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Bioengineering

鼠头的生物力学试验

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60280
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Department of Orthopedic Surgery, Columbia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

Summary

该协议描述了使用定制尺寸的3D打印夹具对肌腱进行高效和可重复的拉伸生物力学测试方法。

Abstract

肌腱疾病是常见的，影响所有年龄的人，并经常使人衰弱。标准治疗，如消炎药、康复和手术修复，往往失败。为了定义肌腱功能并展示新疗法的疗效，必须准确确定动物模型中肌腱的机械特性。鼠种模型现在被广泛用于研究肌腱疾病和评估肌腱病的新疗法;然而，确定小鼠肌腱的机械特性一直具有挑战性。在这项研究中，为肌腱机械测试开发了一个新的系统，其中包括三维打印的固定装置，这些装置与腐殖质和钙化物的解剖完全匹配，分别用于机械地测试上皮肌腱和跟腱。这些夹具是使用原生骨解剖、固体建模和增材制造的 3D 重建来开发的。新方法消除了工件夹持故障（例如，生长板故障而不是肌腱故障），减少了总体测试时间，并增加了可重复性。此外，这种新方法很容易适应测试其他动物的其他肌腱和肌腱。

Introduction

肌腱疾病在老化、运动和活跃人群1、2、3中很常见和高度流行。在美国，每年有1640万结缔组织损伤报告，占所有与伤害有关的医生办公室就诊人数的30%， 8.最常见的受影响的部位包括旋转手铐，跟腱，和骨腱9。虽然已经探索了各种非手术和手术治疗，包括消炎药、康复和手术修复，但效果仍然很差，恢复功能有限，失败率高5 6.这些不良的临床结果促使基础和翻译研究寻求了解肌腱病，并开发新的治疗方法。

拉伸生物力学特性是定义肌腱功能的主要定量结果。因此，肌腱病变和治疗效果的实验室表征必须包括对肌腱拉伸特性的严格测试。许多研究描述了从动物模型（如大鼠、绵羊、狗和兔子10、11、12）中确定肌腱的生物力学特性的方法。然而，很少有研究测试过肌腱的生物力学特性，这主要是因为难以抓住小组织进行拉伸测试。由于鼠模型在机械研究肌腱病方面有许多优点，包括基因操作、广泛的试剂选择和低成本，因此需要开发准确、高效的生物力学方法来检测鼠组织。

为了正确测试肌腱的机械特性，必须有效地抓住组织，而不会在抓斗界面处打滑或被工器撕裂或生长板破裂。在许多情况下，特别是对于短肌腱，骨头被抓住一端，肌腱抓住另一端。骨骼通常通过嵌入环氧树脂13和聚甲基丙烯酸酯14、15等材料来固定。肌腱通常放置在两层沙纸之间，用氰丙烯酸酯粘附，并使用压缩夹（如果横截面平坦）或冷冻介质（如果横截面较大）15、16、17 固定.这些方法已应用于生物力学试验鼠肌腱，但由于标本体积小，生长板的符合性，从未出现过18种，因此出现了挑战。例如，鼠头的直径只有几毫米，因此很难抓住骨头。具体来说，对肌腱到骨骼样本的拉伸测试通常会导致生长板的失效，而不是在肌腱或肌腱上。同样，对跟腱进行生物力学测试也极具挑战性。虽然跟腱比其他肌腱大，但卡内肌很小，使得抓住这个骨头变得困难。骨骼可以去除，然后抓住两个肌腱末端;然而，这排除了肌腱到骨骼附件的测试。其他团体报告使用定制的夹具19，20，锚定在夹21，固定在自固化塑料水泥22或使用锥形槽22，但这些以前的方法仍然受到低重现性、高夹持故障率和繁琐的准备要求的限制。

目前的研究目标是开发一种准确而有效的方法，用于对肌腱进行拉伸生物力学测试，以上皮肌腱和跟腱为例。利用来自原生骨骼解剖、实体建模和增材制造的 3D 重建组合，开发了一种控制骨骼的新方法。这些夹具有效地固定了骨骼，防止了生长板故障，减少了试样制备时间，并增加了测试的可重复性。新方法很容易适应测试其他鼠肌腱以及大鼠和其他动物的肌腱。

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Protocol

动物研究得到了哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。本研究中使用的小鼠具有 C57BL/6J 背景，是从杰克逊实验室（美国梅港巴港）购买的。他们被安置在无病原体屏障条件下，并向他们提供食物和水。

