Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Celle type-specifik genekspression profilering i muse leveren

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Genetics, University of Pennsylvania, 2Department of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Oversættelse af ribosom affinitets rensning (Trap) muliggør hurtig og effektiv isolering af celletype specifik oversættelse af mRNA. Her demonstrerer vi en metode, der kombinerer Hydrodynamisk hale-vene injektion i en musemodel af leveren genindsættelse og fælde for at undersøge udtryks profilen for at genbefolde hepatocytter.

Abstract

Lever genbestand efter skade er et afgørende træk ved pattedyr, som forhindrer umiddelbar organsvigt og død efter eksponering af miljømæssige toksiner. En dybere forståelse af ændringerne i genekspression, der opstår under genpopulation kunne hjælpe med at identificere terapeutiske mål for at fremme genoprettelsen af leverfunktionen i fastsættelsen af skader. Ikke desto mindre, metoder til at isolere specifikt de genbefolgende hepatocytter hæmmes af en mangel på celle markører, begrænsede cellenumre, og skrøbelighed af disse celler. Udviklingen af oversætte ribosom affinitets rensning (Trap) teknologi i forbindelse med Fah-/- musemodel til at rekapitulere genpopulation i fastsættelsen af leverskade tillader genekspression profilering af genbefolkning Hepatocytter. Med TRAP, celletype-specifikke oversætte mRNA er hurtigt og effektivt isoleret. Vi udviklede en metode, der udnytter FÆLDE med affinitets baseret isolering af oversættelse af mRNA fra hepatocytter, der selektivt udtrykker det grønne fluorescerende protein (GFP)-Tagged ribosomale protein (RP), GFP: RPL10A. TRAP omgår den lange tidsperiode, der kræves for fluorescens-aktiveret celle sortering, som kan ændre genekspressions profilen. Desuden, da kun de genbefolkede hepatocytter udtrykker GFP: RPL10A fusion protein, den isolerede mRNA er blottet for kontaminering fra de omgivende skadede hepatocytter og andre celletyper i leveren. Affiniteten-renset mRNA er af høj kvalitet og tillader downstream PCR-eller High-gennemløb sekvensering-baseret analyse af genekspression.

Introduction

Som det vigtigste metaboliske organ i hvirveldyr er leveren ansvarlig for glucosehomøostase, serumprotein syntese, galdesyre sekretion og xenobiotisk metabolisme og afgiftning. Leveren besidder en ekstraordinær evne til at regenerere den skadede parenkym ved udsættelse for toksiner for at forhindre umiddelbar leversvigt1. Men, svigt af regenerering kan forekomme i fastsættelsen af acetaminophen eller alkohol overforbrug, hvilket kan føre til akut leversvigt2. Endvidere, kronisk leverskade forårsaget af viral hepatitis infektion, fedt leversygdom, og steatohepatitis kan forårsage lever fibrose, cirrhose, og hepatocellulære karcinom3. Den eneste tilgængelige helbredende behandling for slutstadiet leversygdom er transplantation, men er begrænset af organmangel, forhindrer effektiv behandling for alle patienter4. En bedre forståelse af nyttiggørelsesprocessen efter giftig leverskade er derfor afgørende for udviklingen af behandlinger til stimulering af regenerering, der er tilstrækkelig til at redde funktionen i det sygdomsramte organ.

Den mest bredt anvendte model system til studiet af lever regenerering er delvis hepatektomi i gnavere, hvor en stor del af leveren er gensendt til at stimulere hurtig hepatocyt ekspansion5. Men, delvis hepatektomi ikke rekapitulere hepatocyt ekspansion efter giftige leverskade på grund af manglen på immuncelle infiltration og hepatocyt celle nekrose ofte observeret i fastsættelsen af akut leverskade hos mennesker6. En mere egnet system til at modellere denne form for organ fornyelse er Fah-/- mus, som mangler funktionelle fumarylacetoacetat hydrolase (Fah) kræves for korrekt tyrosin metabolisme og udvikler alvorlige leverskader fører til døden7. Disse mus kan vedligeholdes i en sund tilstand på ubestemt tid ved behandling med lægemidlet nitisinin i drikkevandet. Alternativt kan FAH-ekspression genoprettes ved transgene levering til en delmængde af hepatocytter, som vil ekspandere for at genbefolke leveren ved nitisinaffjernelse8.

For at profilere genekspression ændringer af genbefolkede hepatocytter, et værktøj til specifikt at isolere replisering hepatocytter i Fah-/- mus uden kontaminering fra de tilstødende skadede hepatocytter og andre celletyper er påkrævet. Desværre, fluorescens-assisteret celle sortering (FACS) af hepatocytter er vanskelig, da (1) skrøbelighed af genbefolker hepatocytter fører til dårlig genopretning efterlever perfusion, (2) replicerende hepatocytter er meget varierende i størrelse, gør isolation af en ren population af FACS vanskeligt, og (3) proceduren tid fra leveren perfusion til RNA isolation er større end 2 h, dermed genekspression profiler kan undergår betydelige kunstige ændringer, før prøverne erhverves9.

