Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Cell type-spesifikke Gene Expression profilering i musen Liver

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242

Summary

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) muliggjør rask og effektiv isolering av celle type-spesifikke oversette mRNA. Her viser vi en metode som kombinerer hydrodynamisk hale-blodåre injeksjon i en mus modell av leveren Repopulation og TRAP å undersøke uttrykket profilen til repopulating hepatocytter.

Abstract

Liver Repopulation etter skade er en viktig funksjon av pattedyr som hindrer umiddelbar organ svikt og død etter eksponering av miljøgifter. En dypere forståelse av endringene i genuttrykk som oppstår under Repopulation kan bidra til å identifisere terapeutiske mål for å fremme restaurering av leverfunksjon i innstillingen av skader. Likevel, metoder for å isolere spesielt de repopulating hepatocytter er hemmet av mangel på celle markører, begrenset celle tall, og skjørhet av disse cellene. Utviklingen av oversette ribosom affinitet rensing (Trap) teknologi i forbindelse med Fah-/- Mouse modell for å recapitulate Repopulation i innstillingen av leverskade tillater genuttrykk profilering av repopulating hepatocytter. Med TRAP, celle type-spesifikke oversette mRNA er raskt og effektivt isolert. Vi utviklet en metode som utnytter TRAP med affinitet-baserte isolering av oversette mRNA fra hepatocytter som selektivt uttrykker det grønne fluorescerende proteinet (GFP)-Tagged ribosomal protein (RP), GFP: RPL10A. TRAP omgår den lange tidsperioden som kreves for fluorescens celle sortering som kan endre gen uttrykks profilen. Videre, siden bare repopulating hepatocytter uttrykke GFP: RPL10A Fusion protein, den isolerte mRNA er blottet for forurensning fra omkringliggende skadde hepatocytter og andre celletyper i leveren. Affinitet-renset mRNA er av høy kvalitet og tillater nedstrøms PCR-eller høy-gjennomstrømning sekvensering-basert analyse av genuttrykk.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som de viktigste metabolske organ i virveldyr, leveren er ansvarlig for glukose homeostase, serum proteinsyntese, galle syre sekresjon, og xenobiotic oval metabolisme og avgiftning. Leveren besitter en ekstraordinær evne til å regenerere den skadde parenchyma upon eksponering for giftstoffer for å hindre umiddelbar leversvikt1. Imidlertid kan svikt i regenerering oppstå i innstillingen av paracetamol eller alkohol overforbruk, som kan føre til akutt leversvikt2. Videre, kronisk leverskader forårsaket av viral hepatitt infeksjon, fatty leversykdom, og steatohepatitis kan forårsake leveren fibrose, skrumplever, og leverkreft3. Den eneste tilgjengelige helbredende behandlingen for sluttfasen leversykdom er transplantasjon, men er begrenset av organ mangel, og forhindrer effektiv behandling for alle pasienter4. En bedre forståelse av gjenopprettingsprosessen etter giftig leverskade er derfor avgjørende for utvikling av behandlinger for å stimulere regenerering tilstrekkelig til å redde funksjon i det syke orgelet.

Den mest omfattende anvendt modell system for studiet av leveren gjenfødelse er delvis hepatectomy i gnagere, der en stor andel av leveren er resected å stimulere rask hepatocytter ekspansjon5. Men, delvis hepatectomy ikke recapitulate hepatocytter ekspansjon etter giftig leverskade på grunn av mangel på immun celle infiltrasjon og hepatocytter celle nekrose ofte observert i innstillingen av akutt leverskade hos mennesker6. Et mer egnet system for å modellere denne formen for orgel fornyelse er Fah-/- mus, som mangler funksjonell fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) kreves for riktig tyrosin metabolisme og utvikler alvorlig leverskader fører til død7. Disse musene kan opprettholdes i en sunn tilstand på ubestemt tid ved behandling med stoffet nitisinone i drikkevannet. Alternativt kan FAH uttrykk gjenopprettes ved transgene levering til en undergruppe av hepatocytter, som vil utvide til gjenbefolke leveren ved nitisinone fjerning8.

Å profil genuttrykk endringer av repopulating hepatocytter, et verktøy for å spesifikt isolere replikere hepatocytter i Fah-/- mus uten forurensning fra nabolandet skadde hepatocytter og andre celletyper er nødvendig. Dessverre er fluorescens-assistert celle sortering (FACS) av hepatocytter vanskelig siden (1) skjørhet av repopulating hepatocytter fører til dårlig restitusjon etter leveren, (2) replikere hepatocytter er svært variabel i størrelse, noe som gjør isolasjon av en ren befolkning av FACS vanskelig, og (3) prosedyren tid fra leveren til RNA isolasjon er større enn 2 h, derav genuttrykk profiler kan gjennomgå betydelige kunstige endringer før prøvene er ervervet9.

