Summary
Burada e. coli biotin-protein ligase BirA'nın belirli bir hedef peptidbiyominiyapan yeni varyantları için seçme yöntemi salıyoruz. Protokol, hedef peptidin bakteriyel olarak görüntülenmesi için bir plazmid yapımını, BirA kütüphanesinin neslinin, BirA varyantlarının seçilmesi ve karakterizasyonunun yapılmasını açıklar.
Abstract
Biotin, proteinlerin izolasyonu ve tespiti için güçlü bir etiket sağlayan, çeviri sonrası çekici bir modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA tarafından enzimatik biyotinylasyon son derece spesifik tir ve hedef proteinlerin yerli ortamında biyotinylasyon sağlar; ancak, BirA aracılı biyotinylation mevcut kullanımı hedef protein sentetik bir kabul veya peptid (AP) varlığını gerektirir. Bu nedenle, uygulama AP içerecek şekilde tasarlanmış proteinler ile sınırlıdır. Bu protokolün amacı, peptidbiyoni yapan BirA varyantları için seçilen değiştirilmemiş bir hedef proteinden elde edilen bir peptitin bakteriyel ekranını kullanmaktır. Sistem bakteriyel yüzeyde peptit ekran için bir iskele ile birlikte BirA varyantları co-ifade sağlayan tek bir plazmid dayanmaktadır. Protokol, hedef peptidin ekran iskelesine dahil edilmesi, BirA kütüphanesinin oluşturulması, aktif BirA varyantlarının seçilmesi ve izole Edilmiş BirA varyantlarının ilk karakterizasyonu için ayrıntılı bir prosedürü açıklar. Bu yöntem, biyotin-protein ligaseslerinin daha da karmaşık çözeltilerde yerli proteini biyotinyle ile yönlendirilen evrimi için kullanılabilecek yeni BirA varyantlarının izolasyonu için son derece etkili bir seçim sistemi sağlar.
Introduction
Bir proteinin biyotinylation onun yakınlık izolasyon ve algılama için güçlü bir etiket oluşturur. Enzimatik protein biyotinylasyonu, biyotin-protein ligasesleri ile katalize edilen çok spesifik bir post-translational modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA son derece spesifik ve kovalent biyotinylates belirli lizin artıkları sadece sınırlı sayıda doğal olarak oluşan proteinler1. BirA katalize biyotinylasyon avantajları şu anda küçük bir sentetik 15-amino-asit biyotin kabul peptid (AP) ile hedef protein eritilmesi ile harnessedolan etkili biyotinylated 2 ve son derece spesifik ve sağlar bir a3,4,5ile birlikte ekspresyonu veya ilavesi ile in vitro biyotinylasyon verimli. In vivo ve in vitro BirA katalize biotin-protein ligasyonu cazip bir etiketleme stratejisi olmasına rağmen, uygulama AP-erimiş proteinler içeren örnekler ile sınırlıdır. Bu yöntemin amacı, yerli modifiye edilmemiş proteinleri seçici olarak biyotinylate ve böylece enzimatik biyotinylation stratejisinin kullanılabildiği uygulamaların sayısını artıran yeni biyotin-protein ligazlarının geliştirilmesidir.
Protein fonksiyonu gen mutasyonunun yinelemeli turları ile evrilebilir, gen varyantlarının istenilen fonksiyonla seçilmesi ve amplifikasyonu. Güçlü ve verimli bir seçim stratejisi yönlendirilmiş evrim için çok önemlidir ve biotin-protein ligaz aktivitesi biotin ve streptavidin ve homologlar arasındaki güçlü bağlanma nedeniyle kolayca seçilir6. Faj görüntüleme teknolojileri biyotinylated peptidler görüntülemek fajların seçimi için izin7,8. İzole fajların amplifikasyonu bakteriyel konak enfeksiyonu gerektirdiğinden, ancak streptavidin ile faj seçimi, biotinin streptavidin için yüksek afinite bağlama non-denaturing altında hemen hemen geri dönüşümsüz olduğu bir darboğaz oluşturur Koşul -ları. Biyotinylated fajlar geri dönüşümlü bağlanmasını sağlamak için, düşük afinite ile monomerik avidinler mütevazı ~ 10 kat zenginleştirme7sonuçlandı kullanılmıştır. Yakın zamanda yakınlık matrise olan elüsasyon ihtiyacını ortadan kaldıran ve önceki BirA seçim sistemlerinden bir darboğaz çıkaran yeni BirA varyantlarının izolasyonu için bakteriyel bir görüntüleme yöntemi geliştirdik9. Gerçekten de, bizim bakteriyel ekran sistemi tek bir seçim adım9aktif klonların bir >1.000.000 kat zenginleştirme sağlar , böylece roman BirA varyantları yönlendirilen evrim için etkili bir seçim sistemi sağlayan.
