Summary
이 프로토콜은 초파리 애벌레 광전술 행동을 조사하기 위해 빛 점 분석기를 소개합니다. 이 분석에서, 광 반점은 빛 자극으로 생성되고, 애벌레 광 회피의 과정은 적외선 광 기지를 둔 화상 진찰 시스템에 의해 기록됩니다.
Abstract
Drosophila melanogaster의 애벌레는 포식 단계 도중 명백한 빛 회피 행동을 보여줍니다. Drosophila 애벌레 광택시는 동물 회피 행동을 연구하는 모형으로 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 애벌레 광전술 행동을 조사하기 위해 빛 점 분석기를 소개합니다. 실험 설정에는 광 점을 생성하는 시각적 자극 시스템과 애벌레 광 회피 과정을 기록하는 적외선 기반 이미징 시스템의 두 가지 주요 부분이 포함됩니다. 이 분석법은 진입 전, 발생 중, 광등 지점을 떠난 후 유충의 행동을 추적 할 수 있습니다. 감속, 일시 정지, 헤드 캐스팅 및 선삭을 포함한 애벌레 운동의 세부 사항을 캡처하고 이 방법을 사용하여 분석할 수 있습니다.
Introduction
Drosophila melanogaster의 애벌레는 포식 단계 도중 명백한 빛 회피 행동을 보여줍니다. Drosophila 애벌레 광택시는 특히 지난 50 년 동안 조사를 받고있다1,2,3,4,5,6,7 ,8. 최근 몇 년 동안, 사실에도 불구하고 1) 애벌레 빛 회피를 중재하는 많은 뉴런이4,5,9,10,11,12로 확인되었다. 및 2) 시냅스의 해상도에서 애벌레 시각 시스템의 완전한 커넥톰이13개확립되었으며, 애벌레 광택시의 근본적인 신경 메커니즘은 크게 불분명합니다.
행동 애벌레 포토택시를 공부에 행동 애시스의 숫자가 사용되었습니다. 공간 광 그라데이션과 시간적 광 그라데이션을 포함하는 다른 클래스의 두 클래스로 크게 나눌 수 있습니다. 공간 광 그라데이션 검정의 경우, 경기장은 빛과 어둠의 동일한 수의 섹션으로 나뉩니다. 경기장은 빛과 어두운 반으로 나눌 수 있습니다2,4 또는 빛과 어두운 사분면14,15,또는 심지어 바둑판7에같은 대체 빛과 어두운 사각형으로 분리 될 수있다. 일반적으로, 한천 플레이트는 공간 광 그라데이션 분석에 사용되지만, 대체 빛과 어두운 섹션으로 분할튜브도10,14를사용할 수 있습니다.
이전 버전의 어설션에서는, 빛 조명은 일반적으로 애벌레 의 밑에 에서 유래합니다. 그러나, 최신 버전의 조명은 주로 위에서 유래, 애벌레 눈 때문에 (예를 들어, 낮은 또는 중간 빛 강도에 민감한 볼비그의 기관16)불투명 한 세팔로 파 하 인 인 균 골격을 향해 구멍 앞위쪽에 있습니다. 이것은 애벌레가 방향7뒤에서 보다 위 정면 방향에서 빛에 더 민감하게 만듭니다. 시간적 광 그라데이션 어시스의 경우 광강도는 경기장에서 공간적으로 균일하지만 시간이 지남에 따라 강도가 변경됩니다. 시간제 사각 파광(즉, 켜기/끄기 또는 강/약한 빛3,7)외에, 강도의 선형 램프에 부합하는 시간적으로 다양한 빛은8을 사용하여 애벌레의 감도를 측정하는 데 사용됩니다. 일시적으로 변화하는 빛 자극.
