Summary
Her presenterer vi en metode for å velge for romanen varianter av E. coli biotin-protein ligase BirA som biotinylates et bestemt mål peptid. Protokollen beskriver byggingen av en plasmider for bakteriell visning av målet peptid, generering av en BirA bibliotek, utvalg og karakterisering av BirA varianter.
Abstract
Biotin er en attraktiv post-translational modifikasjon av proteiner som gir en kraftig kode for isolering og påvisning av protein. Enzymatisk biotinylation av E. coli biotin-protein ligase BirA er svært spesifikk og gir mulighet for biotinylation av mål proteiner i sitt eget miljø; men den nåværende bruken av BirA mediert biotinylation krever tilstedeværelsen av en syntetisk Acceptor peptid (AP) i mål proteinet. Derfor er dens anvendelse begrenset til proteiner som er konstruert for å inneholde AP. Formålet med denne protokollen er å bruke bakteriell visning av et peptid avledet fra en uendret mål protein å velge for BirA varianter som biotinylates peptid. Systemet er basert på en enkelt plasmider som gjør det mulig for co-uttrykk for BirA varianter sammen med et stillas for peptid displayet på bakteriell overflate. Protokollen beskriver en detaljert prosedyre for inkorporering av målet peptid i displayet stillaset, etablering av BirA biblioteket, utvalg av aktive BirA varianter og første karakterisering av de isolerte BirA varianter. Metoden gir et svært effektivt valg system for isolering av romanen BirA varianter som kan brukes for videre rettet utviklingen av biotin-protein ligases som biotinylate et innfødt protein i komplekse løsninger.
Introduction
Biotinylation av et protein skaper en kraftig kode for sin affinitet isolasjon og deteksjon. Enzymatisk protein biotinylation er en svært spesifikk post-translational modifikasjon katalysert av biotin-protein ligases. E. coli biotin-protein ligase BirA er ekstremt spesifikk og covalently biotinylates bare et begrenset antall naturlig forekommende proteiner på bestemte lysin rester1. Fordelene med BirA katalysert biotinylation er for tiden utnyttet ved å smelte målet protein med en liten syntetisk 15-amino-acid biotin Acceptor peptid (AP) som er effektivt biotinylated2 og gir mulighet for svært spesifikke og effektiv in vivo og in vitro biotinylation av co-Expression eller tillegg av BirA3,4,5. Selv om i vivo og in vitro BirA katalysert biotin-protein ligation er en attraktiv merkings strategi, er dens anvendelse begrenset til prøver som inneholder AP-smeltet proteiner. Formålet med denne metoden er utviklingen av nye mutanter av biotin-protein ligases som selektivt biotinylate innfødte uendrede proteiner, og dermed utvide antall søknader der enzymatisk biotinylation strategien kan brukes.
Protein funksjon kan utvikles gjennom gjentakende runder av genet mutasjon, utvalg, og forsterkning av genet varianter med ønsket funksjon. En sterk og effektiv utvalgs strategi er avgjørende for den regissert evolusjon og biotin-protein ligase aktivitet er lett valgt på grunn av den sterke bindingen mellom biotin og streptavidin og dens homologs6. Phage display Technologies tillater valg av phages som viser biotinylated peptider7,8. Siden forsterkning av isolerte phages krever infeksjon av en bakteriell vert, men phage utvalg med streptavidin skaper en flaskehals ved at høy affinitet binding av biotin til streptavidin er nærmest irreversible under ikke-denaturering Forhold. For å sikre reversibel binding av biotinylated phages, monomere avidins med lavere affinitet ble brukt som resulterte i en beskjeden ~ 10-fold berikelse7. Vi har nylig utviklet en bakteriell visningsmetode for isolering av romanen BirA varianter som eliminerer behovet for eluering fra affinitet matrise og dermed fjerner en flaskehals fra tidligere BirA utvalg systemer9. Faktisk gir våre bakterielle display systemet for en > 1, 000, 000-fold berikelse av aktive kloner i et enkelt utvalg trinn9, og dermed gi en effektiv utvalg system for regissert utviklingen av romanen BirA varianter.