Bakteriyel titreşme sistemimiz, C-terminal 6xHis etiketine sahip BirA ve hedef peptidin yüzeyde görüntülenmesini sağlayan bir iskele proteini olmak üzere iki bileşenden oluşur. Biz iskelet proteini kullanılan dairesel permuted dış membran protein X (eCPX) peptidlerin etkili ekran hem De görülebilir beri- ve C-termini10,11. Hedef peptid dizisinin eCPX'in C-terminusuna füzyonu aktif BirA varyantlarını ifade eden bakterilerin biyotinylasyonunu sağlar. Bakteriler biyotinylated peptid şimdi yüzeyde görüntüler gibi etkili streptavidin seçimi için izin(Şekil 1a).
Bu yöntemin amacı, yerli proteinlerde bulunan peptit dizilerini biyotinylates BirA yeni varyantları için seçmektir. Sistem plazmid pBAD-BirA-eCPX-AP mevcut genler tarafından kodlanır, bir arabinose-indüklemez organizatörü BirA kontrol içeren (araBAD), ve bir T7 organizatörü eCPX kontrol9 (Şekil 1b). Bu protokol, hedef proteinden elde edilen bir peptitin eCPX'in C-terminaline dahil edilmesi, 2) hata yatkın PCR ile BirA mutasyonel kütüphanesinin oluşturulması, 3) streptavidin bağlayıcı bakterilerin seçilmesi için ayrıntılı prosedürü açıklar. manyetik aktive hücre tasnifikasyonu (MACS), 4) bakteri zenginleştirme nicelik, ve 5) izole klonların ilk karakterizasyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PBAD BirA-eCPX-AP'ye Peptit Kodlama Sıralama Sırasının Eklenmesi
NOT: Yerli bir hedef proteini biyotinylate BirA varyantları için seçmek için, proteinlerbirincil dizi en az bir lizin (K) kalıntısı içeren 15-amino asit peptit dizisi belirleyerek başlar.
- Sıralı manipülasyon paketi12gidin.
- Belirlenen 15 amino asit peptid dizisini FASTA formatında giriş kutusuna yapıştırın ve Göndertuşuna basın.
- Peptit dizisinin 45 nükleotit ters çevirisini seçin ve kopyalayın.
- http://n2t.net/addgene:121907 pBAD-BirA-eCPX-AP için GenBank Dosyasını indirin.
- Dosyayı bir plazmid düzenleyiciye yükleyin (örn. ApE) ve özellik penceresinde "AviTag(TM)" olarak belirlenen AP sırasını seçin.
- DNA sıralı penceresinde vurgulanan AP sırasını sağ tıklatın ve bağlamsal menüde Paste Rev-Com'u seçin.
NOT: eCPX'in kodlama sırası ters yöndedir ve peptit kodlama dizisi ters kompleman olarak yapıştırılmalıdır. - Vurgulanan sırayı sağ tıklatın ve Yeni Özellik'iseçin.
- Eklenen sıranın açıklayıcı adını ekleyin ve Tamamtuşuna basın.
- Değiştirilen dosyayı kaydetmek için Dosya menüsünde Farklı Kaydet'i seçin.
- İleri astarı, peptit kodlama dizisinin ters komplemanının son 30 nükleotitini içerecek şekilde tasarlayın ve 5' ucuna plazmid bağlayıcı nükleotit dizisini (3'-GCGGCCGCCTGC-5') ekleyin.
- Ters astarı, peptit kodlama dizisinin ters komplemanının ilk 30 nükleotitini içerecek şekilde tasarlayın ve 5' ucuna plazmid bağlayıcı nükleotit dizisini (3'- CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5') ekleyin.
- Tablo 1'de listelenen reaktifleri ekleyerek ince duvarlı bir PCR tüpünde 20 μL PCR reaksiyonu ayarlayın.
- Tüpü bir termal döngüce aktarın ve 30 s için 98 °C'de başlangıç denaturingi olan bir program kullanarak PCR gerçekleştirin, 30 s 'de [15 s, 60 °C'de 15 s ve 72 °C'de 3 dk], 72 °C'de 2 dk ve 4 °C'de tutun.