Alternativt, uttrykk for epitope-merket ribosomer spesielt i repopulating hepatocytter tillater rask isolering av aktivt oversette mRNA bundet av ribosomer ved hjelp av affinitet rensing umiddelbart etter orgel innhøsting, med bulk lever vev lysater. Her beskriver vi en protokoll for å utføre oversette-ribosom affinitet rensing (TRAP)10 etterfulgt av høy gjennomstrømming RNA-SEKVENSERING (Trap-SEQ), til spesielt isolere og profil mRNA i repopulating hepatocytter i Fah-/- mus9. Coexpression av grønne fluorescerende protein-merket ribosomal protein (GFP: RPL10A) med FAH tillater affinitet rensing av oversette mRNA bundet av polysomes som inneholder GFP: RPL10A. Denne metoden unngår alle celle dissosiasjon trinn, for eksempel lever-og repopulating hepatocytter. I stedet utnytter det lyse av hele orgel vev og antistoffer for å raskt trekke ut RNA spesielt fra målet cellene. Til slutt, isolering av rikelig, høy kvalitet mRNA via TRAP-SEQ muliggjør nedstrøms applikasjoner som sekvensering analyse til profilen den dynamiske endringen av genet uttrykk under Repopulation prosessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metoder som involverer bruk av mus er i samsvar med retningslinjene gitt av IACUC av penn Office of Animal Welfare ved University of Pennsylvania.

1. forberedelse av reagens

  1. Cycloheximide
    1. For å gjøre 500 μL av 0,1 g/mL cycloheximide, suspendere 50 mg cycloheximide i 500 μL av metanol.
      Forsiktig: Cycloheximide er ekstremt giftig for miljøet og kan forårsake medfødt misdannelse. Alt avfall og buffere som inneholder cycloheximide skal samles inn for riktig avhending.
      Merk: Cycloheximide kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 1 dag. Cycloheximide hemmer oversettelsen.
  2. Dithiotreitol (DTT)
    1. For å lage 1 mL av 1 M DTT, suspendere 0,15 g av DTT pulver i RNase-fritt vann.
      Forsiktig: DTT kan forårsake irritasjon i hud, øyne og luftveier.
      Merk: DTT er et vaskemiddel. DTT kan oppbevares ved-20 ° c. Det anbefales å lagre 1 M DTT i engangsbruk alikvoter på 50 μL.
  3. Natriumdeoksykolat (DOC)
    1. For å gjøre 10% DOC, suspendere 1 g DOC i et 50 mL konisk rør og tilsett RNase-fritt vann opptil 10 mL. Rist kraftig til pulveret er oppløst.
      Merk: Den 10% DOC-løsningen er litt gul og kan oppbevares ved romtemperatur (RT) i opptil 1 år. DOC brukes for Atom lyse.
  4. GFP antistoffer
    1. Alikvot GFP-antistoffer ved første gangs bruk. Smekk fryse alikvoter og oppbevar ved-80 ° c.
      Merk: Det anbefales å lagre 50 μg av GFP-antistoffer i en gangs alikvoter.
  5. B biotinylated protein L
    1. Resuspend biotinylated protein L i 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) for å gjøre den endelige konsentrasjonen 1 μg/μL.
      Merk: Resuspendert løsning kan oppbevares ved-20 ° c i opptil 6 måneder.

2. buffer forberedelse

  1. Storfe serum albumin (BSA) buffer
    1. For å gjøre 50 mL med 3% BSA-buffer, tilsett 1,5 g av IgG-og protease-fri BSA-pulver i 40 mL PBS etterfulgt av Vortex. Etter at BSA er oppløst, legger du til PBS i et endelig volum på 50 mL.
      Merk: BSA-bufferen kan oppbevares ved 4 ° c i opptil seks måneder.
  2. Disseksjon buffer
    1. For å lage 50 mL disseksjon buffer lager, Kombiner 5 mL 10x Hank ' s balansert saltoppløsning (HBSS), 125 μL av 1 M 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1 750 μL av 1 M glukose, og 200 μL av 1 M NaHCO3. Tilsett RNase vann til et endelig volum på 50 mL.
      Merk: Disseksjon buffer lager kan oppbevares ved 4 ° c i opptil seks måneder.
    2. Legg til 100 μg/mL 0,1 g/mL cycloheximide og hold på isen umiddelbart før bruk.
  3. Høy-salt buffer
    1. For å gjøre 50 mL av høy-salt buffer lager, tilsett 1 mL 1 M HEPES, 8,75 mL 2 M KCl, 500 μL av 1 M MgCl2, og 500 μL av 100% nonylphenyl polyetylen glykol (tabell av materialer) til RNase-fritt vann.
      Merk: Det høye salt buffer lageret kan oppbevares ved 4 ° c i opptil seks måneder.
    2. Legg til 0,5 μL/mL på 1 M DTT og 1 μL/mL 0,1 g/mL cycloheximide umiddelbart før bruk. Hold den friske høy-salt buffer på isen.
  4. Lav salt buffer
    1. For å gjøre 50 mL lav-salt buffer lager, tilsett 1 mL av 1 M HEPES, 3,75 mL 2 M KCl, 500 μL av 1 M MgCl2, og 500 μL av 100% nonylphenyl polyetylen glykol til 44,25 ml RNase-fritt vann.
      Merk: Den lave salt buffer massen kan oppbevares ved 4 ° c i opptil seks måneder.
    2. Tilsett 0,5 μL/mL på 1 M DTT og 1 μL/mL av 0,1 g/mL cycloheximide før bruk. Hold den friske lav-salt buffer på isen.
  5. Vevs lyseringsbuffer
    1. For å lage 50 mL av vev lyseringsbuffer lager, Kombiner 1 mL 1 M HEPES, 3,75 mL 2 M KCl, og 500 μL av 1 M MgCl2. Tilsett RNase-fritt vann til en endelig 50 mL.
      Merk: Disseksjon buffer lager kan oppbevares ved 4 ° c i opptil seks måneder.
    2. Tilsett 1 tablett/10 mL av EDTA-fri protease inhibitor, 1 μL/mL 0,1 g/mL cycloheximide, 10 μL/mL RNase-hemmere hver umiddelbart før bruk. Oppbevar den friske vevs lyseringsbufferen på is.

