Summary
该协议的目标是提供基于接种沙沙霉菌的工业化鱼类发酵技术。
Abstract
该协议提供了一种制备工业化发酵鱼产品的方法，程序是：（1）对养殖的鱼苗进行预处理，包括斩首、脱皮、剥皮、清洗和切割;（2） 在 6-12% （w/v） 盐溶液（1：1，鱼立方质量到溶液体积）中腌制鱼块;（3）通过热空气（40-60°C）或真空干燥鱼块，水含量为50-60%;（4） 发酵涉及在鱼块的风味溶液中加入0.4-1.6%（w）S.cerevisiae的乳化鱼块，并在25-35°C下发酵6-10小时; （5） 用腌制和发酵溶液在真空包装中密封鱼块;（6） 在115-121°C下消毒10-20分钟。用这种方法制备的鱼肉制品味道鲜美，醇厚，有各种类型和大量挥发性香料化合物，如醇和酯类，可以掩盖鱼的霉味和难闻的气味，具有适量的盐分内容，但良好的纹理性能，如高弹簧，软胶和咀嚼性，具有明亮的红花色和有吸引力的外观。这项新技术也可应用于其他鱼类的加工，提供方便的鱼类零食，可在室温下储存。它适用于海洋和淡水鱼。
Introduction
目前我国商业腌制鱼产品存在咸味重、葡萄酒香气不足、弹性差、色泽淡等问题，降低了消费者的接受度。因此，需要创造和优化具有葡萄酒香气的高品质鱼肉产品的新技术。
近年来，现代发酵技术在肉鱼中的应用越来越受到研究者的关注。通过向肉鱼中接种起动机，提高了食品安全，缩短了加工时间;产品感官特性已被修改。Saithong等人5日从天然乳酸杆菌（LAB）中分离出来，并利用该LAB作为启动培养物，诱导高酸度和抑制致病菌。Zeng等人6日报告说，用自体启动剂培养物接种可缩短发酵时间，改善样品的感官特性。Casaburi等人7日声称，使用微生物启动培养物会影响发酵肉类中香气的发展。在这些启动培养物中，S.cerevisae可以通过酒精发酵产生葡萄酒香气，还可以使产品具有其他改进的感官品质。因此，S. cerevisae是一种适合葡萄酒香气产品8、9、10 和葡萄酒香鱼产品的起动机，可由S. cerevisae制成。
在制作葡萄酒香鱼产品的过程中，肉和鱼的质地会受盐含量、含水量、pH、蛋白质变性等影响。因此，腌制、干燥、发酵和灭菌都会影响质地特性。风味和味觉的形成是复杂的，主要受腌制和发酵的影响，因为它与碳水化合物、蛋白质和脂质的水解以及轻度脂质氧化11、12密切相关。它也可能受到添加香料13的影响。为了发展颜色，梅拉德反应发生，这是涉及发酵和灭菌的过程10。
本文可为葡萄酒香气发酵鱼产品的产业化提供技术支持，对鱼类加工业的发展具有重要意义。该技术可以通过增加蛋白酶（更多的游离氨基酸和TCA-可溶性肽），主要通过酒精（乙醇，1-Octen-3-ol，2-甲基-1-丙醇和3-甲基-1-丁醇），酯（乙酸乙酯）和醛（非肛门，3-甲基丁酸和苯甲醛），增加口感通过更高的硬度，弹簧，软胶和咀嚼性，并给予更有吸引力的红组颜色和明亮的表面14。它还为消费者提供了便利，因为产品可以在室温下储存。正如其他先前研究所描述，15、16、17、与S.cerevisae发酵也已被证明可以显著改善其他肉类或鱼类产品的感官质量。
值得注意的是，引入的协议也可以应用于其他鱼类物种，如草鲤、银鲤、黑鲤、大头鲤、鳕鱼、鲑鱼等。对于高质量的鱼产品，应使用未经加工的鱼，如鲜鱼、冰鱼或储存不到1年的冷冻鱼。此外，由于轻度脂质氧化可以增强风味，而广泛的脂质氧化带来令人不快的味道，因此推荐脂肪较少的鱼或脱脂鱼。
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Protocol
1. 样品制备
- 在低于 20°C 的流水下解冻冷冻的鱼肉。然后，清洁，剥皮，将鱼切成立方体（2厘米×2厘米×1.5厘米）。
注：原料可以是新鲜或冷冻的鱼肉。 - 将鱼块与 6-12%（w/v）盐溶液混合，速率为 1：1（鱼立方质量到溶液体积），在 10°C 下，1-3 小时。
- 将腌制鱼块放在不锈钢网格板和干鱼块上，在 40-60 °C 下用热空气干燥约 6-10 小时，或在真空中干燥鱼块，直到水含量降至 50-60%。
