Summary
इस प्रोटोकॉल Drosophila लार्वा phototactic व्यवहार की जांच करने के लिए एक प्रकाश स्पॉट परख का परिचय. इस परख में, एक प्रकाश स्थान प्रकाश उत्तेजना के रूप में उत्पन्न होता है, और लार्वा प्रकाश परिहार की प्रक्रिया एक अवरक्त प्रकाश आधारित इमेजिंग प्रणाली द्वारा दर्ज की गई है.
Abstract
Drosophila मेलेनोगैस्टर के लार्वा फोरेजिंग चरण के दौरान स्पष्ट प्रकाश-वाणकित व्यवहार दिखाते हैं। Drosophila लार्वा phototaxis पशु परिहार व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल लार्वा phototactic व्यवहार की जांच करने के लिए एक प्रकाश स्पॉट परख का परिचय. प्रयोगात्मक सेट अप दो मुख्य भागों में शामिल हैं: एक दृश्य उत्तेजना प्रणाली है कि प्रकाश स्थान उत्पन्न करता है, और एक अवरक्त प्रकाश आधारित इमेजिंग प्रणाली है कि लार्वा प्रकाश परिहार की प्रक्रिया रिकॉर्ड. इस परख में प्रवेश करने से पहले लार्वा के व्यवहार की ट्रैकिंग की अनुमति देता है, मुठभेड़ के दौरान, और प्रकाश स्थान छोड़ने के बाद. मंदी, ठहराव, सिर कास्टिंग, और मोड़ सहित लार्वा आंदोलन का विवरण पर कब्जा कर लिया और इस विधि का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है।
Introduction
Drosophila मेलेनोगैस्टर के लार्वा फोरेजिंग चरण के दौरान स्पष्ट प्रकाश-वाणकित व्यवहार दिखाते हैं। Drosophila लार्वा फोटोटैक्सिस जांच के तहत किया गया है , विशेष रूप से पिछले 50 वर्षों में1,2,3,4,5,6,7 ,8. हाल के वर्षों में, इस तथ्य के बावजूद कि 1) कई न्यूरॉन्स लार्वा प्रकाश परिहार मध्यस्थता की पहचान की गई है4,5,9,10,11,12 और 2) synapses के संकल्प पर लार्वा दृश्य प्रणाली का पूरा connectome स्थापित किया गया है13, तंत्रिका तंत्र अंतर्निहित लार्वा phototaxis काफी हद तक स्पष्ट नहीं रह.
लार्वा फोटोटैक्सिस के अध्ययन में कई व्यवहारिक परखों का उपयोग किया गया है। वे मोटे तौर पर दो वर्गों में विभाजित किया जा सकता है: एक स्थानिक प्रकाश ढाल और अन्य लौकिक प्रकाश ढाल शामिल शामिल. स्थानिक प्रकाश ढाल परख के लिए, क्षेत्र प्रकाश और अंधेरे में वर्गों के बराबर संख्या में विभाजित है. क्षेत्र को प्रकाश और गहरे हिस्सों2,4 या प्रकाश और गहरे वृत्तों14,15में विभाजित किया जा सकता है , या यहां तक कि एक चेकरबोर्ड7पर की तरह वैकल्पिक प्रकाश और अंधेरे वर्गों में विभाजित किया जा सकता है . आमतौर पर, आगर प्लेटों का उपयोग स्थानिक प्रकाश प्रवणता परख के लिए किया जाता है, लेकिन वैकल्पिक प्रकाश और अंधेरे वर्गों में विभाजित ट्यूबों का भी उपयोग किया जा सकताहै 10,14.
परख के पुराने संस्करण में, प्रकाश रोशनी आम तौर पर लार्वा के नीचे से निकलती है। हालांकि, नए संस्करणों में रोशनी काफी हद तक ऊपर से उत्पन्न होती है, क्योंकि लार्वा आंखें (उदाहरण के लिए, बोलविग के अंग जो कम या मध्यम प्रकाश तीव्रता16के प्रति संवेदनशील होते हैं) अपारदर्शी सेफैलोग्रियल कंकाल में होते हैं जिसकी ओर खुलते हैं ऊपरी मोर्चे. इससे लार्वा ऊपरी सामने की दिशाओं से प्रकाश के प्रति अधिक संवेदनशील हो जाता है. अस्थायी प्रकाश प्रवणता परख के लिए, प्रकाश तीव्रता क्षेत्र में स्थानिक रूप से एक समान होती है, लेकिन समय के साथ तीव्रता में परिवर्तन होता है। लौकिक वर्ग तरंग प्रकाश के अलावा (यानी, पर चमकती / बंद या मजबूत / कमजोर प्रकाश3,7), लौकिक रूप से अलग प्रकाश है कि तीव्रता में एक रैखिक रैंप के अनुरूप है भी8 लार्वा की संवेदनशीलता को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है एक अस्थायी रूप से प्रकाश उत्तेजना बदल रहा है.