Alternativt giver ekspression af epitope-mærkede ribosomer specifikt til genbefolkning af hepatocytter mulighed for hurtig isolering af aktivt at oversætte mRNA bundet af ribosomer ved hjælp af affinitets rensning umiddelbart efter organhøst, med bulk lever vævs lysater. Her beskriver vi en protokol til at udføre oversættelse-ribosome affinitet rensning (TRAP)10 efterfulgt af High-gennemløb RNA-sekventering (Trap-SEQ), til specifikt at isolere og profilere mRNA i genbefolkning hepatocytter i Fah-/- mus9. Coexpression af grønt fluorescerende protein-Tagged ribosomale protein (GFP: RPL10A) med FAH tillader affinitet rensning af oversætte mRNA bundet af polysomer indeholdende GFP: RPL10A. Denne metode undgår enhver celle dissociation trin, såsom leveren perfusion at isolere skrøbelige genbefolgende hepatocytter. I stedet, det udnytter lysis af hele orgel væv og antistoffer til hurtigt at udtrække RNA specifikt fra målcellerne. Endelig giver isolering af rigelig, høj kvalitet mRNA via TRAP-SEQ mulighed for downstream-applikationer såsom sekvensering analyse til at profilere den dynamiske ændring af genekspression under genpopulationsprocessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der involverer brug af mus er i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af IACUC af Penn Office af dyrevelfærd på University of Pennsylvania.

1. klargøring af reagens

  1. Cycloheximide
    1. For at gøre 500 μL af 0,1 g/mL cycloheximid, suspendere 50 mg cycloheximid i 500 μL methanol.
      Forsigtig: Cycloheximid er ekstremt giftigt for miljøet og kan forårsage medfødt misdannelse. Alt affald og buffere, der indeholder cycloheximid, skal indsamles med henblik på korrekt bortskaffelse.
      Bemærk: Cycloheximid kan opbevares ved 4 °C i op til 1 dag. Cycloheximid hæmmer oversættelsen.
  2. Dithiothreitol (DTT)
    1. For at gøre 1 mL af 1 M DTT, suspendere 0,15 g DTT pulver i RNase-fri vand.
      Forsigtig: DTT kan forårsage irritation af hud, øjne og luftveje.
      Bemærk: DTT er et vaskemiddel. DTT kan opbevares ved-20 °C. Det anbefales at opbevare 1 M DTT i engangs-aliquoter på 50 μL.
  3. Deoxycholate (dok)
    1. For at gøre 10% DOC, suspendere 1 g DOC i et 50 mL konisk rør og tilsæt RNase-frit vand op til 10 mL. Rystes kraftigt, indtil pulveret er opløst.
      Bemærk: 10% DOC-opløsningen er svagt gul og kan opbevares ved stuetemperatur (RT) i op til 1 år. DOC bruges til nuklear lyse.
  4. GFP-antistoffer
    1. Aliquot GFP-antistoffer, når de anvendes første gang. Snap Frys aliquoterne og opbevar ved-80 °C.
      Bemærk: Det anbefales at opbevare 50 μg GFP-antistoffer i enkelt-use-aliquoter.
  5. B biotinyleret protein L
    1. Resuspension af biotinyleret protein L i 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS) for at gøre den endelige koncentration 1 μg/μL.
      Bemærk: Ophængt opløsning kan opbevares ved-20 °C i op til 6 måneder.

2. fremstilling af buffer

  1. Bovin serumalbumin (BSA) buffer
    1. For at fremstille 50 mL 3% BSA-buffer tilsættes 1,5 g IgG-og proteasefri BSA-pulver til 40 mL PBS efterfulgt af vortex. Når BSA er opløst, tilsættes PBS til en endelig volumen på 50 mL.
      Bemærk: BSA-bufferen kan opbevares ved 4 °C i op til seks måneder.
  2. Dissektions buffer
    1. For at gøre 50 ml dissektion bufferlager, kombinere 5 ml 10x hank's afbalanceret saltopløsning (hbss), 125 μl af 1 m 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethan sulfonsyre (Hepes), 1.750 μl af 1 m glucose, og 200 μl af 1 m NaHCO3. Tilsæt RNase-frit vand til et endeligt volumen på 50 mL.
      Bemærk: Dissektions stødpudelageret kan opbevares ved 4 °C i op til seks måneder.
    2. Umiddelbart før brug tilsættes 100 μg/mL 0,1 g/mL cycloheximide og opbevares på is.
  3. Høj-salt buffer
    1. For at fremstille 50 mL højsalt bufferlager tilsættes 1 mL 1 M HEPES, 8,75 mL 2 M KCl, 500 μL 1 M MgCl2og 500 μl 100% nonylphenyl polyethylenglycol (tabel over materialer) til RNase frit vand.
      Bemærk: Højsalt stødpudelageret kan opbevares ved 4 °C i op til seks måneder.
    2. Umiddelbart før brug tilsættes 0,5 μL/mL 1 M DTT og 1 μL/mL af 0,1 g/mL cycloheximid. Opbevar den friske High-salt buffer på is.
  4. Lav-salt buffer
    1. For at fremstille 50 mL lavsalt bufferlager tilsættes 1 mL 1 M HEPES, 3,75 mL 2 M KCl, 500 μL 1 M MgCl2og 500 μl 100% nonylphenyl polyethylenglycol til 44,25 ml RNase frit vand.
      Bemærk: Lavsalt stødpudelageret kan opbevares ved 4 °C i op til seks måneder.
    2. Tilsæt 0,5 μL/mL 1 M DTT og 1 μL/mL 0,1 g/mL cycloheximid før brug. Opbevar den friske saltfattig buffer på is.
  5. Vævs lyse buffer
    1. For at gøre 50 mL vævs lyse bufferlager, kombinere 1 mL af 1 M HEPES, 3,75 mL af 2 M KCl, og 500 μL af 1 M MgCl2. Tilsæt RNase-frit vand til en endelig 50 mL.
      Bemærk: Dissektions stødpudelageret kan opbevares ved 4 °C i op til seks måneder.
    2. Tilsæt 1 tablet/10 mL EDTA-fri proteasehæmmer, 1 μL/mL 0,1 g/mL cycloheximid, 10 μL/mL Rnasehæmmere hver umiddelbart før brug. Opbevar den friske vævs lyse buffer på isen.