Vår bakterielle display system består av to komponenter, BirA med en C-terminal 6xHis Tag og et stillas protein som gjør det mulig for overflaten visning av et mål peptid. Vi brukte stillaset protein forbedret sirkulært permuted ytre membran protein X (eCPX) siden effektiv visning av peptider kan observeres på både N-og C-Termini10,11. Fusjonen av målet peptid sekvensen til C-Terminus av eCPX sikrer biotinylation av bakterier uttrykker aktive BirA varianter. Bakteriene gir mulighet for effektiv streptavidin utvalg som biotinylated peptid nå vises på overflaten (figur 1a).
Hensikten med denne metoden er å velge for romanen varianter av BirA som biotinylates peptid sekvenser til stede i innfødte proteiner. Systemet er kodet av gener som finnes på plasmider pBAD-BirA-eCPX-AP, som inneholder en arabinose-induserbart promoter kontrollerende BirA (araBAD), og en T7 promoter kontrollerende eCPX9 (figur 1b). Den nåværende protokollen beskriver detaljert prosedyre for 1) innlemmelse av et peptid avledet fra et mål protein i C-terminal av eCPX, 2) etablering av et mutational bibliotek av BirA av feil utsatt PCR, 3) utvalg av streptavidin magnetisk-aktivert celle sortering (Mac), 4) kvantifisering av bakterier berikelse, og 5) første karakterisering av isolerte kloner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. innsetting av peptid koding sekvensering sekvens i pBAD BirA-eCPX-AP
Merk: For å velge for BirA varianter som biotinylate en innfødt mål protein, starte med å identifisere en 15-amino acid peptid sekvens i proteiner primære sekvensen som inneholder minst én lysin (K) rester.
- Gå til sekvensen manipulasjon Suite12.
- Lim den identifiserte 15 aminosyre peptid sekvens inn i input-boksen i FASTA-format og trykk Send.
- Velg og kopier 45-nukleotid omvendte oversettelse av peptid-sekvensen.
- Last ned GenBank-filen for pBAD-BirA-eCPX-AP fra http://n2t.net/addgene:121907.
- Belaste filen inne en plasmider Editor (e.g., ApE) og, inne i fremtiden vindu, velge Ap orden betegnet "AviTag ()".
- Høyreklikk på den markerte Ap-sekvensen i vinduet for DNA-sekvensen, og velg Lim inn rev-com i kontekstmenyen.
Merk: Kodingen sekvensen av eCPX er i motsatt retning og peptid koding sekvensen bør derfor limes som en omvendt komplement. - Høyreklikk på den markerte sekvensen og velg ny funksjon.
- Legg til et beskrivende navn på sekvensen som er satt inn, og trykk på OK.
- Velg Lagre som på fil- menyen for å lagre den endrede filen.
- Design Forward primer for å inkludere de siste 30 nukleotider av omvendt komplement av peptid koding sekvensen og legge til plasmider bindende nukleotid sekvens (3 '-GCGGCCGCCTGC-5 ') til sin 5 ' end.
- Design omvendt primer for å inkludere de første 30 nukleotider av omvendt komplement av peptid koding sekvensen og legge til plasmider bindende nukleotid sekvens (3 '-CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5 ') til sin 5 ' end.
- Sett opp en 20 μL PCR-reaksjon i et PCR-rør med tynne vegger ved å legge til reagensene som er listet opp i tabell 1.
- Overfør røret til en termisk cycler og utfør PCR ved hjelp av et program med en innledende denaturering ved 98 ° c i 30 s, 30 sykluser av [15 s ved 98 ° c, 15 s ved 60 ° c og 3 min ved 72 ° c], endelig utvidelse i 2 minutter ved 72 ° c og hold ved 4 ° c.