3. Bøyning av antistoffer mot magnetiske perler

  1. Antistoffer
    1. Beregn mengden av GFP-antistoffer som kreves for alle prøvene og Forbered deg på en ekstra prøve.
      Merk: 50 μg av hvert GFP-antistoff er nødvendig for hver prøve.
    2. Tin GFP antistoffer mot is og snurr ved maksimal hastighet (> 13000 x g) i 10 min ved 4 ° c og Overfør supernatanter til et nytt mikrosentrifugen rør.
      Merk: Antistoff Forberedelses trinn kan utføres før bead forberedelse og tint antistoffer kan holdes på isen. Alternativt kan denne delen utføres under inkubasjons av magnetisk perle og biotinylated protein L.
  2. Resuspend magnetiske perler
    1. Resuspend magnetiske perler (tabell av materialer) ved milde pipettering.
    2. For hver prøve, bruk 150 μL av magnetisk perle. Beregn volumet av magnetiske perle som kreves for alle prøver og forberede en ekstra. Overfør de resuspendert magnetiske perlene til en 1,5 mL eller 2 mL mikrosentrifugen slange. Hvis det kreves mer enn 1 mL for et eksperiment, må du dele totalbeløpet i like volumer.
    3. Samle perler på et magnetisk stativ i > 1 min og fjern supernatanten. Fjern mikrosentrifugen røret fra det magnetiske stativet og tilsett 1 mL PBS etterfulgt av pipettering opp og ned for å vaske perlene. Samle perler på et magnetisk stativ for > 1 min og fjern PBS.
  3. Utarbeidelse av protein L-belagte perler
    1. For hvert utvalg, bruk 60 μL av biotinylated protein L. Hvis protein L er tidligere resuspendert og oppbevares ved-20 ° c, Tin protein L på isen. Hvis protein L er resuspendert før bruk, ta det beløpet som kreves for alle prøver og forberede en ekstra.
    2. Tilsett beregnet volum av biotinylated protein L til resuspendert og vasket magnetiske perler. Legg 1x PBS å gjøre det endelige volumet 1 mL hvis du bruker en 1,5 mL mikrosentrifugen tube, eller 1,5 mL hvis du bruker en 2 mL mikrosentrifugen tube. Ruge magnetiske perler med biotinylated protein L for 35 min på RT på et rør rotator.
      Merk: Antistoffer kan fremstilles på dette trinnet mens perlene er incubating med biotinylated protein L.
    3. Samle protein L-belagte perler på et magnetisk stativ for > 1 min og fjern supernatanten. Fjern mikrosentrifugen røret fra det magnetiske stativet og tilsett 1 mL 3% BSA-buffer etterfulgt av skånsom pipettering i minst 5 ganger for å vaske proteinet L-belagte perler.
    4. Samle belagte perler på et magnetisk stativ i > 1 min og fjern supernatanten. Gjenta vaske trinnene med 3% BSA for ytterligere 4 ganger (totalt 5 ganger).
  4. Antistoff binding
    1. Legg den beregnede mengden av GFP antistoffer inn i proteinet L-belagte perler og ruge for 1 h ved 4 ° c på en tube rotator.
      Merk: Etter antistoff inkubasjons, Vær spesielt forsiktig med å ikke Vortex affinitet matrise.
    2. Under inkubasjons klargjør du lav salt buffer ved å beregne det totale volumet som kreves for alle prøvene, og tilsett 0,5 μL/mL på 1 M DTT og 1 μL/mL 0,1 g/mL cycloheximide til lav-salt buffer lager før bruk.
      Merk: 3 ml lav salt buffer for vasking av hvert rør av GFP-bøyd perler og 200 μL/sample for blanding av GFP-bøyd perler er nødvendig. Fersk lav-salt buffer kan holdes på isen for et par timer.
    3. Samle affinitet matrise på et magnetisk stativ for > 1 min og ta ut supernatanten. Tilsett 1 mL lav-salt buffer og forsiktig pipette opp og ned for å vaske affinitet matrise. Samle affinitet matrise på et magnetisk stativ for > 1 min og fjerne lav-salt buffer. Gjenta vaske trinnene med lav-salt buffer for en annen 2 ganger (totalt 3 ganger).
    4. Resuspend perlene i lav-salt buffer slik at hver prøve har 200 μL av affinitet matrise.
      Merk: Affinitet matrise kan lagres i 0,02% NaN3 ved 4 ° c i opptil 2 uker. Affinitet matrise bør vaskes raskt i lav-salt buffer 3 ganger og resuspendert forsiktig på et rør Rotator ved 4 ° c i minst 10 min hvis affinitet matrise er utarbeidet innen 1 uke eller over natten hvis affinitet matrise er lagret i over 1 uke. Protokollen kan stanses midlertidig etter dette trinnet.
      Forsiktig: Natrium Natriumazid er ekstremt giftig for miljøet. Kontakt med syrer produserer giftig gass. Alt avfall skal samles inn for riktig avhending.