एक तीसरा प्रकार का फ़ोटोटैक्सिस परख दिशात्मक प्रकाश दृश्य नेविगेशन है, जिसमें ऊपर से 45 डिग्री7के कोण पर रोशनी शामिल होती है। केन एट अल7के काम से पहले, केवल मोटे मापदंडों जैसे प्रकाश और अंधेरे क्षेत्रों में लार्वा की संख्या, मोड़ की आवृत्ति, और निशान लंबाई लार्वा फोटोटैक्सिस परख में गणना की गई थी। इस एक ही समूह के काम के बाद से, लार्वा phototaxis के लिए उच्च लौकिक संकल्प वीडियो रिकॉर्ड के विश्लेषण के साथ, phototaxis के दौरान लार्वा आंदोलन की विस्तृत गतिशीलता (यानी, लार्वा शरीर के विभिन्न भागों की तत्काल गति, दिशा शीर्षक, मोड़ कोण और इसी कोणीय वेग) का विश्लेषण किया गया है7. इस प्रकार, लार्वा फोटोटैक्सिस व्यवहार के अधिक विवरण की खोज की जा करने में सक्षम किया गया है. इन परखों में, समूहों में लार्वा का परीक्षण किया जाता है ताकि समूह प्रभावों को बाहर न रखा जा सके।
इस प्रोटोकॉल व्यक्तिगत प्रकाश उत्तेजना के लिए लार्वा व्यवहार प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए एक प्रकाश स्पॉट परख का परिचय. मुख्य प्रयोगात्मक सेट अप एक दृश्य उत्तेजना प्रणाली और अवरक्त प्रकाश आधारित इमेजिंग प्रणाली के होते हैं. दृश्य उत्तेजना प्रणाली में, एक एलईडी प्रकाश स्रोत एक agar प्लेट, जहां लार्वा का परीक्षण किया है पर एक दौर 2 सेमी व्यास प्रकाश स्थान उत्पन्न करता है. प्रकाश तीव्रता एक एलईडी ड्राइवर का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है। इमेजिंग प्रणाली एक अवरक्त कैमरा है कि तीन 850 एनएम अवरक्त एल ई डी है कि कैमरे के लिए रोशनी प्रदान करने के अलावा लार्वा के व्यवहार को दर्शाता भी शामिल है. कैमरे के लेंस कैमरे में प्रवेश करने से दृश्य उत्तेजना प्रणाली से प्रकाश ब्लॉक करने के लिए एक 850 एनएम बैंड-पास फिल्टर द्वारा कवर किया जाता है, जबकि अवरक्त प्रकाश कैमरे में प्रवेश करने की अनुमति दी है. इस प्रकार, इमेजिंग पर दृश्य उत्तेजना के हस्तक्षेप को रोका जाता है. इस परख में, पहले सहित एक अवधि के भीतर व्यक्तिगत लार्वा की तेजी से प्रतिक्रियाओं के व्यवहार विवरण, के दौरान, और प्रकाश में प्रवेश करने के बाद दर्ज कर रहे हैं और विश्लेषण.
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Protocol
1. ड्रोसोफिला लार्वा की तैयारी
- उबला हुआ मकई का भोजन (73 ग्राम), आगर (5.6 ग्राम), सोयाबीन भोजन (10 ग्राम), खमीर (17.3 ग्राम), सिरप (76 एमएल) और पानी (1000 एमएल) से मिलकर मानक माध्यम तैयार करें।
- 12 h/12 h प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ एक कमरे में मानक माध्यम पर 25 डिग्री सेल्सियस पर सभी मक्खियों उठाएँ।
2. आगर प्लेटों की तैयारी
- 1.0% agar समाधान तैयार करें. एक संतुलन के साथ एक 500 एमएल बीकर में 3 ग्राम आगर का वजन करें, फिर 300 एमएल आसुत जल जोड़ें। पानी को वाष्पित होने से रोकने के लिए ब्रेकर पर एक पन्नी कागज रखें। बीकर को माइक्रोवेव में उबालने के लिए गरम करें।
- बीकर बाहर ले और एक गिलास रॉड के साथ अच्छी तरह से हलचल, तो एक माइक्रोवेव ओवन में गर्मी उबाल. दोहराएँ जब तक तरल पूरी तरह से पारदर्शी और तरल है.