3. konjugering af antistoffer mod magnetiske perler

  1. Antistoffer
    1. Beregn mængden af GFP-antistoffer, der kræves til alle prøver, og Forbered en ekstra prøve.
      Bemærk: For hver prøve er 50 μg af hvert GFP-antistof påkrævet.
    2. Tø GFP-antistoffer på is og spin ved maksimal hastighed (> 13000 x g) i 10 min ved 4 °c og Overfør supernatanter til et nyt mikrocentrifuge glas.
      Bemærk: Antistof forberedelses trinnet kan udføres før fremstilling af perler, og de optøede antistoffer kan holdes på is. Alternativt kan denne del udføres under inkubation af den magnetiske perle og biotinyleret protein L.
  2. Resuspension af magnetiske perler
    1. Resuspension af magnetiske perler (tabel over materialer) ved blid pipettering.
    2. For hver prøve anvendes 150 μL magnetisk perle. Beregn volumen af magnetisk perle kræves for alle prøver og forberede en ekstra. De resuspenderede magnetiske perler overføres til et 1,5 mL eller 2 mL mikrocentrifuge glas. Hvis der kræves mere end 1 mL til et eksperiment, opdeles det samlede beløb i lige store mængder.
    3. Saml perler på en magnetisk stativ for > 1 min og fjerne supernatanten. Fjern mikrocentrifuge røret fra den magnetiske stander, og tilsæt 1 mL PBS efterfulgt af pipettering op og ned for at vaske perlerne. Saml perler på en magnetisk stativ til > 1 min og fjerne PBS.
  3. Fremstilling af protein L-belagte perler
    1. For hver prøve anvendes 60 μL biotinyleret protein L. Hvis protein L tidligere er opslæmmet og opbevaret ved-20 °C, tø protein L på is. Hvis protein L er resuspenderet før brug, skal du tage det nødvendige beløb til alle prøver og forberede en ekstra.
    2. Tilsæt den beregnede mængde biotinyleret protein L til de opslæmmede og vaskede magnetiske perler. Tilsæt 1x PBS for at gøre den endelige volumen 1 mL ved brug af et 1,5 mL mikrocentrifuge glas eller 1,5 mL ved brug af et 2 mL mikrocentrifuge glas. Inkubér magnetiske perler med biotinyleret protein L i 35 min ved RT på en rørrotator.
      Bemærk: Antistoffer kan tilberedes på dette trin, mens perlerne inkubeerer med biotinyleret protein L.
    3. Saml protein L-belagte perler på en magnetisk stander for > 1 min og Fjern supernatanten. Fjern mikrocentrifuge røret fra den magnetiske stander og tilsæt 1 mL 3% BSA-buffer efterfulgt af blid pipettering i mindst 5 gange for at vaske de protein L-belagte perler.
    4. Saml belagte perler på en magnetisk stander for > 1 min og Fjern supernatanten. Gentag vaske trinene med 3% BSA for yderligere 4 gange (i alt 5 gange).
  4. Antistof binding
    1. Tilsæt den beregnede mængde GFP-antistoffer i de protein L-belagte perler og Inkuber i 1 time ved 4 °C på en rørrotator.
      Bemærk: Efter antistof inkubation, Vær særlig forsigtig med ikke at vortex affiniteten matrix.
    2. Under inkubationen forberedes lav-salt buffer ved at beregne den totale mængde, der kræves til alle prøver, og tilsæt 0,5 μL/mL 1 M DTT og 1 μL/mL 0,1 g/mL cycloheximid til lavsalt bufferlager før brug.
      Bemærk: 3 ml lavsalt buffer til vask af hvert rør af gfp-konjugerede perler og 200 μl/prøve til opblanding af gfp-konjugeret perler er påkrævet. Frisk lavsalt buffer kan holdes på is i et par timer.
    3. Opsaml affinitets matrixen på en magnetisk stander i > 1 min. og Fjern supernatanten. Tilsæt 1 mL lavsalt buffer, og pipér forsigtigt op og ned for at vaske affinitets matrixen. Indsaml affinitets matrixen på en magnetisk stander i > 1 min. og fjern saltfattig buffer. Gentag vaske trinene med lav-salt buffer for yderligere 2 gange (i alt 3 gange).
    4. Resuspender perlerne i lavsalt buffer, så hver prøve har 200 μL affinitets matrix.
      Bemærk: Affinity-matrixen kan lagres i 0,02% NaN3 ved 4 °c i op til 2 uger. Affinitets matrixen skal hurtigt vaskes i saltfattig buffer 3 gange og resuspenderes forsigtigt på en rørrotator ved 4 °C i mindst 10 minutter, hvis affinitets matrixen fremstilles inden for 1 uge eller over natten, hvis affinitets matrixen opbevares i mere end 1 uge. Protokollen kan afbrydes midlertidigt efter dette trin.
      Forsigtig: Natriumazid er ekstremt giftigt for miljøet. Kontakt med syrer producerer giftig gas. Alt affald skal opsamles med henblik på korrekt bortskaffelse.

