Summary
Her præsenterer vi en metode til at vælge for nye varianter af E. coli biotin-protein Ubiquitinligase BirA at biotinylates et specifikt mål peptid. Protokollen beskriver opførelsen af en plasmid for bakteriel visning af målet peptid, generation af en BirA bibliotek, udvælgelse og karakterisering af BirA varianter.
Abstract
Biotin er en attraktiv post-translationel modifikation af proteiner, der giver en kraftfuld tag til isolering og påvisning af protein. Enzymatisk biotinylering af E. coli biotin-protein Ubiquitinligase BirA er meget specifik og giver mulighed for biotinylering af målproteiner i deres oprindelige miljø; Men, den nuværende brug af BirA medieret biotinylering kræver tilstedeværelsen af en syntetisk acceptor peptid (AP) i målet protein. Derfor er dens anvendelse begrænset til proteiner, der er blevet konstrueret til at indeholde AP. Formålet med denne protokol er at anvende bakterie visningen af et peptid afledt af et ikke-modificeret målprotein til at udvælge de varianter af BirA, som biotinylerer peptid. Systemet er baseret på en enkelt plasmid, der giver mulighed for Co-ekspression af BirA varianter sammen med et stillads for peptid displayet på den bakterielle overflade. Protokollen beskriver en detaljeret procedure for inkorporering af målet peptid i displayet stillads, oprettelse af BirA bibliotek, udvælgelse af aktive BirA varianter og indledende karakterisering af de isolerede BirA varianter. Metoden giver et meget effektivt udvælgelsessystem til isolering af nye BirA varianter, der kan bruges til yderligere rettet udvikling af biotin-protein ligaser, der biotinylate et indfødt protein i komplekse opløsninger.
Introduction
Biotinylering af et protein skaber en kraftfuld tag for sin affinitet isolation og detektion. Enzymatisk protein biotinylering er en meget specifik post-translationel modifikation katalyseret af biotin-protein-ligaser. E. coli biotin-protein Ubiquitinligase BirA er yderst specifik og kovalent biotinylater kun et begrænset antal naturligt forekommende proteiner ved specifikke lysinrester1. Fordelene ved BirA katalyseret biotinylering udnyttes i øjeblikket ved at fusing målproteinet med en lille syntetisk 15-aminosyre biotin acceptor peptid (AP), der effektivt er biotinyleret2 og giver mulighed for den meget specifikke og effektiv in vivo-og in vitro-biotinylering ved co-ekspression eller tilsætning af BirA3,4,5. Selvom in vivo og in vitro-katalyseret biotin-protein ligering er en attraktiv mærknings strategi, er dens anvendelse begrænset til prøver, der indeholder AP-smeltet proteiner. Formålet med denne metode er at udvikle nye mutanter af biotin-protein-ligaser, der selektivt biotinylerer indfødte umodificerede proteiner og derved udvider antallet af anvendelser, hvor den enzymatiske biotinyleringstrategi kan anvendes.
Protein funktionen kan udvikles gennem iterativ runder af genmutationen, udvælgelsen og amplificeringen af genvarianter med den ønskede funktion. En stærk og effektiv udvælgelses strategi er afgørende for den instruerede evolution og biotin-protein ubiquitinligase aktivitet er let udvalgt på grund af den stærke binding mellem biotin og streptavidin og dens homologer6. Phage display Technologies giver mulighed for udvælgelse af fager, der viser biotinylerede peptider7,8. Da forstærkning af isolerede fager kræver infektion af en bakteriel vært, men fagtypning udvælgelse med streptavidin skaber en flaskehals i, at den høje affinitet binding af biotin til streptavidin er næsten irreversibel under ikke-denaturering Betingelser. For at sikre reversibel binding af biotinylerede fager blev der anvendt monomeriske avidiner med lavere affinitet, hvilket resulterede i en beskeden ~ 10-fold berigelse7. Vi har for nylig udviklet en bakteriel visningsmetode til isolering af nye BirA varianter, der eliminerer behovet for eluering fra Affinity matrix og dermed fjerner en flaskehals fra tidligere BirA udvælgelsessystemer9. Faktisk giver vores bakterielle display system mulighed for en > 1, 000, 000-fold berigelse af aktive kloner i et enkelt valg trin9, hvilket giver et effektivt udvælgelsessystem for den rettede udvikling af nye BirA varianter.
