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Biology

Profilage de l'expression génique spécifique au type cellulaire dans le foie de souris

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Genetics, University of Pennsylvania, 2Department of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

La traduction de la purification d'affinité de ribosome (TRAP) permet l'isolement rapide et efficace de l'ARNm de traduction de type de cellule-spécifique. Ici, nous démontrons une méthode qui combine l'injection hydrodynamique de queue-veine dans un modèle de souris de repeuplement de foie et de TRAP pour examiner le profil d'expression des hépatocytes repoptant.

Abstract

Le repeuplement du foie après une blessure est une caractéristique cruciale des mammifères qui empêche l'échec immédiat des organes et la mort après l'exposition des toxines environnementales. Une meilleure compréhension des changements dans l'expression des gènes qui se produisent pendant le repeuplement pourrait aider à identifier des cibles thérapeutiques pour favoriser la restauration de la fonction hépatique dans le cadre des blessures. Néanmoins, les méthodes pour isoler spécifiquement les hépatocytes repoptant sont inhibées par un manque de marqueurs cellulaires, un nombre limité de cellules, et la fragilité de ces cellules. Le développement de la technologie de purification d'affinité de ribosome de traduction (TRAP) en conjonction avec le modèle fah-/souris pour récapituler le repeuplement dans le cadre des dommages de foie permet le profilage d'expression de gène du repopulating Hépatocytes. Avec TRAP, l'ARNm de traduction spécifique au type cellulaire est rapidement et efficacement isolé. Nous avons développé une méthode qui utilise TRAP avec l'isolement basé sur l'affinité de traduire l'ARNm des hépatocytes qui expriment sélectivement la protéine fluorescente verte (GFP)-étiquetée protéine ribosomal (RP), GFP:RPL10A. TRAP contourne la longue période de temps nécessaire pour le tri cellulaire activé par la fluorescence qui pourrait changer le profil d'expression génique. En outre, puisque seuls les hépatocytes repopant s'expriment la protéine de fusion GFP:RPL10A, l'ARNm isolé est dépourvu de contamination par les hépatocytes blessés environnants et d'autres types de cellules dans le foie. L'ARNm purifié par affinité est de haute qualité et permet l'analyse en aval du séquençage PCR ou à haut débit de l'expression génique.

Introduction

En tant qu'organe métabolique principal chez les vertébrés, le foie est responsable de l'homéostasie du glucose, de la synthèse des protéines du sérum, de la sécrétion d'acide biliaire et du métabolisme et de la désintoxication xénobiotiques. Le foie possède une capacité extraordinaire de régénérer le parenchyme blessé lors de l'exposition aux toxines pour prévenir l'insuffisance hépatique immédiate1. Cependant, l'échec de la régénération peut se produire dans le cadre de l'acétaminophène ou la surconsommation d'alcool, qui peut conduire à une insuffisance hépatique aigue2. En outre, les dommages chroniques de foie provoqués par l'infection virale d'hépatite, la maladie de foie gras, et la stéatohépatite peuvent causer la fibrose de foie, la cirrhose, et le carcinome hépatocellulaire3. Le seul traitement curatif disponible pour la maladie hépatique en phase terminale est la transplantation, mais est limité par la pénurie d'organes, empêchant un traitement efficace pour tous les patients4. Une meilleure compréhension du processus de récupération après des lésions hépatiques toxiques est donc cruciale pour le développement de traitements visant à stimuler la régénération suffisante pour sauver la fonction dans l'organe malade.

Le système modèle le plus largement appliqué pour l'étude de la régénération du foie est l'hépatectomie partielle chez les rongeurs, dans laquelle une grande proportion du foie est réséquée pour stimuler l'expansion rapide des hépatocytes5. Cependant, l'hépatectomy partiel ne récapitule pas l'expansion d'hépatocyte suivant des dommages toxiques de foie dus au manque d'infiltration de cellules immunitaires et de nécrose de cellules d'hépatocyte souvent observées dans l'arrangement des dommages aigus de foie chez les humains6. Un système plus approprié pour modéliser cette forme de renouvellement d'organe est le Fah-/- souris, qui manque d'hydrolase fonctionnel de fumarylacetoacetate (FAH) exigé pour le métabolisme approprié de tyrosine et développe des dommages graves de foie menant à la mort7. Ces souris peuvent être maintenues dans un état sain indéfiniment par le traitement avec la nitisinone de drogue dans l'eau potable. Alternativement, l'expression de FAH peut être reconstituée par la livraison de transgène à un sous-ensemble d'hépatocytes, qui se développera pour repeupler le foie sur l'enlèvement de nitisinone8.

Pour profiler les changements d'expression génique des hépatocytes repoptant, un outil pour isoler spécifiquement les hépatocytes répliférants dans le Fah-/- souris sans contamination des hépatocytes blessés voisins et d'autres types de cellules est nécessaire. Malheureusement, le tri des cellules assistées par fluorescence (FACS) des hépatocytes est difficile puisque (1) la fragilité des hépatocytes repeuplent conduit à une mauvaise récupération après la perfusion du foie, (2) la reproduction des hépatocytes sont très variables en taille, ce qui rend l'isolement d'une population pure par FACS difficile, et (3) le temps de procédure de perfusion de foie à l'isolement d'ARN est plus grand que 2 h, donc les profils d'expression de gène peuvent subir des changements artificiels substantiels avant que des échantillons soient acquis9.