포토택시 분석의 세 번째 유형은 45 °7의각도로 위에서 조명을 포함하는 방향 광 스케이프 탐색입니다. Kane et al.7의작업 전에는 밝고 어두운 지역에서 유충의 수, 선회 빈도 및 트레일 길이와 같은 거친 매개 변수만 애벌레 광과대 검정법으로 계산되었습니다. 이 같은 그룹의 작업 이후, 애벌레 광택시에 대한 높은 시간 해상도 비디오 기록의 분석, 광택시 동안 애벌레 운동의 상세한 역학 (즉, 애벌레 몸의 다른 부분의 즉각적인 속도, 방향 방향, 선회 각도 및 해당 각도 속도)는7. 따라서, 애벌레 광택시 행동의 자세한 내용은 발견 될 수있다. 이 실험에서, 애벌레는 그룹 효력이 제외되지 않도록 단에서 시험됩니다.
이 프로토콜은 개별 적인 빛 자극에 애벌레 행동 반응의 조사를 위한 가벼운 반점 분석기를 소개합니다. 주요 실험 설정은 시각 자극 시스템과 적외선 기반 이미징 시스템으로 구성됩니다. 시각 자극 시스템에서 LED 광원은 한천 판에 둥근 2cm 직경의 광점을 생성하여 유충을 테스트합니다. LED 드라이버를 사용하여 조명 강도를 조정할 수 있습니다. 이미징 시스템에는 카메라에 조명을 제공하는 3개의 850nm 적외선 LED 외에 유충의 거동을 포착하는 적외선 카메라가 포함되어 있습니다. 카메라의 렌즈는 850 nm 밴드 패스 필터로 덮여 있어 시각 자극 시스템의 빛이 카메라에 들어오는 것을 차단하고 적외선은 카메라에 들어갈 수 있습니다. 따라서 이미징에 대한 시각적 자극의 간섭을 방지합니다. 이 분석에서는 빛을 입력하기 전, 도중 및 입력 한 후를 포함하여 기간 내에 개별 애벌레의 빠른 반응의 행동 세부 사항이 기록되고 분석됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 초파리 유충의 준비
- 삶은 옥수수 식사 (73g), 한천 (5.6 g), 콩 식사 (10g), 효모 (17.3 g), 시럽 (76 mL) 및 물 (1000 mL)으로 구성된 표준 매체를 준비하십시오.
- 12 시간 / 12 h의 빛 / 어두운 주기로 방에서 표준 매체에서 25 °C에서 모든 파리를 올립니다.
2. 한천 접시 준비
- 1.0% 한천 용액을 준비하십시오. 500 mL 비커에 한천 3g의 무게를 두고 저울을 가지고 증류수 300mL를 추가합니다. 물이 증발하지 않도록 차단기 위에 호일 용지를 놓습니다. 비커를 전자레인지에 가열하여 끓입니다.
- 비커를 꺼내 유리 막대로 잘 저은 다음 전자 레인지에서 가열하여 끓입니다. 액체가 완전히 투명하고 액체가 될 때까지 반복합니다.
참고 : 최종 뜨거운 한천 솔루션은 기포가 없어야합니다. 그렇지 않으면, 접시에 한천을 붓는 것은 후속 애벌레 행동 테스트에 영향을 미칠 것이다 한천 판의 고르지 않고 찌그러진 표면을 초래할 것이다. 한천 용액의 농도가 너무 높거나 낮아서는 안됩니다. 농도가 너무 높으면 한천 판의 빛 확산 반사가 강해지고 밝은/어두운 경계가 번집니다. 농도가 너무 낮으면 애벌레가 접시에 흔적을 남깁니다. 이러한 오류는 모두 protcol의 나중에 비디오 처리를 방해합니다. - 뜨거운 한천 용액을 페트리 접시(직경 15cm)에 천천히 붓고, 바닥이 한천 층(두께~4mm)으로 고르게 덮일 때까지, 한천 용액이 고형화될 때까지 실온(RT)에서 식힙니다.
- 한천 접시는 신선하게 조리될 때 사용해야 합니다. 그렇지 않은 경우, 표면에 물 층을 붓고 나중에 사용하기 위해 4 °C에서 냉장고에 저장하십시오.
