Summary
我们引入了一种运动分析方法，该方法使用包含四个摄像头和数据处理软件的三维运动捕获装置，用于在涉及啮齿动物模型的基础研究期间执行功能评估。
Abstract
与坐骨功能指数（SFI）相比，运动学分析是一种更可靠、更敏感的方法，用于对坐骨神经损伤啮齿动物模型进行功能评估。在该协议中，我们描述了一种新型的运动学分析方法，该方法使用三维（3D）运动捕获装置，使用大鼠坐骨神经挤压损伤模型进行功能评估。首先，老鼠熟悉跑步机行走。标记然后附加到指定的骨骼地标，老鼠被制造在跑步机上以所需的速度行走。同时，用四台摄像机记录大鼠的后肢运动。根据所使用的软件，使用自动和手动模式创建标记跟踪，并在细微调整后生成所需的数据。这种运动学分析方法使用三维运动捕捉装置，具有许多优点，包括卓越的精度和精度。在综合功能评估期间，可以研究更多的参数。这种方法有几个缺点需要考虑：该系统昂贵，操作起来可能很复杂，并且可能会由于皮肤移位而产生数据偏差。然而，使用3D运动捕捉装置的运动学分析对于执行功能性前肢和后肢评估非常有用。将来，这种方法在生成各种创伤和疾病的准确评估方面可能越来越有用。
Introduction
坐骨功能指数（SFI）是执行功能性坐骨神经评价的基准方法。SFI已被广泛采用，并经常在大鼠坐骨神经损伤2，3，4，5，6的各种功能评估研究中使用。尽管它很受欢迎，但SFI存在几个问题，包括自动切割7，联合合同风险，和涂抹脚印8。这些问题严重影响其预后值9。因此，需要一种替代方法，减少容易出错的方法，以替代 SFI。
一种替代方法是运动学分析。这包括使用附加到骨质地标或关节的跟踪标记进行全面的步态分析。运动学分析越来越多地用于功能评估9。这种方法正逐渐被公认为是功能评估10的可靠而敏感的工具，没有SFI11、12的缺点。
在此协议中，我们描述了一系列运动学分析，这些分析使用由跑步机、四台 120 Hz 带电耦合器件 （CCD） 摄像机和数据处理软件组成的 3D 运动捕获设备（参见材料表）。这种运动学分析方法不同于一般视频行走或步态分析13，14。两个摄像机位于不同的方向，用于记录从单个侧面的后肢运动。随后，利用计算机图形9构建了后肢的3D数字模型。通过密切概括实际的肢体尺寸，我们可以计算指定的关节角度，如髋关节、膝盖、脚踝和脚趾关节。此外，我们可以确定各种参数，如步长/步长和姿态相与摆动相的比率。这些重建基于完全由两组摄像机传输的数据生成的后肢的完全重建的 3D 数字模型。即使是假想的重心（CoG）轨迹也可以自动计算。
我们使用这种3D运动捕捉装置来引入和评估多个运动学参数，这些参数揭示了大鼠坐骨神经挤压损伤模型背景下随时间的变化。
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Protocol
该协议得到了京都大学动物实验委员会的批准，所有协议步骤均按照京都大学动物实验委员会的指导方针（批准文号：MedKyo17029）执行。
1. 让大鼠熟悉跑步机行走
- 在跑步机的两侧设置两块透明塑料布，让一只12周大的雄性刘易斯大鼠朝一个直的、朝前的方向行走，然后打开电击网。
- 让每只老鼠在跑步机上行走。逐渐将跑步机加速到所需的速度（20 厘米/秒或 12 m/min），让大鼠以这种速度正常行走 5 分钟。每次步行后，提供1⁄2分钟的休息时间。重复此过程 3 次，每天 3 次，每周 5 天，为期 1 周。
注意：在步骤 2 前 1 周开始跑步机行走。 - 每笼三只老鼠，每间笼子有12小时的浅暗循环，并喂它们商业性老鼠食品和自来水。
2. 执行坐骨神经挤压损伤
- 将大鼠放入麻醉诱导室，并引入5%的二甘草吸入溶液。
- 向大鼠提供0.15毫克/千克盐酸甲酰胺、2毫克/千克中子和2.5毫克/千克丁醇酸盐的麻醉剂注射。检查是否缺乏踏板反射。然后用电动式式式式骨处理机将区域从左侧大小龙到中高。
- 摊开一块无菌布，把老鼠放在它身上，让它放在左边的侧边位置。将无菌手术器械也放在布上。
- 用10号手术刀片，从大刀到中高创建一个直切口。然后，使用手术血小器在四头肌和二头肌女性之间进行钝切除，以暴露坐骨神经。
- 用两对微钳从周围组织分离坐骨神经，用标准的手术造节粉碎坐骨神经10s，在谷胱状管状正下方的部位造成2毫米长的挤压损伤。
- 使用一对微钳在损伤的近端进行 9-0 尼龙显神经缝合，然后用 4-0 尼龙缝合关闭肌肉和皮肤。
- 向大鼠提供用0.3毫克/千克盐酸阿提帕松制备的麻醉拮抗剂的腹内注射液，在10分钟内将其唤醒。大鼠从麻醉中恢复后，观察左脚趾运动，而大鼠被尾巴底部悬挂。如果脚趾没有扩散，手术是成功的。