1. 开发用于夹持骨的定制贴合 3D 打印夹具

  1. 骨骼图像采集与3D骨骼模型构造
    1. 在准备 3D 模型创建和 3D 骨夹持打印时，解剖感兴趣的骨骼;腐殖质和卡卡内乌斯在当前协议中用作示例。
      注：步骤 2.1.1 中提供了用于机械测试的解剖骨肌肌肉标本的详细说明。应遵循以下步骤来隔离骨骼，以便创建 3D 打印的骨骼夹点。
      1. 腐殖质的解剖：根据IACUC批准的程序对一只老鼠进行安乐死。去除上肢皮肤，去除腐殖质上的所有肌肉，消除肘部和关节，并小心地去除所有附着在腐殖质上的结缔组织。
      2. 切卡内分科：根据IACUC批准的程序对一只老鼠进行安乐死。去除下肢皮肤，消除卡卡内斯和其他脚骨之间的跟腱-卡卡内斯关节和关节，并小心地去除所有连接到钙化物的连接组织。
    2. 对整个骨骼进行微计算断层扫描，例如扫描腐殖质和钙化物样本。
      注： 根据所使用的扫描仪，设置会有所不同。对于当前研究中使用的扫描仪（材料表），建议的设置是：以55 kVP的能量扫描，以6μm的分辨率扫描Al0.25滤波器。
      1. 将阿加玫瑰粉混合在超纯水和微波中1-3分钟，直到甘蔗完全溶解。它有助于微波30-45秒，停止和旋转，然后继续朝沸腾。将冷冻管装满四分之三的甘蔗。让甘蔗冷却约5-10分钟。
      2. 将骨插入胶质凝胶（这将防止扫描过程中的运动伪影）。将带骨骼的冷冻管插入扫描仪。
        注：对于当前研究中使用的扫描仪，所有扫描都使用 16 位置自动样本更换器。此扫描仪可以根据样本的大小和形状自动选择放大倍率。
    3. 重建微计算断层扫描投影图像到横截面图像。对实验者的扫描仪/软件组合使用推荐的参数。
      注：对于当前研究中使用的程序（材料表），建议使用以下重建参数：平滑：0-2，光束硬化校正：45，环技术还原：4-9，并在16位TIFF中重建切片格式。
    4. 创建 3D 模型并保存到与大多数 3D 打印机和快速原型设计兼容的标准 STL 格式中。对于当前研究中使用的程序（材料表），执行以下操作：
      1. 选择命令文件>打开以打开文件数据集。打开对话框"文件>首选项"并选择"高级"选项卡。
      2. 使用自适应渲染算法构造 3D 模型。该算法最大限度地减少了分面三角形的数量，并提供更平滑的表面细节。使用 10 作为局部参数;此参数定义到用于查找对象边框的相邻点的距离（以像素为单位）。将容差最小化为 0.1，以减小文件大小。
        注： 打开数据集后，图像将显示在"原始图像"页中。
      3. 要指定兴趣量 （VOI），请手动选择要设置为所选 VOI 范围的顶部和底部的两个图像。
      4. 移动到第二页，感兴趣的区域。在单个横截面图像上手动选择感兴趣的区域。
        注： 所选区域将以红色突出显示（即，胡同横截面区域）。
      5. 每 10~15 个横截面图像重复上一步。
      6. 移动到第三页二进制选择。在直方图菜单上，单击"从数据集"。将显示数据集所有图像的亮度直方图分布。此外，在直方图菜单上，单击"创建 3D 模型"文件菜单。
    5. 以 STL 文件格式保存骨骼的 3D 模型。
    6. 优化网格：操作网格以减小 STL 文件的大小，使其与任何实体建模计算机辅助设计程序兼容。对于当前研究中使用的程序（材料表），请按照以下步骤操作：
      1. 导入网格并选择要编辑的所有网格。从工具集"编辑"中选择"减少"。然后，从工具集中选择"减少目标"三角形预算。减少三次计数并接受更改。通过选择"导出"作为...
  2. 定制骨骼夹具的设计
    1. 上皮拉皮纳斯肌腱-腐殖质骨