- Kjør 5 μL av PCR-reaksjonen på en 1% agarose gel for å bekrefte forsterkningen av et PCR-produkt på ~ 6 KB.
Merk: Hvis det ikke observeres et PCR-produkt, må du optimalisere PCR-betingelsen i henhold til produsentens anvisninger. Protokollen kan stanses midlertidig her. - Tilsett 1 μL av DpnI til PCR-reaksjonen og ruge i 1 time ved 37 ° c
- Forvandle kompetente E. coli med 2 ΜL av DPNI fordøyd PCR reaksjon og plate på Lysogenic BULJONG (LB)/amp plater. Ruge over natten ved 37 ° c.
- Vaksinere 5 mL LB inneholdende 100 mikrogram/mL Ampicillin med en enkelt koloni. Ruge over natten ved 37 ° c med risting ved 200 rpm.
Merk: Det anbefales å teste minst 6 kolonier. - Lag fryse aksjer på 850 μL av hver overnatting kultur ved å legge glyserol til en endelig konsentrasjon på 15% til kulturen. Store ved-80 ° c.
- Pakk ut plasmider DNA fra de resterende 4 mL kultur ved mini-prep DNA utvinning Kit.
- Bekreft riktig innsetting av peptid koding sekvensen av DNA-sekvensering ved hjelp T7 Terminal primer (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).
2. generering av et BirA bibliotek
Merk: Det første BirA mutational-biblioteket (figur 1c, trinn 1) opprettes av en feil utsatt PCR. Andre metoder for å generere BirA mutational biblioteket vil sannsynligvis fungere også.
- Syntetisere mutant megaprimers med BirA-6xHis Forward (ATGAAGGATAACACCGTGCC) og Reverse (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) primere med 1 ng av pBAD-BirA-eCPX med målet peptid sekvensen (forberedt og bekreftet i trinn 1,20) som en mal og 35 PCR sykluser med en annealing temperatur på 60 ° c i henhold til produsentens anvisninger.
- Kjør 5 μL av forsterknings reaksjonen på en 1% agarose gel for å verifisere forsterkningen av et 984 BP PCR-produkt.
- Rens PCR-produktet fra de resterende 45 μL av forsterknings reaksjonen ved hjelp av et kommersielt PCR rensesett og bruk en spektrofotometer for å quantitate DNA-utbyttet.
Merk: Rensing fra en enkelt 45 μL forsterkning reaksjon gir vanligvis en nok avkastning (> 250 ng). - Klargjør prøve reaksjonen i et PCR-rør med tynne vegger ved å legge til reagensene som er listet opp i tabell 2.
- Overfør reaksjonsblandingen til en termisk cycler og Kjør PCR med mutant megaprimers fremstilt i trinn 2,3 med følgende parametre: 1 min ved 95 ° c og 25 sykluser på 50 s ved 95 ° c, 50 s ved 60 ° c og 12 min ved 68 ° c. Oppbevar reaksjonen ved 4 ° c.
- Tilsett 1 μL av DpnI Begrensnings enzym direkte til forsterknings reaksjonen og bland forsiktig.
- Snurr ned reaksjonsblandingen og ruge for 2 timer ved 37 ° c.
- Transformer T7 Express lysY/IQ kompetente E. coli -celler med 2 ΜL av DpnI-reaksjonen.
- Vaksinere 100 mL LB inneholdende 100 μg/mL Ampicillin med de transformert cellene og ruge over natten ved 37 ° c med risting ved 200 rpm.
- Lag fryser aksjer med 10 mL av natten kultur i LB med 15% glyserol og lagre ved-80 ° c.
3. utvalg av bakterier uttrykker Biotinylated peptid
Merk: Denne delen av protokollen dekker trinn 2-5 i figur 1c. Det anbefales på det sterkeste at valg tilnærmingen er oppsett ved hjelp av pBAD-BirA-eCPX-AP og pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A) som positive og negative kontroller.