Vores bakterielle display system består af to komponenter, BirA med en C-Terminal 6xHis tag og et stillads protein, der giver mulighed for overfladen visning af et mål peptid. Vi brugte stilladset protein forbedret cirkulært permuteret ydre membran protein X (eCPX), da den effektive visning af peptider kan observeres på både N-og C-Termini10,11. Den fusion af Target peptid sekvens til C-endestation af eCPX sikrer biotinylering af bakterier, som udtrykker aktive BirA varianter. Bakterierne giver mulighed for et effektivt streptavidin-valg, da det biotinylerede peptid nu vises på overfladen (figur 1a).
Formålet med denne metode er at udvælge nye varianter af BirA, som biotinylater peptidsekvenser til stede i indfødte proteiner. Systemet er kodet af gener, der findes på plasmid pBAD-BirA-eCPX-AP, som indeholder en Arabinose-inducerbar promotor, som kontrollerer BirA (araBAD), og en T7-promotor, som styrer eCPX9 (figur 1b). Denne protokol beskriver den detaljerede procedure for 1) inkorporering af et peptid afledt af et målprotein i C-terminalen af ecpx, 2) oprettelse af et Mutations Library of BirA med fejlbehæftet PCR, 3) udvælgelse af streptavidin-binding bakterier ved magnetisk-aktiveret celle sortering (MACS), 4) kvantificering af bakterie berigelse, og 5) indledende karakterisering af isolerede kloner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. indsættelse af Peptidkodning sekvensering sekvens i pBAD BirA-eCPX-AP
Bemærk: For at vælge for BirA varianter, biotinylate en Native Target protein, starte med at identificere en 15-aminosyre peptid sekvens i proteinerne primære sekvens, der indeholder mindst én lysin (K) rest.
- Gå til sekvens manipulation Suite12.
- Indsæt den identificerede 15 aminosyre peptidsekvens i indtastningsfeltet i FASTA format, og tryk på submit.
- Vælg og Kopiér 45-nukleotidomvendt oversættelse af peptidsekvensen.
- Download GenBank-filen til pBAD-BirA-eCPX-AP fra http://n2t.net/addgene:121907.
- Indlæs filen i et plasmid-redigeringsprogram (f. eks. ApE), og vælg i funktions vinduet den AP-sekvens , der er angivet "avitag (TM)".
- Højreklik på den fremhævede AP-sekvens i DNA-sekvens vinduet, og vælg Indsæt rev-com i genvejsmenuen.
Bemærk: Kodning sekvens af eCPX er i modsat retning og peptid kodning sekvens bør derfor indsættes som en omvendt supplement. - Højreklik på den fremhævede sekvens, og vælg ny funktion.
- Tilføj et beskrivende navn på den indsatte sekvens, og tryk på OK.
- Vælg Gem som i menuen filer for at gemme den ændrede fil.
- Design Forward primer for at inkludere de sidste 30 nukleotider i det omvendte komplement af peptidkodnings sekvensen og tilsæt plasmid-bindings nukleositidsekvensen (3 '-GCGGCCGCCTGC-5 ') til dens 5 ' ende.
- Design den omvendte primer for at inkludere de første 30 nukleotider i det omvendte komplement af peptidkodnings sekvensen, og tilsæt plasmid bindende nukleosid sekvensen (3 '-CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5 ') til dens 5 ' ende.
- Der oprettes en 20 μL PCR-reaktion i et tyndt indhegnet PCR-rør ved at tilføje de reagenser, der er anført i tabel 1.
- Rør overføres til en termisk variator, og Udfør PCR ved hjælp af et program med en Initial denaturering ved 98 °c i 30 s, 30 cyklusser på [15 s ved 98 °c, 15 s ved 60 °c og 3 min ved 72 °c], endelig forlængelse i 2 min ved 72 °c og hold ved 4 °c.