- ~6 kb PCR ürünün amplifikasyonuna onay vermek için %1 agarose jel üzerinde 5 μL PCR reaksiyonu çalıştırın.
NOT: PCR ürünü gözlenmezse, PCR durumunu üreticinin talimatlarına göre optimize edin. Protokol burada duraklatılmış olabilir. - PCR reaksiyonuna 1 μL DpnI ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın
- Lisojenik broth (LB)/Amp plakaları üzerinde DpnI sindirilmiş PCR reaksiyonu ve plaka 2 μL ile yetkin E. coli dönüştürün. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Tek bir koloni ile 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB inoculate. Gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.
NOT: En az 6 koloninin test etmesi tavsiye edilir. - Kültüre %15'lik son konsantrasyona gliserol ekleyerek her bir gecede kültürün 850 μL'lik donma stokları yapın. -80 °C'de saklayın.
- Plazmid DNA'sını mini hazırlık DNA çıkarma kiti ile kalan 4 mL kültürden ayıklayın.
- T7 Terminal astarı (GCTAGTTATTGCTCAGCGG) kullanarak DNA dizilimi ile peptit kodlama dizisinin doğru eklemesini onaylayın.
2. BirA KütüphanesiNin Üretimi
NOT: İlk BirA mutasyonel kitaplığı(Şekil 1c, adım 1) hataya yatkın PCR tarafından oluşturulur. BirA mutasyonel kitaplığı oluşturmak için diğer yöntemler de çalışması muhtemeldir.
- BirA-6xHis ileri (ATGAAGGATAACACCGTGCC) ve ters (TCAATGATATGATGATGATGATGTTT) astarlar ile bir şablon ve 35 PCR döngüleri olarak hedef peptid dizisi (hazırlanan ve adım 1.20 olarak onaylanan) pBAD-BirA-eCPX 1 ng kullanarak mutant megaprimers sentez üreticinin talimatına göre 60 °C'lik bir sıcaklıkta.
- 984 bp PCR ürünün amplifikasyonuna doğru vermek için %1'lik agarose jelüzerinde amplifikasyon reaksiyonunun 5 0L'sini çalıştırın.
- PCR ürününü, ticari bir PCR arıtma kiti kullanarak amplifikasyon reaksiyonunun kalan 45 μL'sinden arındırın ve DNA verimini quantitate etmek için bir spektrofotometre kullanın.
NOT: Tek bir 45 μL amplifikasyon reaksiyonundan arınma genellikle yeterli verim (>250 ng) üretir. - Tablo 2'delistelenen reaktifleri ekleyerek ince duvarlı bir PCR tüpünde numune reaksiyonu hazırlayın.
- Reaksiyon karışımını bir termal döngücatöre aktarın ve aşağıdaki parametreleri kullanarak adım 2.3'te hazırlanan mutant megaprimerlerle PCR'yi çalıştırın: 95 °C'de 1 dk ve 95 °C'de 50 s, 60 °C'de 50 s ve 68 °C'de 12 dk. Reaksiyonu 4 °C'de saklayın.
- Amplifikasyon reaksiyonuna doğrudan 1 μL DpnI restriksiyon enzimi ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- Reaksiyon karışımını aşağı doğru döndürün ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
- T7 Express lysY/Iq yetkili E. coli hücrelerini DpnI reaksiyonunun 2 μL'si ile dönüştürün.
- Dönüştürülmüş hücrelerle 100 μg/mL ampisilin içeren 100 mL LB aşılayın ve gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.
- LB'de gecelik kültürün 10 mL'lik ve %15'i gliserol ile dondurucu stokları yapın ve -80 °C'de saklayın.
3. Biyotinylated Peptid İfade Bakterilerin Seçimi
NOT: Protokolün bu bölümü Şekil 1 c'nin2-5. Seçim yaklaşımının pozitif ve negatif kontroller olarak pBAD-BirA-eCPX-AP ve pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) kullanılarak kurulum olması önerilir.
- %1 glikoz ve 1 00 μg/mL ampisilin içeren 100 mL'lik 100 mL'lik bir süre boyunca 1 mL BirA kütüphanesi ve 200 rpm'de sallayarak bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- %1 glikoz ve 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB'yi gece kültüründen 100 μL ile inoküle edin.
- Kültür yaklaşık 0,5 Bir OD600 ulaşana kadar 2 saat ve 30 dk için kuluçka.