नोट: अंतिम गर्म आगर समाधान हवा के बुलबुले से मुक्त होना चाहिए; अन्यथा, थाली में आगर डालने से आगर प्लेट की असमान और दांतेदार सतह हो जाएगी, जो बाद में लार्वा व्यवहार परीक्षण को प्रभावित करेगी। आगर समाधान की एकाग्रता बहुत अधिक या कम नहीं होनी चाहिए। यदि सांद्रता बहुत अधिक है, तो आगर प्लेट पर प्रकाश विसरित परावर्तन मजबूत होगा और प्रकाश/अंधेरे सीमा को स्मियर करेगा। यदि एकाग्रता बहुत कम है, तो लार्वा प्लेट पर निशान छोड़ देगा। इन त्रुटियों के दोनों protcol में बाद में वीडियो प्रसंस्करण में बाधा होगी. - धीरे धीरे एक पेट्री डिश में गर्म आगर समाधान डालना (व्यास 15 सेमी) जब तक नीचे समान रूप से agar की एक परत के साथ कवर किया जाता है ($ 4 मोटाई में मिमी), और कमरे के तापमान पर शांत (आरटी) जब तक agar समाधान ठोस है.
- आगर प्लेट का प्रयोग ताजा होने पर किया जाना चाहिए। यदि ऐसा नहीं है, तो पानी की एक परत को सतह पर डाल दें और बाद में उपयोग के लिए इसे फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
3. दृश्य उत्तेजना प्रणाली का सेट अप
- एलईडी प्रकाश स्रोत का चयन करें: 470 एनएम या गर्म सफेद प्रकाश में एलईडी नीले प्रकाश collimated.
नोट: प्रकाश स्रोत किसी भी अन्य तरंगदैर्ध्य के एलईडी प्रकाश के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इस प्रयोग में, नीले प्रकाश एलईडी एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है. - एल्यूमीनियम पन्नी या काले कार्डबोर्ड की एक मोटी टुकड़ा रोल (अस्पष्टता सुनिश्चित करें) 3 सेमी के व्यास के साथ नीले प्रकाश एलईडी के समान व्यास के साथ लंबाई में 12 सेमी के एक खुले सिलेंडर के रूप में। सिलेंडर के शीर्ष अंत नीले प्रकाश एलईडी के सामने के अंत को कवर करते हैं। केंद्र में एक छोटे गोल छेद (0.5 सेमी व्यास) के साथ एक काले कार्डबोर्ड के साथ नीचे के अंत को कवर करें। यह प्रकाश स्रोत प्रणाली सेट अप का गठन किया.
- एक क्लिप के साथ लोहे के फ्रेम पर तैयार प्रकाश स्रोत को ठीक करें, सुनिश्चित करें कि एलईडी प्रकाश डेस्कटॉप की ओर नीचे परियोजनाओं. सिलेंडर को थोड़ा झुकाएं। बेलन तल तथा ऊर्ध्वाधर तल के बीच का कोण लगभग 10 डिग्री है (चित्र 1देखें)। उच्च शक्ति एलईडी ड्राइवर के "एलईडी1" प्लग करने के लिए 470 एनएम नीले एलईडी प्रकाश कनेक्ट करें। ड्राइवर को चालू करें, चैनल 470 एनएमका चयन करने के लिए ड्राइवर के ऊपरी दाएं कोने में घुंडी को चालू करें, फिर एलईडीक्लिक करें। फिर, जब स्क्रीन प्रदर्शित करता है "जेड", एक नीले प्रकाश स्थान डेस्कटॉप पर दिखाई देगा.
नोट: यदि सिलेंडर छोटे दौर छेद के अलावा प्रकाश लीक, यह केवल छेद के माध्यम से प्रकाश पारित कर सकते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए लीक भागों पर काले टेप का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. - ठीक क्लिक करें और प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करने के लिए घुंडी बारी. 50 लेकिन की एक उच्च प्रकाश तीव्रता के लिए घुंडी घुमाएँ. उपाय और एक स्पेक्ट्रोमीटर के साथ प्रकाश के स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड.