- 手术后，用12小时的浅暗循环将大鼠单独饲养，并喂它们商业大鼠食品和自来水。
3. 附加标记
- 将经过训练的大鼠放入麻醉诱导室，并引入5%的非卢兰吸入溶液。通过捏脚趾检查踏板反射是否不足。
- 允许使用麻醉面膜（2%异氧糖吸入溶液）对大鼠进行持续麻醉。当大鼠接受稳定的麻醉时，使用电动除肖器从下背部到双边马莱奥利的面积。
注意：为了防止研究人员接触到泄漏的胶面，确保面罩紧紧地盖住大鼠的头部和面部。
注意：为防止对大鼠造成伤害，请尽可能轻柔地将头发摘下。 - 将大鼠置于易发位置。使用黑色标记笔标记被擦伤的皮肤上的以下骨骼地标：从腰部到骨椎的旋转过程，前侧优的脊柱，更大的小刺，膝关节，侧侧双体骨，第五行元骨素关节，和第四个脚趾的尖端。
注： 穿过旋转过程的线用于确定双边标记是否轴向对称。 - 使用液体粘合剂将这些骨骼地标附加半球标记，但从腰部到骨椎和第四个脚趾尖的旋转过程线除外。对所有其他地标使用不同的颜色，以避免混淆。第四个脚趾的尖端用粉红色的墨水标记。
注意：注意不要将胶粘剂滴到操作员暴露的皮肤上。 - 放置所有标记后，将老鼠放回笼子里。在老鼠完全从麻醉中恢复之前，不要将老鼠放在跑步机上。
注意：如果大鼠不能完全从麻醉中恢复，意识下降可能会严重影响正常行走。
4. 校准和软件设置
- 在跑步机的两侧设置两块透明塑料片，并将校准箱放在跑步机的中间。打开录制软件，然后单击显示屏上的校准图像图标 （补充文件 1）。
- 单击"录制"图标，使用 120 Hz CCD 摄像机从四个方向录制 1⁄2 s 的视频。再次单击"录制"图标可停止录制。
注：录制结束后，视频将自动保存。 - 在计算软件中打开视频文件。单击校准框 3D 模型的特征点，将屏幕右下角的标记拖动到四张图片上的相应标记，这些标记会自动从校准模式（补充文件 2）中的视频变换。然后单击"保存"图标。
注：校准完成后，请勿更改摄像机的位置。
5. 记录行走
- 将校准箱从跑步机中拿出来，打开电击网格，将完全清醒的大鼠放在跑步机上。打开记录软件并输入有关大鼠的基本信息，包括其序列号、行走速度和主要操作员的姓名。
- 打开跑步机，将速度设置为 20 厘米/s。大鼠适应速度并能够正常行走后，单击显示屏上的"录制"图标，用四台摄像机记录行走的大鼠。记录足够步骤后（>10），再次单击图标以停止录制，然后关闭跑步机。
注：录制结束后，视频将自动保存。 - 将大鼠放回麻醉诱导室进行麻醉。当大鼠处于连续麻醉（通过麻醉面膜施用）时，去除半球标记物。
注意：尽可能轻轻地去除标记，以避免对大鼠造成疼痛。 - 在指定时间（例如，手术后 1 周、3 周或 6 周），通过重复步骤 3.1-5.3 对大鼠进行运动测量。在实验开始时，对于未接受手术的大鼠（即对照组），只进行一次运动学测量。
6. 标记跟踪
- 打开计算软件，打开界面上的视频文件。
- 单击并拖动视频进度栏上的双边控制栏，以确保仅显示 10 步跑步机行走记录（补充文件 3）。单击并拖动屏幕右下角的 3D 模型的每个特征点，拖动到摄像机拍摄的视频的四个初始图片的每个上都有相应的标记（补充文件 4）。
- 单击自动跟踪图标以启动自动标记跟踪过程 （补充文件 5， 补充文件 6）。如果系统没有准确跟踪标记，请单击手动数字化图标切换到手动跟踪模式 （补充文件 7），单击 3D 模型中的跟踪特征点，然后单击图片中的响应标记。
- 单击标记后，确保图片切换到视频的下一帧。现在持续单击标记，直到标记跟踪过程完成。完成后，单击"保存"图标。
7. 运动学分析
- 打开分析软件，然后在界面上打开已处理的视频文件。
- 单击"设置"图标，选择右侧弹出窗口（补充文件 8 ） 中的显示列表（补充文件 8） 中选择并添加指定参数，如脚踝角度、脚趾角和骨盆偏移（X 和 Z 轴）。单击"确定"，以便表示参数中值更改的曲线显示在界面上。
- 单击"测量"图标，并在下拉菜单中选择"平滑处理"。在弹出窗口中输入20 Hz以删除曲线内大于 20 Hz 的频率 （补充文件 9）。
- 确保界面上有五个面板：大鼠的行走视频、动态 3D 模型、表示 10 步周期中参数中的值变化的曲线、表示参数中平均值变化的曲线以及表示姿态和摆动相比的直方图和原理图（补充文件 10）。
- 右键单击面板，查看表示参数中平均值变化的曲线，并在下拉菜单（补充文件 11）中选择"数据输出"。这将产生后肢关节角度的平均值，包括脚踝和脚趾角、骨盆移位，以及 10 步周期内的任何其他所需参数。
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Representative Results
我们选择了四个参数来研究大鼠坐骨神经粉碎损伤模型中随时间的变化。这些是"脚趾关闭"阶段9中姿态与摆动相、重心 （CoG） 轨迹、脚踝角度和脚趾角的比率。24只大鼠被随机分配到四组之一：对照组（C），大鼠在第一（1w），第三（3w）和第六（6w）周后左坐骨神经粉碎损伤。
通过3D运动学分析，自动计算并在界面上表示10步周期中姿态或摆动相位的平均比率（图1A-D）。我们发现，姿势与摆动阶段的比例在手术后恢复。
CoG 是一个虚拟点，可以通过 3D 运动捕获设备使用虚拟标记进行跟踪。它位于两条线的交叉点，连接两个前优的脊柱到它们的反向大刺。因此，在日冕平面（X 和 Z 轴）中的实时骨盆偏移会导致 CoG 同时移动，因为使用 3D 构造的骨盆模型。也可以自动测量此班次。CoG 轨迹被描述为 10 步周期的 X 轴和 Z 轴中骨盆移位平均值的变化曲线。正常的 CoG 轨迹形状类似于无穷大符号 （*）。我们发现，CoG轨迹形状直到手术后6周才恢复到大致正常的形状（图2A-D）。
在步进周期15的终点位，正常脚踝和脚趾角在"脚趾脱落"阶段达到最大值，但如果大鼠接受了手术，这些参数可能会被错误地报告。然而，3D运动学分析使我们能够通过引用视频来确定"脚趾关闭"阶段的角度。"脚趾脱落"阶段脚踝或脚趾角的平均值是从 10 步循环中计算的。结果表明，在"脚趾关闭"阶段的脚踝和脚趾角在手术后向向上方向改善。（图3A-B）。
图1：双边姿态和摆动阶段。右摆动（洋红色）、右姿势（红色）、左摆动（蓝色）和左姿势（蓝色）阶段分别由它们分别着色的条形表示。黄色条表示双支撑阶段。面板A-D显示控制组（A）、1w（B）、3w（C）和6w（D）组在10步周期内每个双边姿态和摆动阶段。C = 控制;1w = 手术后1周;3w = 手术后3周;6w = 手术后6周。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：CoG轨迹。面板A-D显示对照组（A）、1w （B）、3w （C） 和 6w （D） 组在 10 步周期周期内具有代表性的平均 CoG 轨迹。C = 控制;1w = 手术后1周;3w = 手术后3周;6w = 手术后6周。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：脚踝和脚趾角。面板A和B显示对照组、1w、3w 和 6w 组（与对照组相比为 0.01 的对照组相比，p<0.01）的 10 个"脚趾关闭"阶段中脚踝和脚趾角随时间的变化。误差柱 = 平均值 （SEM） 的标准误差;C = 控制;1w = 手术后1周;3w = 手术后3周;6w = 手术后6周。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件1。请点击此处查看此文件。
补充文件2。请点击此处查看此文件。
补充文件3.请点击此处查看此文件。
补充文件4.请点击此处查看此文件。
补充文件5.请点击此处查看此文件。
补充文件6.请点击此处查看此文件。
补充文件7。请点击此处查看此文件。
补充文件8.请点击此处查看此文件。
补充文件9。请点击此处查看此文件。
补充文件10。请点击此处查看此文件。
补充文件11.请点击此处查看此文件。
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Discussion
在此协议中，稳定和连续行走的大鼠是运动学分析中最重要的组成部分。跑步机速度设置为20厘米/s。如果老鼠移动时没有空间限制，这种行走速度绝不被认为是"高"。然而，这种速度太快，未经训练的老鼠无法在跑步机上稳态行走，并可能导致步态异常和不均匀的动作。这些事件可能会严重影响数据的可靠性和真实性。然而，低于20厘米/秒的跑步机速度可能导致大鼠间歇性地停止行走，从而可能导致较大的偏差和降低数据可靠性。因此，训练大鼠能够在跑步机上以直线、朝前的方向稳步行走，对于实现精确的运动学分析，这一点非常重要。
此外，操作员不应忽视在运动分析过程中重新确认和精细调整的需要。我们发现，在正常大鼠中，摆动阶段占步数周期的25%。这意味着在摆动阶段，后肢运动加速到摄像系统无法持续和随时间准确地捕捉运动。此外，过度明亮或暗淡的环境光、透明跑步机上污渍以及行走时偶然发生的异常运动模式可能导致跟踪标签与附着在大鼠身上的标记的夸大偏差。这些因素可能会降低运动捕获过程的准确性。为了解决这个问题，对标记跟踪系统进行了手动调整。使用手动调整，在标记跟踪过程中可以立即纠正明显的偏差或细微的运动捕获损失。此外，重新确认使用运动分析软件处理的多个参数曲线的变化，帮助搜索和纠正标记跟踪过程中的缺陷。重新确认还使我们能够生成最可靠和真实的数据。
与运动学分析相比，SFI的缺点主要来源于其精度和可靠性低，而不是来自上述因素产生的干扰。先前的研究也指出，在17日损伤初期应用时，SFI方法既不可靠，也不可重现。另一方面，运动学分析的高精度和可靠性得到了广泛的认可。然而，许多以前的应用只能观察和测量指定的角度，特别是脚踝角度10，15，18，19，20。二维 （2D） 视频分析的局限性阻止了在功能评估期间调查其他参数。
三维运动学分析克服了SFI的所有缺点，能够研究许多附加参数。3D 数字模型由四台摄像机拍摄的图像构建而成。因此，该装置可以比传统的二维运动学方法更准确地测量或计算参数。因此，使用3D运动捕获装置的运动学分析作为其他功能评估方法的潜在替代品，具有巨大的前景。
然而，三维运动学分析方法有几个局限性。训练啮齿动物、附加标记和追踪检查过程既复杂又耗时。为了获得可重复和可靠的数据，操作员应熟悉所需的关键步骤。啮齿动物行走过程中发生的皮肤转移特别可能产生数据偏差21。此外，3D运动分析设备成本高，可能阻碍其普及，限制相关研究的使用。
此前的研究发现，3D运动学分析在大鼠坐骨神经损伤模型9、22的背景下取得了准确有效的结果。因此，我们有理由相信，这种方法可能是一个有用的工具，用于功能评估涉及后肢的各种创伤或疾病状态，包括中枢和周围神经系统和肌肉骨骼疾病的紊乱。此外，通过改变标记定位，此方法可用于功能评估前肢运动。尽管这些假设需要通过未来的实验进一步验证，但我们相信，使用三维运动捕获装置的运动学分析可以激发更有前途的功能评估方法，并在研究和临床应用中发挥重要作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了JSPS KAKENHI授权号JP19K19793、JP18H03129和JP18K19739的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9-0 nylon suture | Bear Medic Corporation. | T06A09N20-25 | |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| Kine Analyzer | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | A analysis software |
| Liquid adhesive | KANBO PRAS CORPORATION | PT-B180 | |
| Micro forceps | BRC CO. | 16171080 | |
| Motion Recorder | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | A recording software |
| Standard surgical hemostat | Fine Science Tools, Inc. | 12501-13 | |
| Surgical blade No.10 | FEATHER Safety Razor CO., LTD | 100D | |
| Surgical hemostat | World Precision Instruments | 503740 | |
| Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for Animal) | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | A 3D motion analysis system that consists of cameras |
| Three-dimensional(3D) Calculator | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | A marker tracing software |
| Treadmill | MUROMACHI KIKAI CO.,LTD | MK-685 | a treadmill with affialiated the electrical schocker, transparent sheats and a speed control apparatus |
References
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