- Kør 5 μL af PCR-reaktionen på en 1% agopstået gel for at bekræfte amplificeringen af et ~ 6 KB PCR-produkt.
Bemærk: Hvis der ikke observeres et PCR-produkt, skal PCR-betingelsen optimeres i henhold til producentens anvisninger. Protokollen kan sættes på pause her. - Tilsæt 1 μL DpnI til PCR-reaktionen, og Inkuber i 1 time ved 37 °C
- Den kompetente E. coli transformeres med 2 ΜL DPNI-FORDØJET PCR-reaktion og plade på Lysogenic BOUILLON (lb)/amp-plader. Inkuber natten over ved 37 °C.
- Inoculate 5 mL LB indeholdende 100 μg/mL ampicillin med en enkelt koloni. Inkuber natten over ved 37 °C med omrystning ved 200 rpm.
Bemærk: Det anbefales at teste mindst 6 kolonier. - Lav fryselagre på 850 μL af hver dag kultur ved tilsætning af glycerol til en endelig koncentration på 15% til kulturen. Opbevares ved-80 °C.
- Udpak plasmid-DNA fra den resterende 4 mL-kultur med mini-prep-DNA-ekstraktions udstyr.
- Bekræft den korrekte indsættelse af peptidkodnings sekvensen ved DNA-sekvensering ved hjælp af T7 Terminal primer (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).
2. generation af et BirA bibliotek
Bemærk: Det oprindelige BirA Mutations Library (figur 1c, trin 1) er skabt af fejlbehæftet PCR. Andre metoder til at generere BirA Mutations Library er tilbøjelige til at arbejde så godt.
- Syntetisere de mutante megaprimers med BirA-6xHis Forward (ATGAAGGATAACACCGTGCC) og reverse (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) primere ved hjælp af 1 ng af pBAD-BirA-eCPX med målet peptid sekvens (forberedt og bekræftet i trin 1,20) som en skabelon og 35 PCR cyklusser med en udglødnings temperatur på 60 °C i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Der køres 5 μL af forstærknings reaktionen på en 1% agopstået gel for at verificere amplificeringen af et 984 BP PCR-produkt.
- PCR-produktet skal rense fra de resterende 45 μL af forstærknings reaktionen ved hjælp af et kommercielt PCR-rensningsudstyr og bruge et spektrofotometer til at kvantificere DNA-udbyttet.
Bemærk: Oprensning fra en enkelt 45 μL forstærknings reaktion giver generelt et tilstrækkeligt udbytte (> 250 ng). - Prøve reaktionen forberedes i et tyndt indhegnet PCR-rør ved at tilføje de reagenser, der er anført i tabel 2.
- Reaktionsblandingen overføres til en termisk variator og køres PCR med de mutante megaprimers fremstillet i trin 2,3 ved hjælp af følgende parametre: 1 min ved 95 °c og 25 cyklusser af 50 s ved 95 °c, 50 s ved 60 °c og 12 min ved 68 °c. Reaktionen opbevares ved 4 °C.
- Tilsæt 1 μL DpnI-begrænsnings enzym direkte til forstærknings reaktionen, og bland forsigtigt.
- Drej reaktionsblandingen ned, og Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
- Omdan T7 Express lysY/IQ kompetente E. coli -celler med 2 ΜL DPNI-reaktion.
- Inoculate 100 mL LB indeholdende 100 μg/mL ampicillin med de transformerede celler og Inkuber natten over ved 37 °C med omrystning ved 200 rpm.
- Lav fryselagre med 10 mL af den overnight kultur i LB med 15% glycerol og opbevares ved-80 °C.
3. udvælgelse af bakterier, som udtrykker biotinyleret peptid
Bemærk: Denne del af protokollen dækker trin 2-5 i figur 1c. Det anbefales stærkt, at udvælgelsesmetoden er setup ved hjælp af pBAD-BirA-eCPX-AP og pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A) som positive og negative kontroller.
- 100 mL LB indeholdende 1% glucose og 100 μg/mL ampicillin med 1 mL BirA-bibliotek og Inkuber natten over ved 37 °C med omrystning ved 200 rpm.