- 将干鱼块与调味液混合接种 0.4-1.6%（w，起始培养质量到鱼立方质量） S. cerevisae以 1：1 的速度（鱼立方质量到溶液体积）。将混合物密封在容器中，在25-35°C下发酵6-10小时。
注：发酵必须在厌氧环境下进行。- 准备调味液，包括25%香料液体，40%黄葡萄酒，7%白葡萄酒，25%甘蔗糖，2%谷氨酸钠，和1%醋的质量分数。
- 准备香料液体如下。混合香料包括1.2个单位的葱，1单位的生姜，0.6单位的星黄，0.6单位的香肠，0.3单位的绿茶和0.3个单位的胡椒40单位水，煮0.5小时。将残留物与另外 40 单位水混合，再煮 0.5 小时。结合两个沸腾的滤液，使用开水组成多达100个单位。
注：在添加起动机培养剂之前，必须暂停此处的协议，直到香料液体冷却至室温。这种暂停可以避免酵母因热而失活。
- 以11-13：1（鱼立方质量至溶液体积）的速度，用浸料和发酵溶液密封真空包装发酵鱼块。真空强度、密封时间和冷却时间分别为0.085 MPa、3.6 s和5.5s。
注：真空封装材料为聚乙烯对苯二甲酸酯/铸造聚丙烯（PET/CPP）。包装重量为 50-80 g。 - 在储存和销售之前对包装好的鱼块进行消毒。灭菌 F 值应大于 4.5 分钟。灭菌温度和时间分别为115-121°C和10-20分钟。将压力保持在 0.12 MPa，用于灭菌后冷却。
注：当灭菌F值为4.5分钟，灭菌温度设定为121°C时，本条设备条件下的灭菌时间为11.4分钟。当所用设备类型不同时，修改灭菌时间。
2. 发酵鱼肉制品保质期估算
注：根据Wahyuni等人的方法，采用加速保质期测试（ASLT）方法对发酵鱼肉产品的保质期进行估算，并作了一些修改18。
- 将产品储存在20°C、30°C、40°C。
- 使用酸化率通过 Arrrhenius 模型预测保质期。通过在不同温度下测试酸值 （AV） 来测量酸度。
- 测量AV在0，14日，28日，42日，第56天，第70天。
3. 化学分析
- 盐含量的测定
注：我们根据曾等人19日提出的方法测量盐含量。- 准确称量1克样品，并加入10 mL的0.1 M AgNO3 + 10 mL的HNO3。
- 在电磁炉上轻轻加热混合物10分钟。
- 用自来水冷却混合物，并加入蒸馏水（50 mL）和铁铝指示料（5 mL）。
- 用标准 0.1 M KSCN 将混合物与乳液一起打发，直到溶液变成永久的棕红色。
注：计算结果并将其表示为%NaCl。
- 水分含量的测定
- 根据曾等人19号的方法测定水分含量。
- 确定 pH 值
注：我们根据曾等人6的方法测量pH值。- 用90 mL的去离子水使样品10克均匀化。
- 使用数字 pH 计测量 pH 值。
4. 头空间固相微萃取，然后是气相色谱-质谱分析
注：我们根据高等人的方法测量风味，并稍加修改17。
- 挥发性香料的提取
- 准确称量2克样品，然后放入样品小瓶中。
- 将2.5 mL的饱和氯化钠溶液和0.5M 2，4，6-三甲基丙氨酸加入带转子的样品小瓶中，然后关闭小瓶盖。
- 将样品小瓶放在磁力搅拌器上，搅拌10分钟，使样品均匀混合。
- 将纤维插入样品瓶的头部空间。
- 在60°C下吸附30分钟，然后在250°C下在注射口中解吸3分钟。
- GC-MS风味分析
- 有关所用仪器的详细信息，请参阅材料表。
- 使用氦（纯度 > 99.995%）作为载运气体，并将流速设置为0.9 mL/min。
- 先将柱温度设置为 40°C 3 分钟，然后以 5°C/min 的速率增加到 90°C。随后，以10°C/min的速率升高至230°C。
- 在电子电离（EI）*模式下运行MS，并将电子能量设置为70 eV。设置扫描范围从 30 m/z 到 500 m/z。将发射电流设置为 80 μA。分别使用250和200°C的接口和源温度。
- 通过 NIST2005 和 Willey 7 标准库识别挥发性香料化合物。使用内部标准（2，4，6-三甲基丙氨酸）对挥发性化合物的保留指数（RI）进行半量化。
- 通过将每种风味化合物的峰值面积与内部标准的峰值面积进行比较，计算挥发性香料化合物的浓度。将结果表示为 μg/kg。
5. 纹理轮廓分析
注：按照上一项研究20分析纹理轮廓。
- 使用配备圆柱形探头 （P/36R） 的纹理分析仪执行纹理轮廓分析 （TPA）。