- ECPX ve BirA ekspresyonunu %0,2 w/v L-arabinose, 100 μM İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ve 100 μM biotin ile ikna edin ve 37 °C'de 1 saat boyunca 200 rpm'de kültürü salla.
- 5.000 x g 10 dakika için kültür santrifüj ve supernatant kaldırın.
- 5 dakika boyunca 5.000 x g buz gibi PBS ve santrifüj 1 mL hücreleri resuspend.
- Supernatant atın ve buz gibi pbs 400 μL hücreleri yeniden askıya ve buz üzerinde hücreleri depolamak.
- 10 μL'lik yeniden askıda hücreleri çıkarın ve "Giriş" etiketli 1,5 mL'lik bir tüpte buzun üzerinde saklayın.
- 20 μL streptavidin manyetik boncukları 1 mL buz gibi PBS'de yıkayın ve tüpü supernatant'ı dikkatlice çıkarmadan önce bir tezgah üstü manyetik partikül ayırıcısına yerleştirin.
- Streptavidin manyetik boncuklarını 20 μL buz gibi PBS'de yeniden askıya alın ve 3.8 adımdan itibaren 390 μL'lik yeniden askıya alınmış hücrelere aktarın.
- Yavaşça pipetleme ve daha sonra 4 ° C'de 30 dakika kuluçka ile karıştırın.
NOT: Bu hücreleri lyse olabilir gibi girdap etmeyin. Boncuk ların toplanması genellikle biyotinylated peptid gösteren bakterilerin yüksek bolluk ile gözlenir. - Ferromanyetik küreli bir kolonu manyetik parçacık ayırıcıya yerleştirin ve 5 mL buz gibi PBS ile yıkayın.
- Hücreleri ve streptavidin manyetik boncukları ayırıcıya bağlı kolona aktarın.
- Sütun haznesi boşaldıktan sonra, 500 μL buz gibi PBS ekleyin ve kolon toplam 5 mL buz gibi PBS hacmi yle yıkanana kadar tekrarlayın.
- Kolonu ayırıcıdan çıkarın ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
- Pipet 1 mL buz gibi PBS sütun üzerine ve sütun ile birlikte piston uygulayarak manyetik etiketli hücreleri elite.
- 1,5 mL'lik tüpü bir tezgah üstü ayırıcıya aktarın ve manyetik etiketli hücreyi 1 mL buz gibi PBS ile yıkayın.
- "Çıkış" etiketli 1,5 mL'lik bir tüpte 10 μL'lik resuspension'ı çıkarmadan ve depolamadan önce, buz gibi PBS'nin 1 mL'inde manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri yavaşça yeniden askıya alın.
- %1 glikoz ve 100 μg/mL ampisilin içeren 100 mL'lik LB'yi manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerle aşıla ve gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün, lb hücreleri ile dondurucu stokları yapmak için 10 mL kullanın 15% gliserol ve depolamak -80 °C ve 1 mL bir sonraki seçim turu için, yani, adım 3.2.
NOT: Genel olarak, streptavidin bağlayıcı bakterilerin zenginleşmesi için 3-5 tur seçim önerilir.
4. Zenginleştirmenin Nicelikselleştirilmesi
NOT: "Girdi" ve "çıktı" örneklerindeki canlı bakterilerin sayısallaştırılması, her seçim turundan sonra numunelerin seri seyreltmelerinin kaplaması ve koloni oluşturan birimlerin (CPU) sonraki sayımı ile gerçekleştirilir.
- Girişe (adım 3.8'den) ve çıktıya (3.18'den) 990 μL buz gibi PBS ekleyin ve tüpleri sırasıyla "Giriş 10-2" ve "Çıkış 10-2" etiketleyin.
- "Giriş 10-2" ve "Output 10-2" numunelerinin 10 kat seri seyreltmelerini buz gibi PBS'de girdi numunesinde 10-10 ve çıktı numunesinde 10-4'lük son seyreltme ulaşınana kadar yapın.
- "Giriş 10-6", "Giriş 10-8", "Giriş 10-10", "Çıkış 10-2", "Çıkış 10-3" ve "Çıkış 10-4" dan örneklerin plaka 100 μL LB / Amp plakalar üzerinde ve tüp lüttür 37 °C gecede.
- Plakalar üzerinde açıkça ayrılmış koloniler ile kolonilerin sayısını saymak. Bakteri konsantrasyonu sayısı/100 μL elde etmek için koloni sayısını seyreltme faktörüyle çarpın.