3. 시각 자극 시스템 설정
- 470 nm에서 시준 된 LED 블루 라이트 또는 따뜻한 백색광의 LED 광원을 선택하십시오.
참고 : 광원은 다른 파장의 LED 조명으로 대체 할 수 있습니다. 이 실험에서는 청색광 LED가 예로 사용됩니다. - 알루미늄 호일 또는 검은 판지의 두꺼운 조각을 롤 (불투명도를 보장) 3cm의 직경청과 유사한 직경과 길이 12cm의 열린 실린더를 형성한다. 실린더의 상단 끝이 청색광 LED의 전면 끝을 덮게 합니다. 중앙에 작은 둥근 구멍 (0.5 cm 직경)이있는 검은 색 판지로 하단 끝을 덮습니다. 이것은 광원 시스템 설정을 구성한다.
- 준비된 광원을 클립으로 철 프레임에 고정하여 LED 표시등이 바탕 화면쪽으로 투사되도록 합니다. 실린더를 약간 기울입니다. 실린더 평면과 수직 평면 사이의 각도는 약 10°입니다(그림 1참조). 470nm 의 파란색 LED 조명을 고출력 LED 드라이버의 "LED1" 플러그에 연결합니다. 드라이버를 켜고 드라이버의 오른쪽 상단 모서리에있는 노브를 돌려 채널 470 nm를선택한 다음 LED를클릭합니다. 그런 다음 화면에 "√"가 표시되면 바탕 화면에 파란색 표시등이 나타납니다.
참고: 실린더가 작은 둥근 구멍 외에 빛이 새는 경우 누출 부품에 검은색 테이프를 사용하여 구멍만 통과할 수 있는지 확인하는 것이 좋습니다. - 확인을 클릭하고 손잡이를 돌려 빛의 강도를 조정합니다. 노브를 50mA의 높은 광도로 회전시다. 분광계로 빛의 스펙트럼을 측정하고 기록합니다.
- 광원의 위치를 위아래로 이동하여 광점의 지름을 2cm로 조정합니다. 더 나은 대비 효과를 위해 바탕 화면은 검은색이어야 합니다.
- 노브를 회전하여 실험적 필요에 따라 조명 강도를 선택합니다. 표준 포토다이오드 전원 센서가 있는 컴팩트한 파워 미터 콘솔을 사용하여 그 자리에서 최대 및 최소한의 광전력을 측정하고, 기록하고, 세 번 측정하고, 평균 값을 측정합니다.
참고: 광다이오드 전력 센서를 사용하여 특정 파장의 빛의 광도를 측정하고 화력 센서를 사용하여 백색광의 광도를 측정하는 것이 좋습니다. - 측정된 광전력을 센서 영역으로 나누어 광점의 광강도를 계산합니다.
참고: 예를 들어, 2.6단계에서 측정된 광전력이 20pW이고 센서 영역이 0.81mm2인경우 광강도는 24.69pW/mm2입니다(20pW를 0.81mm2로나누기).
4. 이미징 시스템 설치
- 바탕 화면의 라이트 스폿 위로 약 10cm 높이의 철제 클립으로 고해상도 웹 카메라를 클램프합니다(그림1).
- 카메라 렌즈의 방향을 바탕 화면쪽으로 조정합니다. USB 인터페이스를 통해 카메라를 컴퓨터에 연결합니다.
- 카메라 바로 아래에 한천 접시를 바탕 화면에 놓습니다.
- Windows 7이 있는 컴퓨터에서 "Amcap9.22" 소프트웨어를 열면 조명 점이 자동으로 AMcap 창에 표시됩니다. 라이트 스팟이 창 의 중심 근처에 있는지 확인하려면 카메라를 약간 왼쪽 또는 오른쪽으로 이동합니다. 카메라가 라이트 경로를 차단하지 않는지 확인합니다. 라이트 스폿은 완전하고 둥글어야 합니다.