Alternativement, l'expression des ribosomes épitope-marqués spécifiquement dans les hépatocytes repoptant permet l'isolement rapide de traduire activement l'ARNm lié par des ribosomes utilisant la purification d'affinité immédiatement après la récolte d'organe, avec le foie en vrac lysates tissulaires. Ici, nous décrivons un protocole pour effectuer la purification d'affinité de traduisme-ribosome (TRAP)10 suivie du séquençage à haut débit d'ARN (TRAP-seq), pour isoler et profiler spécifiquement l'ARNm dans les hépatocytes repoptant dans le Fah-/- souris9. La coexpression de la protéine nerbiomale fluorescente verte (GFP:RPL10A) avec FAH permet la purification d'affinité de traduire l'ARNm lié par des polysomes contenant GFP:RPL10A. Cette méthode évite toute dissociation cellulaire, comme la perfusion du foie pour isoler les hépatocytes repopuantfragiles. Au lieu de cela, il utilise la lyse de tissus d'organes entiers et des anticorps pour extraire rapidement l'ARN spécifiquement des cellules cibles. Enfin, l'isolement de l'ARNm abondant et de haute qualité via TRAP-seq permet aux applications en aval telles que l'analyse de séquençage de profiler le changement dynamique de l'expression des gènes pendant le processus de repeuplement.

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Protocol

Toutes les méthodes qui impliquent l'utilisation de souris sont conformes aux lignes directrices fournies par l'IACUC du Penn Office of Animal Welfare de l'Université de Pennsylvanie.

1. Préparation de réactif

  1. Cycloheximide Cycloheximide
    1. Pour faire 500 oL de cycloheximide de 0,1 g/mL, suspendre 50 mg de cycloheximide dans 500 l de méthanol.
      MISE EN GARDE: Le cycloheximide est extrêmement toxique pour l'environnement et peut causer une malformation congénitale. Tous les déchets et tampons contenant du cycloheximide doivent être collectés pour une élimination appropriée.
      REMARQUE: Le cycloheximide peut être stocké à 4 oC jusqu'à 1 jour. Cycloheximide inhibe la traduction.
  2. Dithiothreitol (TNT)
    1. Pour faire 1 ml de 1 M DTT, suspendre 0,15 g de poudre de TNT dans de l'eau sans RNase.
      MISE EN GARDE: La TNT peut causer une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires.
      REMARQUE: La TNT est un détergent. La TNT peut être stockée à -20 oC. Il est recommandé de stocker 1 M TNT dans des aliquots à usage unique de 50 L.
  3. Deoxycholate (DOC)
    1. Pour faire 10% de DOC, suspendre 1 g de DOC dans un tube conique de 50 ml et ajouter de l'eau sans RNase jusqu'à 10 ml. Agiter vigoureusement jusqu'à ce que la poudre soit dissoute.
      REMARQUE: La solution DOC de 10 % est légèrement jaune et peut être stockée à température ambiante (RT) jusqu'à 1 an. DOC est utilisé pour la lyse nucléaire.
  4. Anticorps GFP
    1. Aliquot GFP anticorps lors de l'utilisation pour la première fois. Congeler les aliquots et les conserver à -80 oC.
      REMARQUE: Il est recommandé de stocker 50 g d'anticorps GFP dans des aliquots à usage unique.
  5. B protéine biotinylated L
    1. Resuspendre la protéine biotinylated L dans 1x saline tamponnée par phosphate (PBS) pour faire la concentration finale de 1 g/L.
      REMARQUE: La solution rechargée peut être stockée à -20 oC jusqu'à 6 mois.

2. Préparation tampon

  1. Albumine de sérum bovin (BSA) tampon
    1. Pour faire 50 ml de tampon BSA de 3 %, ajouter 1,5 g de poudre BSA sans IgG et protéase dans 40 mL de PBS suivi d'un vortex. Après la dissolution du BSA, ajouter du PBS à un volume final de 50 ml.
      REMARQUE: Le tampon BSA peut être stocké à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à six mois.
  2. Tampon de dissection
    1. Pour faire 50 ml de stock tampon de dissection, combiner 5 ml de 10x solution de sel équilibrée de Hank (HBSS), 125 'L de 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES), 1 750 'L de 1 M de glucose, et 200 'L de 1 M NaHCO3. Ajouter de l'eau sans RNase à un volume final de 50 ml.
      REMARQUE: Le stock tampon de dissection peut être stocké à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à six mois.
    2. Immédiatement avant l'utilisation, ajouter 100 g/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL et garder sur la glace.
  3. Tampon à haute teneur en sel
    1. Pour faire 50 ml de stock tampon à haute teneur en sel, ajouter 1 ml de 1 M HEPES, 8,75 ml de 2 M KCl, 500 oL de 1 M MgCl2, et 500 l de 100% nonylphényle polyéthylène glycol (Table of Materials) à l'eau sans RNase.
      REMARQUE: Le stock tampon à haute teneur en sel peut être stocké à 4 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à six mois.
    2. Immédiatement avant l'utilisation, ajouter 0,5 L/mL de 1 M DTT et 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL. Gardez le tampon frais de haute teneur en sel sur la glace.
  4. Tampon à faible teneur en sel
    1. Pour faire 50 ml de stock tampon à faible teneur en sel, ajouter 1 ml de 1 M HEPES, 3,75 ml de 2 M KCl, 500 oL de 1 M MgCl2, et 500 l de 100% nonylphényle polyéthylène glycol à 44,25 Ml d'eau sans RNase.
      REMARQUE: Le stock tampon à faible teneur en sel peut être stocké à 4 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à six mois.
    2. Ajouter 0,5 L/mL de 1 M DTT et 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL avant d'utiliser. Gardez le tampon frais à faible teneur en sel sur la glace.
  5. Tampon de lyse tissulaire
    1. Pour faire 50 ml de stock tampon de lyse tissulaire, mélanger 1 ml de 1 M HEPES, 3,75 ml de 2 M KCl, et 500 oL de 1 M MgCl2. Ajouter de l'eau sans RNase à une finale de 50 ml.
      REMARQUE: Le stock tampon de dissection peut être stocké à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à six mois.
    2. Ajouter 1 comprimé/10 ml d'inhibiteur de la protéase sans EDTA, 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL, 10 l/mL d'inhibiteurs de la NNase chacun immédiatement avant l'utilisation. Gardez le tampon de lyse des tissus frais sur la glace.