- 应用两个连续循环。TPA的变形程度为50%，触发力为5×g。
- 前、中、亲测试的圆柱探头速度分别为2、1和5 mm/s。通过其内置软件计算纹理参数。
6. 颜色测量
注：根据Czerner等人的方法测量颜色，并作一些修改21。
- 使用色度计测量样品。记录样本的光度值 （L+）、绿色/红度值 （a+） 和蓝色/黄色值 （b*）。
- 测量每个样本的五个复制。
7. 感官评价
- 由至少20名受过训练的小组成员（23名小组成员，12名男子和11名女性，年龄20-40岁）对样本进行感官分析，使用先前的方法，修改20个。
- 对样品的口味、味道、颜色和质地进行评分，从0到10。分数 0 表示"非常不喜欢"，分数 10 表示"喜欢极"。
注：评分标准如表1所示。总分由不同贡献者的总和（30% 味觉得分 + 30% 风味得分 + 20% 颜色分数 + 20% 纹理分数）组成。总分为 6 被视为可接受的质量的边界线。
| 质量参数 | 描述 | 得分 |
| 味道 | 可接受的甜味和咸咸;和谐的味道;葡萄酒味;不收敛 | 8-10 |
| 太重或太轻（甜或咸）;和谐的味道;葡萄酒味;不收敛 | 6-8 | |
| 太重或太轻（甜或咸）;清淡的葡萄酒和后味;涩 | 3-6 | |
| 太轻的酒和后味;显然收敛 | 0-3 | |
| 味道 | 美洛葡萄酒风味;丰富的发酵香气;没有奇怪的气味 | 8-10 |
| 美洛葡萄酒风味;光发酵香气;没有奇怪的气味 | 6-8 | |
| 清淡的葡萄酒味;光发酵香气;光怪味 | 3-6 | |
| 没有葡萄酒的香气;光发酵香气;明显奇怪的气味 | 0-3 | |
| 外观 | 鲁塞特颜色;光泽的外观;明亮的表面 | 8-10 |
| 鲁塞特颜色;明亮的表面 | 6-8 | |
| 黄色;非 均匀 | 3-6 | |
| 淡色;粗糙表面 | 0-3 | |
| 纹理 | 可接受的咀嚼性 | 8-10 |
| 努力 | 6-8 | |
| 轻盈的弹簧 | 3-6 | |
| 柔软的质地;粗口感觉 | 0-3 |
表1：发酵葡萄酒香鱼肉制品感官质量评分标准。
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Representative Results
合适的盐浓度、腌制时间和温度使产品的质感质量更好。最佳腌制条件如下：腌制溶液中盐浓度为8%;腌制时间为2小时;腌制温度为10°C。参见图 1。
在干燥过程中，最终的水分含量和干燥温度会影响质地和感官质量。最佳干燥条件如下：干鱼块含水量55%，干燥温度50°C。参见图2。
在发酵过程中，加入S.cerevisae，温度和时间都影响鱼的味道、味道、颜色和质地特性。比较了失败发酵鱼和成功的发酵鱼。成功的发酵鱼在口感、风味、颜色和质地上具有高分，形成和谐口感、发酵香气、葡萄酒味、红花色、鲜亮表面、焦糖和al凹痕质地。失败的鱼产品在口感、味道、颜色和质地方面得分较低，导致口感差、苦味、酸味、鱼味、淡色、表面粗糙、口感粗糙、质地变差。鱼产品失败的原因可能是发酵过程中厌氧条件的失败。加入0.8%的S.s.cerevisae，在28°C下发酵6小时，从而获得最佳感官质量。见表2。
在灭菌过程中，适宜的灭菌强度和灭菌温度为4.5分钟和121°C。灭菌技术可以保证在室温下储存的产品的安全性，而最小灭菌的研究可以减少对纹理质量的损害。参见表3和图3。
对于存储，AV 随温度变化速率变化的 Arrhenius 方程为 lnk = -2337.97/T = 2.98913。发酵葡萄酒-香鱼肉制品的脂肪氧化动力学模型方程为A= 0.38μe0.0078t，在25°C下。发酵葡萄酒-香鱼肉制品的脂肪氧化动力学模型方程为A= 0.38μe0.0100t，在35°C下。保质期预测分别为264天和205天，分别25°C和35°C。参见图4。
图1：盐浓度和腌制参数对最终产物的纹理特性的影响。
（a） 盐浓度;（b） 腌制时间;（c） 腌制温度.值和误差条定义为均值 = 标准差 （SD）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：水分含量和干燥温度对最终产品纹理特性和感官评价的影响。