4. leveren tissue lyse

  1. Oppsett av buffer forberedelser og utstyr
    1. Beregn antall mikrosentrifugen rør som kreves, etikett og chill på isen.
      Merk: Vanligvis er syv 1,5 mL mikrosentrifugen rør nødvendig for hvert utvalg: 1 for de resterende dissekert leveren, 4 for 4 mL homogenisert lever lysat, og 2 for overføring av supernatanter.
    2. Forbered frisk disseksjon buffer ved å beregne det totale volumet som kreves for alle prøvene og tilsett 1 μL/mL av 0,1 g/mL cycloheximide. Plasser den friske disseksjon buffer på isen for å holde kulde gjennom hele eksperimentet.
      Merk: For hver prøve kreves 10 mL disseksjon buffer.
    3. Klargjør frisk lyseringsbuffer ved å beregne det totale volumet som kreves for alle prøvene og tilsett 1 tablett/10 mL av EDTA-fri protease inhibitor, 1 μL/mL 0,1 g/mL cycloheximide og 10 μL/mL RNase-hemmere hver. Hold lyseringsbufferen på isen gjennom hele eksperimentet.
      Merk: For hvert utvalg kreves 4 mL lyseringsbuffer.
    4. Sett opp vev jeksel (tabell av materialer) slik at POLYTETRAFLUORETYLEN (PTFE)-glass rør kan plasseres på is under homogenisering av lever brikker. Sett 4 mL kald lyseringsbuffer i PTFE-glass rørene.
  2. Repopulating leveren homogenisering
    1. Euthanize en 8 − 12-ukers-gamle Fah-/- mus injisert med fellen vektor og repopulated for 1 − 4 uker med anestesi og cervical forvridning henhold til godkjente dyr eksperimentelle retningslinjer.
    2. Plasser musen på en disseksjon bord og spray magen med 70% etanol. Tent huden og peritoneum lav i magen ved hjelp av tang og bruke saks for å lage en tverrgående snitt. Fortsett å skjære med saksen for å lage et bredt U-formet bukhulen, med forsiktighet for å ikke kutte innvollene. Vend bukhulen over brystbenet for å eksponere leveren.
    3. Forsiktig fjerne leveren ved hjelp av fin saks og pinsett og raskt plassere vevet i kaldt disseksjon buffer for å skylle. For å homogenisere frosset vev, raskt flytte den ønskede mengden av leveren vev i PTFE-glass rør med kaldt lyseringsbuffer uten å tine vevet.
      Merk: Den dissekert vev kan være flash-frosset og lagres ved-80 ° c etter at den er vasket med disseksjon buffer. Protokollen kan stanses midlertidig etter dette trinnet.
    4. Veie leveren på en Petri parabol og isolere 200 − 500 mg av lever brikker og flytte inn i PTFE-glass rør. Plasser gjenværende leveren vev i en pre-kjølt mikrosentrifugen tube og blits fryse.
    5. Homogenisere prøvene i en motor-drevet homogenisator starter på 300 RPM til distansere hepatocytter fra leveren struktur i minst 5 slag. Senk glassrøret hver gang, men pass på å ikke la morter heve seg over løsningen for å hindre lufting som kan forårsake protein denaturering.
    6. Øke hastigheten til 900 RPM å fullt homogenisere leveren vev i minst 12 fulle slag.
    7. Overfør lysat til de merkede og pre-kjølte rørene, med ikke mer enn 1 mL lysat per 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Hvis 4 mL lyseringsbuffer brukes, må du holde 1 rør og blits fryse de resterende 3 rørene.
      Merk: Lysater kan holdes på is i opptil 1 time mens du dissekere neste dyr og forbereder fersk lysater. Den homogenisert leveren kan blinke frosset etter lyse Rings trinnet og lagres ved-80 ° c. Det kan være 50% reduksjon i isolert RNA hvis frosne lysater brukes. Protokollen kan stanses midlertidig etter dette trinnet.
  3. Kjernefysisk lyse
    1. Sentrifuger leveren lysat ved 2 000 x g ved 4 ° c i 10 min og Overfør supernatanten til et nytt, prechilled mikrosentrifugen rør på is.
    2. Tilsett 1/9 av det supernatanten volumet på 10% nonylphenyl polyetylen-glykol for å gjøre den endelige konsentrasjonen 1% nonylphenyl polyetylen-glykol og bland ved å forsiktig invertere mikrosentrifugen rørene.
    3. Raskt spinne ned mikrosentrifugen rør og legge 1/9 av prøven volumet på 10% DOC å gjøre den endelige konsentrasjonen 1% DOC og bland ved forsiktig invertere mikrosentrifugen tuber. Raskt spinne ned mikrosentrifugen rør og ruge på isen i 5 min.
    4. Sentrifuger Atom lysat ved 20 000 x g ved 4 ° c i 10 min og Overfør supernatanten til et nytt, prechilled mikrosentrifugen rør på is.
      Merk: Den mitokondrier-utarmet supernatanten kan plasseres på isen i et par timer mens de resterende prøvene blir samlet.