- Vaksinere 100 mL LB inneholder 1% glukose og 100 μg/mL Ampicillin med 1 mL BirA-bibliotek og ruge over natten ved 37 ° c med risting ved 200 rpm.
- Vaksinere 5 mL LB inneholdende 1% glukose og 100 μg/mL Ampicillin med 100 μL av natt kulturen.
- Ruge for 2 t og 30 min til kulturen når en OD600 på ca 0,5.
- Indusere eCPX og BirA uttrykk med 0,2% w/v L-arabinose, 100 μM isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTH) og 100 μM biotin og riste kulturen ved 200 RPM for 1 time ved 37 ° c.
- Sentrifuger kulturen i 10 min ved 5 000 x g og fjern supernatanten.
- Resuspend cellene i 1 mL av iskald PBS og sentrifuger på 5 000 x g i 5 min.
- Kast supernatanten og resuspend cellene i 400 μL av iskald PBS og lagre celler på isen.
- Fjern 10 μL av resuspendert celler og oppbevar på isen i et 1,5 mL rør merket "input".
- Vask 20 μL av streptavidin magnetiske perler i 1 mL iskald PBS og plasser røret i en benk topp magnetisk partikkel separator før du forsiktig fjerner supernatanten.
- Resuspend de streptavidin magnetiske perlene i 20 μL av iskald PBS og Overfør til 390 μL av resuspendert celler fra trinn 3,8.
- Bland ved å forsiktig pipettering og deretter ruge i 30 min ved 4 ° c.
Merk: Ikke Vortex, da dette kan lyse cellene. Aggregering av perler er ofte observert med en høy overflod av bakterier som viser en biotinylated peptid. - Plasser en kolonne med ferromagnetisk kuler i en magnetisk partikkel separator og vask med 5 mL iskald PBS.
- Overfør celler og streptavidin magnetiske perler til kolonnen vedlagt i separatoren.
- Når Kol onne reservoaret er tomt, tilsett 500 μL av iskald PBS og gjenta til kolonnen har blitt vasket med et samlet volum på 5 mL iskald PBS.
- Fjern kolonnen fra separatoren og plasser den i et 1,5 mL rør.
- Pipette 1 mL av iskald PBS til kolonnen og eluere de magnetisk merkede cellene ved å bruke stempelet som følger med kolonnen.
- Overfør 1,5 mL røret til en benkeplate separator og vask magnetisk merket celle med 1 mL iskald PBS.
- Resuspend forsiktig de magnetisk merkede cellene i 1 mL iskald PBS før du fjerner og oppbevarer 10 μL av blanding i et 1,5 mL rør merket "output".
- Vaksinere 100 mL LB inneholder 1% glukose og 100 μg/mL Ampicillin med magnetisk merkede celler og ruge over natten ved 37 ° c med risting ved 200 rpm.
- Neste dag, bruker 10 mL av natten kultur for å lage fryse aksjer med celler i LB med 15% glyserol og lagre på-80 ° c og 1 mL av natten kultur for neste runde av utvalget, dvs, trinn 3,2.
Merk: Vanligvis er 3-5 runder av utvalget anbefalt for berikelse av streptavidin bindende bakterier.
4. kvantifisering av berikelse
Merk: Kvantifisering av levende bakterier i "input" og "output" prøvene er utført etter hvert valg runde av plating av seriell fortynninger av prøvene og påfølgende telling av kolonien forming enheter (CFUs).
- Legg 990 μL iskald PBS til innspill (fra trinn 3,8) og utgang (fra trinn 3,18) prøver og etiketten rørene "input 10-2" og "output 10-2", henholdsvis.
- Lag 10-fold seriell fortynninger av "input 10-2" og "output 10-2" prøver i iskald PBS til en endelig fortynning av 10-10 er nådd i input prøven og 10-4 i output prøven.
- Plate 100 μL av prøver fra "input 10-6", "inngang 10-8", "input 10-10", "utgang 10-2", "output 10-3" og "output 10-4" på lb/amp plater og ruge over natten ved 37 ° c.