4. lever vævs lyse

  1. Opsætning af buffer klargøring og udstyr
    1. Beregn antallet af påkrævede mikrocentrifuge slanger, Mærk og chill på isen.
      Bemærk: Normalt er der behov for syv 1,5 mL mikrocentrifuge glas til hver prøve: 1 for den resterende dissekerede lever, 4 for 4 mL homogeniseret leverlyat og 2 for overførsel af supernatanter.
    2. Forbered frisk dissektions buffer ved at beregne den totale mængde, der kræves til alle prøver, og tilsæt 1 μL/mL 0,1 g/mL cycloheximide. Placer den friske dissektions buffer på isen for at holde den kold i hele eksperimentet.
      Bemærk: For hver prøve skal der anvendes 10 mL dissektions buffer.
    3. Forbered frisk lyse buffer ved at beregne den totale mængde, der kræves til alle prøver, og tilsæt 1 tablet/10 mL EDTA-fri proteasehæmmer, 1 μL/mL 0,1 g/mL cycloheximid og 10 μL/mL Rnasehæmmere hver. Opbevar lysis-bufferen på isen under hele forsøget.
      Bemærk: For hver prøve skal der anvendes 4 mL lysisbuffer.
    4. Indstil vævs kværnen (tabel over materialer), så polytetrafluorethylen (PTFE)-glasrør kan placeres på is under homogenisering af lever stykker. Sæt 4 mL kold lyse buffer i PTFE-glas rørene.
  2. Genbefoldelse af lever homogenisering
    1. Euthanize en 8 − 12-ugers gamle Fah-/- mus injiceres med fælden vektor og genbefolket i 1 − 4 uger med anæstesi og livmoderhals dislokation i henhold til godkendte dyreeksperimentelle retningslinjer.
    2. Placer musen på en dissektion bord og spray maven med 70% ethanol. Telt huden og bughinden lavt i maven ved hjælp af pincet og bruge en saks til at lave en tværgående snit. Fortsæt med at skære med saksen for at lave en bred U-formet peritonealdialyse flap, med omhu for ikke at skære Viscera. Vend den peritoneale flap over brystbenet for at udsætte leveren.
    3. Fjern forsigtigt leveren ved hjælp af fine saks og pincet og hurtigt placere vævet i kold dissektion buffer til at skylle. For at homogenisere frosset væv, hurtigt flytte den ønskede mængde af leveren væv i PTFE-glas rør med kold lyse buffer uden optøning af vævet.
      Bemærk: Det dissekeret væv kan opfryses og opbevares ved-80 °c, efter at det er vasket med dissektion buffer. Protokollen kan afbrydes midlertidigt efter dette trin.
    4. Afvejes leveren på en Petri skål og isoleres 200 − 500 mg lever stykker og flyttes ind i PTFE-glas rørene. Placer det resterende levervæv i et præ-kølet mikrocentrifuge glas og flash fryse.
    5. Prøverne homogeniseres i en motordreven homogenisator startende ved 300 RPM for at dissociere hepatocytter fra lever strukturen i mindst 5 slagtilfælde. Sænk glasrøret hver gang, men pas på ikke at lade Pestle stige over opløsningen for at forhindre beluftning, der kan forårsage proteindenaturering.
    6. Løft hastigheden til 900 rpm for fuldt homogeniserer leveren væv i mindst 12 fulde slagtilfælde.
    7. Lysatet overføres til de mærkede og forkølede rør med højst 1 mL lysat pr. 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Hvis der anvendes 4 mL lysis-buffer, skal du holde 1 slange og blitz fastfryse de resterende 3 rør.
      Bemærk: Lysaterne kan holdes på is i op til 1 time, mens man dissekerer det næste dyr og forbereder friske lysater. Den homogeniserede lever kan blinke frosset efterlyse trinnet og opbevares ved-80 °C. Der kan være et fald på 50% i isoleret RNA, hvis der anvendes frosne lysater. Protokollen kan afbrydes midlertidigt efter dette trin.
  3. Nuklear lyse
    1. Lever lysningen centrifugeres ved 2.000 x g ved 4 °c i 10 min., og supernatanten overføres til et nyt, forkølet mikrocentrifuge glas på is.
    2. Tilsæt 1/9 af supernatanten volumenet på 10% nonylphenyl polyethylenglycol for at gøre den endelige koncentration 1% nonylphenyl polyethylenglycol og blandes ved forsigtigt at invertere mikrocentrifuge rørene.
    3. Spin hurtigt mikrocentrifuge rørene og tilsæt 1/9 af prøvevolumenet på 10% DOC for at gøre den endelige koncentration 1% DOC og blandes ved forsigtigt at invertere mikrocentrifuge rørene. Drej hurtigt mikrocentrifuge rørene og Inkuber på is i 5 minutter.
    4. Det nukleare lysstof centrifugeres ved 20.000 x g ved 4 °c i 10 min., og supernatanten overføres til et nyt, forkølet mikrocentrifuge glas på is.
      Bemærk: Den mitokondria-depleterede supernatanten kan placeres på is i et par timer, mens de resterende prøver bliver indsamlet.