3. Conjugaison d'anticorps aux perles magnétiques

  1. Anticorps
    1. Calculez la quantité d'anticorps GFP nécessaires pour tous les échantillons et préparez-vous à un échantillon supplémentaire.
      REMARQUE: Pour chaque échantillon, 50 g de chaque anticorps GFP sont nécessaires.
    2. Décongeler les anticorps GFP sur la glace et tourner à une vitesse maximale (13 000 x g)pendant 10 min à 4 oC et transférer les supernatants dans un nouveau tube de microcentrifugeur.
      REMARQUE: L'étape de préparation des anticorps peut être effectuée avant la préparation des perles et les anticorps décongelés peuvent être conservés sur la glace. Alternativement, cette partie peut être exécutée pendant l'incubation de la perle magnétique et de la protéine biotinylated L.
  2. Resuspendre les perles magnétiques
    1. Resuspendre les perles magnétiques (Table of Materials) par pipetage doux.
    2. Pour chaque échantillon, utilisez 150 ll de perles magnétiques. Calculez le volume de perles magnétiques requis pour tous les échantillons et préparez-en un de plus. Transférer les perles magnétiques resuspensionsuruns à un tube microcentrifuge de 1,5 ml ou 2 ml. Si plus de 1 ml est nécessaire pour une expérience, diviser le montant total en volumes égaux.
    3. Recueillir des perles sur un support magnétique pour 'gt'1 min et enlever le supernatant. Retirez le tube de microcentrifuge du support magnétique et ajoutez 1 ml de PBS suivi d'un tuyauterie de haut en bas pour laver les perles. Recueillir des perles sur un support magnétique pour 'gt;1 min et supprimer PBS.
  3. Préparation de perles enrobées de protéines L
    1. Pour chaque échantillon, utilisez 60 ll de protéine Biotinylated L. Si la protéine L est préalablement remise en suspension et stockée à -20 oC, décongeler la protéine L sur la glace. Si la protéine L est remise en suspension avant l'utilisation, prenez la quantité requise pour tous les échantillons et préparez-en un de plus.
    2. Ajoutez le volume calculé de protéine L biotinylated aux perles magnétiques resuspendues et lavées. Ajouter 1x PBS pour faire le volume final 1 ml si vous utilisez un tube microcentrifuge de 1,5 ml, ou 1,5 ml si vous utilisez un tube microcentrifuge de 2 ml. Incuber des perles magnétiques avec la protéine biotinylated L pendant 35 min à RT sur un rotateur de tube.
      REMARQUE: Les anticorps peuvent être préparés à cette étape pendant que les perles couvent avec la protéine Biotinylated L.
    3. Recueillir des protéines L-enduitde perles sur un support magnétique pour 'gt'1 min et enlever le supernatant. Retirez le tube de microcentrifuge du support magnétique et ajoutez 1 ml de tampon BSA de 3 % suivi d'une pipetilline douce pendant au moins 5 fois pour laver les perles enduites de protéines L.
    4. Recueillir des perles enduites sur un support magnétique pour 'gt;1 min et enlever le supernatant. Répétez les étapes de lavage avec 3% BSA pour un autre 4 fois (un total de 5 fois).
  4. Fixation d'anticorps
    1. Ajouter la quantité calculée d'anticorps GFP dans les perles enrobées de protéines L et incuber pendant 1 h à 4 oC sur un rotateur à tube.
      REMARQUE: Après l'incubation des anticorps, prenez soin de ne pas vortexlant la matrice d'affinité.
    2. Pendant l'incubation, préparer un tampon à faible teneur en sel en calculant le volume total requis pour tous les échantillons et ajouter 0,5 L/mL de 1 M DTT et 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL au stock tampon à faible teneur en sel avant utilisation.
      REMARQUE : 3 ml de tampon à faible teneur en sel pour laver chaque tube de perles conjuguées au GFP et 200 L/échantillon pour la suspension des perles conjuguées au GFP est nécessaire. Un tampon frais à faible teneur en sel peut être conservé sur la glace pendant quelques heures.
    3. Recueillir la matrice d'affinité sur un support magnétique pour 'gt;1 min et enlever le supernatant. Ajouter 1 ml de tampon à faible teneur en sel et pipette doucement de haut en bas pour laver la matrice d'affinité. Recueillir la matrice d'affinité sur un support magnétique pour 'gt;1 min et enlever tampon à faible teneur en sel. Répétez les étapes de lavage avec un tampon à faible teneur en sel pour un autre 2 fois (un total de 3 fois).
    4. Resuspendre les perles dans un tampon à faible teneur en sel afin que chaque échantillon ait 200 ll de matrice d'affinité.
      REMARQUE: La matrice d'affinité peut être stockée dans 0,02% NaN3 à 4 oC pendant jusqu'à 2 semaines. La matrice d'affinité doit être lavée rapidement dans un tampon à faible teneur en sel 3 fois et remise en suspension délicate sur un rotateur de tube à 4 oC pendant au moins 10 min si la matrice d'affinité est préparée dans un délai de 1 semaine ou pendant la nuit si la matrice d'affinité est stockée pendant plus d'une semaine. Le protocole peut être mis en pause après cette étape.
      MISE EN GARDE: L'azide de sodium est extrêmement toxique pour l'environnement. Le contact avec les acides produit des gaz toxiques. Tous les déchets doivent être collectés pour une élimination appropriée.

4. Lyse tissu l'hépatique

  1. Préparation et configuration de l'équipement de tampon
    1. Calculer le nombre de tubes de microcentrifuge requis, étiqueter et refroidir sur la glace.
      REMARQUE: Habituellement, sept tubes microcentrifugeurs de 1,5 ml sont nécessaires pour chaque échantillon : 1 pour le foie disséqué restant, 4 pour 4 ml de lysate homogénéisé du foie et 2 pour le transfert des supernatants.
    2. Préparer un tampon de dissection frais en calculant le volume total requis pour tous les échantillons et ajouter 1 cycloheximide de 0,1 g/mL. Placez le tampon de dissection fraîche sur la glace pour garder au froid tout au long de l'expérience.
      REMARQUE: Pour chaque échantillon, 10 ml de tampon de dissection sont nécessaires.
    3. Préparer un tampon de lyse fraîche en calculant le volume total requis pour tous les échantillons et ajouter 1 comprimé/10 ml d'inhibiteur de la protéase sans EDTA, 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL et 10 'L/mL d'inhibiteurs de la RNase chacun. Gardez le tampon de lyse sur la glace tout au long de l'expérience.
      REMARQUE: Pour chaque échantillon, 4 ml de tampon de lyse sont nécessaires.
    4. Mettre en place le broyeur de tissu (Table of Materials) de sorte que le polytétrafluoroéthylène (PTFE) tubes de verre peut être placé sur la glace lors de l'homogénéisation des morceaux de foie. Mettre 4 ml de tampon de lyse froide dans les tubes de verre PTFE.
  2. Repopulation de l'homogénéisation du foie
    1. Euthanasiez un Fahde 8 à 12 semaines-/- souris injectée avec le vecteur TRAP et repeuplée pendant une ou quatre semaines avec anesthésie et luxation cervicale selon les directives expérimentales animales approuvées.
    2. Placez la souris sur un tableau de dissection et vaporisez l'abdomen avec 70% d'éthanol. Tente zetez la peau et le péritoine bas dans l'abdomen à l'aide de forceps et utilisez des ciseaux pour faire une incision transversale. Continuer à couper avec les ciseaux pour faire un large rabat péritonéal en forme de U, avec soin de ne pas couper les viscères. Retourner le rabat péritonéal sur le sternum pour exposer le foie.
    3. Retirez soigneusement le foie à l'aide de ciseaux et de forceps fins et placez rapidement le tissu dans un tampon de dissection froide pour rincer. Pour homogénéiser les tissus congelés, déplacez rapidement la quantité désirée de tissu hépatique dans des tubes de verre PTFE avec tampon de lyse froide sans dégeler le tissu.
      REMARQUE: Le tissu disséqué peut être congelé au flash et stocké à -80 oC après avoir été lavé avec un tampon de dissection. Le protocole peut être mis en pause après cette étape.
    4. Peser le foie sur un plat Petri et isoler 200 à 500 mg de morceaux de foie et se déplacer dans les tubes de verre PTFE. Placer le tissu hépatique restant dans un tube microcentrifuge préréfrigéré et un gel éclair.
    5. Homogénéiser les échantillons dans un homogénéisateur motorisé à partir de 300 tr/min pour dissocier les hépatocytes de la structure hépatique pendant au moins 5 coups. Abaissez le tube de verre à chaque fois, mais prenez soin de ne pas laisser le pilon s'élever au-dessus de la solution pour prévenir l'aération qui pourrait causer la dénaturation des protéines.
    6. Augmenter la vitesse à 900 tr/min pour homogénéiser complètement les tissus hépatiques pour au moins 12 coups complets.
    7. Transférer le lysate dans les tubes étiquetés et préréfrigérés, avec pas plus de 1 ml de lysate par tubes microcentrifuges de 1,5 ml. Si 4 ml de tampon de lyse est utilisé, garder 1 tube et flash geler les 3 tubes restants.
      REMARQUE: Les lysates peuvent être conservés sur la glace jusqu'à 1 h tout en disséquant le prochain animal et en préparant des lysates frais. Le foie homogénéisé peut être congelé au flash après l'étape de lyse et stocké à -80 oC. Il pourrait y avoir une diminution de 50 % de l'ARN isolé si des lysates congelés sont utilisés. Le protocole peut être mis en pause après cette étape.
  3. Lyse nucléaire
    1. Centrifuger le lysate du foie à 2 000 x g à 4 oC pendant 10 min et transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifuge préréfrigéré sur glace.
    2. Ajouter 1/9 du volume supernatant de 10% de polyéthylène polyéthylène glycol pour faire la concentration finale 1% nonylphényl polyéthylène glycol et mélanger en inversant doucement les tubes microcentrifuge.
    3. Faites rapidement tourner vers le bas les tubes de microcentrifuge et ajoutez 1/9 du volume d'échantillon de 10% DOC pour faire la concentration finale 1% DOC et mélangez en inversant doucement les tubes de microcentrifuge. Faites rapidement tourner les tubes de microcentrifuge et incubez sur la glace pendant 5 min.
    4. Centrifuger le lysate nucléaire à 20 000 x g à 4 oC pendant 10 min et transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifuge préréfrigéré sur glace.
      REMARQUE: Le supernatant appauvri par les mitochondries peut être placé sur la glace pendant quelques heures pendant que les échantillons restants sont prélevés.

5. Immunoprécipitation

  1. Pour chaque tube, éliminer 1 % du volume total du supernatant comme contrôle pré-immunoprécipitation pour comparer l'enrichissement de la cible après l'incubation avec la matrice d'affinité. Placez les contrôles de pré-immunoprécipitation sur un rotateur de tube à 4 oC pendant la nuit, de la même manière que les échantillons immunoprécipités sont traités.
  2. Ajouter 200 l de matrice d'affinité à chaque échantillon. Prenez soin de resuspendre les perles par pipetting douce avant d'ajouter la matrice d'affinité à chaque échantillon. Incuber les lysates avec une matrice d'affinité à 4 oC pendant la nuit avec un mélange doux sur un rotateur de tube.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause jusqu'à un jour après cette étape.

6. Isolation de l'ARN

  1. Préparation et configuration de l'équipement de tampon
    1. Placer la grille magnétique à 4 oC pendant au moins 30 min pour pré-réfrigérer et garder la grille sur la glace tout au long de l'expérience.
    2. Calculer le nombre de tubes de microcentrifugerie requis et pré-refroidir sur la glace ou à 4 oC.
      REMARQUE: Habituellement, chaque échantillon nécessite 1 tube microcentrifugepour l'ARN purifié final.
    3. Faites rapidement tourner les tubes à partir de l'étape 5.2 et collectez les perles en plaçant sur le support magnétique pendant au moins 1 min. Recueillir ou jeter le supernatant dans des tubes microcentrifuge supplémentaires.
      REMARQUE: Le supernatant collecté qui contient une fraction non liée peut être congelé au flash et stocké à -80 oC pour se comparer à la fraction liée pour l'enrichissement de la transcription après la purification. Le protocole peut être mis en pause après cette étape.
    4. Préparer un tampon à haute teneur en sel en ajoutant 0,5 L/mL de 1 M DTT et 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL au stock tampon à haute teneur en sel.
      REMARQUE: Pour chaque échantillon, 5 ml de tampon à haute teneur en sel sont nécessaires.
  2. Isolement de l'ARN
    1. Ajouter 1 ml de tampon frais à haute teneur en sel à chaque tube suivi d'une pipetilisation douce pendant au moins 5 fois sans introduire de bulles.
      REMARQUE: Un lavage insuffisant pourrait introduire des antécédents de transcriptions non liées tandis que l'introduction de bulles pourrait accélérer la dégradation de l'ARN.
    2. Recueillir des perles sur un support magnétique pour 'gt'1 min et enlever le supernatant. Répétez les étapes de lavage avec un tampon à haute teneur en sel pour un autre 4 fois (un total de 5 fois).
    3. Retirer le reste de la mémoire tampon à haute teneur en sel et retirer les tubes de microcentrifuge du support magnétique et placer à RT pendant 5 minutes pour se réchauffer.
    4. Resuspendre les perles dans 100 l de tampon de lyse (fourni dans le kit d'isolement de l'ARN) avec du mercaptoéthanol.
      REMARQUE: Tout kit d'isolement et de purification de l'ARN qui contient la guanidine thiocyanate dénaturante peut être utilisé comme tampon de lyse pour libérer l'ARN lié de la matrice d'affinité. L'extraction de l'ARN doit être traitée à RT puisque la guanidine thiocyanate peut se cristalliser à basse température.
    5. Vortex les perles et tampon pour au moins 5 s à la vitesse la plus élevée, rapidement spin vers le bas pour recueillir le tampon sur le côté du tube microcentrifuge et incuber les perles avec le tampon à RT pendant 10 min pour libérer l'ARN lié à la perle dans le tampon de lyse.
    6. Recueillir des perles sur un support magnétique pour 'gt;1 min et de recueillir le supernatant de procéder immédiatement au nettoyage de l'ARN selon le protocole de purification de l'ARN comme spécifié dans le kit (Tableau des matériaux).
      REMARQUE: Le supernatant contenant l'ARN éluté dans le tampon de lyse peut également être stocké à -80 oC pendant jusqu'à 1 mois avant le nettoyage en réchauffant jusqu'à RT lors de la décongélation.
    7. Pour obtenir la qualité maximale de l'ARN isolé, effectuer toutes les étapes facultatives, y compris la digestion DNase et toutes les étapes d'élution de l'ARN. Chauffez le tampon d'élution fourni par le kit d'isolement de l'ARN ou l'eau sans RNase à 60 oC pour une récupération maximale de l'ARN.
      REMARQUE: L'ARN isolé peut être stocké à -20 oC pendant une durée allant jusqu'à 1 mois ou -80 oC pendant plusieurs années. Le protocole peut être mis en pause après cette étape.

7. Analyse facultative de la qualité de l'ARN (recommandé)

  1. Évaluer la qualité de l'ARN à l'aide d'un bioanalyseur11 et la quantité avec un spectrophotomètre12 pour déterminer si la répétition du processus d'immunoprécipitation est nécessaire pour obtenir un ARN suffisant et de haute qualité.
    REMARQUE: La qualité optimale de l'ARN pour le séquençage à haut débit doit suivre les protocoles spécifiés par les kits de préparation de la bibliothèque et les plates-formes de séquençage.

8. Applications en aval

REMARQUE: L'ARN total isolé par le protocole TRAP peut être utilisé dans un certain nombre d'applications standard en aval, y compris l'ARN-seq (TRAP-seq). La transcription inverse standard et les protocoles PCR quantitatifs peuvent également être utilisés après TRAP.

  1. Pour TRAP-seq, effectuer la préparation de la bibliothèque RNA-seq selon les méthodes standard13.
  2. Pour l'ARN-seq, préparez des bibliothèques de séquençage de cDNA utilisant des kits commerciaux d'ARN-seq avec l'enrichissement d'oligo d(T)-basé des transcriptions polyadenylated poly(A). Alternativement, si la qualité totale de l'ARN est inférieure à celle recommandée pour l'enrichissement en poly(A), utilisez des modules d'épuisement de l'ARNre. Cependant, attendez-vous à voir plus d'alignement de rRNA après le séquençage.

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Representative Results

Pour profiler l'expression des gènes dans les hépatocytes repopuants du Fah-/souris, la fusion Gfp:Rpl10a et les transgènes Fah sont co-livrés dans un plasmide8 contenant des transposons (vecteur TRAP) aux foies par injection hydrodynamique (Figure 1A). L'élimination de la nitisinone induit une lésion hépatique toxique qui crée une pression de sélection pour les hépatocytes exprimant de façon stable FAH pour repeupler le parenchyme blessé9. La coloration de l'immunofluorescence confirme la coexpression de FAH et de la protéine de fusion GFP:RPL10A dans les hépatocytes repopuants après deux semaines de repeuplement du foie (Figure 1B).

Dans l'expérience représentative suivante, TRAP-seq a été exécuté utilisant des hépatocytes de souris quiescents et repoptants. Tout d'abord, pour obtenir des ribosomes marqués GFP à partir d'hépatocytes quiescents, des souris transgéniques RosaLSL-GFP-L10A ont été injectées avec AAV8-TBG-Cre 7 jours avant le sacrifice pour induire l'expression GFP:RPL10A dans tous les hépatocytes14. Nous avons également traité un échantillon de foie prélevé à partir d'une souris de type sauvage comme un contrôle négatif pour assurer l'isolement de la traduction de l'ARNm était spécifique, ce qui signifie que l'ARN ne pouvait être extrait de souris exprimant GFP:RPL10A. La concentration d'ARN isolé était corrélée avec le nombre de cellules exprimant la protéine de fusion, l'échantillon quiescent produisant le rendement le plus élevé puisque tous les hépatocytes expriment GFP:RPL10A après injection aAV8-TBG-Cre (Figure 2A). Inversement, à peine n'importe quel ARN était détectable dans les contrôles de type sauvage qui n'ont pas eu le transgène GFP:RPL10A, indiquant que la procédure TRAP est très spécifique et a un fond bas. Lorsque trap a été utilisé sur le tissu hépatique subissant le repeuplement avec gFP:RPL10A-transduced hépatocytes, abondant, ARN de haute qualité a été obtenu (Figure 2B). En revanche, aucune trace d'ARN n'a été détectée par bioanalyseur pour l'échantillon témoin négatif.

L'analyse d'expression génique en aval peut être effectuée par transcription inversée et PCR quantitatif ou ARN-seq sur l'ARN TRAP-isolé. Gsta1 code le glutathion S-transferase qui joue un rôle important pour le métabolisme du glutathion, le peptide détoxifiant principal pour protéger le foie contre les dommages de stress oxydatif15. L'expression de Gsta1 est induite par plus de 10 fois dans les hépatocytes repeuplés par rapport aux hépatocytes quiescents, tandis qu'aucune valeur de cycle de seuil (Ct) n'a été détectée avec l'ARN TRAP-isolé de la souris sauvage de type dû au manque d'ARN d'entrée(figure 3 A. Notez que la qualité de l'ARN peut avoir un impact considérable sur l'analyse de l'expression génique. Dans le cas des expériences ARN-seq, l'évaluation de la qualité de l'ARN doit être effectuée selon les recommandations de la trousse de préparation de la bibliothèque et de la plate-forme de séquençage (figure 3B). Un bioanalyseur est souvent utilisé pour déterminer le nombre d'intégrité de l'ARN (RIN), avec un RIN élevé corrélé avec un taux plus élevé d'alignements d'ARNm au génome (Figure 3B, à gauche), tandis qu'un RIN inférieur conduisant à un taux plus élevé de lectures ribosomal, indiquant la dégradation de l'ARNm (figure 3B, à droite). Figure 3 C,D démontre que TRAP-seq peut identifier l'expression différentielle de gène dans les hépatocytes quiescent et repoptant. Par exemple, l'expression Alb est inhibée et l'expression afp est régulée pendant le repeuplement du foie, ce qui reflète que les hépatocytes répliférants supposent un état moins différencié pour inhiber les fonctions métaboliques hépatiques pendant repeuplement9,16.

Figure 1
Figure 1 : Mise en œuvre de TRAP avec Fah-/- pour profiler le changement d'expression génique des hépatocytes repoptant. (A) Schématique d'exprimer la protéine de fusion GFP:RPL10A avec FAH dans le système de transposon de la Belle au bois dormant suivie d'une injection dans la sourisFah./- Les hexagones verts indiquent des hépatocytes repopuants avec l'expression stable de FAH et de GFP:RPL10A, tandis que les hexagones noirs représentent les hépatocytes blessés et mourants. (B) La coloration immunofluorescence représentative démontre la coexpression de la protéine ribosomal taguée GFP L10A (vert) et de FAH (rouge) dans les hépatocytes repoptant. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : LE TRAP permet l'isolement par type cellulaire de l'ARN de haute qualité. (A) Le rendement de l'ARN est positivement corrélé avec le nombre d'hépatocytes exprimant GFP:RPL10A. Le faible rendement de l'ARN d'une souris de type sauvage démontre la spécificité de TRAP à partir de sources sans l'expression de GFP:RPL10A. (B) Les traces bio-analyseurs de l'ARN total isolés des foies repoptant exprimant GFP:RPL10A et des foies de type sauvage démontrent la spécificité de TRAP. L'ARN total isolé du tissu hépatique de type sauvage dépourvu du transgène GFP:RPL10A montre que l'ARN minimal a été recueilli, tandis que le tissu transgénique-exprimant fournit l'ARN amplement de haute qualité. Notez que les pics d'ARN ribosomal sont présents suite au succès de TRAP10. FU, unité de fluorescence. RIN, numéro d'intégrité de l'ARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : L'ARN isolé par TRAP peut être utilisé pour l'analyse de l'expression génique en aval. (A) Transcription inverse représentative et résultats quantitatifs de CPR de Gsta1 dans les hépatocytes quiescent et repoptant. Aucune valeur de Ct n'a été détectée avec l'ARN isolé des animaux sauvages de type. (B) Analyse de l'alignement de l'ARN isolé après le séquençage à haut débit, démontrant l'importance de déterminer l'intégrité de l'ARN après l'isolement. L'ARN de haute qualité donne un pourcentage plus élevé de lectures d'ARNm (vert), tandis que l'ARN de faible qualité conduit à un pourcentage beaucoup plus élevé de lectures de ribosome (rouge), comme la plupart des ARNm est dégradé. RIN, numéro d'intégrité de l'ARN. (C,D) Integrative Genomics Viewer (IGV) tracks of RNA-seq reads of mRNA affinity-purified from quiescent and repopulating hepatocytes at the (C) Alb and (D) Afp loci. Notez que le biais de lecture 3' est typique d'un pipeline de sélection poly(A). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

TRAP-seq est une technique pour l'isolement de type cellulaire spécifique de traduire l'ARNm par l'intermédiaire de ribosomes épitope-marqués et présente une alternative aux approches FACS, car il contourne des limitations telles que des exigences de temps de FACS9. Au lieu de cela, TRAP permet l'isolement rapide et efficace de l'ARN directement à partir des tissus en vrac, aidant à éviter toute altération de l'expression des gènes. TRAP-seq est particulièrement bien adapté pour une utilisation dans le foie de Fahrepeuplement -/- souris, car l'expansion des hépatocytes après l'ablation de la nitisinone est autonome cellulaire et permet le profilage de l'expression génique du sous-ensemble des hépatocytes avec intégré Transgènes. Le vecteur TRAP peut également être coexprimé avec des molécules d'activation ou de silençage génique17, y compris l'ADNc, l'ARN à épingles courtes et l'ARN guide, afin d'étudier les effets sur l'expression génétique globale de l'activation ou de l'inhibition d'un gène spécifique. Alternativement, la souris transgénique RosaLSL-GFP-L10A offre la possibilité de profiler l'expression des gènes dans n'importe quelle cellule avec une activité de recombinase Cre. Puisque GFP:RPL10A peut être spécifiquement exprimé dans toutes les cellules qui expriment Cre, le rôle d'autres types de cellules dans le foie pendant des dommages de foie et de repeuplement pourrait être étudié. Par exemple, le croisement de la souris CK19-Cre avec la souris transgénique TRAP pourrait être utilisé pour exprimer GFP:RPL10A dans les cholangiocytes suivis par TRAP-seq pour étudier le changement d'expression génique dans l'épithélium biliaire pendant le processus de repeuplement.

Pour assurer un profilage précis de l'expression des gènes, il est essentiel de préparer tous les tampons et la matrice d'affinité avant la dissection des tissus. Toutes les étapes doivent être effectuées sur la glace avec des tampons froids, sauf indication contraire pour assurer la stabilisation polysome10 et prévenir la dégradation de l'ARN. Tous les tampons doivent être préparés avec des réactifs sans RNase et le protocole TRAP-seq doit être effectué dans un environnement exempt de NNase pour prévenir la dégradation de l'ARN et le faible rendement de l'ARN immunoprécipité. La matrice d'affinité peut être préparée jusqu'à 2 semaines avant l'utilisation avec une légère résuspension sur un rotateur de tube pendant la nuit. Il faut prendre soin de ne pas secouer vigoureusement la matrice afin d'éviter la perturbation des perles magnétiques enduits de protéines L. Les méthodes de préparation de la matrice d'affinité comprennent la conjugaison de perles magnétiques à la protéine Biotinylated L suivie d'incubation avec des anticorps anti-GFP. Cependant, les perles magnétiques de protéine A/G disponibles dans le commerce peuvent être substituées ; s'il est utilisé, sautez l'étape initiale de conjugaison et passez directement à la fixation des anticorps. En outre, d'autres étiquettes d'épitope sont vraisemblablement réalisables avec le protocole ci-dessus avec la modification appropriée.

Il y a différents points dans lesquels l'étape d'isolement et de purification d'ARN peut être mise en pause (voir protocole ci-dessus). Cependant, une fois que les échantillons de foie ont été récoltés, il est recommandé de continuer à immunoprécipitation, car le rendement de l'ARN isolé pourrait chuter de 50 % avec congélation à cette étape10. Les tissus doivent être rapidement rincés avec un tampon de dissection qui contient du cycloheximide pour inhiber la traduction de l'ARNm. Une lyse tissulaire insuffisante pourrait également contribuer à un faible rendement de l'ARN. Il est essentiel d'homogénéiser les tissus sur la glace jusqu'à ce qu'aucun morceau de tissu ne soit visible avec l'homogénéisateur moteur tout en assurant une aération minimale10. En outre, un lavage suffisant avec un tampon à haute teneur en sel est crucial pour assurer l'élimination de la liaison non spécifique des protéines ribosomal à la matrice d'affinité. L'inclusion d'un contrôle négatif de type sauvage permet d'évaluer la spécificité de l'immunoprécipitation et l'efficacité des étapes de lavage. En outre, l'utilisation d'un kit commercial de purification de l'ARN qui comprend le traitement Sans NNase DNase augmentera la pureté de l'ARN.

En outre, il est recommandé de vérifier l'expression et l'abondance de la protéine de fusion GFP:RPL10A et d'évaluer la quantité de tissu nécessaire pour obtenir suffisamment d'ARN pour l'analyse en aval. Des sections ou des lysates de tissu pourraient être employés pour des méthodes immuno-basées de détection pour valider l'expression de GFP:RPL10A. La quantité d'ARN isolé peut varier en : (1) le nombre de cellules exprimant GFP:RPL10A, (2) le niveau d'expression du transgène, et (3) la taille et la ploidy des cellules exprimant le transgène. Une expérience pilote utilisant la moitié et le double de la quantité de tissu recommandée pourrait être utile pour déterminer le lysate d'entrée optimal pour TRAP-seq. Dans nos mains, nous pourrions obtenir 150 ng d'ARN avec aussi peu que 1-2% des hépatocytes exprimant GFP:RPL10A de 200 mg de la repeuplement Fah-/- foie, représentant 2 x 105 hépatocytes polyploïdes avec expression transgène9.

La méthodologie TRAP-seq isole l'ARNm lié au ribosome pour dresser le profil du pool d'ARNm traduisant d'une cellule. Les lectures de séquençage qui en résultent correspondent donc au «translatome» plutôt qu'au transcriptome. Notez que la traduction des empreintes de pas de ribosome ne sera pas collectée, car TRAP est effectuée sur des complexes natifs plutôt que croisés. Si des analyses d'empreinte sont souhaitées, le protocole ci-dessus doit être modifié en appliquant des liens croisés pertinents, suivis des méthodologies d'immunoprécipitation (CLIP)18. Une autre limitation de TRAP est l'exigence d'un nombre suffisant de cellules exprimant la protéine de fusion GFP:RPL10A. Pour les expériences dans lesquelles le type de cellule d'intérêt est petit, la combinaison de plusieurs échantillons biologiques peut être nécessaire pour isoler suffisamment d'ARN pour permettre l'ARN-seq19. En outre, TRAP-seq nécessite la présence de GFP:RPL10A dans le type de cellule d'intérêt. Cela pourrait poser un défi s'il n'y a pas de système de livraison spécifique aux cellules ou si un promoteur spécifique de type cellulaire pour conduire l'expression Cre n'est pas disponible.

Le développement récent de la technologie RNA-seq à cellule unique (scRNA-seq) a permis un séquençage direct suivi d'une identification en silico de divers types de cellules, permettant le séquençage sans tri pour des types de cellules spécifiques d'intérêts20 ,21,22. Cependant, scRNA-seq exige toujours la dissociation des cellules de l'organe. Dans le cas du modèle Fah-/repeuple, la perfusion hépatique et l'isolement des hépatocytes sont extrêmement difficiles et inefficaces en raison de la fragilité des hépatocytes blessés et des hépatocytes reproduisant. En fait, nous n'avons pas encore été en mesure d'isoler suffisamment d'hépatocytes de Fah-/- souris subissant une repeuplement après injection hydrodynamique de plasmides Fah. En outre, dans le temps qu'il faut pour traiter les tissus, les niveaux d'expression des gènes pourraient changer. Les protocoles de perfusion hépatique prennent jusqu'à 30 min de temps d'ischémie chaude. Les futures méthodologies visant à optimiser la perfusion hépatique afin de réduire le temps de traitement et d'accroître l'efficacité de l'isolement pourraient permettre l'intégration du scRNA-seq au système de modèle Fah-/souris et éventuellement à d'autres modèles de blessures et de repeuplement. Cela permettrait également l'étude de tous les types de cellules hépatiques.

En conclusion, l'intégration de TRAP-seq avec le Fah-/- souris permet l'isolement spécifique et le profilage de l'expression génique des hépatocytes de reproduction pour identifier des cibles thérapeutiques qui pourraient favoriser le repeuplement du foie. Cette méthode peut être mise en œuvre pour étudier d'autres types de cellules dans le foie et d'autres systèmes d'organes pour l'identification spécifique de la maladie des changements d'expression génique afin d'identifier les cibles potentielles des médicaments ou des biomarqueurs. Une technique analogue peut être utilisée pour recueillir des noyaux des hépatocytes repoptant en utilisant la purification d'affinité, puis pour effectuer une analyse épigénétique de ces cellules spécifiques16.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), et P30-DK050306 (Subvention pilote à KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

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References

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Biologie Numéro 151 régénération du foie type cellulaire spécifique TRAP TRAP-seq ARN-seq immunoprécipitation profilage d'expression hépatocyte injection hydrodynamique de queue-veine
Profilage de l'expression génique spécifique au type cellulaire dans le foie de souris
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Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

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