참고 : 소프트웨어는 http://amcap.en.softonic.com/ 찾을 수 있습니다. - 850 nm ± 3 nm 밴드 패스 필터를 카메라 바로 아래 5-7mm의 클립으로 고정합니다.
참고: 필터의 직경은 약 2.5cm이고 카메라 렌즈의 직경은 1cm 미만이므로 필터가 카메라의 시야를 덮을 수 있습니다. 카메라 아래의 필터를 사용하면 AMcap의 창에서 라이트 스폿을 볼 수 없습니다. - 한천 판 주위에 3개의 적외선 발생 LED(중앙 파장 = 850nm)를 골고루 놓습니다. 각 LED는 한천 판의 가장자리에서 약 5cm 떨어져 있어야하며 LED의 렌즈 면은 한천 플레이트쪽으로 70 ° 아래쪽 각도여야합니다. AC-DC 컨버터를 통해 LED를 전원에 연결합니다.
참고: 적외선 LED의 위치와 각도를 수정하여 다양한 실험 에서 현장의 밝기의 일관성을 보장하고 나중에 비디오 처리를 용이하게하는 것이 좋습니다. - 컴퓨터와 장치 사이에 블랙 보드를 놓습니다. 컴퓨터 화면 표시등이 실험에 영향을 미치지 않도록 컴퓨터 화면의 밝기를 낮게 설정합니다.
참고: 빛의 파장이나 강도를 측정할 때 환경을 어둡게 유지합니다.
5. 이미징의 매개 변수 설정
- AMcap 소프트웨어 의 메뉴에서 옵션을 선택 | 비디오 장치 | 캡처 형식을 캡처하고캡처한 비디오의 픽셀 크기를 800 x 600, 프레임 속도를 60fps로 설정합니다.
- 카메라 아래에서 필터를 제거하고 눈금자를 카메라 아래에 놓고 카메라 초점을 조정하여 배율 선이 비디오 시야의 너비와 선명하고 평행하게 만듭니다.
- 캡처 | 설정 | 비디오 캡처를 클릭하여 저장 경로를 선택하고 녹화 시작을클릭하고 600픽셀에 해당하는 실제 거리를 기록하고 각 픽셀의 비율을 실제 거리까지 계산합니다.
6. 빛 회피 행동의 비디오 녹화
- 모든 실험을 통해 25.5°C의 온도를 유지한다. 필요한 경우 에어컨으로 실내 온도를 조절하십시오. 가습기로 습도를 60%로 지속적으로 유지하십시오.
- "lightarea1"이라는 라이트 스폿 위치의 짧은 비디오를 촬영합니다. 이어서, 850 nm±3 nm 필터를 뒤로 이동하여 카메라 렌즈를 덮는다.
참고: 애벌레 의 거동을 기록할 때, 카메라 렌즈는 850 nm ±3 nm 필터로 덮여 있어 광점이 비디오에 표시되지 않도록 한다. 라이트 스팟은 나중에 Matlab과 애벌레와 비디오에서 재구성 할 수 있습니다. 카메라의 위치를 변경하지 말고 각 픽셀의 비율을 4.3 단계에서 측정된 실제 거리로 변경하지 마십시오. - 실험 장치에서 멀리 떨어진 조명(예: 룸 라이트)을 켭니다. 애벌레가 눈으로 명확하게 볼 수있는 한 가능한 한 낮게 빛을 내려십시오. 숟가락으로 배양 배지에서 유충을 꺼내 서 세 번째 별 애벌레를 부드럽게 선택하고 증류수로 깨끗하게 씻으십시오. 배고픔의 간섭을 피하기 위해 유충을 한 번에 하나씩 씻으시기 않도록 주의하십시오. 단일 실험에는 적어도 20개의 애벌레가 필요합니다.