- Hücre konsantrasyonu ile giriş (400 μL) ve çıkış hacmini (1 mL) çarparak giriş ve çıkış örneklerindeki toplam bakteri sayısını hesaplayın ve çıktıyı giriş hücre sayısıyla bölerek zenginleştirmeyi tahmin edin.
NOT: 3-5 seçim turundan sonra önemli bir zenginleştirme görülmelidir
5. Seçilen BirA Varyantının Karakterizasyonu
NOT: Karakterizasyon, ilk BirA kitaplığından BirA türevleri seçtikten sonra gerçekleştirilebilir; ancak, BirA varyantları genellikle peptid doğru düşük aktiviteye sahip. Bu nedenle, karakterizasyondan önce ek bir mutasyon ve seçim turu da yapılabilir. Genellikle, son seçim turundan 10 klon daha fazla karakterizasyon için izole edilir.
- Son seçim turundan seçilen klonlarla 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB inoküle. Buna ek olarak, aşağıda açıklanan batı lekeiçin pozitif kontrol olarak kullanılacak olan pBAD-BirA-eCPX-AP ile dönüştürülmüş T7 Express lysY/Iq E. coli ile 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB inokül.
- Gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.
- Kültüre %15'lik son konsantrasyona gliserol ekleyerek her bir gecede kültürün 850 μL'lik donma stokları yapın. -80 °C'de saklayın.
- 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB'yi 100 μL gece kültürü yle aşıla ve 37 °C'de 200 rpm'de 2 saat boyunca titreyerek kuluçkaya yatırın.
- Plazmid DNA'sını kalan 4 mL kültüründen ticari olarak mini hazırlık DNA çıkarma kiti ile ayıklayın. DNA dizisini bira varyantlarının ileri ve ters yönde pBAD (ATGCCATAGCATTTTATCC) ve pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) astarları ile gerçekleştirin.
- Adım 5.4'ten itibaren kültürlere %0.2 w/v L-arabinose ve 100 μM IPTG ve 100 μM biotin ekleyin ve eCPX ve BirA varyantlarının ifadesini sağlamak için kültürü 37 °C'de 1 saat boyunca 200 rpm'de salla.
- Kültürün 65 μL'sini numune yükleme tamponunun 25 μL'si ve 10 μL'lik azaltma maddesini içeren 1,5 mL'lik tüplere aktarın.
- 95 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.
- Numuneyi (pozitif kontrol dahil) bir boyut belirteci ile birlikte %12'lik SDS-poliakrilamid jelüzerine yükleyin ve 20, 25 ve 37 kDa standart bantlar net bir şekilde ayrılana kadar yaklaşık 45 dakika boyunca 200 V'de jel elektroforezi yapın.
- Kasetten jel bırakın ve bir PVDF membran üzerine jel blotting için sandviç monte.
- 35 V'de buz üzerinde 2 saat için elektroblot.
- PVDF membranını çıkarın ve tamponu bloke ederek inkübül [PBS, %0.05 Ara-20, %3 Yağsız Süt Tozu] oda sıcaklığında sallayarak 1 saat boyunca.
- PBST'de streptavidin-HRP 1:1.000'i seyrelterek biotin algılama çözeltisini hazırlayın.
NOT: Engelleme tamponu biotin içerir ve bu nedenle streptavidin-HRP için seyreltme tamponolarak kullanılmamalıdır. - Engelleme tamponu atın, membranı PBST'de hızlı bir şekilde yıkayın [PBS, %0.05 Ara-20] ve biotin algılama solüsyonu ekleyin. Sallayarak oda sıcaklığında 1 saat kuluçka.
- Biotin algılama çözeltisini atın ve membranı pbst'ta iki kez 5 dakika ve oda sıcaklığında hafifçe sallayarak bir kez 10 dk boyunca iyice yıkayın.
- PBST atın, 2 mL ECL karışımı ekleyin ve sallayarak 1 dakika kuluçka.
- Membranı bir kağıt üzerinde hızla kurutun ve görüntüyü x-ray filminde veya dijital jel görüntüleme sisteminde geliştirin.