（a） 水分含量对最终产品纹理特性的影响;（b） 水分含量对最终产品感官评价的影响;（c） 不同干燥温度对最终产品纹理特性的影响。值和误差条被定义为均值 = SD。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：灭菌温度对产品纹理特性和感官评价的影响。
（a） 纹理属性;（b） 感官评价.值和误差条定义为均值 = SD。同一指标中具有不同字母的均值明显不同 （P < 0.05）。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：产品AV变化的Arrhenius曲线。请点击此处查看此图的较大版本。
| 味道 | 味道 | 颜色 | 纹理 | 整体 | 感官描述 | |
| 成功的发酵鱼 | 8.7±1.3a | 8.7±0.8a | 8.9±0.8a | 8.8±0.6a | 8.8±0.1a | 和谐的味道， 发酵香味， 葡萄酒， 红花色， 明亮的表面， 焦糖和 al 凹痕 |
| 失败的发酵鱼 | 4.5±0.5b | 5.2±0.4b | 5.9±0.5b | 3.8±0.4b | 4.9±0.2b | 味道不好，苦，酸，鱼，淡色，粗糙的表面，粗糙的口感和恶化的质地 |
表2：成功发酵鱼和失败鱼产品的感官特性（味道、风味、颜色和质地）。值表示为均值 = SD。 同一行中具有不同上标字母的表示表示显著不同 （P < 0.05）。
| 灭菌强度（分钟） | 温度 （°C） | 时间（分钟） | 凸块袋号 |
| 3 | 115 | 15.1 | 1 |
| 121 | 8.7 | 2 | |
| 125 | 2.1 | 4 | |
| 115 | 18.8 | 0 | |
| 3.9 | 121 | 10.4 | 1 |
| 125 | 3.6 | 1 | |
| 115 | 21.2 | 0 | |
| 4.5 | 121 | 11.4 | 0 |
| 125 | 4.2 | 0 | |
| 115 | 23.5 | 0 | |
| 5.1 | 121 | 12.4 | 0 |
| 125 | 4.8 | 0 | |
| 115 | 26.9 | 0 | |
| 6 | 121 | 13.6 | 0 |
| 125 | 5.6 | 0 |
表3：灭菌条件对产品安全的影响。样本数 = 20。
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Discussion
本研究提供了一种生产具有葡萄酒香气的优质发酵鱼产品的新技术，并测试了感官特性。该技术的关键工艺是腌制、干燥、发酵和灭菌。在腌制过程中，盐的浓度、温度和时间都影响着鱼的纹理特性。随着盐浓度（0-12%，w/v）和腌制时间延长（0-2.5 h），产品的硬度和咀嚼性逐渐增加;但 2 小时后的增加并不显著。同时，当温度高于10°C时，咀嚼性随腌汁温度的增加而增加，而硬度降低。在干燥过程中，最终水分含量和干燥温度会影响蛋白质的状态，从而产生不同的质地特性。随着最终水分含量的降低（75%-45%）在鱼片中，产品的硬度和咀嚼性逐渐增加。当干燥端的最终水分含量从约75%降至约55%时，产品弹性的变化并不显著（P > 0.05）。当最终水分含量降至55%以下时，产品的弹性显著降低。原因可能是未结合的水对纹理特性影响不大，而结合水则有显著的影响。干燥温度也可能影响纹理质量。当最终水分含量固定在55%时，在40°C和50°C干燥产品在硬度、咀嚼性和弹性方面无显著差异（P > 0.05）。相比之下，在60°C下干燥的产品在硬度和耐嚼性上要高得多;弹性显著降低。在发酵过程中，加入S.cerevisae，温度和时间都影响鱼的风味特性。适当添加S. cerevisae （0.8%）、发酵温度 （28 °C） 和发酵时间 （6 h） 可提高感官接受性，促进和谐口感、发酵香气、葡萄酒、红花色、明亮表面、焦糖和 al 凹痕纹理。在灭菌过程中，灭菌强度和温度均影响鱼类的安全性和质地特性。随着灭菌强度的增大，产品的安全性逐渐提高。当灭菌时间超过4.5分钟时，产品可满足商业不育要求。在相同灭菌强度（持续时间）下在较高温度下消毒的产品具有更好的纹理质量。