- Tell antall kolonier på platene med klart adskilte kolonier. Multiplisere kolonien telle med fortynning faktor for å oppnå bakteriell konsentrasjon Count/100 μL.
- Beregn totalt bakteriell telling i input og output prøver ved å multiplisere celle konsentrasjonen med input (400 μL) og output volum (1 mL), henholdsvis, og anslå berikelse ved å dele utgang med input celle telling.
Merk: En betydelig berikelse bør være synlig etter 3-5 utvalg runder
5. karakterisering av valgt BirA variant
Merk: Karakterisering kan utføres etter å ha valgt BirA varianter fra det første BirA biblioteket; imidlertid har BirA varianter generelt lav aktivitet mot peptid. Derfor kan en ekstra runde av mutasjon og valg også utføres før karakterisering. Vanligvis er 10 kloner fra den endelige valg runden isolert for videre karakterisering.
- Vaksinere 5 mL LB inneholdende 100 mikrogram/mL Ampicillin med utvalgte kloner fra den endelige valg runden. I tillegg, vaksinere 5 mL LB som inneholder 100 μg/mL Ampicillin med T7 Express lysY/IQ E. coli forvandlet med PBAD-BirA-ECPX-AP, som vil bli brukt som en positiv kontroll for den vestlige blot beskrevet nedenfor.
- Ruge over natten ved 37 ° c med risting ved 200 rpm.
- Lag fryse aksjer på 850 μL av hver overnatting kultur ved å legge glyserol til en endelig konsentrasjon på 15% til kulturen. Store ved-80 ° c.
- Vaksinere 5 mL LB inneholdende 100 mikrogram/mL Ampicillin med 100 μL av natt kultur og ruge ved 37 ° c med risting ved 200 RPM for 2 timer.
- Pakk ut plasmider DNA fra de resterende 4 mL kultur av s kommersielt mini-prep DNA utvinning Kit. Utfør DNA sekvensen i fremover og bakover retninger av BirA varianter med pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) og pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) primere.
- Legg til 0,2% w/v L-arabinose og 100 μM IPTH og 100 μM biotin mot kulturer fra trinn 5,4 og riste kulturen ved 200 RPM for 1 time ved 37 ° c for å indusere uttrykk for eCPX-og BirA-varianter.
- Overfør 65 μL av kulturen til 1,5 mL rør som inneholder 25 μL av prøve belastnings bufferen og 10 μL av reduksjons MIDlet.
- Ruge ved 95 ° c i 5 min.
- Legg prøven (inkludert den positive kontrollen) på en 12% SDS-polyakrylamid-gel sammen med en størrelses markør og utfør gel-elektroforese på 200 V i ca. 45 min til standard båndene til 20, 25 og 37 kDa er klart adskilt.
- Løsne gelen fra kassetten og Monter sandwich for blotting av gel på en PVDF membran.
- Electroblot på 35 V for 2 t på isen.
- Fjern PVDF-membranen og ruge i blokkerings bufferen [PBS, 0,05% mellom-20, 3% skummet melkepulver] i 1 time ved romtemperatur med risting.
- Klargjør biotin-deteksjons løsningen ved å fortynne streptavidin-HRP 1:1000 i PBST.
Merk: Blokkerings bufferen inneholder biotin og bør derfor ikke brukes som fortynnings buffer for streptavidin-HRP. - Kast blokkerings bufferen, vask membranen raskt i PBST [PBS, 0,05% mellom-20] og tilsett biotin-deteksjons løsningen. Ruge for 1 time ved romtemperatur med risting.
- Kast biotin-deteksjon løsningen og vask membranen grundig i PBST for 5 min to ganger og 10 min en gang med forsiktig risting ved romtemperatur.
- Kast PBST, tilsett 2 mL ECL mix og ruge i 1 min med risting.
- Tørk membranen raskt på en silkepapir og utvikle bildet på en X-ray film eller i et digitalt gel Imaging system.
Merk: I kjørefelt som er lastet med positiv kontroll, bør to distinkte streptavidin være godt synlig: en 30 kDa biotinylated endogenously uttrykt protein og ~ 22 kDa eCXP-AP-båndet. Hvis de 10 valgte koloniene kan biotinylate den viste peptid, et band på ~ 22 kDa skal være synlig. Intensiteten av disse bandene er generelt lavere enn den positive kontrollen og kan derfor kreve lengre eksponeringstider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Western Blot av pBAD-BirA-eCPX-AP uttrykker bakterier produserer en ~ 22 kDa streptavidin-reagerer bandet i samsvar med Molekylvekten av eCPX (figur 2a). I motsetning til BirA-6xHis, biotinylated eCPX-AP var til stede i både uninduced og indusert kulturer (figur 2a) på grunn av en liten grad av T7 promoter aktivitet selv i uninduced kulturer og påfølgende biotinylation av AP av endogene BirA. I BirA-eCPX-AP (K10A) som uttrykker kulturer, ble det ikke funnet noe biotinylated eCPX-band (figur 2a). Den sterke overflate biotinylation i eCPX-AP uttrykker bakterier forårsaker aggregering ved tilsetning av streptavidin magnetiske perler og dannelsen av en pellet på bunnen av et rør (figur 2b). I eCPX-AP (K10A) uttrykk bakterier, streptavidin-perle aggregering og utfelling ble ikke observert (figur 2b). Analyse av utfelling fra streptavidin rullegardin, viser en klar 22-kDa streptavidin-reaksjon og anti-6xHis band i prøvene fra eCPX-AP kulturer, men ikke eCPX-AP (K10A) kulturer (figur 2c). Tilsvarende var antall bakterier bundet til streptavidin-perlene signifikant høyere i eCPX-AP enn eCPX-AP (K10A) kulturer (figur 2d).
For å velge for BirA varianter som biotinylate et mål peptid, dens DNA sekvensen ble innlemmet i C-terminal av eCPX av PCR ved hjelp av primere utformet i trinn 1,10 og 1,11. Et eksempel på primere utformet for inkorporering av en peptid sekvens avledet fra α-delenhet av epitel na+ Channel (ENaC) er vist i Figur 3a. Etter PCR ble en 5-μL alikvot analysert av agarose gel elektroforese og et klart og sterkt bånd på ~ 5900 BP ble observert (Figur 3b).
Etter generering av BirA mutasjon biblioteket ble utvalget av aktive BirA-varianter initiert. En lav grad av streptavidin kontra input bakterier var forventet etter første valg runde. Men etter 2nd og 3Rd utvalg runder en klar berikelse ble observert i graden av Streptavidin-bundet bakterier Figur 4a). Hvis en klar berikelse ikke oppdages (Figur 4b), det er en indikasjon på svikt i BirA varianter å biotinylate peptid og en annen peptid sekvensen bør derfor testes.
Etter den siste valg runden, 10 kloner var preget av vestlige blotting for deres evne til å biotinylate den viste peptid (Figur 4c). I positiv kontroll (dvs. AP), var ~ 22 kDa band tilsvarende biotinylated eCPX-AP observert i en vestlig blot analysert med streptavidin-HRP (Figur 4c). I de testede kloner, var et band på samme størrelse indikasjon på biotinylation av den viste peptid smeltet til eCPX (Figur 4c). Intensiteten av de ~ 22 kDa-bandene var lavere enn intensiteten til eCPX-AP-båndet i den positive kontrollen, noe som indikerer en lavere aktivitet for de isolerte BirA-variantene. Den isolerte kloner kan derfor brukes som en mal for en ny runde med mutasjoner og utvalg, gir svært aktive kloner. Flere band indikerer de isolerte kloner var ikke spesifikke mot den viste peptid og at flere mål ble også biotinylated (Figur 4c).
| Reagens | volum (μL) |
| 5x reaksjons buffer | 4 |
| 10 mM dNTP | 0,4 |
| 10 μM forover primer | 1 |
| 10 μM omvendt primer | 1 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Variabel (~ 25 ng) |
| DNA-polymerase av høy kvalitet | 0,20 |
| Nuklease-fritt vann | til 20 |
Tabell 1: PCR-reagenser. Enheter og volumer kan variere mellom produsenter.
| Reagens | volum (μL) |
| 2x enzym blanding | 25 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP med mål peptid sekvens * | Variabel (~ 50 ng) |
| Mutant megaprimer | 250 av ng |
| Buffer | 3 |
| Nuklease-fritt vann | til 50 |
Tabell 2: feilutsatte PCR-reagenser. Enheter og volumer kan variere mellom produsenter. * utarbeidet i del 1 av protokollen.
Figur 1: bakteriell display system for BirA-valg. (a) systemet var basert på co-uttrykk for 2 komponenter: BirA og eCPX smeltet sammen med Acceptor PEPTID (AP). eCPX transporteres til overflaten, og hvis BirA-varianten biotinylates AP, vises biotin (rød B) som er festet til eCPX-AP på overflaten. (b) systemet ble uttrykt fra plasmider PBAD-BirA-ECPX-AP, der BirA uttrykket styres av en arabinose-induserbart arrangøren og ECPX-Ap uttrykk er drevet av T7 arrangøren. (c) etter generering av et tilfeldig mutert bibliotek av BirA-variantene (trinn 1), BirA og ECPX-Ap-uttrykket ble indusert (trinn 2). Bakterier ble inkubert med affinitet reagens (trinn 3), ubundne bakterier ble forkastet (trinn 4) og utvalgte bakterier ble forsterket (trinn 5). Dette tallet er endret fra Granhøj et al.9Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative resultater fra modell utvalg med pBAD-BirA-eCPX-Ap og pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A). (a) ved vestlig blotting, ECPX-Ap ble observert å være biotinylated i både uninduced og indusert bakterier, mens ingen Biotinylation av ECPX-AP (K10A) ble oppdaget selv etter induksjon av BirA. BirA-uttrykket ble oppdaget av anti-6xHis-antistoff. * Angir et løs streptavidin protein når BirA ble indusert. (b) bakterielle kulturer med indusert uttrykk for BirA og ECPX-Ap samlet raskt etter tilsetning av magnetiske streptavidin-perler (pil), mens ingen aggregering ble OBSERVERT i AP (K10A) bakterier. (c) BirA var tilstede i bakterier som uttrykker ECPX-Ap og ECPX-AP (K10A) før thestreptavidin-rullegardin (input), men bare BirA i ECPX-Ap uttrykker bakterier ble trukket ned av streptavidin. I avtalen, (d) levedyktige bakterier ble igangsatt effektive i ECPX-AP, men ikke ECPX-AP (K10A), uttrykker bakterier. Dette tallet er endret fra Granhøj et al.9Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: primer design og inkorporering av målet peptid koding sekvens i pBAD-BirA-eCPX-Ap av PCR. (a) et eksempel på primere design som brukes for inkorporering av et peptid sekvens avledet fra αENaC inn i C-terminalen i eCPX. Biotin akseptere lysin er vist i rødt. Målet peptid sekvensen var omvendt oversatt til DNA, og fremover og omvendt primere ble utformet ved å sikre en ~ 15 base overlapping mellom primere. (b) representative agarose gel ELEKTROFORESE av PCR med PBAD-BirA-ECPX-Ap som mal og primere spesifikk for α, β, og γ-ENaC avledet peptid sekvenser, henholdsvis. Et klart og sterkt DNA-produkt på ~ 5900 BP var en indikasjon på en vellykket PCR. "M" angir markerings bane. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative resultater fra utvelgelse og karakterisering av bakterier som viser peptider. Bakterier viser et peptid avledet fra (a) TagRFP viste en klar berikelse etter 3 utvalg runder, mens et peptid avledet fra (b) EGFP viste ingen berikelse av streptavidin-bundet bakterier selv etter 4 utvalg runder. (c) 10 kloner av bakterier som viser et peptid fra γENaC gjennom 5 utvalg runder ble testet for deres evne til å Biotinylate den γENaC-peptid. Alle 10 kloner viste en streptavidin-reaksjon band i samsvar med størrelsen på eCPX-AP, som indikerer at de isolerte kloner inneholder BirA varianter som biotinylate den viste peptid. Ytterligere streptavidin ble også observert, noe som tyder på at andre proteiner, foruten den viste peptid, også ble biotinylated. * Indikerer en endogene E. coli protein Biotinylated av BirA. Dette tallet er endret fra Granhøj et al.9Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som for alle utvalgsmetoder, er stringens av vaske trinnene av største betydning. Siden bakterier ikke trenger å bli eluert fra perlene før forsterkning av de utvalgte kloner, kan den høye affinitet binding mellom biotin og streptavidin brukes i stedet for å bruke lavere affinitet avidins, som tidligere gjort med phage display system, for utvalget av BirA varianter7,8. Dette sikrer at sjeldne kloner er valgt og at ikke-biotinylated bakterier blir forkastet. En annen fordel med å bruke bakteriell display, sammenlignet med phage display, er at bakteriell display er kvantitativ11 og derfor tillater valg av bakterier basert på enzymatisk aktivitet.
I protokollen, brukte vi MACS å velge for bakterier å skape en binær utvalg system basert på tilstedeværelse eller fravær av biotin på overflaten. Men ved hjelp av kvantitative fluorescens aktivert celle sortering, i stedet, bør det være mulig å velge for bakterier som uttrykker de mest aktive variantene av BirA. Dette vil være viktig i den fremtidige utviklingen av romanen BirA varianter som det vil tillate en effektiv valg for de mest aktive BirA varianter.
Vi har så langt brukt bakteriell visning av 14 forskjellige peptider og, av disse, 13 produserte en klar berikelse9, noe som indikerer at vårt utvalg systemet gir en robust metode for å velge for romanen BirA varianter. I det nåværende oppsettet har vi bare testet utvalget av BirA-varianter som er aktive mot 15-aminosyre-peptider, og derved fortrinnsvis vi valgt for BirA-variantene som er aktive mot den primære sekvensen av mål proteinet. Den målrettede lysin kan imidlertid bli begravet inne i 3D strukturen av et protein eller ikke være ellers tilgjengelig for BirA, gir BirA varianter som ikke er aktive mot deres mål protein. En potensiell løsning ville være å vise større protein fragment på eCPX. Den eCPX stillaset er allsidig med hensyn til peptid display11; Det er imidlertid ikke kjent om større proteiner kan vises.
Vi brukte utvalget systemet til å isolere en BirA variant som biotinylates native TagRFP9. Det testet BirA variant spesielt biotinylated TagRFP på mål lysines, bortsett fra aktiviteten av det isolere variant var lav9. Derfor bør ytterligere runder med rettet evolusjon utføres for å forbedre sin aktivitet. Målet peptid er i C-Terminus av TagRFP, der den strukturelle likheten mellom den viste peptid og protein regionen er mer sannsynlig. Bioinformatic analyse av alle menneskelige og mus proteiner viser at ~ 75% av proteinene inneholder en eller flere lysin innenfor deres første og/eller siste 30 aminosyrer9. Dermed kan bakteriell display system av peptider potensielt brukes til å isolere aktive BirA varianter mot en stor brøkdel av innfødte proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Mohamed Abdullahi Ahmed for eksperten tekniker assistanse. Dette arbeidet ble støttet av stipend fra Lundbeck Foundation, Novo nordisk Foundation, den danske nyre foreningen, Aase og Ejnar Danielsen Foundation, A.P. Møller Foundation for fremming av medisinsk vitenskap, og Knud og Edith Eriksen Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