NOT: Pozitif kontrol yüklü şeritte, iki farklı streptavidin reaksiyon bantları açıkça görülebilir olmalıdır: bir 30 kDa biyotinylated endojen protein ve ~ 22 kDa eCXP-AP bant ifade. Seçilen 10 koloni görüntülenen peptidi biyotinylate eğer ~ 22 kDa bir bant görünür olmalıdır. Bu bantların yoğunluğu genellikle pozitif kontrolden daha düşüktür ve bu nedenle daha uzun pozlama süreleri gerektirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBAD-BirA-eCPX-AP ifade bakterilerin Batı leke bir ~ 22 kDa streptavidin-eCPX moleküler ağırlığı ile tutarlı tepki bant üretir(Şekil 2a). BirA-6xHis'in aksine, biyotinylated eCPX-AP hem indüklenmemiş hem de indüklenen kültürlerde(Şekil 2a)t7 promotör aktivitesi nin küçük bir derecesi nedeniyle bile uninduced kültürlerde ve endojen BirA tarafından AP sonraki biyotinylation mevcuttu. Kültürleri ifade eden BirA-eCPX-AP(K10A) hiçbir biyotinylated eCPX bandı algılanmadı(Şekil 2a). ECPX-AP'de bakterileri ifade eden güçlü yüzey biyotinylasyonu, streptavidin manyetik boncukların eklenmesi ve bir tüpün alt kısmında bir pelet oluşumu üzerine biraraya neden olur(Şekil 2b). eCPX-AP(K10A) ekspresyonunda bakteri, streptavidin-boncuk agregasyonu ve yağış gözlenmedi (Şekil 2b). Streptavidin pulldown gelen çökelti analizi, eCPX-AP kültürlerden örneklerde net bir 22-kDa streptavidin-reacting ve anti-6xHis bant görüntüler, ama eCPX-AP (K10A) kültürleri(Şekil 2c). Benzer şekilde, streptavidin-boncuklara bağlı bakteri sayısı eCPX-AP'de eCPX-AP (K10A) kültürlerinden anlamlı olarak daha yüksekti(Şekil 2d).
Bir hedef peptidi biyotinylate BirA varyantları için seçmek için, DNA dizisi adım 1.10 ve 1.11 tasarlanmış astarlar kullanılarak PCR tarafından eCPX C-terminaline dahil edilmiştir. Epitel Na+ kanalının (ENaC) α-alt biriminden elde edilen bir peptit dizisinin birleştirilmesi için tasarlanmış astarların bir örneği Şekil 3a'dagösterilmiştir. PCR'den sonra agarose jel elektroforezi ile 5-μL aliquot analiz edildi ve ~5900 bp'de açık ve güçlü bir bant gözlendi (Şekil 3b).
BirA mutasyon kütüphanesinin oluşumundan sonra aktif BirA varyantlarının seçimi ne başlatıldı. İlk seçim turundan sonra streptavidin eki ve giriş bakterisinin düşük olması bekleniyordu. Ancak, 2ve 3 seçim turlarından sonra streptavidin ebağlı bakteri lerin derecesişekil 4a'danet bir zenginleştirme gözlenmiştir. Net bir zenginleştirme saptanmazsa(Şekil 4b),BirA varyantlarının peptidin biyotinylate başarısızlığının göstergesidir ve bu nedenle başka bir peptit dizisi test edilmelidir.
Son seçim turundan sonra, 10 klon, görüntülenen peptidi biyotinylate yetenekleri için batı lekeleme ile karakterize edildi(Şekil 4c). Pozitif kontrolde (yani AP), biyotinylated eCPX-AP'ye karşılık gelen ~ 22 kDa bandı, streptavidin-HRP(Şekil 4c)ile incelenmiş batı lekelerinde gözlendi. Test edilen klonlarda, benzer boyuttaki bir bant, eCPX'e kaynaşmış görüntülenen peptitin biyotinylasyonunun göstergesiydi (Şekil 4c). ~22 kDa bantlarının yoğunluğu pozitif kontroldeki eCPX-AP bandının yoğunluğundan daha düşüktü ve bu da izole Edilmiş BirA varyantlarının daha düşük bir aktivitesini gösteriyordu. Bu nedenle izole klonlar, son derece aktif klonlar vererek başka bir mutasyon ve seçim turu için şablon olarak kullanılabilir. Ek bantlar izole klonların görüntülenen peptide özgü olmadığını ve ek hedeflerin de biyotinylated olduğunu göstermektedir (Şekil 4c).
| Reaktif | hacim (3L) |
| 5x Reaksiyon Tampon | 4 |
| 10 mM dNTP | 0.4 |
| 10 μM İleri Astar | 1 |
| 10 μM Ters Astar | 1 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Değişken (~25 ng) |
| Yüksek SadakatLI DNA polimeraz | 0.20 |
| Nükleazsız Su | 20'ye kadar |
Tablo 1: PCR reaktifler. Birimler ve hacimler üreticiler arasında farklılık gösterebilir.