为了改进这一技术，值得注意的是，脂质氧化应考虑和控制，因为广泛的脂质氧化可能会带来不愉快的味道，导致整体感官质量下降。解决方案可能是使用脂肪较少的鱼或添加食物抗氧化剂。
在这项研究中的局限性中，应该提到，只检查了感官特性和微生物安全性。尚未对营养价值进行调查，以便对该产品和技术进行全面评估。
这种技术制备的发酵鱼产品具有甜味，醇厚，具有各种类型和大量的挥发性香料化合物，如酒精和酯类，可以掩盖鱼的霉味和难闻的气味。它含盐量适中，但具有高弹性、软胶和咀嚼性等良好纹理特性，具有明亮的红花色和吸引人的外观。这项新技术也可应用于其他鱼类的加工，提供方便的鱼类零食，可在室温下储存。对渔业的发展具有重要意义。
今后，可以对这一技术进行更多的研究。例如，本研究中仅将一种S.cerevisae菌株用作葡萄酒香气的起始培养物，不同的菌株可用于开发独特复杂而丰富的风味。因此，有必要在后续研究中进一步研究不同菌株发酵工艺和混合比对产品质量的影响，以优化混合比和工艺参数，进一步提高质量。发酵鱼产品。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由江苏省自然科学基金专项资金（BK20170185）、江苏省水产厅项目（Y2017-30）、国家自然科学基金（NFSC31801575）、中国农业研究资助。系统（CARS-45-26）、国家一级食品科技学科项目（JUFSTR20180201）和易通江苏博士后项目。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trimethylpyridine | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Purity 98% | |
| Colorimeter | Hunterlab | UltraScan Pro1166 | |
| DB-WAX column | Agilent | 30 m × 0.25 mm × 0.25μm | |
| Digital pH meter | Mettler toledo Instrument (Shanghai) Co., Ltd. | DELTA-320 | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | DHG-9070A | |
| Frozen sturgeon | Huada Marine Industry Group Co., Ltd | - | |
| Gas chromatograph-mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | TSQ Quantum XLS | |
| Humidities incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LHS-250HC-II | |
| Saccharomyces cerevisiae | Angel Yeast Co., Ltd | - | |
| Spices | Auchan Supermarket | - | |
| Sterilization pot | Longqiang Machinery Technology Co., Ltd. | RHS-03-700 | |
| Supelco | Sigma | 65μm, PDMS/DVB | |
| Texture analyzer | Stable Micro Systems, Ltd. | TA-XT2i | |
| Vacuum package machine | Quanzhou Yiminxin Electromechanical Co., Ltd. | YMX-958-10L |
References
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