      1. 使用实体建模计算机辅助设计程序创建 Humerus 夹持夹具的自定义拟合模型（图 1，补充文件）。
        注：当前研究中使用的程序列在"材料表"中。
      2. 在实体建模程序中打开腐殖质骨骼的 STL 格式文件，并保存为零件文件。
        注：对于当前研究中使用的软件（材料表），3D骨骼对象以SLDPRT格式保存。
      3. 打开零件文件并手动创建三个与解剖学相关的平面（即，下垂、日冕、横向）。
        1. 手动定义下垂平面，以在更大的管状下切开上皮肌腱附件。确保 3D 块包含作为对称平面的下垂平面。为此，如果需要，应从块中添加或切割材料。
          注：此对称平面可确保将试样插入夹具时，肌腱和肌腱附件位于夹具的中轴。
      4. 沿三个平面（即高度、宽度、长度）测量骨骼的尺寸。
      5. 测量将连接 3D 打印夹具的机械测试夹具的尺寸。
      6. 首先设计实心块零件（例如，实心圆柱体）。
        1. 确保块的每个尺寸至少比腐殖质的尺寸大 5 mm。
        2. 考虑机械测试夹具的设计约束（即，确保 3D 打印夹具可以在机械测试夹具中自由组装和拆卸）。
      7. 创建具有两个零部件的装配模型：实心块和右侧或左侧腐殖质骨骼。定义块内骨骼的方向（即肌腱和骨骼之间的角度）。确保整个骨骼体积适合块内。
      8. 使用腐殖质骨作为模具在块中创建空腔。如果使用材料表中指定的软件，请按照以下步骤操作：
        1. 将设计零件（腐殖质）和模具底座（缸体）插入临时组件。在装配体窗口中，选择块，然后从装配体工具栏单击"编辑零部件"。
        2. 单击插入>特征>型腔。选择"均匀缩放"，然后输入 0% 作为在所有方向进行缩放的值。
      9. 抑制骨骼零件并将装配体另存为零件。
      10. 打开零件（带型腔的圆柱体）。沿下垂平面切割零件，以创建两个对称的部件，这些组件在骨骼前部和后部配合（例如，两个半圆柱体，如图1所示）。
        注：两个组件设计为适合骨骼前和后。前部分量包括一个半球形的腔，从腐殖质头的前侧延伸到上皮肌腱附件。后部腔的形状类似于腐殖质的后部分（即腐殖质头的后侧、三角管状、中侧和侧史诗）。
      11. 将每个组件另存为单独的文件部件。
      12. 对于前部分量，通过定义适当的公差，确保腐殖质头嵌入零件的腔中。
        注：在当前研究中，使用材料表中指定的软件，建议按照以下步骤操作：
        1. 创建旋转切割以平滑型腔的网格几何体。通过模拟型腔几何体并添加位置间隙，为切割创建草图。
          注： 间隙允许在骨骼和前零部件之间自由组装和拆卸。
      13. 修改后零部件以模仿型腔几何体以创建增加间隙的切口，如上文所述的前零部件。
      14. 在横向平面上进行切割，从后部的顶部开始，一端到大/小管板的峰顶。
        注：如图1和图2所示，后侧分量包括一个切口，在肌腱附件处创建一个开口。
      15. 在两个零部件之间创建舒适配合，以便自由组装和拆卸。
        注： 在当前算例中，为夹具创建了带有松散运行间隙的孔轴配合。
      16. 为对方肢体（即左侧或右侧）的夹具的每个零部件创建 3D 镜像模型。
      17. 在夹具底部添加蚀刻以区分左右两侧。
      18. 以 STL 标准文件格式保存所有夹具部件，为 3D 打印做准备。
    2. 阿基里斯肌腱-卡卡内斯骨
      1. 按照上述步骤操作，用于上皮胡体头夹具。
        注：阿喀琉斯卡卡内只需一组固定装置，因为左右钙化物骨骼的解剖结构几乎对称。

2. 鼠腱的生物力学试验

  1. 标本制备和横截面面积测量
    1. 在准备拉伸机械测试时，解剖感兴趣的肌肉-肌腱骨。在目前的研究中，从8周大的C57BL/6J小鼠中分离出超皮肌 - 肌腱 - 腐殖质骨标本（N=10，5雄性，5雌性）和胃关节肌- 阿基里斯肌腱-卡内乌斯骨标本（N=12，6雄性，6雌性）。
      1. 解剖上皮皮肌 - 肌腱 - 腐殖质骨标本
        1. 根据IACUC批准的程序对鼠标实施安乐死。将鼠标置于易放置位置。从前爪肘部上方向肩部切开皮肤。
        2. 用钝切除仔细去除皮肤，使肩部的肌肉可见。取出腐殖质周围的组织，直到骨头暴露，并可以用钳子牢固地固定。
        3. 用钳子握住腐殖质，并小心地去除三角和梯形肌肉，以暴露胸围。识别关节关节，用手术刀小心地将锁骨与颈骨分离。
        4. 注意不要损坏上皮肌腱及其骨质附件，使用手术刀从其肩囊附件中取出肌肉。注意不要损坏上皮肌腱及其骨质附件，将腐殖质头从鹰形分离;使用手术刀刀片，撕裂关节胶囊和红外线，下囊，和三叶肌腱。
        5. 分解肘关节，将腐殖质与 ulna 和半径分开。分离腐殖质 - 上皮肌腱 - 肌肉标本，并清除腐殖质和腐殖质头上多余的软组织。
      2. 阿基里斯肌腱的解剖 - 卡卡内斯骨样本
        1. 根据IACUC批准的程序对鼠标实施安乐死。将鼠标置于易放置位置。注意不要损坏跟腱及其骨质附件，用钝切除去除皮肤，使脚踝和膝关节周围的肌肉暴露。
        2. 使用手术刀刀片，从跟腱 - 卡卡内斯附件开始，小心地将胃肠肌从近端附件中分离出来。
        3. 仔细地从各种相邻的骨头中解说钙化物。分离跟腱 - 卡卡内斯标本，并清除多余的软组织。
    2. 使用微计算断层扫描确定肌腱的横截面区域。
      注：对于当前研究中使用的扫描仪（材料表），建议的设置是：以55 kVP的能量扫描，以5μm的分辨率扫描Al0.25滤波器。
      1. 将阿加玫瑰粉混合在超纯水和微波中1-3分钟，直到甘蔗完全溶解。它有助于微波30-45秒，停止和旋转，然后继续朝沸腾。将冷冻管装满四分之三的甘蔗。让甘蔗冷却约5-10分钟。
      2. 将骨骼倒置插入冷冻管中，将试样挂起。
        注：只有骨头应位于胶质凝胶中。肌腱和肌肉应该悬挂在外。
    3. 扫描后，使用手术刀轻轻去除肌腱的肌肉。将试样插入 3D 打印夹具中。
      注： 夹持对于每个测试都是可重用的。请勿在夹具中使用胶水或环氧树脂;骨头被扣在压合。
    4. 在折叠的薄纸巾（2 厘米 x 1 厘米）之间插入和粘合肌腱，并使用薄膜夹紧夹紧结构。将带有试样的 3D 打印夹具连接到测试夹具中。
    5. 在37°C（即小鼠体温23）将样品和手柄插入磷酸盐缓冲盐水（PBS）测试槽中。
  2. 拉伸测试
    1. 在材料测试框架上执行拉伸机械测试。
      注：对于当前研究中使用的测试框架（材料表），建议的协议是：
      1. 将仪表长度定义为从肌腱附件到上部手柄的距离。
      2. 在 0.05 N 和 0.2 N 之间循环 5 个周期的前提条件。
      3. 保持 120 s。
      4. 使用张力以 0.2%/s 的故障。
    2. 收集负载变形数据。
    3. 将应变计算为相对于肌腱初始仪表长度的位移。
    4. 计算应力，将力除以初始肌腱横截面面积（从微CT测量）。
    5. 如果对粘弹性行为感兴趣，在张力测试失败之前执行应力松弛，并使用数据从准线性粘弹性模型24中计算 A、B、C、tau1 和 tau2 等参数。
    6. 从载荷变形曲线中，计算刚度（曲线线性部分的斜率）、最大力和要屈服的工作（曲线下的面积到屈服力）。
      1. 通过在负载变形曲线中选择点窗口来标识线性部分，该窗口在线性最小二乘回归25中最大化 R2值。
      2. 将刚度确定为载荷位移曲线25、26的线性部分的斜率。
    7. 从应力应变曲线中，计算模量（曲线线性部分的斜率）、强度（最大应力）和弹性（曲线下的面积，以产生应力）。
      注： 使用 RANSAC 算法，当 y 拟合偏离预期应力值 （y 值） 的 0.5% 时，屈服应变 （x 值） 被定义为第一个点。屈服应力是屈服应变的对应 y 值。
      注：除了当前研究中描述的单调拉伸载荷到故障之外，循环载荷还可以提供有关肌腱疲劳和/或粘弹性特性的重要信息。例如，弗里德曼等人报告了27号肌腱的疲劳特性。
    8. 完成拉伸测试后，对整个骨骼进行微计算断层扫描，例如扫描腐殖质和卡卡内乌斯样本。
      注：对于当前研究中使用的扫描仪（材料表），建议的设置是：以55 kVP的能量扫描，以6μm的分辨率扫描Al0.25滤波器。
      1. 重复步骤 1.1.2.1~1.1.2.2。
    9. 重复步骤 1.1.3。
    10. 使用与扫描仪兼容的 3D 可视化程序创建扫描对象的卷渲染 3D 模型。
      注：当前研究中使用的程序列在"材料表"中。
    11. 通过检查 3D 对象确定故障模式和故障站点区域。
  3. 统计分析：将所有样本结果显示为均值 = 标准差 （SD）。使用学生的 t 测试（双尾和未配对）对组进行比较。将显著性设置为p < 0.05。
    注：当前研究中使用的统计软件列在材料表中。

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Representative Results

3D打印的固定装置用于测试8周大的鼠超脊柱和跟腱。所有经过机械测试的样品在检测时均失败，其特点是微CT扫描、目视检查和拉伸测试后的视频分析。图3对实验室中以前和当前超皮肌腱测试方法的一对一比较。在上一种方法28，29，30中，腐殖质骨被嵌入环氧树脂中，一个回形针被放置在腐殖质头部，以防止生长板断裂。需要4-6小时才能使环氧树脂完全固化（图3），只允许6-8个样本在典型的一天内进行测试。该方法的进一步限制是回形针放置的与用户相关的有效性，以防止生长板断裂。使用这些先前方法的测试结果是高度可变的，大多数参数的变化系数约为30%，生长板故障率约为10%~20%。如图3所总结，使用新方法的试样制备时间缩短至5~10分钟，因此每天测试16-20个样品是可行的。此外，还消除了生长板故障。

与其他人报告用于测试肌腱的方法相比，14、15、17、25、28、29、30、31 ，32，33， 新方法更有效，更可重复.对于超脊柱肌腱，结构特性（如最大负载（3.8 ± 0.6 N）和刚度（12.7 ± 1.8 N/mm））以及标准化材料特性（如最大应力（8.7 ± 3.0 MPa）和模量（51.7 ± 13.5 MPa）的系数大大降低。与文献结果相比的变化（表1）。对于跟腱，机械特性，如最大负载（7.8 ± 1.1 N）和刚度（13.2 ± 1.9 N/mm）与文献19、21、22的结果相比，变化系数较低，32，33，34，35，36，37，38， 而最大应力 （24.2 × 5.4 MPa） 和模量 （73.2 °22.1 MPa） 的变异系数与文献中报告的系数相似（表2）。

动物性对上皮肌腱和跟腱的机械特性有显著影响（图4）。当比较雄性和雌性上皮肌腱时，最大力（p = 0.002）和工作屈服（p = 0.008）显著增加。两组之间有刚度（p = 0.057）、应力（p = 0.068）、模量（p = 0.061）和弹性（p = 0.078）之间的趋势。当比较男性和女性跟腱时，最大应力（p = 0.0006）和弹性（p = 0.0019）显著增加。两组工作屈服（p = 0.079）和模量（p = 0.074）之间存在趋势，最大力（p = 0.1880）和刚度（p = 0.6759）无差异。

Figure 1
图 1：用于腐殖质（上行）和卡卡内乌斯（下排）的夹具的代表性 3D 模型。（A） 骨骼的 3D 模型.（B） 拆卸的夹具型号。（C） 夹具的装配型号。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2：代表性的 3D 打印夹具。（A） 用于在腐殖质和上皮肌腱之间以 180° 角对 8 周大小鼠的上皮肌腱进行生物力学测试的夹具。（B） 用于8周大小鼠上皮肌腱的生物力学测试夹具，其角度为胡同肌腱和上皮肌腱之间的角度为135°。（C） 用于在钙化物和跟腱之间以 120° 角对鼠跟腱进行生物力学测试的夹具。（D） 用于对成年斯普拉格道利大鼠的上皮肌腱进行生物力学测试的夹具，在腐殖质和上皮肌腱之间的角度为 180°。比例尺：5毫米。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：对鼠皮上肌腱进行机械测试的以往和当前方法的比较。（A） 在机械测试之前，我们实验室使用以前的标本制备方法：腐殖质被灌在环氧树脂中，以稳定骨骼，将回形针放在腐殖质头上，以防止生长板断裂，以及对于环氧树脂固化，在机械测试前将样品留在室温中4-6小时。（B） 当前研究中使用的标本制备方法（步骤 1.2 和 2.1.4）：左上角显示由实体建模程序生成的夹具的 3D 表示形式。3D 打印夹具可重复使用，易于组装和拆卸。试样骨端插入夹具中，固定生长板并露出肌腱进行夹持和测试。肌腱末端粘在折叠的薄纸巾之间，并插入手柄。每个试样的准备时间是10~15分钟。（C） 使用现有方法用于超皮肌腱拉伸测试的代表性载荷变形曲线。（D） 代表载荷变形曲线，用于超皮肌腱的拉伸测试，显示生长板故障。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4：对超皮质（SST）和阿基里斯（ACHT）肌腱的机械特性的性影响。基于未配对的t-测试（[性效应，p<0.05）》，性对许多机械特性有显著影响。数据显示为均值 = 标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5：微CT的横截面面积测量。（A） 沿上皮肌腱长度的最小横截面面积测量。（B） 沿跟腱长度的最小横截面面积测量。应仅选择肌腱本身进行测量。请点击此处查看此图的较大版本。

结构属性 材料属性
动物 最大力 （N） 硬度（N/mm） 最大应力（Mpa） 模组 （MPa）
作者 N 背景 平均 = SD COV（%） 平均 = SD COV （%） 平均 = SD COV （%） 平均 = SD COV （%）
比森等人《肩部和肘部手术杂志》（2013）15 10 C57Bl/6 0.93±0.34 36.56 95.1[39.8] 41.85 3.40±1.56 45.88 312.8±127.0 40.60
贝尔等人骨科研究杂志（2014）31 6 C57Bl/6 1.22 ± 0.52 42.62 2.37 × 1.6 67.51 星期日 星期日
康等人骨科研究杂志（2018）17 8 C57Bl/6 5.38 × 2.404# 44.68 4.25 × 1.67# 39.29 星期日 星期日
康尼佐等人生物医学工程年鉴（2014）32 10 NR（db/+） 星期日 84.44 ± 27.23° 32.25 星期日 476 × 186.27° 39.13
康尼佐等人生物医学工程杂志（2013）14 星期日 C57/BL6 星期日 星期日 星期日 297 × 148.90* 50.13
戴美尔等人Acta 生物材料（2019）28 12 CD-1 IGS 鼠标 （WT） 5.0 × 0.7 14 9.2 × 2.9 31.52 33 × 35 106.06 星期日
Eekhoff等人生物医学工程杂志（2017）33 13 埃尔恩 [/] 星期日 8.50 ± 2.95 34.71 5.96 × 3.23 54.19 101.2 × 50.8 50.20
基里安等人FASEB 杂志（2016）29 8 C57BL/6 星期日 星期日 7.79 ± 2.61° 33.50 58.32 ± 31.73° 54.41
施瓦茨等人骨（2014）25 20 CD-1 IGS 鼠标 （WT） 4.11 ± 0.79° 19.22 8.58 ± 3.78° 44.06 12.29 ± 5.95° 48.41 133.80 ± 59.41° 44.40
施瓦茨等人发展（2015）30 12 （罗萨-DTA （DTA） x Gli1-CreERT2 ）ScxCre;斯莫夫尔/fl （WT） 4.16 ± 0.29° 6.97 11.04 ± 1.98° 17.93 26.24 × 5.81 22.14 121.89 × 44.18 36.25
平均 COV 27.34 平均 COV 38.64 平均 COV 51.70 平均 COV 45.02
新方法 10 C57BL/6J 3.79 ± 0.62 16.41 12.73 × 1.81 14.20 8.71 × 3.04 34.91 51.67 × 13.54 26.20

表1：上皮肌腱的机械特性。平均 = SD 和变异系数 （COV），用于使用新方法估计的结构和材料属性 （COV），与文献中报告的方法相比。[NR：未报告，=从数字估计，*从报告的标准误差计算的标准偏差，*使用光学染色线测量变形*。

结构属性 材料属性
动物 最大力 （N） 硬度（N/mm） 最大应力（Mpa） 杨的模量 （MPa）
作者 N 背景 平均 = SD COV（%） 平均 = SD COV （%） 平均 = SD COV （%） 平均 = SD COV （%）
Boivin等人的肌肉，韧带和肌腱杂志 （2014）19 6 非糖尿病精益控制小鼠 8.1 × 0.6 7.41 3.9 × 0.7 17.95 星期日 16 × 3.7 23.13
康尼佐等人生物医学工程年鉴 （2014）32 10 db/* 星期日 20.39 ± 2.43° 11.92 星期日 152.94 × 44.12° 28.85
Eekhoff等人生物力学工程杂志 （2017）33 8 埃尔恩 [/] 星期日 18.86 × 3.37 17.87 10.55 × 2.97 28.15 443.8 × 131.7 29.68
Mikic等人骨科研究杂志 （2006）34 20 C57BL/6-J x 129SV/J 星期日 星期日 18 × 5 27.78 61 × 20 32.79
Probst等人调查性外科杂志 （2000）22 20 巴尔布/c 8.4 × 1.1 13.10 6.3 × 1.2 19.05 星期日 星期日
Shu 等人对等 J （2018）21 9 C57BL/6 9.6 × 3.84 39.96 8.19 × 3.63 44.32 27.55 × 10.54 38.26 星期日
Sikes等人骨科研究杂志 （2018）35 7 C57BL/6 星期日 星期日 19.53 × 7.03 0.36 62.82 × 20.20 32.16
王等人骨科研究杂志 （2006）36 9 A/J 8.4 × 1.2 14.29 12.2 × 2.8 22.95 78.2 × 8.6 11.00 713.9 × 203.7 28.53
王等人骨科研究杂志 （2006）36 8 C57BL/6J 10.2 × 1.4 13.73 13.1 × 2.5 19.08 97.4 × 11.4 11.70 765.1 × 179.6 23.47
王等人骨科研究杂志 （2006）36 7 C3H/HeJ 12.5 × 1.7 13.60 14.1 × 3.2 22.70 97.5 × 10.9 11.18 708.6 × 127.8 18.04
王等人骨科研究杂志 （2011）37 7 C57BL/6 6.6 × 1.7 25.76 8.2 × 1.4 17.07 13.4 × 3.7 27.61 86.8 × 15.5 17.86
张等人矩阵生物学 （2016）38 星期日 CD-1 和 C57BL/6J 6.73 ± 3.74° 55.57 12.03 ± 3.34° 27.76 25.4 ± 15.14° 59.61 632.31 × 113.79° 18.00
平均 COV 22.93 平均 COV 22.07 平均 COV 23.96 平均 COV 25.25
新方法 12 C57BL/6J 7.8 ± 1.08 13.91 13.19 × 1.86 14.08 24.16 × 5.42 22.45 73.17 × 16.14 22.06

表2：跟腱的机械特性。均值 = SD 和 COV，用于使用新方法估计的结构和材料属性，与文献中报告的方法相比。[NR：未报告，= 从数字估计，= 从报告的标准误差计算的标准偏差]。

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Discussion

鼠群模型通常用于研究肌腱疾病，但其机械特性的表征在文献中具有挑战性且罕见。该协议的目的是描述一种对肌腱进行拉伸测试的时间高效和可重复的方法。新方法将测试样本所需的时间从数小时缩短到几分钟，并消除了以前方法中常见的重大夹持伪影。

该协议中描述的几个步骤对于生产有效的夹具至关重要，机械测试鼠超脊柱和跟腱。首先，步骤 1.1.4 是创建所需骨骼的 3D 模型所必需的;但是，由于用于此扫描的通常高分辨率，文件大小可能太大，无法与实体建模程序一起使用。该协议中使用的软件成功地减小了文件的大小（步骤 1.1.6）并保留了对象几何体，尽管其他软件也可以有效地实现此目的。其次，每个解剖位点都有特定的设计标准，要考虑有效的抓取。对于上皮肌腱夹具的设计，关键应：（i） 固定腐殖质头以防止生长板故障（步骤 1.2.1.12），（ii） 定义间隙配合，以避免在测试期间从模具中分离腐殖质骨（步骤 1.2.1.12.1）和 （iii） 定位腐殖质骨，以形成 180° 角度与肌腱的长轴 （步骤 1.2.1.7）。对于跟腱夹具设计，以下关键：（i） 定义一个间隙配合，在测试期间不从夹具中滑出小卡内骨，以及 （ii） 定位卡卡内骨，使其形成 120° 角度（30° 平面弯曲）与长轴肌腱。第三，精确测量肌腱横截面面积（步骤2.1.2）对于正确计算工程应力以测定材料性能至关重要。为了测量上皮肌腱的横截面面积，我们建议对悬浮在底部平的冷冻管中的骨肌肌肉标本进行微计算断层扫描扫描，将骨骼倒置在管中，并带有角胶。只应将腐殖质骨插入到胶质凝胶中，而跟腱和肌肉附着的腐殖质头部应在空中扫描。由于上皮肌腱在插入骨骼时具有带状几何体，因此测量横截面区域的最一致方法是确定沿肌腱长度的最小横截面面积。应遵循类似的程序来测量跟腱的横截面区域。对于跟腱，高分辨率微计算断层扫描扫描显示两个不同的组织：肌腱本身和周围的护套，显示为较浅的阴影。要持续估计跟腱的最小横截面面积，应只选择肌腱进行测量（图5）。最后，夹具是可重用的，样品与样品的微小变化不会影响其有效性。每个骨骼应扫描一次（例如，对于当前研究，左腐殖质、右腐殖质和卡卡内乌斯），并且应为每个骨骼创建一个 3D 模型。此外，对于同龄动物，骨骼几何形状几乎相同，因此可用于测试所有标本的相同夹具。在这份手稿中，3D打印夹具特定于8周大小鼠（骨骼成熟成年小鼠）用于测试肌腱。没有必要单独创建男女固定装置。对于其他年龄组（例如4周大小鼠）或具有独特骨表型的小鼠，建议制造适合骨骼特定几何形状的固定装置。

在设计和3D打印夹具后，为了确保方法的可重复性和效率，通常应测试来自计划研究背景和年龄相同小鼠的10个肌腱样本（确切的样本大小可能因组织和动物模型）。应确定这些肌腱的机械特性，以确保结构和材料特性的变异系数在预期范围内，如表1和表2所述。这些试验还应确认不发生工件故障（例如生长板故障）。可能需要多个设计周期、原型设计和验证，以实现当前论文中描述的上皮肌腱和跟腱以外的肌腱所需的结果。

许多小组已经报告了肌腱的机械特性。这些研究中的变异系数通常很高，通常很难发现比较组之间的差异。此外，各种研究之间组织抓握的方法差异使得很难确定故障性质是否与肌腱相关，还是由于工件抓地力故障。为了将新的测试方法与现有方法进行比较，进行了文献综述，并总结了20项研究的结果（表1和表2）。在文献中，对于超脊柱肌腱机械测试，最大力、刚度、最大应力和模量的平均变异系数分别为27%、39%、52%和45%。在跟腱机械测试中，最大力、刚度、最大应力和模量的平均变异系数分别为23%、22%、24%和25%。在目前的研究中，测试肌腱的新方法使上皮肌腱变异系数降低了32%-63%，阿基里斯肌腱变异系数降低了6%-39%。

目前没有抓取骨骼的标准方法，因此不清楚人工夹持问题在多大程度上影响了报告的肌腱的机械特性。大多数组报告使用环氧树脂13、聚甲基甲酰胺 （PMMA）14、15或氰丙烯酸酯16夹持腐殖质骨，并通过应用 PMMA14的第二层涂层固定腐殖质头，使用定制夹具39和/或插入回形针25，28，30 。同样，其他团体报告使用定制的夹具19，20，用夹21锚定，固定在自固化塑料水泥22或使用圆锥形的卡卡内骨。插槽22.但是，这些方法仍然受到低重现性、高工件故障率和耗时的准备要求的限制。本研究提出的新方法消除了人工握持故障，使一天内可测试的试样数量增加了两倍。此外，这些方法并不限于上皮肌腱和跟腱，因为它们很容易适应测试其他肌腱和肌腱从较大的动物模型。然而，要测试来自大型动物的肌腱，3D 打印夹具材料的模量必须足够高，使其与被测试的肌腱的强度不兼容。

几项研究表明，肌腱疾病的性别差异表明，女性在肌腱损伤40、41、42后治疗后功能下降。在目前的研究中，性对肌腱的机械特性有显著影响。在国家卫生研究院 （NIH） 的指导下，我们建议在动物模型的研究设计中，将性别作为生物变量进行核算，从而测量肌腱的机械性能。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

该研究得到了NIH/NIAMS（R01 AR055580，R01 AR057836）的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100 Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose 
Bruker microCT  Bruker BioSpin Corp Skyscan 1272  Used by authors
ElectroForce  TA Instruments 3200 Testing platform
Ethanol 200 Proof Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips Custom made Used by authors
Kimwipes Kimberly-Clark  S-8115 As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan) Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
MilliQ water (Ultrapure water) Millipore Sigma QGARD00R1 (or related purifier) 100 ml 
Meshmixer Autodesk http://www.meshmixer.com/ Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS  Stratasys LTD Precision Prototyping
Objet Studio Stratasys LTD Used by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 10010031 2.5 L of 10% PBS 
S&T Forceps Fine Science Tools 00108-11 Used by authors
Scalpel Blade - #11 Fine Science Tools 10011-00 Used by authors
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools 10003-12 Used by authors
SkyScan 1272 Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
Skyscan CT-Vox Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SkyScan NRecon Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SolidWorks CAD Dassault Systèmes SolidWorks Research Subsription Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue Loctite 234790 As suggested in protocol
Testing bath Custom made Used by authors
Thin film grips  Custom made Used by authors
VeroWhitePlus Stratasys LTD NA 3D printing material used by authors
WinTest  WinTest Software Used by authors to collect data

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References

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Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. J. Vis. Exp. (152), e60280, doi:10.3791/60280 (2019).

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