5. immunutfelling

  1. For hvert rør, ta ut 1% av det totale volumet av supernatanten som en pre-immunutfelling kontroll for å sammenligne målet berikelse etter inkubasjons med affinitet matrise. Plasser immunutfelling kontroller på en tube Rotator ved 4 ° c over natten, på samme måte som immunoprecipitated prøvene er behandlet.
  2. Legg 200 μL av affinitet matrise til hver prøve. Ta ekstra forsiktighet for å resuspend perlene ved milde pipettering før du legger affinitet matrise til hver prøve. Ruge lysater med affinitet matrise ved 4 ° c over natten med skånsom miksing på en tube rotator.
    Merk: Protokollen kan stanses midlertidig i opptil en dag etter dette trinnet.

6. RNA-isolasjon

  1. Oppsett av buffer forberedelser og utstyr
    1. Plasser magnet stativet ved 4 ° c i minst 30 min for å roe ned og holde stativet på isen gjennom hele eksperimentet.
    2. Beregn antall mikrosentrifugen slanger nødvendig og pre-chill på is eller ved 4 ° c.
      Merk: Vanligvis krever hvert utvalg 1 mikrosentrifugen rør for endelig renset RNA.
    3. Snurr raskt ned rørene fra trinn 5,2 og samle perlene ved å plassere på det magnetiske stativet i minst 1 min. samle eller kast supernatanten i ekstra mikrosentrifugen rør.
      Merk: De innsamlede supernatanten som inneholder ubundne brøk kan blinke og lagres ved-80 ° c for å sammenligne med den bundne fraksjonen for transkripsjon berikelse etter rensing. Protokollen kan stanses midlertidig etter dette trinnet.
    4. Klargjør høy salt buffer ved å tilsette 0,5 μL/mL på 1 M DTT og 1 μL/mL av 0,1 g/mL cycloheximide til høyt salt buffer lager.
      Merk: For hver prøve er 5 mL høy-salt buffer nødvendig.
  2. RNA-isolasjon
    1. Tilsett 1 mL fersk høy-salt buffer til hvert rør etterfulgt av milde pipettering i minst 5 ganger uten å innføre bobler.
      Merk: Utilstrekkelig vasking kunne innføre bakgrunn av ubundne transkripsjoner mens innføringen av bobler kunne akselerere RNA degradering.
    2. Samle perler på et magnetisk stativ i > 1 min og fjern supernatanten. Gjenta vaske trinnene med høy salt buffer for en annen 4 ganger (totalt 5 ganger).
    3. Fjern gjenværende høy-salt buffer og fjerne mikrosentrifugen rør fra det magnetiske stativet og plasser på RT i 5 min for å varme opp.
    4. Resuspend av perlene i 100 μL av lyseringsbuffer (leveres i RNA isolasjons settet) med β-mercaptoethanol.
      Merk: Enhver RNA isolasjon og rensing kit som inneholder denaturant guaniniumtiocyanat ammoniumthiocyanat kan brukes som en lyseringsbuffer for å frigi bundet RNA fra affinitet matrise. RNA-ekstraksjon skal behandles på RT siden guaniniumtiocyanat ammoniumthiocyanat kan utkrystallisere ved lave temperaturer.
    5. Vortex perlene og buffer i minst 5 s ved høyeste hastighet, raskt spinne ned for å samle buffer på siden av mikrosentrifugen røret og ruge perlene med buffer på RT i 10 min for å løsne den perle bundne RNA i lyseringsbufferen.
    6. Samle perler på en magnetisk stativ for > 1 min og samle supernatanten å fortsette umiddelbart til RNA opprydding i henhold til RNA rensing protokollen som angitt i settet (tabell av materialer).
      Merk: Supernatanten som inneholder eluert RNA i lyseringsbuffer, kan også oppbevares ved-80 ° c i opptil 1 måned før opprydding ved å varmes opp til RT ved tine.
    7. For å oppnå maksimal kvalitet på den isolerte RNA-en må du utføre alle valgfrie trinn, inkludert DNase-fordøyelsen og alle RNA-eluering trinn. Varm opp den eluering bufferen som leveres av RNA isolasjons settet eller RNase-fritt vann til 60 ° c for maksimal RNA-gjenoppretting.
      Merk: Den isolerte RNA-en kan oppbevares ved-20 ° c i opptil 1 måned eller-80 ° c i flere år. Protokollen kan stanses midlertidig etter dette trinnet.

7. valgfri RNA Kvalitetsanalyse (anbefales)

  1. Vurder RNA-kvalitet med en bioanalyzer11 og kvantitet med en spektrofotometer12 for å avgjøre om det er nødvendig å gjenta immunutfelling prosessen for å oppnå god RNA med høy kvalitet.
    Merk: Den optimale RNA-kvaliteten for sekvenser med høy gjennomstrømming bør følge protokoller angitt av biblioteks Forberedelses sett og sekvensering-plattformer.

8. nedstrøms søknader

Merk: Total RNA isolert av FELLE protokollen kan brukes i en rekke standard nedstrøms applikasjoner, inkludert RNA-SEQ (TRAP-SEQ). Standard omvendt transkripsjon og kvantitative PCR-protokoller kan også brukes etter TRAP.