- प्रकाश स्रोत की स्थिति को 2 सेमी तक प्रकाश स्थान के व्यास को समायोजित करने के लिए ऊपर और नीचे ले जाएँ। डेस्कटॉप एक बेहतर विपरीत प्रभाव के लिए काला होना चाहिए.
- प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार प्रकाश तीव्रता का चयन करने के लिए घुंडी घुमाएँ। जगह में अधिक से अधिक और कम से कम प्रकाश शक्ति को मापने के लिए एक मानक photodiode शक्ति संवेदक के साथ एक कॉम्पैक्ट शक्ति मीटर कंसोल का प्रयोग करें, यह रिकॉर्ड, तीन बार उपाय, और औसत मूल्य ले.
नोट: यह एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य के प्रकाश के लिए प्रकाश की तीव्रता को मापने और सफेद प्रकाश के लिए प्रकाश की तीव्रता को मापने के लिए एक थर्मल पावर सेंसर का उपयोग करने के लिए एक photodiode शक्ति संवेदक का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. - संवेदक के क्षेत्र द्वारा मापा प्रकाश शक्ति विभाजित करके प्रकाश स्थान में प्रकाश की तीव्रता की गणना.
नोट: उदाहरण के लिए, यदि चरण 2.6 में मापी गई प्रकाश शक्ति 20 pW है और संवेदक का क्षेत्रफल 0.81 मिमी2है, तो प्रकाश की तीव्रता 24.69 pW/mm2 (0.81 मिमी2) द्वारा 20 pW विभाजित करना है।
4. इमेजिंग सिस्टम का सेट-अप
- एक लोहे की क्लिप के साथ एक उच्च संकल्प वेब कैमरा दबाना, डेस्कटॉप पर प्रकाश स्थान के ऊपर के बारे में 10 सेमी पर (चित्र 1).
- डेस्कटॉप की ओर कैमरा लेंस के अभिविन्यास समायोजित करें. कैमरा किसी USB इंटरफ़ेस के माध्यम से किसी कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
- कैमरे के नीचे डेस्कटॉप दाईं ओर एक agar प्लेट रखें.
- विंडोज 7 के साथ कंप्यूटर पर "Amcap9.22" सॉफ्टवेयर खोलें, और प्रकाश स्थान स्वचालित रूप से AMcap की खिड़की में दिखाया जाएगा. कैमरा थोड़ा छोड़ दिया है या सही ले जाएँ सुनिश्चित करने के लिए कि प्रकाश स्थान खिड़की के केंद्र के पास है. सुनिश्चित करें कि कैमरा प्रकाश पथ ब्लॉक नहीं करता है। प्रकाश स्थान पूर्ण और दौर होना चाहिए।
नोट: सॉफ्टवेयर http://amcap.en.softonic.com/ में पाया जा सकता है. - कैमरे के ठीक नीचे 5-7 मिमी पर एक क्लिप के साथ एक 850 एनएम - 3 एनएम बैंड-पास फिल्टर को ठीक करें।
नोट: फिल्टर का व्यास के बारे में 2.5 सेमी है, और कैमरा लेंस व्यास में कम से कम 1 सेमी है, तो फिल्टर कैमरे के दृश्य क्षेत्र को कवर कर सकते हैं. कैमरे के नीचे फिल्टर के साथ, प्रकाश स्थान AMcap की खिड़की में नहीं देखा जाना चाहिए. - तीन अवरक्त प्रकाश पैदा एल ई डी प्लेस (केंद्रीय तरंगदैर्ध्य - 850 एनएम) समान रूप से agar प्लेट के चारों ओर. प्रत्येक एलईडी के बारे में 5 सेमी दूर agar प्लेट के किनारे से होना चाहिए, और एलईडी के लेंस चेहरा एक 70 डिग्री नीचे की ओर कोण पर agar प्लेट की ओर होना चाहिए. एसी-टू-डीसी कनवर्टर के माध्यम से पावर के लिए एल ई डी कनेक्ट करें।
नोट: यह पदों और अवरक्त प्रकाश एल ई डी के कोण को ठीक करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक परीक्षणों में क्षेत्र की चमक की स्थिरता सुनिश्चित करने और बाद में वीडियो प्रसंस्करण की सुविधा के लिए बेहतर है. - कंप्यूटर और डिवाइस के बीच एक ब्लैक बोर्ड रखें। कंप्यूटर स्क्रीन लाइट को प्रयोग को प्रभावित करने से रोकने के लिए कंप्यूटर स्क्रीन की चमक को नीचे सेट करें.