5. immunopræcipitation

  1. For hvert rør, tage 1% af den samlede volumen af supernatanten som en præ-immunoprecipitation kontrol for at sammenligne målberigelse efter inkubation med affiniteten matrix. Før immunopræcipitation kontrol på en rørrotator ved 4 °C natten over, på samme måde som de immunopræcipiterede prøver behandles.
  2. Tilsæt 200 μL affinitets matrix til hver prøve. Vær ekstra forsigtig med at resuspendere perlerne ved blid pipettering, før du tilføjer affinitets matrixen til hver prøve. Der inkubaterer lysaterne med affinitets matrix ved 4 °C natten over med blid blanding på en rørrotator.
    Bemærk: Protokollen kan sættes på pause i op til en dag efter dette trin.

6. RNA-isolation

  1. Opsætning af buffer klargøring og udstyr
    1. Anbring det magnetiske rack ved 4 °C i mindst 30 minutter for at forslappe og holde stativet på is under hele eksperimentet.
    2. Der skal beregnes et antal mikrocentrifugerør og præ-chill på is eller ved 4 °C.
      Bemærk: Normalt kræver hver prøve 1 mikrocentrifuge glas til det endelige rensede RNA.
    3. Drej hurtigt rørene ned fra trin 5,2 og Saml perlerne ved at anbringe den på magnet stativet i mindst 1 min. Saml eller kassér supernatanten i yderligere mikrocentrifuge glas.
      Bemærk: Den indsamlede supernatanten, der indeholder ubundet fraktion, kan opfryses og opbevares ved-80 °C for at sammenligne med den bundne fraktion for transkriptionsberigelse efter rensning. Protokollen kan afbrydes midlertidigt efter dette trin.
    4. Forbered højsalt buffer ved at tilsætte 0,5 μL/mL 1 M DTT og 1 μL/mL 0,1 g/mL cycloheximid til højsalt bufferlager.
      Bemærk: For hver prøve skal der anvendes 5 mL højsalt buffer.
  2. RNA-isolation
    1. Tilsæt 1 mL frisk højsalt buffer til hvert rør efterfulgt af blid pipettering i mindst 5 gange uden at introducere bobler.
      Bemærk: Utilstrækkelig vask kunne introducere baggrunde af ubundne udskrifter, mens indførelsen af bobler kunne accelerere RNA nedbrydning.
    2. Saml perler på en magnetisk stativ for > 1 min og fjerne supernatanten. Gentag vaske trinene med høj-salt buffer for yderligere 4 gange (i alt 5 gange).
    3. Fjern den resterende højsalt buffer, og fjern mikrocentrifuge rørene fra den magnetiske stander og Placer på RT i 5 minutter for at varme op.
    4. Perlerne opslæmmes i 100 μL lysis-buffer (leveres i RNA-isolations sættet) med β-mercaptoethanol.
      Bemærk: Ethvert RNA-Isolations-og rensningsudstyr, der indeholder denaturerende guanidin thiocyanat, kan bruges som en lyse buffer til frigivelse af bundet RNA fra affinitets matrixen. RNA-ekstraktion skal behandles ved RT, da guanidin thiocyanat kan krystallisere ved lave temperaturer.
    5. Vortex perlerne og bufferen i mindst 5 s ved den højeste hastighed, drej hurtigt ned for at samle bufferen på siden af mikrocentrifuge røret og Inkuber perlerne med bufferen ved RT i 10 min for at frigøre det perle bundne RNA i lysis-bufferen.
    6. Saml perler på en magnetisk stativ til > 1 min og indsamle supernatanten at fortsætte straks til RNA oprydning i henhold til RNA oprensnings protokol som angivet i sættet (tabel over materialer).
      Bemærk: Supernatanten indeholdende det elueret RNA i lysis buffer kan også opbevares ved-80 °c i op til 1 måned før oprydning ved opvarmning op til rt ved optøning.
    7. For at opnå maksimal kvalitet af det isolerede RNA skal du udføre alle valgfrie trin, herunder DNase-fordøjelse og alle RNA-elueringstrin. Opvarme elueringsbufferen fra RNA-isolations sættet eller det RNase-frie vand til 60 °C for maksimal RNA-genvinding.
      Bemærk: Det isolerede RNA kan opbevares ved-20 °C i op til 1 måned eller-80 °C i flere år. Protokollen kan afbrydes midlertidigt efter dette trin.

7. valgfri RNA-kvalitetsanalyse (anbefales)

  1. Vurder RNA-kvaliteten ved hjælp af en bibilioteker11 og mængde med et spektrofotometer12 for at afgøre, om det er nødvendigt at gentage chromatinimmunpræcipitation processen for at opnå rigelig og høj kvalitet RNA.
    Bemærk: Den optimale RNA-kvalitet til sekvensering med høj gennemløb bør følge de protokoller, der er angivet af Biblioteks forberedelses kits og sekvensering af platforme.