  1. For TRAP-SEQ, utføre RNA-SEQ biblioteket forberedelse i henhold til standard metoder13.
  2. For RNA-SEQ, utarbeide cDNA sekvensering biblioteker ved hjelp av kommersielle RNA-SEQ kits med oligo d (T)-basert berikelse av polyadenylated Poly (A) transkripsjoner. Alternativt, hvis den totale RNA kvaliteten er lavere enn anbefalt for Poly (A) berikelse, bruk rRNA nedbryting moduler. Men forvent å se mer rRNA justering etter sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Til profil genuttrykk i repopulating hepatocytter av Fah-/- Mouse, Gfp: Rpl10a Fusion og Fah transgenes er co-levert i en Transposon-inneholdende plasmider8 (Trap Vector) til lever av hydrodynamisk injeksjon (figur 1A). Fjerning av nitisinone induserer en giftig leverskade som skaper et utvalg press for hepatocytter stabilt uttrykker FAH å gjenbefolke den skadde parenchyma9. Immunofluorescence farging bekrefter co-uttrykk for FAH og GFP: RPL10A Fusion protein i repopulating hepatocytter etter to uker av leveren Repopulation (figur 1B).

I følgende representative eksperiment ble TRAP-SEQ utført ved hjelp av Quiescent og repopulating mus hepatocytter. For det første, for å få GFP-Tagged ribosomer fra Quiescent hepatocytter, transgene rosaLSL-GFP-L10A mus ble INJISERT med AAV8-TBG-grobunn 7 dager før offer for å indusere GFP: RPL10A uttrykk i alle hepatocytter14. Vi har også behandlet en lever prøve innhentet fra en vill type mus som en negativ kontroll for å sikre isolering av oversette mRNA var spesifikk, noe som betyr RNA kunne bare trekkes ut fra mus uttrykker GFP: RPL10A. Konsentrasjonen av isolert RNA korrelert med antall celler uttrykker Fusion protein, med Quiescent prøven produsere høyest utbytte siden alle hepatocytter uttrykke GFP: RPL10A etter AAV8-TBG-grobunn injeksjon (figur 2A). Motsatt, knapt noen RNA var synlig i vill type kontroller som ikke har GFP: RPL10A transgene, indikerer TRAP prosedyren er svært spesifikk og har en lav bakgrunn. Når TRAP ble brukt på leveren vev gjennomgår Repopulation med GFP: RPL10A-transduced hepatocytter, rikelig, høy kvalitet RNA ble innhentet (figur 2B). Ingen RNA-spor ble derimot oppdaget via bioanalyzer for den negative kontroll prøven.

Nedstrøms genuttrykk analyse kan utføres via omvendt transkripsjon og kvantitative PCR eller RNA-SEQ på TRAP-isolert RNA. Gsta1 koder glutation S-glutamyltransferase som spiller en viktig rolle for metabolismen av glutation, den viktigste avgifte peptid for å beskytte leveren mot oksidativt stress skade15. Gsta1 uttrykk er indusert av over 10-Fold i repopulating hepatocytter i forhold til Quiescent hepatocytter, mens ingen terskel syklus (CT) verdi ble oppdaget med Trap-isolert RNA fra den ville typen musen på grunn av mangel på input RNA (Figur 3 A). Vær oppmerksom på at RNA-kvalitet i stor grad kan påvirke analyse av genuttrykk. Når det gjelder RNA-SEQ-eksperimenter, bør vurdering av RNA-kvalitet utføres i henhold til anbefalingene fra biblioteks Forberedelses settet og sekvensering-plattformen (Figur 3B). En bioanalyzer er ofte brukt til å bestemme RNA integritet nummer (RIN), med en høy RIN samkjøre med en høyere rate av mRNA justeringer til Genova (Figur 3B, venstre), mens en lavere Rin fører til en høyere rate av ribosomal leser, indikerer mRNA degradering (Figur 3B, høyre). Figur 3 C, D DEMONSTRERER at Trap-SEQ kan identifisere differensial genuttrykk i Quiescent og repopulating hepatocytter. For eksempel er alb uttrykk hemmet og AFP uttrykket er upregulated under leveren Repopulation, som reflekterer at replikere hepatocytter anta en mindre differensiert stat å hemme leveren metabolske funksjoner under Repopulation9,16.