| Reaktif | hacim (3L) |
| 2x Enzim karışımı | 25 |
| hedef peptid dizilipli pBAD-BirA-eCPX-AP* | Değişken (~50 ng) |
| Mutant megaprimer | 250 ng |
| Arabellek | 3 |
| Nükleazsız Su | 50'ye kadar |
Tablo 2: Hataya yatkın PCR reaktifleri. Birimler ve hacimler üreticiler arasında farklılık gösterebilir. * protokolün 1.
Şekil 1: BirA seçimi için bakteriyel teşhir sistemi. (a)Sistem 2 bileşenin ortak ifadesine dayanıyordu: BirA ve eCPX kabul eden peptid (AP) ile kaynaştırıldı. eCPX yüzeye taşınır ve BirA varyantı AP'yi biyotinylates, biotin (kırmızı B) eCPX-AP bağlı yüzeyde görüntülenir. (b)Sistem plazmid pBAD-BirA-eCPX-AP' den ifade edilerek, BirA ifadesi nin arabinose indüklenebilir bir organizatör tarafından kontrol edildiği ve eCPX-AP ifadesinin T7 organizatörü tarafından yönlendirildiği. (c) BirA varyantları (adım 1), BirA ve eCPX-AP ekspresyonu rasgele mutasyona uğramış bir kitaplığın nesilden sonra (adım 2) indüklendi. Bakteriler afinite reaktifi ile kuluçkaya yatırıldı (adım 3), bağlanmamış bakteriler atıldı (adım 4) ve seçilen bakteriler güçlendirildi (adım 5). Bu rakam Granhøj ve ark.9'dandeğiştirilmiştir.
Şekil 2: PBAD-BirA-eCPX-AP ve pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) ile model seçiminin temsilcisi sonuçlar. (a) Batı lekeleme ile eCPX-AP'nin hem indüklenmemiş hem de indüklenen bakterilerde biyotinylated olduğu gözlenirken, BirA indüksiyonundan sonra bile eCPX-AP(K10A) biyotinylasyonu saptanmadı. BirA ekspresyonu anti-6xHis antikor tarafından saptEdildi. * BirA indüklendiğinde spesifik olmayan bir streptavidin retepkiproteingösterir. (b)Manyetik streptavidin-boncuk (ok) eklenmesinden sonra BirA ve eCPX-AP indüklenen ekspresyonu ile bakteri kültürleri hızla toplanırken, AP(K10A) bakterilerinde herhangi bir toplama gözlenmedi. (c) BirA, eCPX-AP ve eCPX-AP(K10A) ifade eden bakterilerde thestreptavidin-pulldown (giriş) önce mevcuttu, ancak eCPX-AP'de bakterileri ifade eden sadece BirA streptavidin tarafından aşağı çekildi. Anlaşma, (d) canlı bakteriler eCPX-AP etkili çöktürülmüş, ancak eCPX-AP (K10A), bakterileri ifade. Bu rakam Granhøj ve ark.9'dandeğiştirilmiştir.
Şekil 3: PCR tarafından pBAD-BirA-eCPX-AP'ye hedef peptid kodlama dizisinin astar tasarımı ve dahil edilmesi. (a) αENaC'dan eCPX'in C terminaline türetilen bir peptit dizisinin eklenmesi için kullanılan astar tasarımının bir örneğidir. Lizin kabul eden biotin kırmızı ile gösterilir. Hedef peptid dizisi DNA'ya çevrilmiş ve ileri ve geri astarlar astarlar arasında ~15 baz çakışması sağlanarak tasarlanmıştır. (b) PcR'nin α, β ve γ-ENaC türetilmiş peptid dizilerine özgü şablon ve astar olarak pBAD-BirA-eCPX-AP ile temsilcisi agarose jel elektroforezi. ~ 5900 bp net ve güçlü DNA ürünü başarılı bir PCR göstergesi oldu. "M" işaret şeridini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Peptidler gösteren bakterilerin seçimi ve karakterizasyonundan elde edilen sonuçlar. Türetilen bir peptit gösteren bakteriler (a) TagRFP 3 seçim tursonra net bir zenginleştirme gösterdi, bir peptit türetilen ise (b) EGFP 4 seçim tur sonra bile streptavidin bağlı bakterilerin hiçbir zenginleştirme gösterdi. (c) γENaC'dan 5 seçim turuna kadar peptid gösteren 10 bakteri klonu γENaC-peptidin biyotinyle'i için test edildi. Tüm 10 klonlar eCPX-AP boyutu ile tutarlı bir streptavidin tepki bant gösterdi, izole klonlar görüntülenen peptid biyotinylate BirA varyantları içerdiğini gösteren. Ek streptavidin tepki bantları da gözlendi, bu da görüntülenen peptidin yanı sıra diğer proteinlerin de biyotinylated olduğunu gösterdi. * BirA tarafından biyotinylated bir endojen E. coli proteingösterir. Bu rakam Granhøj ve ark.9'dandeğiştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm seçim yöntemlerine gelince, yıkama adımlarının sıkılığı son derece önemlidir. Bakterilerin seçilen klonların amplifikasyonönce boncuklardan eluted gerek olmadığından, biotin ve streptavidin arasındaki yüksek yakınlık bağlayıcı yerine daha düşük afinite avidinler kullanarak kullanılabilir, daha önce faj görüntüleme sistemi ile yapılan, için BirA varyantları seçimi7,8. Bu, nadir klonların seçilmesini ve biyotinylated olmayan bakterilerin atılmasını sağlar. Bakteri ekran kullanmanın bir diğer avantajı, faj ekran ile karşılaştırıldığında, bakteriyel ekran kantitatif11 ve bu nedenle, enzimatik aktiviteye dayalı bakteri seçimi için izin verir.
Protokolde, yüzeyde biotin varlığı veya yokluğuna dayalı bir ikili seçim sistemi oluşturan bakteriler için seçmek için MACS kullandık. Ancak, kantitatif floresan aktif hücre sıralama kullanarak, bunun yerine, BirA en aktif varyantları ifade bakteriler için seçmek mümkün olmalıdır. Bu, en aktif BirA varyantları için etkili bir seçim sağlayacak gibi roman BirA varyantları gelecekteki gelişiminde önemli olacaktır.
Biz, şimdiye kadar, 14 farklı peptidler bakteriyel ekran kullanılan ve, bu, 13 net bir zenginleştirme 9 üretti,bizim seçim sistemi roman BirA varyantları için seçmek için sağlam bir yöntem sağladığını belirten. Mevcut kurulumda, sadece 15-amino asit peptidler doğru aktif BirA varyantları seçimi test ettik ve bu nedenle tercihen hedef proteinin birincil dizidoğru aktif Olan BirA varyantları için seçilmiştir. Ancak hedeflenen lizin bir proteinin 3Boyutlu yapısına gömülebilir veya BirA için başka türlü erişilemeyerek hedef proteine karşı aktif olmayan BirA varyantları verebilir. Potansiyel bir çözüm eCPX üzerinde büyük protein parçası görüntülemek olacaktır. ECPX iskelesi peptit ekranı11ile ilgili olarak çok yönlüdür; ancak daha büyük proteinlerin görüntülenip sergilenemeyeceği bilinmemektedir.
Biz yerli TagRFP9biyotinylates bir BirA varyantı izole etmek için seçim sistemi kullanılır. Test Edilmiş BirA varyantı özellikle hedeflenen lizinler üzerinde TagRFP biyotinylated, ancak izole varyant aktivitesidüşük9 oldu . Bu nedenle, faaliyetlerini geliştirmek için yönlendirilmiş evrimin daha ileri turlar yapılmalıdır. Hedef peptid TagRFP C-terminus, burada görüntülenen peptid ve protein bölgesi arasındaki yapısal benzerlik daha olasıdır. Tüm insan ve fare proteinlerinin biyoinformatik analizi proteinlerin ~75%'inin ilk ve/veya son 30amino asitiçinde bir veya daha fazla lizin içerdiğini göstermektedir 9. Böylece, peptidlerin bakteriyel titresistemi potansiyel olarak yerli proteinlerin büyük bir kısmına doğru aktif BirA varyantları izole etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar uzman teknisyen yardım için Mohamed Abdullahi Ahmed teşekkür ederim. Bu çalışma Lundbeck Vakfı, Novo Nordisk Vakfı, Danimarka Böbrek Derneği, Aase og Ejnar Danielsen Vakfı, A.P. Møller Tıp Biliminin İlerlemesi Vakfı ve Knud ve Edith Eriksen'in bağışları ile desteklendi. Anıt Vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