नोट: प्रकाश की तरंगदैर्ध्य या तीव्रता को मापने जब पर्यावरण अंधेरे रखें।
5. इमेजिंग के मापदंडों की स्थापना
- AMcap सॉफ़्टवेयर के मेनू पर, विकल्प चुनें | वीडियो डिवाइस ] कैप्चर स्वरूप,और 800 x 600 और फ्रेम दर करने के लिए 60 एफपीएस के लिए कब्जा कर लिया वीडियो के पिक्सेल आकार सेट.
- कैमरे के नीचे से फिल्टर निकालें, कैमरे के नीचे एक शासक डाल दिया और पैमाने लाइन स्पष्ट और दृश्य के वीडियो क्षेत्र की चौड़ाई के समानांतर बनाने के लिए कैमरा फोकस समायोजित करें।
- कैप्चर क्लिक करें ] सेट अप करें ] पथ सहेजने का चयन करने के लिए वीडियो कैप्चर, रिकॉर्डिंग प्रारंभ करेंक्लिक करें, 600 पिक्सेल से संबंधित वास्तविक दूरी रिकॉर्ड करें, और प्रत्येक पिक्सेल के अनुपात को वास्तविक दूरी पर परिकलित करें.
6. प्रकाश परिहार व्यवहार की वीडियो रिकॉर्डिंग
- सभी प्रयोगों के माध्यम से 25.5 डिग्री सेल्सियस का तापमान बनाए रखें। यदि आवश्यक हो तो एक एयर कंडीशनर के साथ नियंत्रण कक्ष तापमान। एक humidifier के साथ 60% पर लगातार आर्द्रता रखें.
- "lightarea1" नाम प्रकाश स्थान स्थिति का एक छोटा वीडियो ले लो. फिर, 850 एनएम ले जाएँ - 3 एनएम फिल्टर वापस कैमरा लेंस को कवर करने के लिए.
नोट: लार्वा व्यवहार रिकॉर्डिंग करते समय, कैमरा लेंस 850 एनएम - 3 एनएम फिल्टर द्वारा कवर किया जाता है ताकि वीडियो में प्रकाश स्थान नहीं दिखाया गया है। प्रकाश स्थल को बाद में मैटलैब के साथ लार्वा के साथ वीडियो में पुनर्निर्माण किया जा सकता है। कैमरे की स्थिति को न बदलें, और चरण 4.3 में मापे गए वास्तविक दूरी के लिए प्रत्येक पिक्सेल के अनुपात को बदलने से बचें. - प्रयोगात्मक डिवाइस से बहुत दूर एक प्रकाश (यानी, एक कमरे की रोशनी) को चालू करें। संभव के रूप में कम के रूप में प्रकाश नीचे बारी, जब तक लार्वा स्पष्ट रूप से आंखों के साथ देखा जा सकता है। लार्वा को एक चम्मच के साथ संस्कृति माध्यम से बाहर ले लो, धीरे से एक तिहाई सितारा लार्वा लेने के लिए, और आसुत पानी से साफ धो लें। भूख से हस्तक्षेप से बचने के लिए एक समय में लार्वा एक धोने के लिए सावधान रहें। एक प्रयोग में कम से कम 20 लार्वा की आवश्यकता होती है।
- चरण 3.3 के दौरान कैमरे के नीचे रखी आगर प्लेट के केंद्र में लार्वा को स्थानांतरित करें। लेंस के नीचे प्रकाश के प्रतिबिंब को रोकने के लिए लार्वा से अतिरिक्त पानी को ब्रश से धीरे निकालें या ब्लाटिंग पेपर का उपयोग करें ताकि लार्वा से पानी को हटाया जा सके। कमरे की रोशनी बंद करें और लार्वा को अंधेरे वातावरण में 2 मिनट के लिए अनुकूल होने दें।
- अवरक्त प्रकाश उत्पन्न करने के लिए एलईडी प्रकाश को चालू करें, और धीरे से प्लेट के केंद्र में लार्वा ब्रश करें। जब लार्वा सीधे क्रॉल करने के लिए शुरू होता है, प्लेट बारी बारी से लार्वा प्रकाश स्थान की ओर सिर बनाने के लिए। सुनिश्चित करें कि यह शुरू से ही सीधे क्रॉल करता है, अन्यथा यह प्रकाश स्थान तक पहुँच प्राप्त नहीं कर सकता है।
- कैप्चर क्लिक करें ] सेट अप करें ] पथ सहेजने का चयन करने के लिए वीडियो कैप्चर करें, फिर रिकॉर्ड करने के लिए रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें क्लिक करें. लार्वा को प्रकाश स्थान की ओर क्रॉल करने दें, प्रकाश स्थान में प्रवेश करें, फिर प्रकाश स्थान को तब तक छोड़ दें जब तक कि यह दृश्य के क्षेत्र से लगभग बाहर न हो जाए। रिकॉर्डिंग रोकेंक्लिक करें. यदि लार्वा बंद होने से पहले प्रकाश स्थान से दूर हो जाता है, तो सीधे रिकॉर्डिंग बंद करेंक्लिक करें.