- Der inokuleres 5 mL LB indeholdende 1% glucose og 100 μg/mL ampicillin med 100 μL af natkulturen.
- Inkuber i 2 timer og 30 min, indtil kulturen når en OD600 på ca. 0,5.
- Inducerer eCPX-og BirA-ekspression med 0,2% w/v L-Arabinose, 100 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) og 100 μM biotin, og ryst kulturen ved 200 rpm i 1 time ved 37 °C.
- Centrifuger kulturen i 10 minutter ved 5.000 x g , og Fjern supernatanten.
- Cellerne opslæmmes i 1 mL iskold PBS og centrifugeres ved 5.000 x g i 5 min.
- Kassér supernatanten og resuspension cellerne i 400 μL iskold PBS og opbevar cellerne på isen.
- Fjern 10 μL af resuspenderede celler og opbevar på isen i et 1,5 mL rør mærket "input".
- Der vaskes 20 μL streptavidin-magnetiske perler i 1 mL iskold PBS, og røret placeres i en magnetisk partikel separator i en bænk, før supernatanten forsigtigt fjernes.
- De magnetiske perler af streptavidin opslæmmes i 20 μL iskold PBS og overføres til 390 μL af resuspenderede celler fra trin 3,8.
- Bland forsigtigt med pipettering og Inkuber derefter i 30 min ved 4 °C.
Bemærk: Må ikke vortex, da dette kan lysere cellerne. Sammenlægning af perler observeres ofte med en høj overflod af bakterier, der viser et biotinyleret peptid. - Placer en søjle med ferromagnetiske kugler i en magnetisk partikel separator, og vask med 5 mL iskold PBS.
- Overfør celler og streptavidin magnetiske perler til kolonnen vedhæftet i separatoren.
- Når kolonne beholderen er tom, tilsættes 500 μL iskold PBS og gentages, indtil søjlen er vasket med et samlet volumen på 5 mL iskold PBS.
- Fjern kolonnen fra separatoren og Placer den i et 1,5 mL rør.
- Der afpipetteres 1 mL iskold PBS på søjlen, og de magnetiske mærkede celler elueres ved at anvende stemplet, der følger med søjlen.
- 1,5 mL røret overføres til en bænk topseparator og vaskes med en magnetisk mærket celle med 1 mL iskold PBS.
- Resuspender forsigtigt de magnetisk mærkede celler i 1 ml iskold PBS, før du fjerner og opbevarer 10 μl af opblanding i et 1,5 ml rør mærket "output".
- 100 mL LB indeholdende 1% glucose og 100 μg/mL ampicillin med de magnetisk mærkede celler og Inkuber natten over ved 37 °C med omrystning ved 200 rpm.
- Den næste dag, bruge 10 mL af natten kultur til at gøre fryselagre med celler i LB med 15% glycerol og opbevares ved-80 °C og 1 mL af natten kultur til næste runde af udvælgelse, dvs trin 3,2.
Bemærk: Generelt anbefales 3-5 runder af udvælgelse til berigelse af streptavidin binding bakterier.
4. kvantificering af tilsætning
Bemærk: Kvantificering af de levende bakterier i "input" og "output" prøver udføres efter hver udvælgelsesrunde ved plating af serielle fortyndinger af prøverne og efterfølgende optælling af kolonidannende enheder (CFUs).
- Tilsæt 990 μL iskold PBS til indgangen (fra trin 3,8) og udgang (fra trin 3,18) prøver og mærk henholdsvis rørene "indgang 10-2" og "udgang 10-2".
- Der foretages 10-dobbelte serielle fortyndinger af prøverne "input 10-2" og "output 10-2" i iskold PBS, indtil der opnås en endelig fortynding på 10-10 i indgangs prøven og 10-4 i output prøven.
- Plade 100 μL af prøverne fra "indgang 10-6", "indgang 10-8", "indgang 10-10", "udgang 10-2", "udgang 10-3" og "udgang 10-4" på LB/amp plader og Inkuber natten over ved 37 °c.