8. downstream-ansøgninger

Bemærk: Total RNA isoleret af TRAP-protokollen kan anvendes i en række standard downstream-applikationer, herunder RNA-SEQ (TRAP-SEQ). Standard reverse transskription og kvantitative PCR protokoller kan også bruges efter FÆLDE.

  1. I FÆLDE-SEQ udføres RNA-SEQ-bibliotekets forberedelse i henhold til standardmetoderne13.
  2. For RNA-SEQ, forberede cDNA sekvensering biblioteker ved hjælp af kommercielle RNA-SEQ kits med oligo d (T)-baseret berigelse af polyadenylerede poly (A) udskrifter. Alternativt, hvis den samlede RNA-kvalitet er lavere end anbefalet til poly (A) berigelse, brug rRNA depletering moduler. Men Forvent at se mere rRNA justering efter sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at profilere genekspression i at genbefolde hepatocytter af Fah-/- musen, gfp: Rpl10a fusion og Fah Trans Genes er co-leveret inden for en Trans-holdige plasmid8 (fælde vektor) til lever ved Hydrodynamisk injektion (figur 1A). Fjernelsen af nitisinan inducerer en giftig leverskade, der skaber et selektions Tryk for hepatocytter stabilt at udtrykke Fah at genbefolke den skadede parenkym9. Immunofluorescens farvning bekræfter Co-ekspression af FAH og GFP: RPL10A fusion protein i genbefolgende hepatocytter efter to ugers lever genbestand (figur 1B).

I det følgende repræsentative eksperiment blev Trap-SEQ udført ved hjælp af latent og genbefolserende mus hepatocytter. For det første, for at opnå gfp-mærkede ribosomer fra latent hepatocytter, blev transgene RosaLSL-gfp-L10A- mus injiceret med AAV8-TBG-CRE 7 dage før offer for at inducere gfp: RPL10A udtryk i alle hepatocytter14. Vi har også behandlet en lever prøve indsamlet fra en vildtype mus som en negativ kontrol for at sikre isolering af oversættelsen mRNA var specifik, hvilket betyder RNA kun kunne udvindes fra mus, der udtrykker GFP: RPL10A. Koncentrationen af isoleret RNA korreleret med antallet af celler, der udtrykker fusions proteinet, med den lysende prøve, der giver det højeste udbytte, da alle hepatocytter udtrykker GFP: RPL10A efter AAV8-TBG-CRE injektion (figur 2A). Omvendt, næppe nogen RNA var detekterbare i vildtype Kontroller, der ikke har GFP: RPL10A transgene, angiver FÆLDEN procedure er meget specifik og har en lav baggrund. Når TRAP blev brugt på levervæv, der gennemgik genpopulation med GFP: RPL10A-transduced hepatocytter, rigelige, høj kvalitet RNA blev opnået (figur 2B). I modsætning hertil blev der ikke påvist RNA-spor via bibilioteker for den negative kontrolprøve.

Downstream-analyse af genekspression kan gennemføres via omvendt transskription og kvantitativ PCR eller RNA på TRAP-isoleret RNA. Gsta1 koder glutathion S-transferase, der spiller en vigtig rolle for metabolismen af glutathion, den vigtigste afgiftende peptid til at beskytte leveren mod oxidativ stress skader15. Gsta1 udtryk er induceret af over 10-fold i genbefolserende hepatocytter i forhold til latent hepatocytter, mens ingen tærskel cyklus (CT) værdi blev detekteret med Trap-isolerede RNA fra Wild type mus på grund af manglende input RNA (figur 3 A). Bemærk, at RNA-kvaliteten i høj grad kan påvirke genekspressions analysen. I tilfælde af RNA-SEQ-eksperimenter skal der foretages en vurdering af RNA-kvaliteten i overensstemmelse med anbefalingerne fra Biblioteks forberedelses sættet og sekvensplatformen (figur 3B). En bioanalysator bruges ofte til at bestemme RNA-integritets nummeret (RIN), med en høj RIN, der relaterer til en højere hastighed af mRNA-justeringer til genomet (figur 3B, venstre), hvorimod en lavere Rin, som fører til en højere frekvens af ribosomale læsninger, hvilket indikerer nedbrydning af mRNA (figur 3B, højre). Figur 3 C, D viser, at fælden kan identificere differens genekspression i latent og genbefolserende hepatocytter. For eksempel er Alb -ekspression hæmmet, og AFP -udtryk er upregulated under lever genpopulation, hvilket afspejler, at de replikrerende hepatocytter antager en mindre differentieret tilstand for at hæmme lever metaboliske funktioner under genbestand9,16.