- फ़िल्टर को कैमरे से दूर ले जाएँ. "lightarea2" नाम के प्रकाश स्थान की स्थिति का एक छोटा वीडियो ले लो और यह करने के लिए तुलना "lightarea1" यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रकाश स्थान की स्थिति नहीं बदला है. यदि कोई स्पष्ट स्थिति परिवर्तन देखा जाता है, तो डेटा छोड़ दें.
7. डेटा विश्लेषण
- पहले वर्णित17 के रूप में छवि प्रसंस्करण तरीकों का उपयोग कर वीडियो से पशु शरीर समोच्च और आंदोलन मापदंडों को निकालने के लिए एसओएस17का प्रयोग करें।
नोट: हेडस्पीड (लार्वा सिर का वेग), टेलस्पीड (लार्वा पूंछ का वेग), मिडस्पीड (कंकाल रेखा के लार्वा मध्य बिंदु का वेग), और सेमीस्पीड (लार्वा सेंट्रोइड का वेग) सहित पैरामीटर लार्वा गति को मापने के लिए उपयोग किए गए थे। हेडथेटा (हेड-मिडपॉइंट और मिडपॉइंट-टेल की लाइनों के बीच के कोण) और हेडओमेगा (हेडथेटा की बदलती हुई गति) सहित पैरामीटर का उपयोग लार्वा शरीर झुकने और झुकने की कोणीय गति को मापने के लिए किया गया था।
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Representative Results
प्रोटोकॉल के अनुसार, प्रकाश स्थान परख का उपयोग तीसरे इनस्टार लार्वा के प्रकाश परिहार व्यवहार की जांच करने के लिए किया गया था जो मानक माध्यम पर 12 h/12 h प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ मानक माध्यम पर 25 डिग्री सेल्सियस पर उठाया गया था। 25.5 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश बिंदु परख का उपयोग करके एक डब्ल्यू 1118 लार्वा का परीक्षण किया गया। 460 एनएम एलईडी द्वारा उत्पन्न प्रकाश स्थान की औसत प्रकाश तीव्रता 0.59 डिग्रीसेल्सियस2 थी। प्रकाश स्थल में प्रवेश करने और बाहर निकलने की पूरी प्रक्रिया को एसओएस सॉफ्टवेयर और कस्टम लिखित लिपियों12,17का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया और उसका विश्लेषण किया गया . पुच्छ चाल के समय वक्र, शरीर बंकन कोण तथा प्रतिनिधि लार्वा के शरीर बंकन की कोणीय चाल चित्र 2 तथा मूवी 1में दर्शायी गई है।
लार्वा प्रकाश परिहार पर octopaminergic न्यूरॉन्स के प्रभाव की जांच करने के लिए, एक Tdc2-Gal4 ड्राइवर के साथ टेटनस विष व्यक्त करके बाधित octopaminergic न्यूरॉन्स के साथ तीसरे instar लार्वा (UAS-TNTG) प्रकाश स्पॉट परख के साथ परीक्षण किया गया. जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है , लार्वा सिर कास्ट (अधिकतम शरीर झुकने कोण) का आकार माता पिता के नियंत्रण की तुलना में काफी कम हो गया था, यह दर्शाता है कि Tdc2-Gal4 न्यूरॉन्स एक सामान्य लार्वा प्रकाश प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं.
चित्र 1: प्रायोगिक सेट-अप. (क)प्रकाश स्थान आधारित लार्वा फास्ट फोटोटैक्सिस परख के लिए सेट-अप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। नीली रेखाएँ दृश्य उत्तेजना के रूप में प्रयुक्त दृश्य प्रकाश के पथकांद का प्रतिनिधित्व करती हैं, और लाल रेखाएँ अवरक्त प्रकाश के पथों का प्रतिनिधित्व करती हैं. तीर प्रकाश की दिशा दर्शाते हैं। 850 एनएम बैंड-पास फिल्टर अवरक्त प्रकाश पारित करने की अनुमति देता है, लेकिन यह दिखाई प्रकाश ब्लॉक. (बी)प्रकाश स्थान परख के लिए सेट अप की एक छवि. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि छवि बेहतर दृश्य के लिए प्रकाश की स्थिति में लिया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: किसी प्रकाश स्थान में प्रवेश करते समय लार्वा की अभिक्रिया का मात्रात्मक वर्णन। (क)लार्वा शरीर की गति मापने में प्रयुक्त पैरामीटरों को दर्शाने वाला एक आरेख। लार्वा की समोच्च रेखा पतली रेखा में दिखाई जाती है। मोटी रेखा पतली लार्वा शरीर समोच्च के कंकाल से पता चलता है. कंकाल रेखा के दो सिरों और मध्यबिंदु को लार्वा सिर, मध्यबिंदु और पूंछ के पदों के रूप में सौंपा जाता है। सिर से मध्यबिंदु तक रेखा और मध्यबिंदु से पूंछ तक की रेखा के बीच का कोण शरीर झुकने वाला कोण है। समय के साथ शरीर बंकन कोण के परिवर्तन की चाल को लार्वा सिर कास्ट के कोणीय वेग के रूप में परिभाषित किया गया है। यहाँ का प्रतिनिधित्व पूंछ की गति(बी, पूंछ की गति), सिर डाली कोणीय वेग(सी, headomega), और शरीर झुकने कोण(डी, headtheta) एक w1118 लार्वा है कि प्रवेश करती है और एक प्रकाश स्थान छोड़ देता है. हरी रेखाएं उस समय बिंदु को चिह्नित करती हैं जो लार्वा सिर में प्रवेश करती है और प्रकाश स्थान को छोड़ तीज करती है। एक मजबूत मंदी अवधि के समय खिड़की पीले रंग में है. तीर सिर मंदी अवधि और सिर में संबंधित चोटियों को इंगित कोणीय वेग और शरीर झुकने कोण डाली. व्यवहार प्रक्रिया मूवी 1में दिखाया गया है। यह आंकड़ा घंटा एट अल12से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: Tdc2-Gal4 लेबल न्यूरॉन्स टेटनस विष टीएनटीजी का उपयोग कर प्रकाश स्थान प्रवेश द्वार के जवाब में लार्वा सिर डाली के आकार को कम कर देता है. **, पी एंड एलटी; 0.01, n ] 81, 52, 92; Kruskal-Wallis परीक्षण के बाद तदर्थ डन के कई तुलना परीक्षण के बाद इस्तेमाल किया गया था. यह आंकड़ा घंटा एट अल12से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
मूवी 1: एक w1118 लार्वा में प्रवेश करती है और प्रकाश स्थान परख में एक प्रकाश स्थान छोड़ देता है. किनारे smoothed के साथ प्रकाश स्थान सफेद में है. लार्वा शीर्ष का ट्रैक दिखाया गया है। लार्वा टेलस्पीड, हेडथेटा और हेडओमेगा के संगत वक्र एक साथ खेले जाते हैं। इस फिल्म घंटा एट अल12से संशोधित किया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
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Discussion
इस प्रोटोकॉल प्रकाश स्थान परख प्रस्तुत करता है प्रकाश से बचने के लिए Drosophila लार्वा की क्षमता का परीक्षण करने के लिए। यह परख प्रवेश करने से पहले लार्वा के व्यवहार पर नज़र रखने की अनुमति देता है, मुठभेड़ के दौरान, और एक प्रकाश स्थान छोड़ने के बाद. लार्वा आंदोलन के विवरण पर कब्जा कर लिया और विश्लेषण किया जा सकता है. प्रकाश स्थान परख बहुत सरल है और मजबूत practicability के पास. पूरे डिवाइस की लागत अधिक नहीं है। प्रयोग में, एलईडी प्रकाश प्रकाश स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है. यदि आवश्यक हो तो इसे विभिन्न तरंगदैर्ध्य के प्रकाश स्रोतों से बदला जा सकता है। प्रकाश तीव्रता भी एलईडी ड्राइव द्वारा समायोजित किया जा सकता है. स्थान में सबसे कम प्रकाश तीव्रता 1.80 pW/mm2 (ठंडा सफेद प्रकाश) तक पहुँच सकते हैं। यहां तक कि इतनी कम प्रकाश तीव्रता पर, लार्वा अभी भी प्रकाश को समझ सकते हैं और प्रकाश से बचने वाले व्यवहार11दिखा सकते हैं।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आगर प्लेट की एकाग्रता 0.8% और 1.0% के बीच नियंत्रित किया जाता है। यदि एकाग्रता बहुत अधिक है, agar प्लेट पर प्रकाश के प्रकीर्णन गंभीर हो सकता है, और वीडियो में मान्यता प्राप्त प्रकाश स्थान का आकार अतिरंजित है. इसलिए, स्थान की चमक बहुत अधिक नहीं होनी चाहिए। चूंकि एक प्रकाश स्थान में लार्वा शायद ही दिखाई दे रहे हैं, यदि दृश्य प्रकाश रोशनी के लिए उपयोग किया जाता है, तो लार्वा को रोशन करने के लिए अवरक्त प्रकाश का उपयोग करना आवश्यक है और कैमरे पर 850 एनएम बैंड-पास फिल्टर जोड़ना आवश्यक है ताकि प्रकाश स्थान संकेतों को कैमरे में प्रवेश करने से रोका जा सके। प्रकाश स्पॉट के लिए लार्वा प्रतिक्रिया के वीडियो लार्वा केवल और प्रकाश स्पॉट केवल वीडियो के आधार पर बाद में संश्लेषित किया जा सकता है.
प्रकाश स्थान परख तीन मुख्य गुण के पास: 1) लार्वा प्रकाश परिहार की प्रक्रिया पर नजर रखी जा सकती है और विस्तार से विश्लेषण किया जा सकता है; 2) लार्वा प्रकाश प्रतिक्रिया केवल एक बार परीक्षण किया है, ताकि प्रकाश अनुकूलन के संभावित भागीदारी को बाहर रखा जा सकता है; और 3) अन्य लार्वा से प्रकाश प्रतिक्रिया पर संभावित प्रभाव को बाहर रखा जा सकता है। इस परख का एक स्पष्ट नुकसान यह है कि यह कम थ्रूपुट है, क्योंकि एक समय में केवल एक लार्वा का परीक्षण किया जाता है। हालांकि इस परख का उपयोग मुख्य रूप से प्रकाश11,12की कम तीव्रता पर किया जाता है , लेकिन यह मजबूत प्रकाश में लार्वा परिहार पर भी लागू हो सकता है जो चतुर्थ श्रेणी डीए न्यूरॉन्स को उत्तेजित कर सकता है जो शरीर की दीवारों की सतह16को टाइल करता है .
हमारे प्रयोगात्मक उपकरण भी optogenetics के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 850 एनएम बैंड-पास फिल्टर उत्तेजना प्रकाश को ब्लॉक कर सकता है, क्योंकि यह प्रकाश स्पॉट सिग्नल के लिए करता है, ताकि कैमरा पहले, दौरान, और लाल बत्ती उत्तेजना के बाद स्पष्ट रूप से लार्वा व्यवहार रिकॉर्ड कर सके। विशेष रूप से, जब 620 एनएम लाल बत्ती optogenetic उत्तेजना के लिए Chrimson के साथ संयोजन में प्रयोग किया जाता है, अवरक्त प्रकाश एल ई डी के कम आधा नकाबपोश होने की जरूरत है, और लाल बत्ती की दिशा अच्छी तरह से नियंत्रित किया जाना चाहिए लार्वा स्पष्ट रूप से छवि. इस बीच, छवि में लाल बत्ती से उत्पन्न शोर संकेतों के मध्यम स्तर पर / संक्षेप में, प्रकाश स्थान परख तेजी से लार्वा प्रकाश परिहार व्यवहार के विस्तृत स्थानिक और लौकिक गुणों की निगरानी और विश्लेषण करने के लिए एक अतिरिक्त विधि प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31671074) और झेजियांग प्रांतीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष (2019X-X003-12) द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED | Thorlabs, USA | PM100A | Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V |
| AC to DC converter | Thorlabs, USA | S120VC | Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm) |
| band-pass filter | Thorlabs, USA | DC2100 | LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary |
| Collimated LED blue light | ELP, China | USBFHD01M | Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710 |
| Compact power meter console | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber |
| High-Power LED Driver | Minhongshi, China | MHS-48XY | Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm |
| high-resolution web camera | Thorlabs, USA | MWWHL4 | Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120? Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group |
| LED Warm White | Mega-9, China | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm |
| Spectrometer | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards. |
| Standard photodiode power sensor | Super Dragon, China | YGY-122000 | Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | S401C | Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5% |
References
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