- Tæl antallet af kolonier på pladerne med klart adskilte kolonier. Kolonien multipliceres med fortyndingsfaktoren for at opnå den bakterielle koncentrations tælling/100 μL.
- Beregn det totale bakterie antal i input-og output prøverne ved at multiplicere celle koncentrationen med input (400 μL) og udgangsvolumen (1 mL) og anslå berigning ved at dividere output med input celletal.
Bemærk: En signifikant berigelse bør være synlig efter 3-5 udvælgelsesrunder
5. karakterisering af udvalgte BirA variant
Bemærk: Karakteriseringen kan udføres efter at have valgt BirA varianter fra det første BirA bibliotek; Men, BirA varianter generelt har lav aktivitet mod peptid. Derfor kan en ekstra runde af mutation og udvælgelse også udføres før karakteriseringen. Normalt, 10 kloner fra den endelige udvælgelse runde er isoleret til yderligere karakterisering.
- Der inoculate 5 mL LB indeholdende 100 μg/mL ampicillin med udvalgte kloner fra den endelige udvælgelsesrunde. Desuden podes 5 ml lb indeholdende 100 μg/ml ampicillin med T7 Express Lysy/IQ E. coli omdannet med pbad-BirA-ecpx-AP, som vil blive anvendt som en positiv kontrol for den vestlige blot beskrevet nedenfor.
- Inkuber natten over ved 37 °C med omrystning ved 200 rpm.
- Lav fryselagre på 850 μL af hver dag kultur ved tilsætning af glycerol til en endelig koncentration på 15% til kulturen. Opbevares ved-80 °C.
- Der inokuleres 5 mL LB indeholdende 100 μg/mL ampicillin med 100 μL natkultur og Inkuber ved 37 °C med omrystning ved 200 rpm i 2 timer.
- Pak plasmid-DNA ud af den resterende 4 mL-kultur med s kommercielt mini-prep-DNA-ekstraktions udstyr. Udfør DNA-sekvensen i fremad-og omvendt retning af BirA-varianterne med pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) og pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) primere.
- Tilsæt 0,2% w/v L-Arabinose og 100 μM IPTG og 100 μM biotin til kulturer fra trin 5,4, og ryst kulturen ved 200 rpm i 1 time ved 37 °C for at inducere ekspression af eCPX-og BirA-varianter.
- 65 μL af kulturen overføres til 1,5 mL rør, der indeholder 25 μL af prøve indlæsnings bufferen og 10 μL af reduktionsmidlet.
- Inkuber ved 95 °C i 5 minutter.
- Læg prøven (inklusive den positive kontrol) på en 12% SDS-polyacrylamidgel sammen med en størrelses markør og Udfør gel elektroforese ved 200 V i ca. 45 min, indtil de 20, 25 og 37 kDa standardbånd er tydeligt adskilte.
- Slip gelen fra kassetten og saml sandwichen til blotting af gelen på en PVDF-membran.
- Electroblot ved 35 V i 2 timer på is.
- Fjern PVDF-membranen, og Inkuber i blokerende buffer [PBS, 0,05% Tween-20, 3% skummetmælkspulver] i 1 time ved stuetemperatur ved omrystning.
- Klargøring af biotin-detektionsopløsningen ved fortynding af streptavidin-HRP 1:1000 i PBST.
Bemærk: Blokerende buffer indeholder biotin og bør derfor ikke anvendes som fortyndingsbuffer til streptavidin-HRP. - Kassér blokerende buffer, vask membranen hurtigt i PBST [PBS, 0,05% Tween-20] og tilsæt biotin-detektionsopløsningen. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur ved omrystning.
- Kassér biotin-detektionsopløsningen, og vask membranen grundigt i PBST i 5 minutter to gange og 10 min én gang med blid omrystning ved stuetemperatur.
- Kassér PBST, tilsæt 2 mL ECL mix og Inkuber i 1 min. ved omrystning.
- Tør membranen hurtigt på et vævs papir, og udvikl billedet på en røntgenfilm eller i et digitalt gelbilledbehandlings system.
