic damage to isolated cardiomyocytes. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 426 (6), 548-551 (1994).
- Hardy, M. E., Lawrence, C. L., Standen, N. B., Rodrigo, G. C. Can optical recordings of membrane potential be used to screen for drug-induced action potential prolongation in single cardiac myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 54 (2), 173-182 (2006).
- Tian, Q., et al. Optical action potential screening on adult ventricular myocytes as an alternative QT-screen. Cellular Physiology and Biochemistry. 27 (3-4), 281-290 (2011).
- Warren, M., et al. High-precision recording of the action potential in isolated cardiomyocytes using the near-infrared fluorescent dye di-4-ANBDQBS. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (4), 1271-1281 (2010).
- FluoVolt™ Membrane Potential Kit. ThermoFisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0009668_FluoVolt_Membrane_Potential_Kit_UG.pdf (2018).
- Fluorescence SpectraViewer. ThermoFisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2019).
- Calcium and Contractility in Isolated Myocytes. IonOptix. , Available from: http://www.ionoptix.com/product/myocyte-calcium-and-contractility-recording-system/ (2019).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Davis, J., et al. Diastolic dysfunction and thin filament dysregulation resulting from excitation-contraction uncoupling in a mouse model of restrictive cardiomyopathy. The Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (3), 446-457 (2012).
- Ren, J., Davidoff, A. J. Diabetes rapidly induces contractile dysfunctions in isolated ventricular myocytes. The American Journal of Physiology. 272, 1 Pt 2 148-158 (1997).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Goldhaber, J. I., et al. Action potential duration restitution and alternans in rabbit ventricular myocytes: the key role of intracellular calcium cycling. Circulation Research. 96 (4), 459-466 (2005).
- Weiss, J. N., et al.
- Baher, A., et al. Short-term cardiac memory and mother rotor fibrillation. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (1), 180-189 (2007).
- Kleber, A. G., Rudy, Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias. Physiological Reviews. 84 (2), 431-488 (2004).
- McPheeters, M. T., Wang, Y. T., Werdich, A. A., Jenkins, M. W., Laurita, K. R. An infrared optical pacing system for screening cardiac electrophysiology in human cardiomyocytes. PLoS ONE. 12 (8), 0183761 (2017).
- Gordon, A. M., Huxley, A. F., Julian, F. J. The variation in isometric tension with sarcomere length in vertebrate muscle fibres. The Journal of Physiology. 184 (1), 170-192 (1966).
- Li, Y., et al. Three Preservation Solutions for Cold Storage of Heart Allografts: A Systematic Review and Meta-Analysis. The Journal of Artificial Organs. 40 (5), 489-496 (2016).