- 3.3 단계에서 카메라 아래에 배치된 한천 플레이트의 중심으로 애벌레를 옮김을 옮김을 옮김. 브러시로 유충에서 여분의 물을 부드럽게 제거하거나 블로팅 페이퍼를 사용하여 애벌레에서 물을 제거하여 렌즈 아래의 빛이 반사되는 것을 방지합니다. 실내 조명을 끄고 애벌레가 어두운 환경에서 2 분 동안 적응할 수 있도록하십시오.
- LED 조명을 켜서 적외선을 생성하고 애벌레를 플레이트 중앙으로 부드럽게 브러시합니다. 애벌레가 똑바로 크기 시작하면 플레이트를 회전하여 애벌레가 라이트 스폿쪽으로 향하도록 합니다. 처음부터 바로 크롤링하거나 라이트 스폿에 대한 액세스 권한을 얻지 못할 수 있는지 확인합니다.
- 캡처 | 설정 | 비디오 캡처를 클릭하여 저장 경로를 선택한 다음 녹화 시작을 클릭하여 녹화합니다. 애벌레가 라이트 스팟쪽으로 기어가고, 라이트 스폿에 들어간 다음, 시야에서 거의 벗어날 때까지 라이트 스폿을 남깁니다. 기록 중지를 클릭합니다. 애벌레가 가까이 가기 전에 라이트 스팟에서 멀어지면 녹화 중지를직접 클릭합니다.
- 필터를 카메라에서 멀리 이동합니다. "lightarea2"라는 라이트 스폿의 위치를 짧은 비디오로 촬영한 후 "lightarea1"과 비교하여 라이트 스폿 위치가 변경되지 않도록 합니다. 명백한 위치 변경이 관찰되면 데이터를 삭제합니다.
7. 데이터 분석
- SOS17을 사용하여 앞서 설명한 바와 같이 이미지 처리 방법을 사용하여 비디오에서 동물의 신체 윤곽 및 이동 매개변수를 추출합니다(17).
참고: 헤드스피드(애벌레 머리속도), 꼬리속도(애벌레 꼬리 속도), 미드스피드(해골선의 애벌레 중간점 속도), cmSpeed(애벌레 중심의 속도)를 포함한 파라미터를 사용하여 애벌레의 이동 속도를 측정했습니다. 헤드테타(헤드 미드포인트와 미드포인트 꼬리 선 사이의 각도)와 헤드오메가(headTheta의 변화하는 속도)를 포함한 파라미터는 애벌레 몸체 굽힘과 굽힘의 각도 속도를 측정하는 데 사용되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
프로토콜에 따르면, 광 점 분석기는 12 시간/12 시간 빛/어두운 주기를 가진 방에서 표준 배지에서 25°C에서 제기된 제 3 의 instar 유충의 광 회피 거동을 조사하기 위해 사용되었다. 단일 w1118 유충은 25.5°C에서 광점 분석실험을 사용하여 시험하였다. 460 nm LED에 의해 생성된 광점의 평균 광도는 0.59 μW/cm2였습니다. 애벌레의 전체 과정은 SOS 소프트웨어 및 사용자 정의 서면 스크립트12,17을사용하여 기록 및 분석되었다. 대표적인 유충의 테일 속도, 바디 굽힘 각도 및 바디 굽힘의 각도 속도의 시간 곡선은 그림 2 및 Movie 1에나와 있습니다.
유충광 회피에 대한 옥토파민성 뉴런의 효과를 조사하기 위해, Tdc2-Gal4 드라이버를 사용하여 파상풍 독소(UAS-TNTG)를 발현하여 억제된 옥토파민성 뉴런을 가진 제3 의 유충을 광스폿 분석으로 시험하였다. 도 3에나타낸 바와 같이, 애벌레 헤드 캐스트의 크기(최대 신체 굽힘 각도)는 보호자 통제에 비해 현저히 감소하였으며, 이는 Tdc2-Gal4 뉴런이 정상적인 애벌레 광 반응에 필요하다는 것을 나타낸다.
그림 1: 실험적 설정. (a)광점 기반 애벌레 빠른 광택시 분석에 대한 설정의 개략적 표현. 파란색 선은 시각적 자극으로 사용되는 가시광선의 경로를 나타내고 빨간색 선은 적외선의 경로를 나타냅니다. 화살표는 라이트의 방향을 나타냅니다. 850 nm 밴드 패스 필터는 적외선을 통과할 수 있지만 가시광선을 차단합니다. (B)라이트 스폿 분석에 대한 설정의 이미지입니다. 더 나은 시각화를 위해 조명 조건에서 이미지를 촬영했다는 점에 유의해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 등점진입 시 유충의 반응에 대한 정량적 설명. (A)애벌레 몸의 움직임을 측정하는 데 사용되는 매개 변수를 보여주는 다이어그램. 유충의 윤곽은 얇은 선으로 표시됩니다. 굵은 선은 얇게 썬 애벌레 몸윤곽의 골격을 보여줍니다. 골격 선의 두 끝과 중간점은 애벌레 머리, 중간점 및 꼬리의 위치로 지정됩니다. 머리에서 중간점까지의 선과 중간점에서 꼬리까지의 선 사이의 각도는 바디 굽힘 각도입니다. 시간이 지남에 따라 바디 굽힘 각도의 변화 속도는 애벌레 헤드 캐스트의 각도 속도로 정의됩니다. 여기에 표현된 꼬리속도(B,테일스피드), 헤드캐스트각도(C,headomega), 그리고 라이트 스팟으로 들어오고 나뭇잎을 남기는 w1118 유충의 차체 굽힘 각도(D, headtheta)가 있다. 녹색 선은 애벌레 머리가 들어와 라이트 스폿을 떠난 타임포인트를 표시합니다. 강한 감속 기간의 시간 창은 노란색입니다. 화살표 헤드는 감속 기간 및 헤드 캐스트 각도 및 바디 굽힘 각도의 관련 피크를 가리킵니다. 동작 프로세스는 동영상 1에표시됩니다. 이 그림은 공 외12에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 파상풍 독소 TNTG를 사용하여 Tdc2-Gal4 표지된 뉴런을 억제하면 빛 스폿 입구에 반응하여 애벌레 헤드 캐스트의 크기를 감소시킨다. **, P < 0.01, n = 81, 52, 92; 크루스칼-월리스 테스트와 포스트 호크 던의 다중 비교 테스트가 사용되었다. 이 그림은 공 외12에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1: w 1118 애벌레가 들어와 빛 점 분석에서 빛 지점을 남깁니다. 가장자리가 스무화된 라이트 스폿은 흰색입니다. 애벌레 머리의 트랙이 표시됩니다. 애벌레 테일 스피드, 헤드세타, 헤드오메가의 해당 곡선이 동시에 재생됩니다. 이 영화는 공 외12에서수정되었습니다 . 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 빛에서 탈출하는 Drosophila 애벌레의 능력을 테스트하는 빛 반점 분석실험을 제시한다. 이 분석법은 진입 전, 발생 중, 그리고 가벼운 지점을 떠난 후 유충의 행동을 추적 할 수 있습니다. 애벌레 운동의 세부 사항을 캡처하고 분석 할 수 있습니다. 가벼운 점 분석법은 매우 간단하고 강한 실용성을 가지고 있습니다. 전체 장치의 비용이 높지 않습니다. 실험에서 LED 광은 광원으로 사용됩니다. 필요한 경우 다른 파장의 광원으로 교체할 수 있습니다. LED 드라이브로 도도의 광도를 조절할 수 있습니다. 스팟의 가장 낮은 광도는 1.80 pW/mm2(차가운 백색광)에 도달할 수 있습니다. 이러한 낮은 광강도에서도 애벌레는 여전히 빛을 감지하고 빛을 피하는 행동을 보일 수 있다11.
한천 판의 농도는 0.8 %와 1.0 % 사이에서 제어된다는 점에 유의해야합니다. 농도가 너무 높으면 한천 판에 빛의 산란이 심각할 수 있으며 비디오에서 인식되는 광점의 크기는 과장됩니다. 따라서 스팟의 밝기가 너무 높아서는 안됩니다. 빛 스폿의 유충은 거의 보이지 않으므로 가시광선을 사용하여 유충을 비추고 카메라에 850nm 밴드 패스 필터를 추가하여 라이트 스폿 신호가 카메라에 유입되는 것을 방지해야 합니다. 빛 반점에 대한 애벌레 반응의 비디오는 애벌레 전용 및 빛 점 전용 비디오를 기반으로 나중에 합성 될 수있다.
빛 점 분석세 세 가지 주요 장점을 가지고 : 1) 애벌레 빛 회피의 과정을 모니터링하고 상세하게 분석 할 수있다; 2) 애벌레 빛 반응은 빛 적응의 가능한 관여를 배제 할 수 있도록, 한 번만 테스트; 및 3) 다른 애벌레의 빛 반응에 대한 가능한 영향은 배제 될 수있다. 이 분석의 한 명백한 단점은 한 번에 하나의 애벌레만 테스트되기 때문에 처리량이 낮다는 것입니다. 이러한 분석방법은 주로 빛의 낮은강도(11,12)에서사용되지만, 체벽(16)의 표면을 타일로 하는 클래스 IV DA뉴런을 자극할 수 있는 강한 빛에서 애벌레 회피에도 적용될 수 있다.
우리의 실험 장치는 또한 광유전학을 위해 이용될 수 있습니다. 850 nm 밴드 패스 필터는 광점 신호와 마찬가지로 여기 빛을 차단할 수 있으므로 카메라가 적색 광 자극 전, 도중 및 후에 애벌레의 행동을 명확하게 기록할 수 있습니다. 특히, 620 nm 적색광이 광유전학 적자극을 위해 Chrimson과 함께 사용될 때 적외선 LED의 낮은 반쪽은 마스크되어야 하며, 적색광의 방향은 유충을 명확하게 이미지화하기 위해 잘 제어되어야 합니다. 한편, 이미지의 적색 광원에서 발생하는 중간 정도의 시끄러운 신호는 온/오프 자극의 타이밍을 판단하는 데 사용할 수 있습니다. 요컨대, 광 점 분석은 급속한 애벌레 빛 회피 거동에 대한 상세한 공간 및 시간적 특성을 모니터링하고 분석하는 추가 방법을 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국의 자연 과학 재단 (31671074)과 절강 성 대학에 대한 기본 연구 기금 (2019XZZX003-12)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED | Thorlabs, USA | PM100A | Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V |
| AC to DC converter | Thorlabs, USA | S120VC | Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm) |
| band-pass filter | Thorlabs, USA | DC2100 | LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary |
| Collimated LED blue light | ELP, China | USBFHD01M | Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710 |
| Compact power meter console | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber |
| High-Power LED Driver | Minhongshi, China | MHS-48XY | Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm |
| high-resolution web camera | Thorlabs, USA | MWWHL4 | Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120? Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group |
| LED Warm White | Mega-9, China | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm |
| Spectrometer | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards. |
| Standard photodiode power sensor | Super Dragon, China | YGY-122000 | Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | S401C | Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5% |
References
- Grossfield, J. Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).
- Godoy-Herrera, R. C. L. D. The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation. Animal Behaviour. 37, (1989).
- Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions. Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends in Neurosciences. 35, (2012).
- Kane, E. A., et al. Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).
- Humberg, T. H., et al. Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues. Nature Communications. 9. 1260, (2018).
- Gong, Z., et al. Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference. Science. 330, (2010).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341, 1113 (2013).
- Zhao, W., et al. A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference. Nature Communications. 10, (2019).
- Gong, C., et al. A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance. Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).
- Larderet, I., et al. Organization of the Drosophila larval visual circuit. eLife. 6, (2017).
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. Journal of Neurogenetics. 10, (1995).
- Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921 (2010).
- Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, e41642 (2012).