Bemærk: I den vognbane, der er lastet med den positive kontrol, skal to forskellige streptavidin-reaktions bånd være tydeligt synlige: en 30 kDa biotinyleret endogent udtrykt protein og ~ 22 kDa eCXP-AP-båndet. Hvis de 10 udvalgte kolonier kan biotinylere det viste peptid, skal et bånd på ~ 22 kDa være synligt. Intensiteten af disse bånd er generelt lavere end den positive kontrol og kan derfor kræve længere eksponeringstider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Western blot af pBAD-BirA-eCPX-AP udtrykker bakterier producerer en ~ 22 kDa streptavidin-reagerende bånd i overensstemmelse med molekylvægten af eCPX (figur 2a). I modsætning til BirA-6xHis var biotinyleret eCPX-AP til stede i både uinduceret og induceret kulturer (figur 2a) på grund af en lille grad af T7 promotor aktivitet selv i ikke-inducerede kulturer og efterfølgende BIOTINYLERING af AP af endogene BirA. I BirA-eCPX-AP (K10A), som udtrykker kulturer, blev der ikke påvist noget biotinyleret eCPX-bånd (figur 2a). Den kraftige overflade biotinylering i eCPX-AP udtrykker bakterier forårsager aggregering ved tilsætning af streptavidin magnetiske perler og dannelsen af en pellet i bunden af et rør (figur 2b). I eCPX-AP (K10A) ekspression bakterier, blev streptavidin-perle sammenlægning og nedbør ikke observeret (figur 2b). Analyse af bundfaldet fra streptavidin pulldown, viser en klar 22-kDa streptavidin-reagerer og anti-6xHis band i prøverne fra eCPX-AP kulturer, men ikke eCPX-AP (K10A) kulturer (figur 2c). Tilsvarende var antallet af bakterier bundet til streptavidin-perler signifikant højere i eCPX-AP end eCPX-AP (K10A) kulturer (figur 2d).
For at vælge for BirA varianter, der biotinylate et målpeptid, blev dets DNA-sekvens indarbejdet i C-terminalen af ecpx ved PCR ved hjælp af primere designet i trin 1,10 og 1,11. Et eksempel på de primere, der er beregnet til inkorporering af en peptidsekvens afledt af α-subenheden af epitelial na+ Channel (ENAC), er vist i figur 3a. Efter PCR blev en 5-μL-alikvot analyseret af agrose gel elektroforese, og der blev observeret et klart og stærkt bånd ved ~ 5900 BP (figur 3b).
Efter genereringen af BirA-Mutations biblioteket blev udvælgelsen af aktive BirA-varianter initieret. En lav grad af streptavidin-bundne vs. input bakterier blev forventet efter den første udvælgelsesrunde. Efter 2nd og 3Rd udvælgelsesrunder blev der imidlertid observeret en klar berigelse i graden af streptavidin-bundne bakterier figur 4a). Hvis der ikke påvises en klar berigelse (figur 4b), er det en indikation af, at BirA-varianterne ikke er i biotinylat peptid og en anden peptidsekvens bør derfor testes.
Efter den endelige udvælgelse runde, 10 kloner var karakteriseret ved vestlige blotting for deres evne til at biotinylate den viste peptid (figur 4c). I den positive kontrol (dvs. AP) blev der observeret ~ 22 kDa-bånd svarende til det biotinylerede eCPX-AP i en Western blot probed med streptavidin-HRP (figur 4c). I de testede kloner var et bånd i samme størrelse en indikation af biotinylering af det viste peptid, der blev smeltet til eCPX (figur 4c). Intensiteten af ~ 22 kDa-båndene var lavere end intensiteten af eCPX-AP-båndet i den positive kontrol, hvilket indikerer en lavere aktivitet af de isolerede BirA-varianter. De isolerede kloner kan derfor bruges som skabelon for en anden runde af mutationer og udvælgelse, hvilket giver meget aktive kloner. Yderligere frekvensbånd indikerer, at de isolerede kloner ikke var specifikke i forhold til det viste peptid, og at yderligere mål også var biotinyleret (figur 4c).
| Reagens | volumen (μL) |
| 5x reaktions buffer | 4 |
| 10 mM dNTP | 0,4 |
| 10 μM fremad primer | 1 |
| 10 μM omvendt primer | 1 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Variabel (~ 25 ng) |
| High-Fidelity DNA Polymerase | 0,20 |
| Nuklease frit vand | til 20 |
Tabel 1: PCR-reagenser. Enheder og volumener kan variere mellem fabrikanterne.
| Reagens | volumen (μL) |
| 2x enzym mix | 25 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP med Target peptid sekvens * | Variabel (~ 50 ng) |
| Mutant megaprimer | 250 ng |
| Buffer | 3 |
| Nuklease frit vand | til 50 |
Tabel 2: fejlbehæftede PCR-reagenser. Enheder og volumener kan variere mellem fabrikanterne. * udarbejdet i protokollens afsnit 1.
Figur 1: det bakterielle display system for BirA udvælgelse. a) systemet var baseret på Co-ekspression af 2 komponenter: BirA og ecpx, der blev smeltet sammen med acceptor peptid (AP). eCPX transporteres til overfladen, og hvis BirA varianten biotinylates AP, vises biotin (Red B), der er fastgjort til eCPX-AP, på overfladen. b) systemet blev udtrykt fra plasmid Pbad-BirA-ECPX-AP, hvor BirA-ekspression styres af en Arabinose-inducerbar promotor, og ecpx-AP-ekspression drives af T7-promotoren. (c) efter generering af et tilfældigt muteret bibliotek af Bira-varianter (trin 1) blev Bira og ecpx-AP-ekspression induceret (trin 2). Bakterier blev inkuberet med affinitets reagens (trin 3), ubundne bakterier blev kasseret (trin 4), og udvalgte bakterier blev forstærket (trin 5). Dette tal er blevet ændret fra Granhøj et al.9venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative resultater fra model udvælgelse med Pbad-Bira-ecpx-AP og Pbad-Bira-ecpx-AP (K10A). (a) ved Western blotting blev ECPX-AP observeret at være biotinyleret i både ikke-inducerede og induktive bakterier, mens der ikke blev påvist biotinylering af ecpx-AP (K10A) selv efter induktion af BirA. BirA udtryk blev opdaget af anti-6xHis antistof. * Indikerer et uspecifikt streptavidin-reagerende protein, når BirA blev induceret. (b) bakterielle kulturer med induceret ekspression af BirA og ECPX-AP aggregeret hurtigt efter tilsætning af magnetiske streptavidin-perler (pil), mens ingen sammenlægning blev observeret i AP (K10A) bakterier. (c) BirA var til stede i bakterier, som udtrykker ecpx-AP og ecpx-AP (K10A) før thestreptavidin-pulldown (input), men kun BirA i ECPX-AP udtrykker bakterier blev trukket ned af streptavidin. I enighed, (d) levedygtige bakterier blev fremskyndet effektiv i ECPX-AP, men ikke ECPX-AP (K10A), udtrykker bakterier. Dette tal er blevet ændret fra Granhøj et al.9venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: primer design og inkorporering af Target peptid kodning sekvens i Pbad-BirA-ECPX-AP ved PCR. a) et eksempel på det primere-design, der anvendes til inkorporering af en peptidsekvens afledt af αenac i C-terminalen i ecpx. Biotin, der accepterer lysin, vises med rødt. Målet peptid sekvens blev omvendt oversat til DNA, og Forward og reverse primere blev designet ved at sikre en ~ 15 base overlap mellem primere. b) repræsentativt agrose gel elektroforese af PCR med Pbad-BirA-ECPX-AP som skabelon og primere specifikt for henholdsvis α-, β-og γ-ENAC-afledte peptidsekvenser. Et klart og stærkt DNA-produkt ved ~ 5900 BP var et tegn på en vellykket PCR. "M" indikerer markør Lane. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative resultater fra udvælgelse og karakterisering af bakterier, som viser peptider. Bakterier, der viser et peptid afledt af (a) tagrfp viste en klar berigelse efter 3 udvælgelsesrunder, mens et peptid afledt af (b) egfp viste ingen berigelse af streptavidin-bundne bakterier selv efter 4 udvælgelsesrunder. c) 10 kloner af bakterier, der viser et peptid fra γenac gennem 5 udvælgelsesrunder, blev testet for deres evne til at biotinylere γenac-peptid. Alle 10 kloner viste et streptavidin-reagerende bånd i overensstemmelse med størrelsen af eCPX-AP, hvilket indikerer, at de isolerede kloner indeholder BirA varianter, der biotinylerer det viste peptid. Yderligere streptavidin-reagerende bånd blev også observeret, hvilket indikerer, at andre proteiner, foruden det viste peptid, også var biotinyleret. * Indikerer en endogene E. coli -protein biotinyleret af BirA. Dette tal er blevet ændret fra Granhøj et al.9venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som for alle udvælgelsesmetoder er stringens af vaske trinene af allerstørste vigtighed. Da bakterier ikke behøver at blive elueret fra perlerne før amplificeringen af de valgte kloner, kan den høje affinitets binding mellem biotin og streptavidin anvendes i stedet for at bruge lavere affinitet avidiner, som tidligere gjort med fagtypning display system, for udvælgelsen af BirA varianter7,8. Dette sikrer, at sjældne kloner udvælges, og at ikke-biotinylerede bakterier kasseres. En anden fordel ved at bruge bakteriel display, sammenlignet med fagtypning display, er, at bakteriel display er kvantitativ11 og derfor giver mulighed for udvælgelse af bakterier baseret på den enzymatiske aktivitet.
I protokollen brugte vi MACS til at vælge for bakterier, der skabte et binært udvælgelsessystem baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af biotin på overfladen. Men ved hjælp af kvantitative fluorescens aktiveret celle sortering, i stedet, bør det være muligt at vælge for bakterier, der udtrykker de mest aktive varianter af BirA. Dette vil være vigtigt i den fremtidige udvikling af romanen BirA varianter, da det vil give en effektiv udvælgelse til de mest aktive BirA varianter.
Vi har indtil videre brugt den bakterielle visning af 14 forskellige peptider og, af dem, 13 produceret en klar berigelse9, hvilket indikerer, at vores udvælgelsessystem giver en robust metode til at vælge for den roman BirA varianter. I den nuværende opsætning, har vi kun testet udvælgelsen af BirA varianter, der er aktive mod 15-aminosyre peptider og dermed vi fortrinsvis valgt til BirA varianter, der er aktive mod den primære sekvens af målet protein. Den målrettede lysin kan dog begraves inde i 3D-strukturen af et protein eller ikke være på anden måde tilgængelig for BirA, hvilket giver BirA varianter, der ikke er aktive mod deres målprotein. En potentiel løsning ville være at vise det større protein fragment på eCPX. ECPX-stilladset er alsidigt med hensyn til peptiddisplayet11; Det vides dog ikke, om der kan vises større proteiner.
Vi brugte udvælgelsessystemet til at isolere en BirA-variant, som biotinylates Native TagRFP9. Den testede BirA variant specifikt biotinylated TagRFP på de målrettede lysines, men aktiviteten af den isolerede variant var lav9. Derfor bør yderligere runder af styret udvikling udføres for at forbedre sin aktivitet. Målet peptid er i C-endestation af TagRFP, hvor den strukturelle lighed mellem det viste peptid og protein regionen er mere tilbøjelige. Bioinformatisk analyse af alle humane og muse proteiner viser, at ~ 75% af proteinerne indeholder en eller flere lysin inden for deres første og/eller sidste 30 aminosyrer9. Således kan det bakterielle display system af peptider potentielt bruges til at isolere aktive BirA varianter mod en stor brøkdel af indfødte proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Mohamed Abdullahi Ahmed for ekspert teknikeren assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Lundbeck fonden, Novo Nordisk Fonden, den danske nyre forening, Aase og Ejnar Danielsen Foundation, A.P. Møller fonden til fremme af lægevidenskaben, og Knud og Edith Eriksen Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