Figure 1
Figur 1: gennemførelse af Trap med Fah-/- profil genekspression ændring af genbefolgende hepatocytter. (A) skematisk at udtrykke gfp: RPL10A fusion protein med Fah i Sleeping Beauty gennemførelse system efterfulgt af injektion i Fah-/- mus. Grønne sekskanter indikerer genbefolgende hepatocytter med stabilt udtryk af Fah og gfp: RPL10A, hvorimod sorte sekskanter repræsenterer sårede, døende hepatocytter. (B) repræsentativ immunofluorescens farvning demonstrerer coexpression af gfp-Tagged ribosomale protein L10A (grøn) og Fah (rød) i de genbefolkede hepatocytter. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Trap tillader celletype-specifik isolering af høj kvalitet RNA. A) UDBYTTET af RNA er positivt korreleret med antallet af hepatocytter, der udtrykker gfp: RPL10A. Den lave udbytte af RNA fra en vildtype mus demonstrerer specificiteten af FÆLDE fra kilder uden udtryk for GFP: RPL10A. B) bioanalysator spor af totalt RNA isoleret fra genbefolkning af lever, som udtrykker gfp: RPL10A og fra vilde type lever viser sædens specificitet. Total RNA isoleret fra vildtype levervæv blottet for GFP: RPL10A transgene viser, at minimal RNA er blevet indsamlet, hvorimod transgen-ekspression væv giver rigelig høj kvalitet RNA. Bemærk, at ribosomale RNA-toppe er til stede efter en vellykket FÆLDE10. FU, fluorescens enhed. RIN, RNA-integritets nummer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Trap-isoleret RNA kan anvendes til downstream-analyse af genekspression. (A) repræsentativ reverse transskription og kvantitative PCR resultater af Gsta1 i latent og genbefolserende hepatocytter. Der blev ikke detekteret CT-værdi med RNA isoleret fra vildtlevende dyr. (B) justering analyse af isolerede RNA efter high-gennemløb sekvensering, viser betydningen af bestemmelse af RNA integritet efter isolation. Høj kvalitet RNA resulterer i en højere procentdel af mRNA læser (grøn), mens lav kvalitet RNA fører til en langt højere procentdel af ribosom læser (rød), da de fleste mRNA er forringet. RIN, RNA-integritets nummer. (C,D) Integrativ Genomics Viewer (igv) spor af RNA-SEQ-læsninger af mRNA affinitet-renset fra latent og genbefolserende hepatocytter på (C) Alb og (D) AFP loci. Bemærk, at 3 ' Read bias er typisk for en poly (A) udvælgelse pipeline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TRAP-SEQ er en teknik til celletype-specifik isolering af oversætte mRNA via epitope-mærkede ribosomer og præsenterer et alternativ til FACS tilgange, da det omgår begrænsninger såsom tids krav af FACS9. I stedet, FÆLDE tillader hurtig og effektiv isolering af RNA direkte fra bulk væv, hjælpe med at undgå eventuelle ændringer i genekspression. Trap-SEQ er især velegnet til brug i den genbefolke Fah-/- muselever, da hepatocytter ekspansion efter fjernelse af nitisinis er celle autonom og muliggør genekspressions profilering af undersæt af hepatocyter med integreret Trans. FÆLDE vektoren kan også udtrykkes med genaktiverings-eller-lyddæmpnings molekyler17, herunder cDNA, kort hårnål RNA og guide RNA, for at studere virkningerne på det globale genekspression af aktivering eller hæmning af et bestemt gen. Alternativt giver den transgene RosaLSL-GFP-L10A- mus mulighed for at profilere genekspression i enhver celle med CRE rekombinaseaktivitet. Da GFP: RPL10A kan udtrykkes specifikt i alle celler, der udtrykker CRE, kan rollen af andre celletyper i leveren under leverskade og genpopulation undersøgt. For eksempel, krydse CK19-CRE mus med fælden Transgene mus kunne bruges til at udtrykke gfp: RPL10A i cholangiocytter efterfulgt af Trap-SEQ at studere ændringen af genekspression i galde epitelet under genindsættelse proces.

For at sikre nøjagtig profilering af genekspression er det afgørende at forberede alle buffere og affinitets matrixen før vævs dissektion. Alle trin skal udføres på is med kolde buffere, medmindre andet er angivet for at sikre polysome stabilisering10 og forhindre RNA nedbrydning. Alle buffere skal tilberedes med RNase-frie reagenser, og TRAP-SEQ-protokollen bør udføres i et RNase frit miljø for at forhindre RNA-nedbrydning og lavt udbytte af immunopræcipiteret RNA. Affiniteten matrix kan tilberedes op til 2 uger før brug med blid opblanding på en tube rotator natten over. Der bør udvises særlig omhu for ikke kraftigt at ryste matrixen for at forhindre forstyrrelse af de antistof konjugerede, protein L-belagte magnetiske perler. Metoderne til klargøring af affinitets matrixen omfatter konjugation af magnetiske perler til biotinyleret protein L efterfulgt af inkubation med anti-GFP-antistoffer. Dog kan kommercielt tilgængelige protein A/G magnetiske perler erstattes; Spring det indledende bøjnings trin over, og gå direkte til antistof binding, hvis det bruges. Endvidere, alternative epitop Tags er formentlig muligt med ovenstående protokol med passende modifikation.

Der er forskellige punkter, hvor RNA isolation og rensning trin kan sættes på pause (se protokollen ovenfor). Men, når leverprøver er blevet høstet, fortsætter til chromatinimmunpræcipitation anbefales, da udbyttet af isolerede RNA kunne falde med ~ 50% med frysning på dette trin10. Væv skal hurtigt skylles med dissektion buffer, der indeholder cycloheximid til at hæmme mRNA oversættelse. Utilstrækkelig vævs lyse kan også bidrage til lavt RNA-udbytte. Det er afgørende at homogenisere væv på is, indtil ingen væv bidder er synlige med motor homogenisator samtidig sikre minimal beluftning10. Derudover er tilstrækkelig vask med højsalt buffer afgørende for at sikre fjernelse af uspecifik binding af ribosomale proteiner til affinitets matrixen. Herunder en vildtype negativ kontrol hjælper med at vurdere specificiteten af chromatinimmunpræcipitation og effektiviteten af vask trin. Derudover, ved hjælp af en kommerciel RNA rensning kit, der omfatter RNase-fri DNase behandling vil øge RNA renhed.