Figure 1
Figur 1: gjennomføring av Trap med Fah-/- til profil genuttrykk endring av repopulating hepatocytter. (A) skjematisk å uttrykke GFP: RPL10A Fusion protein med Fah i Sleeping Beauty Transposon system etterfulgt av injeksjon i Fah-/- Mouse. Grønne Sekskanter indikerer repopulating hepatocytter med stabilt uttrykk for FAH og GFP: RPL10A, mens svart Sekskanter representerer skadde, døende hepatocytter. (B) representative immunofluorescence farging demonstrerer COEXPRESSION av GFP-Tagged RIBOSOMAL protein L10A (grønn) og Fah (rød) i repopulating hepatocytter. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Trap tillater celle type spesifikk isolering av høykvalitets RNA. (A) den utbytte av RNA er positivt korrelert med antall HEPATOCYTTER uttrykke GFP: RPL10A. Den lave avkastningen av RNA fra en vill type mus demonstrerer spesifisitet av TRAP fra kilder uten uttrykk for GFP: RPL10A. (B) Bioanalyzer spor av total RNA isolert fra repopulating lever uttrykker GFP: RPL10A og fra vill type lever demonstrere spesifisitet av Trap. Total RNA isolert fra vill type leveren vev blottet for GFP: RPL10A transgene viser at minimal RNA har blitt samlet inn, mens transgene vev gir rikelig med høy kvalitet RNA. Merk at ribosomal RNA-topper er til stede etter vellykket TRAP10. FU, fluorescens enhet. Nummeret til RIN, RNA-integritet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Trap-ISOLERT RNA kan brukes for analyse av genuttrykk nedstrøms. (A) representant omvendt transkripsjon og kvantitative PCR resultater av Gsta1 i Quiescent og repopulating hepatocytter. Det ble ikke oppdaget CT-verdi med RNA isolert fra dyr av typen Wild. (B) justering analyse av isolert RNA etter sekvenser med høy gjennomstrømning, som demonstrerer viktigheten av å bestemme RNA-integritet etter isolering. Høy kvalitet RNA resulterer i en høyere prosentandel av mRNA leser (grønn), mens lav kvalitet RNA fører til en mye høyere prosentandel av ribosom leser (rød), som de fleste mRNA er degradert. Nummeret til RIN, RNA-integritet. (C,D) Integrative Genomics Viewer (IGV) spor av RNA-SEQ leser av mRNA affinitet-renset fra Quiescent og repopulating hepatocytter ved (C) alb og (D) AFP Loci. Merk at de 3 ' Read bias er typisk for en Poly (A) valg rørledning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

FELLE-SEQ er en teknikk for cellen type-spesifikk isolasjon av oversette mRNA via epitope-merket ribosomer og gaver en alternativ å FACS tilnærmelser, for den omgår begrensninger som tid behov av FACS9. I stedet tillater TRAP rask og effektiv isolering av RNA direkte fra masse vev, noe som bidrar til å unngå eventuelle endringer i genuttrykk. Trap-SEQ er spesielt velegnet for bruk i repopulating Fah-/- mus leveren, som hepatocytter ekspansjon etter fjerning av nitisinone er celle autonom og muliggjør genuttrykk profilering av under gruppen av hepatocytter med integrert transgenes. TRAP-vektoren kan også være coexpressed med Gen-aktivering eller-deaktivering av molekyler17, inkludert cDNA, kort---og lede RNA, for å studere virkningene på globalt genuttrykk for aktivering eller hemming av et bestemt gen. Alternativt, rosaLSL-GFP-L10A transgene Mouse gir deg muligheten til å profil genuttrykk i enhver celle med grobunn recombinase aktivitet. Siden GFP: RPL10A kan uttrykkes spesielt i noen celler som uttrykker grobunn, rollen til andre celletyper i leveren under leverskade og Repopulation kan bli studert. For eksempel kan kryssing av CK19-grobunn med TRAP transgene Mouse brukes til å uttrykke GFP: RPL10A i cholangiocytes etterfulgt av TRAP-SEQ for å studere endringen av genuttrykk i galle epitel under Repopulation prosessen.

For å sikre nøyaktig profilering av genuttrykk er det avgjørende å klargjøre alle buffere og affinitet matrise før vevs disseksjon. Alle trinn bør utføres på isen med kalde buffere med mindre annet er spesifisert for å sikre polysome stabilisering10 og hindre RNA degradering. Alle buffere bør tilberedes med RNase-frie reagenser og TRAP-SEQ-protokollen bør utføres i et RNase-fritt miljø for å forhindre RNA-forringelse og lav avkastning på immunoprecipitated RNA. Affinitet matrise kan være forberedt opptil 2 uker før bruk med milde blanding på et rør Rotator over natten. Spesiell forsiktighet bør utvises for å ikke kraftig riste matrisen for å hindre forstyrrelse av antistoff-bøyd, protein L-belagt magnetiske perler. Metodene for å forberede affinitet matrise inkluderer Bøyning av magnetiske perler til biotinylated protein L etterfulgt av inkubasjons med anti-GFP antistoffer. Imidlertid kan kommersielt tilgjengelige protein A/G magnetiske perler erstattes; Hvis brukt, hopp over det innledende Bøyning trinn og gå direkte til antistoff binding. Videre alternative epitope koder er antagelig gjennomførbart med ovennevnte protokollen med riktig modifikasjon.

Det finnes ulike punkter der RNA-isolasjonen og rense trinnet kan stanses midlertidig (se protokoll over). Men når leveren prøvene har blitt høstet, fortsetter til immunutfelling anbefales, som avkastningen av isolerte RNA kunne slippe av ~ 50% med frysing på dette trinnet10. Vev bør skylles raskt med disseksjon buffer som inneholder cycloheximide for å hemme mRNA oversettelse. Utilstrekkelig vev lyse kan også bidra til lav RNA yield. Det er viktig å homogenisere vev på isen til ingen vev biter er synlige med motor homogenisator samtidig som det sikrer minimal lufting10. I tillegg er tilstrekkelig vasking med høy-salt buffer avgjørende for å sikre fjerning av ikke-spesifikk binding av ribosomal proteiner til affinitet matrise. Inkludert en vill type negativ kontroll bidrar til å vurdere spesifisitet av immunutfelling og effektiviteten av vasketrinn. I tillegg, ved hjelp av en kommersiell RNA rensing kit som inkluderer RNase-Free DNase behandling vil øke RNA renhet.

Videre anbefales det å verifisere uttrykket og overflod av GFP: RPL10A Fusion protein og vurdere mengden av vev som kreves for å oppnå rikelig RNA for nedstrøms analyse. Vevs deler eller lysater kan brukes til Immuno gjenkjenningsmetoder for å validere uttrykket for GFP: RPL10A. Mengden RNA isolert kan variere med: (1) antall celler som uttrykker GFP: RPL10A, (2) uttrykks nivået til transgene, og (3) størrelsen og ploidy til cellene som uttrykker transgene. En pilot eksperiment med halvparten og doble mengden av anbefalt mengde vev kan være nyttig for å bestemme den optimale input lysat for TRAP-SEQ. I våre hender, kunne vi få ~ 150 ng av RNA med så lite som 1-2% av hepatocytter uttrykker GFP: RPL10A fra 200 mg av repopulating Fah-/- Liver, som representerer ~ 2 x 105 polyploid hepatocytter med transgene uttrykk9.

FELLEN-SEQ metodikk isolerer ribosom-bundet mRNA å profil en celle ' s oversette mRNA basseng. Den resulterende sekvensering leser derfor tilsvarer "translatome" i stedet for transcriptome. Merk at oversette ribosom fotavtrykk ikke vil bli samlet, som TRAP utføres på innfødte snarere enn krysskoblet komplekser. Hvis Footprinting analyser ønskes, skal protokollen ovenfor modifiseres med relevant tverr kobling etterfulgt av immunutfelling (CLIP)-metoder18. En annen begrensning av TRAP er kravet om et tilstrekkelig antall celler uttrykker GFP: RPL10A Fusion protein. For eksperimenter der celletypen interesse er liten, kan det være nødvendig å kombinere flere biologiske prøver for å isolere tilstrekkelig RNA for å aktivere RNA-SEQ19. Videre, TRAP-SEQ krever tilstedeværelsen av GFP: RPL10A i cellen type interesse. Dette kan utgjøre en utfordring hvis det ikke er noen bestemt leveranse system til cellene, eller hvis en celle-type spesifikk promoter å kjøre grobunn uttrykket er ikke tilgjengelig.

Det nylig utviklingen av enkelt-cellen RNA-SEQ (scRNA-SEQ) teknologien har innrømmet direkte sekvensering føle etter av inne silisiummangan legitimasjonen av forskjellige cellen typer, muliggjør sekvensering uten sortering for spesifikk cellen typer av interesserer20 ,21,22. Imidlertid, scRNA-SEQ fremdeles behøver dissosiasjon av celler fra orgelet. Når det gjelder Fah-/- Repopulation-modellen, er lever-og hepatocytter isolering ekstremt vanskelig og ineffektiv på grunn av sårbarheten til både den skadde og replikere hepatocytter. Faktisk har vi ennå ikke vært i stand til å isolere tilstrekkelig hepatocytter fra Fah-/- mus gjennomgår Repopulation etter hydrodynamisk injeksjon av Fah plasmider. I tillegg, i tiden det tar å behandle vev, kan gen uttrykks nivåer endres. Protokoller for lever-og ta opptil 30 min av varme iskemi tid. Fremtidige metoder for å optimalisere leveren for å redusere behandlingstiden og øke isolasjons effektiviteten kan tillate scRNA-SEQ integrering til Fah-/- Mouse modell system og muligens til andre skader og Repopulation modeller. Dette vil også gjøre det mulig å studere alle typer leverceller.

I konklusjonen, integrering av Trap-SEQ med Fah-/- Mouse tillater spesifikk isolasjon og genuttrykk profilering av replikere hepatocytter å identifisere terapeutiske mål som kan fremme leveren Repopulation. Denne metoden kan implementeres for å studere andre celletyper i leveren og andre organsystemer for sykdoms spesifikk identifisering av genuttrykk endringer for å identifisere potensielle narkotika mål eller biomarkører. En analog teknikk kan brukes til å samle kjerner fra repopulating hepatocytter ved hjelp av affinitet rensing, og deretter å utføre en epigenetic analyse av disse spesifikke cellene16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) og P30-DK050306 (pilot stipend til KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28, (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
  4. Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22, (18), 4438-4445 (2016).
  5. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276, (5309), 60-66 (1997).
  6. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176, (1), 2-13 (2010).
  7. Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7, (12A), 2298-2307 (1993).
  8. Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47, (5), 1714-1724 (2008).
  9. Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128, (6), 2297-2309 (2018).
  10. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, (6), 1282-1291 (2014).
  11. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).
  12. NEBNext. NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).
  13. NanoDrop. 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).
  14. Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124, (3), 1242-1254 (2014).
  15. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30, (1-2), 42-59 (2009).
  16. Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. (2019).
  17. Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. (2019).
  18. Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
  19. Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64, (3), 894-907 (2016).
  20. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542, (7641), 352-356 (2017).
  21. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546, (7659), 533-538 (2017).
  22. Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled? Cell Metabolism. 29, (3), 539-544 (2019).
Cell type-spesifikke Gene Expression profilering i musen Liver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter