اختبار نشاط لأوتار المورين
Summary
يصف البروتوكول طرق اختبار نشاط الشد الفعالة والقابلة للتكرار لأوتار المريدين من خلال استخدام التركيبات المطبوعة ثلاثية الابعاد المخصصة المناسبة.
Abstract
اضطرابات الأوتار شائعه ، وتؤثر علي الناس من جميع الاعمار ، وغالبا ما تضعف. غالبا ما تفشل العلاجات القياسية ، مثل الادويه المضادة للالتهابات ، وأعاده التاهيل ، والإصلاح الجراحي. من أجل تحديد وظيفة وتر وإثبات فعاليه العلاجات الجديدة ، يجب تحديد الخصائص الميكانيكية للأوتار من النماذج الحيوانية بدقه. وتستخدم نماذج الحيوانية murine الآن علي نطاق واسع لدراسة اضطرابات الأوتار وتقييم العلاجات الجديدة لامراض التين. ومع ذلك ، فان تحديد الخواص الميكانيكية لأوتار الفئران كان صعبا. في هذه الدراسة ، تم تطوير نظام جديد لاختبار وتر الميكانيكية التي تشمل المباراات 3d المطبوعة التي تتطابق تماما مع التشريحية من عظم العضد و عقبي لاختبار ميكانيكيا الأوتار سوبرافياتوس والأوتار اخيل ، علي التوالي. وقد تم تطوير هذه التركيبات باستخدام الإنشاءات ثلاثية الابعاد لتشريح العظام الاصليه ، والنمذجة الصلبة ، وتصنيع المضافات. النهج الجديد القضاء علي الأخطاء التي تجتاح الوقائع (علي سبيل المثال ، فشل في فشل لوحه النمو بدلا من الوتر) ، وانخفاض الوقت الكلي للاختبار ، وزيادة استنساخ. وعلاوة علي ذلك ، هذه الطريقة الجديدة هي قابله للتكيف بسهوله لاختبار الأوتار الأخرى والأوتار murine من الكائنات الأخرى.
Introduction
اضطرابات وتر شائعه ومنتشرة للغاية بين الشيخوخة, رياضي, والسكان النشطة1,2,3. في الولايات المتحدة ، يتم الإبلاغ عن إصابات النسيج الضام 16,400,000 كل عام4 وتمثل 30 ٪ من جميع الإصابات المتعلقة مكتب الطبيب الزيارات3،5،6،7، 8-الآن وتشمل المواقع الأكثر تاثرا الكفة المدورة ، وتر اخيل ، والوتر الرضفي9. علي الرغم من انه تم استكشاف مجموعه متنوعة من العلاجات غير الجراحية والعملية ، بما في ذلك الادويه المضادة للالتهابات ، وأعاده التاهيل ، والإصلاح الجراحي ، والنتائج لا تزال سيئه ، مع عوده محدوده إلى وظيفة ومعدلات عاليه من الفشل5، 6– وقد حفزت هذه النتائج السريرية السيئة الدراسات الاساسيه والانتقالية التي تسعي إلى فهم اعتلال الأوتار وتطوير نهج العلاج الجديدة.
خصائص نشاط الشد هي النتائج الكمية الاوليه تعريف وظيفة وتر. لذلك ، يجب ان يتضمن التوصيف المختبري لاعتلال الأوتار وفعالية العلاج اختبارا دقيقا لخصائص شد الأوتار. وقد وصفت العديد من الدراسات أساليب لتحديد خصائص نشاط من الأوتار من النماذج الحيوانية مثل الفئران والأغنام والطيور والأرانب10،11،12. ومع ذلك ، وقد اختبرت دراسات قليله خصائص نشاط الأوتار murine ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى الصعوبات التي تجتاح الانسجه الصغيرة لاختبار الشد. كما نماذج murine لديها العديد من المزايا لدراسة ميكانيكيا اعتلال الأوتار ، بما في ذلك التلاعب الوراثية ، وخيارات واسعه كاشف ، وانخفاض التكلفة ، وتطوير أساليب دقيقه وفعاله لاختبار الميكانيكا الحيوية الانسجه murine مطلوب.
من أجل اختبار الخصائص الميكانيكية للأوتار بشكل صحيح ، يجب ان تكون الانسجه قد سيطرت علي نحو فعال ، دون الانزلاق أو تمزيق المقالة في واجهه قبضه أو كسر لوحه النمو. في كثير من الحالات ، وخاصه بالنسبة لأوتار قصيرة ، يتم الخناق علي العظم علي طرف واحد ويتم الخناق علي الوتر علي الطرف الآخر. وعاده ما يتم تامين العظام عن طريق تضمينها في مواد مثل راتنجات الايبوكسي13 و بوليميثيلميثريلات14,15. وغالبا ما توضع الأوتار بين طبقتين من الصنفرة ، لاصق مع السيانواكريليت ، والمضمون باستخدام المشابك ضغط (إذا كان المقطع العرضي هو مسطح) أو في وسط المجمدة (إذا كان المقطع العرضي كبير)15،16،17 . وقد طبقت هذه الطرق علي اختبار الميكانيكا الحيوية الأوتار ، ولكن تنشا التحديات بسبب صغر حجم العينات والامتثال للوحه النمو ، والتي لا تحجر18. علي سبيل المثال ، فان قطر الراس murine العضد هو فقط بضعة ملليمترات ، مما يجعل من الصعب الإمساك بالعظم. وعلي وجه التحديد ، فان اختبار الشد لعينات الأوتار إلى العظم من murine غالبا ما يؤدي إلى الفشل في لوحه النمو بدلا من الأوتار أو في الأوتار. المثل ، فان اختبار نشاط وتر العرقوب يشكل تحديا. علي الرغم من ان وتر العرقوب أكبر من الأوتار الأخرى ، فان الكالكيوس صغير ، مما يجعل الإمساك بهذه العظمة أمرا صعبا. يمكن أزاله العظم ، تليها التي تجتاح طرفي الوتر. ومع ذلك ، فان هذا يمنع اختبار التعلق من وتر إلى عظم. مجموعات أخرى تقرير تجتاح العظام عقبي باستخدام التجهيزات المصنوعة خصيصا19،20، رسو من قبل المشابك21، وتحديد في النفس علاج الاسمنت البلاستيك22 أو باستخدام فتحه شكل مخروطي22، ولكن هذه لا تزال الطرق السابقة محدوده بسبب انخفاض استنساخ ، وارتفاع معدلات الفشل التي تجتاح ، ومتطلبات اعداد مملة.
وكان الهدف من الدراسة الحالية لتطوير طريقه دقيقه وفعاله لاختبار نشاط الشد من الأوتار murine ، مع التركيز علي الأوتار فوق العالية والعرقوب كامثله. باستخدام مزيج من أعاده البناء ثلاثي الابعاد من تشريح العظام الاصليه ، والنمذجة الصلبة ، والتصنيع المضافة ، تم تطوير طريقه جديده لقبضه العظام. هذه التركيبات تامين العظام بشكل فعال ، ومنع فشل لوحه النمو ، وانخفاض وقت اعداد العينات ، وزيادة اختبار استنساخ. الطريقة الجديدة قابله للتكيف بسهوله لاختبار الأوتار الأخرى المريدين وكذلك الأوتار في الفئران والكائنات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
تستخدم نماذج الحيوانية murine عاده لدراسة اضطرابات الأوتار ، ولكن توصيف خصائصها الميكانيكية أمر صعب وغير مالوف في الأدب. الغرض من هذا البروتوكول هو وصف طريقه فعاله وقابله للتكرار لاختبار الشد من الأوتار murine. الأساليب الجديدة خفضت الوقت اللازم لاختبار عينه من ساعات إلى دقائق والقضاء علي قطع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت الدراسة من قبل المعاهد القومية للصحة/NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose |
| Bruker microCT | Bruker BioSpin Corp | Skyscan 1272 | Used by authors |
| ElectroForce | TA Instruments | 3200 | Testing platform |
| Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% and use as suggested in protocol |
| Fixture to attach grips | Custom made | Used by authors | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | S-8115 | As suggested in protocol |
| MicroCT CT-Analyser (Ctan) | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| MilliQ water (Ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | 100 ml |
| Meshmixer | Autodesk | http://www.meshmixer.com/ | Free engineering software used by authors to refine mesh |
| Objet EDEN 260VS | Stratasys LTD | Precision Prototyping | |
| Objet Studio | Stratasys LTD | Used by authors with 3D printer | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 2.5 L of 10% PBS |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | Used by authors |
| Scalpel Blade – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | Used by authors |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Used by authors |
| SkyScan 1272 | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| Skyscan CT-Vox | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SkyScan NRecon | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SolidWorks CAD | Dassault Systèmes | SolidWorks Research Subsription | Solid modeling computer-aided design used by authors |
| SuperGlue | Loctite | 234790 | As suggested in protocol |
| Testing bath | Custom made | Used by authors | |
| Thin film grips | Custom made | Used by authors | |
| VeroWhitePlus | Stratasys LTD | NA | 3D printing material used by authors |
| WinTest | WinTest Software | Used by authors to collect data |
References
- Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
- Thomopoulos, S., Parks, W. C., Rifkin, D. B., Derwin, K. A. Mechanisms of tendon injury and repair. Journal of Orthopaedic Research. 33, 832-839 (2016).
- Scott, A., Ashe, M. C. Common Tendinopathies in the Upper and Lower Extremities. Current Sports Medicine Reports. 5, 233-241 (2006).
- Praemer, A., Furner, S., Rice, D. P. Musculoskeletal Conditions in the United States. American Academy of Orthopaedic Surgeons. , (1992).
- Nourissat, G., Berenbaum, F., Duprez, D. Tendon injury: From biology to tendon repair. Nature Reviews Rheumatology. 11, 223-233 (2015).
- Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. 86, 219-224 (2004).
- Sher, J. S., Uribe, J. W., Posada, A., Murphy, B. J., Zlatkin, M. B. Abnormal findings on magnetic resonance images of asymptomatic shoulders. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77, 10-15 (1995).
- Ker, R. F., Wang, X. T., Pike, A. V. Fatigue quality of mammalian tendons. The Journal of Experimental Biology. 203, 1317-1327 (2000).
- Wilson, J. J., Best, T. M. Common overuse tendon problems: A review and recommendations for treatment. American Family Physician. 72, 811-818 (2005).
- Fleischer, J., et al. Biomechanical strength and failure mechanism of different tubercula refixation methods within the framework of an arthroplasty for shoulder fracture. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research. 103, 165-169 (2017).
- West, J. R., Juncosa, N., Galloway, M. T., Boivin, G. P., Butler, D. L. Characterization of in vivo Achilles tendon forces in rabbits during treadmill locomotion at varying speeds and inclinations. Journal of Biomechanics. 37, 1647-1653 (2004).
- Cavinatto, L., et al. Early versus late repair of rotator cuff tears in rats. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27, 606-613 (2018).
- Potter, R., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The developing shoulder has a limited capacity to recover after a short duration of neonatal paralysis. Journal of Biomechanics. 47, 2314-2320 (2014).
- Connizzo, B. K., Sarver, J. J., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Effect of Age and Proteoglycan Deficiency on Collagen Fiber Re-Alignment and Mechanical Properties in Mouse Supraspinatus Tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021019 (2013).
- Beason, D. P., et al. Hypercholesterolemia increases supraspinatus tendon stiffness and elastic modulus across multiple species. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22, 681-686 (2013).
- Miller, K. S., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J. Collagen fiber re-alignment in a neonatal developmental mouse supraspinatus tendon model. Annals of Biomedical Engineering. 40, 1102-1110 (2012).
- Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2780-2788 (2018).
- Thomopoulos, S., Birman, V., Genin, G. M. Structural Interfaces and Attachments in Biology. Infection and Immunity. 35, (2013).
- Boivin, G. P., et al. Biomechanical properties and histology of db/db diabetic mouse Achilles tendon. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 4, 280-284 (2014).
- Ansorge, H. L., Adams, S., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Mechanical, Compositional, and Structural Properties of the Post-natal Mouse Achilles Tendon. Annals of Biomedical Engineering. 39, 1904-1913 (2011).
- Shu, C. C., Smith, M. M., Appleyard, R. C., Little, C. B., Melrose, J. Achilles and tail tendons of perlecan exon 3 null heparan sulphate deficient mice display surprising improvement in tendon tensile properties and altered collagen fibril organisation compared to C57BL/6 wild type mice. PeerJ. 6, 5120 (2018).
- Probst, A., et al. A new clamping technique for biomechanical testing of tendons in small animals. Journal of Investigative Surgery. 13, 313-318 (2000).
- Talan, M. Body temperature of C57BL/6J mice with age. Experimental Gerontology. 19, 25-29 (1984).
- Newton, M. D., et al. The influence of testing angle on the biomechanical properties of the rat supraspinatus tendon. Journal of Biomechanics. 49, 4159-4163 (2016).
- Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55, 44-51 (2014).
- Gimbel, J. A., Van Kleunen, J. P., Williams, G. R., Thomopoulos, S., Soslowsky, L. J. Long durations of immobilization in the rat result in enhanced mechanical properties of the healing supraspinatus tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 400-404 (2006).
- Freedman, B. R., Sarver, J. J., Buckley, M. R., Voleti, P. B., Soslowsky, L. J. Biomechanical and structural response of healing Achilles tendon to fatigue loading following acute injury. Journal of Biomechanics. 47, 2028-2034 (2014).
- Deymier, A. C., et al. The multiscale structural and mechanical effects of mouse supraspinatus muscle unloading on the mature enthesis. Acta Biomaterialia. 83, 302-313 (2019).
- Killian, M. L., Thomopoulos, S. Scleraxis is required for the development of a functional tendon enthesis. FASEB Journal. 30, 301-311 (2016).
- Schwartz, A. G., Long, F., Thomopoulos, S. Enthesis fibrocartilage cells originate from a population of Hedgehog-responsive cells modulated by the loading environment. Development. 142, 196-206 (2015).
- Bell, R., Taub, P., Cagle, P., Flatow, E. L., Andarawis-Puri, N. Development of a mouse model of supraspinatus tendon insertion site healing. Journal of Orthopaedic Research. 33, 25-32 (2014).
- Connizzo, B. K., Bhatt, P. R., Liechty, K. W., Soslowsky, L. J. Diabetes Alters Mechanical Properties and Collagen Fiber Re-Alignment in Multiple Mouse Tendons. Annals of Biomedical Engineering. 42, 1880-1888 (2014).
- Eekhoff, J. D., et al. Functionally Distinct Tendons From Elastin Haploinsufficient Mice Exhibit Mild Stiffening and Tendon-Specific Structural Alteration. Journal of Biomechanical Engineering. 139, 111003 (2017).
- Mikic, B., Bierwert, L., Tsou, D. Achilles tendon characterization in GDF-7 deficient mice. Journal of Orthopaedic Research. 24, 831-841 (2006).
- Sikes, K. J., et al. Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).
- Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains. Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).
- Wang, V. M., et al. Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5. Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).
- Zhang, K., et al. Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model. Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).
- Rooney, S. I., et al. Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model. American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).
- Galasso, O., et al. Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears. Arthroscopy – Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).
- Sarver, D. C., et al. Sex differences in tendon structure and function. Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).
- Razmjou, H., et al. Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66 (2011).