Desuden anbefales det at kontrollere udtryk og overflod af GFP: RPL10A fusion protein og vurdere mængden af væv, der kræves for at opnå rigelig RNA til downstream-analyse. Vævs sektioner eller lysater kan anvendes til immuno-baserede detekteringsmetoder til validering af udtrykket gfp: RPL10A. Mængden af RNA isoleret kan variere ved: (1) antallet af celler, som udtrykker gfp: RPL10A, (2) ekspressions niveauet for transgenet og (3) størrelsen og Ploidi af cellerne, som udtrykker transgenet. Et piloteksperiment med halv-og dobbelt så stor mængde af den anbefalede mængde væv kan være nyttigt til bestemmelse af det optimale indgangs lysværk til TRAP-SEQ. I vores hænder, vi kunne få ~ 150 ng af RNA med så lidt som 1-2% af hepatocytter udtrykker gfp: RPL10A fra 200 mg af den genbefolkning Fah-/- leveren, der repræsenterer ~ 2 x 105 polyploide hepatocytter med transgen Expression9.

TRAP-SEQ-metodologien isolerer ribosome-bundet mRNA for at profilere en celles omregning af mRNA-puljen. Den resulterende sekvens aflæsninger svarer derfor til» translatome «i stedet for transkriptomet. Bemærk, at oversættelse af ribosom-fodspor ikke vil blive indsamlet, da Trap udføres på indfødte snarere end tvær tilknyttede komplekser. Hvis der ønskes fodaftryk-analyser, bør ovenstående protokol ændres med relevant tværbinding efterfulgt af metoder til immun opcipitation (Clip)18. En anden begrænsning af FÆLDEN er kravet om et tilstrækkeligt antal celler, der udtrykker GFP: RPL10A fusion protein. For forsøg, hvor celle typen af interesse er lille, kan det være nødvendigt at kombinere flere biologiske prøver for at isolere tilstrækkeligt RNA til at muliggøre RNA-SEQ19. Endvidere, TRAP-SEQ kræver tilstedeværelsen af GFP: RPL10A i celle typen af interesse. Dette kan udgøre en udfordring, hvis der ikke er noget specifikt leveringssystem til cellerne, eller hvis en celletype specifik promotor til at drive CRE-udtryk ikke er tilgængelig.

Den nylige udvikling af encellet RNA-SEQ (scRNA-SEQ)-teknologi har givet mulighed for direkte sekvensering efterfulgt af i silico -identifikation af forskellige celletyper, hvilket muliggør sekvensering uden sortering for specifikke celletyper af interesser20 ,21,22. Imidlertid kræver scRNA-SEQ stadig dissociation af celler fra organet. I tilfælde af Fah-/- genindsættelse model, lever perfusion og hepatocyt isolation er yderst vanskeligt og ineffektiv på grund af skrøbelighed af både de sårede og replikanerende hepatocytter. Faktisk har vi endnu ikke været i stand til at isolere tilstrækkelige hepatocytter fra Fah-/- mus undergår genindsættelse efter Hydrodynamisk injektion af Fah Plasmids. Desuden, i den tid det tager at behandle væv, genekspression niveauer kan ændre sig. Protokoller for leveren perfusion tage op til 30 min af varm iskæmi tid. Fremtidige metoder til optimering af lever perfusion for at reducere behandlingstid og øge isolations effektiviteten kan muliggøre scrna-SEQ-integration til Fah-/- musemodel systemet og muligvis til andre skade-og genpopulations modeller. Dette vil også gøre det muligt at studere alle lever celletyper.

Afslutningsvis, integrationen af Trap-SEQ med Fah-/- mus tillader specifikke isolation og genekspression profilering af replikations hepatocytter til at identificere terapeutiske mål, der kan fremme leveren repopulation. Denne metode kan implementeres for at studere andre celletyper i leveren og andre organ systemer til sygdomsspecifik identifikation af genekspressions ændringer for at identificere potentielle stofmål eller biomarkører. En analog teknik kan bruges til at indsamle kerner fra genbefolkning hepatocytter ved hjælp af affinitet rensning, og derefter til at udføre en epigenetisk analyse af disse specifikke celler16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) og P30-DK050306 (pilot Grant til KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
  4. Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
  5. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
  6. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
  7. Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
  8. Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
  9. Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
  10. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  11. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).
  12. NEBNext. NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).
  13. NanoDrop. 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).
  14. Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
  15. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
  16. Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
  17. Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
  18. Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
  19. Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
  20. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
  21. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
  22. Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled? Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).

Tags

Biologi lever regenerering celletype-specifik FÆLDE FÆLDE-SEQ RNA-SEQ immunopræcipitation ekspressions profilering hepatocyte hydrodynamiske hale-vene injektion
Celle type-specifik genekspression profilering i muse leveren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, A. W., Zahm, A. M.,… More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter