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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Tests biomécaniques des tendons murines

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60280
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Department of Orthopedic Surgery, Columbia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

Summary

Le protocole décrit des méthodes d'essai biomécaniques tendineuses et reproductibles efficaces et reproductibles pour les tendons murins grâce à l'utilisation d'appareils imprimés 3D sur mesure.

Abstract

Les troubles tendons sont fréquents, touchent les personnes de tous âges et sont souvent débilitants. Les traitements standard, tels que les médicaments anti-inflammatoires, la réadaptation et la réparation chirurgicale, échouent souvent. Afin de définir la fonction tendineuse et de démontrer l'efficacité des nouveaux traitements, les propriétés mécaniques des tendons des modèles animaux doivent être déterminées avec précision. Les modèles animaux de Murine sont maintenant largement employés pour étudier des désordres de tendinon et pour évaluer de nouveaux traitements pour des tendinopathies ; cependant, la détermination des propriétés mécaniques des tendons de souris a été difficile. Dans cette étude, un nouveau système a été développé pour les essais mécaniques de tendon qui inclut les montages 3D-imprimés qui correspondent exactement aux anatomies de l'humérus et du calcaneus pour tester mécaniquement des tendons supraspinatus et tendons d'Achille, respectivement. Ces appareils ont été développés en utilisant des reconstructions 3D de l'anatomie osseuse indigène, la modélisation solide, et la fabrication additive. La nouvelle approche a éliminé les défaillances de préhension artifactual (par exemple, l'échec à l'échec de la plaque de croissance plutôt que dans le tendon), a diminué le temps d'essai global, et a augmenté la reproductibilité. En outre, cette nouvelle méthode est facilement adaptable pour tester d'autres tendons et tendons murines d'autres animaux.

Introduction

Les troubles tendons sont fréquents et très répandus parmi les populations vieillissantes, athlétiques et actives1,2,3. Aux États-Unis, 16,4 millions de lésions des tissus conjonctifs sont signalées chaque année4 et représentent 30 % de toutes les visites au bureau des médecins liées aux blessures3,5,6,7, 8. Les sites les plus fréquemment touchés sont la coiffe des rotateurs, le tendon d'Achille et le tendon rotulien9. Bien qu'une variété de traitements non-opératoires et opératoires aient été explorés, y compris les drogues anti-inflammatoires, la réadaptation, et la réparation chirurgicale, les résultats restent pauvres, avec le retour limité à la fonction et les taux élevés d'échec5, 6. Ces mauvais résultats cliniques ont motivé des études de base et translationnelles visant à comprendre la tendinopathie et à développer de nouvelles approches de traitement.

Les propriétés biomécaniques tensiles sont les principaux résultats quantitatifs définissant la fonction tendinetaire. Par conséquent, la caractérisation en laboratoire de la tendinopathie et de l'efficacité du traitement doit inclure un test rigoureux des propriétés tendineuses. De nombreuses études ont décrit des méthodes pour déterminer les propriétés biomécaniques des tendons à partir de modèles animaux tels que les rats, les moutons, les chiens et les lapins10,11,12. Cependant, peu d'études ont testé les propriétés biomécaniques des tendons murines, principalement en raison des difficultés à saisir les petits tissus pour l'essai tendu. Comme les modèles murins ont de nombreux avantages pour étudier mécaniste tendinopathie, y compris la manipulation génétique, des options de réactifs étendus, et à faible coût, le développement de méthodes précises et efficaces pour tester biomécaniquement les tissus murines est nécessaire.

Afin de tester correctement les propriétés mécaniques des tendons, le tissu doit être saisi efficacement, sans glisser ou extirper l'interface d'adhérence ou la fracturation de la plaque de croissance. Dans de nombreux cas, en particulier pour les tendons courts, l'os est saisi à une extrémité et le tendon est saisi à l'autre extrémité. Les os sont généralement fixés en les incorporant dans des matériaux tels que la résine époxy13 et le polyméthylmethacrylate14,15. Les tendons sont souvent placés entre deux couches de papier de verre, collés avec du cyanoacrylate, et fixés à l'aide de pinces de compression (si la section transversale est plate) ou dans un milieu gelé (si la section transversale est grande)15,16,17 . Ces méthodes ont été appliquées aux tendons murines biomécaniquement d'essai, mais les défis se posent en raison de la petite taille des spécimens et de la conformité de la plaque de croissance, qui n'ossifie jamais18. Par exemple, le diamètre de la tête humérale murine n'est que de quelques millimètres, ce qui rend la préhension de l'os difficile. Plus précisément, l'essai tendu des échantillons de tendon-à-os de supraspinatus murine a souvent comme conséquence l'échec à la plaque de croissance plutôt que dans le tendon ou à l'enthèse de tendon. De même, l'essai biomécanique du tendon d'Achille est difficile. Bien que le tendon d'Achille soit plus grand que les autres tendons maurines, le calcanéum est petit, ce qui rend la préhension de cet os difficile. L'os peut être enlevé, suivi par la préhension des deux extrémités du tendon; cependant, ceci empêche l'essai de l'attachement de tendon-à-os. D'autres groupes rapportent saisir l'os de calcaneus utilisant des montages faits sur commande19,20,moulant par des pinces21,fixant dans le ciment plastique d'auto-traitement22 ou utilisant une fente conique de forme22,pourtant ces les méthodes antérieures restent limitées par une faible reproductibilité, des taux d'échec de préhension élevés et des exigences fastidieuses en matière de préparation.

L'objectif de la présente étude était de développer une méthode précise et efficace pour l'essai biomécanique tendu des tendons murins, en se concentrant sur les tendons supraspinatus et d'Achille comme exemples. Utilisant une combinaison des reconstructions 3D de l'anatomie indigène d'os, de la modélisation pleine, et de la fabrication additive, une nouvelle méthode a été développée pour saisir les os. Ces appareils ont effectivement sécurisé les os, empêché l'échec de plaque de croissance, diminué le temps de préparation d'échantillon, et la reproductibilité accrue d'essai. La nouvelle méthode est facilement adaptable pour tester d'autres tendons maurines ainsi que des tendons chez les rats et d'autres animaux.

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Protocol

Les études sur les animaux ont été approuvées par le Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee. Les souris utilisées dans cette étude étaient d'un fond C57BL/6J et ont été achetées du laboratoire de Jackson (Bar Harbor, ME, Etats-Unis). Ils étaient logés dans des conditions de barrière exemptes d'agents pathogènes et on leur a fourni de la nourriture et de l'eau ad libitum.

1. Développement d'appareils imprimés 3D sur mesure pour la préhension osseuse

  1. Acquisition d'image d'os et construction de modèle d'os 3D
    1. Disséquer l'os de l'intérêt dans la préparation de la création de modèle 3D et l'impression 3D de poignée osseuse ; l'humérus et le calcaneus sont utilisés comme exemples dans le protocole actuel.
      REMARQUE : Des instructions détaillées pour disséquer les échantillons de tendon-muscle osseux pour les essais mécaniques sont fournies à l'étape 2.1.1. Les étapes suivantes doivent être suivies pour isoler les os dans le but de créer des poignées osseuses imprimées en 3D.
      1. Dissection de l'humérus : Euthanasiez une souris par procédure approuvée par l'IACUC. Enlever la peau des extrémités supérieures, enlever tous les muscles sur l'humérus, désarticuler le coude et les articulations glenohumérales, et enlever soigneusement tous les tissus conjonctifs attachés à l'humérus.
      2. Dissection du calcaneus : Euthanasiez une souris par procédure approuvée par l'IACUC. Enlever la peau des extrémités inférieures, désarticuler les articulations tendonales-calcaneus du tendon d'Achille et les articulations entre le calcaneus et les autres os du pied, et enlever soigneusement tous les tissus conjonctifs attachés au calcaneus.
    2. Effectuez un balayage microcomputé de tomographie de l'os entier, par exemple, scannez l'humérus et les échantillons de calcaneus.
      REMARQUE : Selon le scanner utilisé, les paramètres seront différents. Pour le scanner utilisé dans la présente étude (Tableau des matériaux),les paramètres recommandés sont: scan à une énergie de 55 kVP, Al 0.25 filtre, à une résolution de 6 'm.
      1. Mélanger la poudre d'agarose dans de l'eau ultrapure et cuire au micro-ondes pendant 1-3 min jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute. Il est utile de micro-ondes pour 30-45 s, arrêter et tourbillonner, puis continuer vers une ébullition. Remplissez les cryotubes jusqu'aux trois quarts d'agarose. Laisser refroidir l'agarose pendant environ 5-10 min.
      2. Insérer l'os dans le gel d'agarose (ce qui empêchera les artefacts de mouvement pendant la numérisation). Insérer un cryotube avec de l'os dans le scanner.
        REMARQUE : Pour le scanner utilisé dans la présente étude, un changeur automatique d'échantillon de 16 positions a été utilisé pour tous les scans. Ce scanner peut sélectionner automatiquement le grossissement en fonction de la taille et de la forme d'un échantillon.
    3. Reconstruire des images de projection de tomodensitométrie microcomputées en images transversales. Utilisez les paramètres recommandés pour la combinaison scanner/logiciel de l'expérimentateur.
      REMARQUE: Pour le programme utilisé dans la présente étude (Tableau des matériaux) il est recommandé d'utiliser les paramètres de reconstruction suivants: Lissage: 0-2, Correction du durcissement des faisceaux: 45, Réduction de l'artefact anneau: 4-9 et de reconstruire les tranches en 16 bits TIFF format.
    4. Créez un modèle 3D et économisez dans un format STL standard compatible avec la plupart des imprimantes 3D et un prototypage rapide. Pour le programme utilisé dans la présente étude (Tableau des matériaux), faites ce qui suit :
      1. Sélectionnez le fichier de commande 'gt; Ouvrez pour ouvrir le jeu de données de fichier. Ouvrez le fichier de dialogue et sélectionnez l'onglet Advanced.
      2. Utilisez l'algorithme de rendu adaptatif pour construire les modèles 3D. Cet algorithme minimise le nombre de triangles de facettes et fournit des détails de surface plus lisses. Utilisez 10 comme paramètre de localité; ce paramètre définit la distance en pixels par rapport au point voisin utilisé pour trouver la bordure de l'objet. Réduire la tolérance à 0,1 pour réduire la taille du fichier.
        REMARQUE : Après l'ouverture du jeu de données, les images sont affichées dans la page « Images brutes ».
      3. Pour spécifier le volume d'intérêt (VOI), sélectionnez manuellement deux images à définir en haut et en bas de la plage VOI sélectionnée.
      4. Passez à la deuxième page, Région d'intérêt. Sélectionnez manuellement la région d'intérêt sur une seule image transversale.
        REMARQUE : La région sélectionnée sera mise en surbrillance en rouge (c.-à-d. la zone transversale de l'humérus).
      5. Répétez l'étape précédente toutes les 10 à 15 images transversales.
      6. Passez à la troisième page De la sélection binaire. Sur le menu histogramme, cliquez sur De Dataset. La distribution de luminosité de l'histogramme à partir de toutes les images de l'ensemble de données sera affichée. Également sur le menu histogramme, cliquez sur le menu Créer un fichier modèle 3D.
    5. Enregistrer un modèle 3D de l'os dans le format de fichier STL.
    6. Affiner le maillage : Manipulez le maillage pour réduire la taille du fichier STL et le rendre compatible avec n'importe quel programme de conception assisté e par ordinateur de modélisation solide. Pour le programme utilisé dans la présente étude (Tableau des matériaux),suivez les étapes ci-dessous:
      1. Importer le maillage et sélectionnez tout à modifier. Choisissez Réduire à partir de l'ensemble d'outils Modifier. Ensuite, sélectionnez Le budget Triangle à partir de l'ensemble d'outils Réduire la cible. Réduisez le tri compte et acceptez les modifications. Reenregistrer le fichier nouvellement réduit en format STL en choisissant Export comme...
  2. Conception d'appareils osseux sur mesure
    1. Os tendon-huméral de Supraspinatus
      1. Utilisez un programme de conception assistée par ordinateur pour créer un modèle sur mesure de montage de préhension de l'humérus (Figure 1, Fichiers supplémentaires).
        REMARQUE : Le programme utilisé dans la présente étude est répertorié dans le Tableau des matériaux.
      2. Ouvrez le fichier format STL de l'os de l'humérus dans un programme de modélisation solide et enregistrez-le en tant que fichier partiel.
        REMARQUE: Pour le logiciel utilisé dans la présente étude (Tableau des matériaux), l'objet osseux 3D a été enregistré en format SLDPRT.
      3. Ouvrez le fichier de pièce et créez manuellement trois plans anatomiquement pertinents (c.-à-d. sagittal, coronal, transversal).
        1. Définir manuellement le plan sagittal pour couper à travers l'attachement du tendon supraspinatus à la plus grande tubéroité. Assurez-vous que le bloc 3D contient le plan sagittal comme un plan de symétrie. Pour ce faire, ajoutez ou coupez le matériau du bloc si nécessaire.
          REMARQUE : Ce plan de symétrie garantit que lorsque le spécimen est inséré dans les appareils, le tendon et l'attachement du tendon sont situés dans l'axe central de l'appareil.
      4. Mesurer les dimensions de l'os le long de chacun des trois plans (c.-à-d. hauteur, largeur, longueur).
      5. Mesurez les dimensions des poignées d'essai mécaniques où le luminaire imprimé 3D sera attaché.
      6. Commencez par concevoir une pièce de bloc solide (p. ex., un cylindre solide).
        1. Assurez-vous que chaque dimension du bloc est d'au moins 5 mm supérieure aux dimensions de l'humérus.
        2. Tenir compte des contraintes de conception liées aux poignées d'essai mécaniques (c.-à-d. s'assurer que l'appareil imprimé 3D peut être assemblé et démonté librement dans les poignées d'essai mécaniques).
      7. Créez un modèle d'assemblage avec deux composants : le bloc solide et l'os de l'humérus droit ou gauche. Définir l'orientation de l'os dans le bloc (c.-à-d. l'angle entre le tendon et l'os). Assurez-vous que le volume entier d'os s'adapte à l'intérieur du bloc.
      8. Créer une cavité dans le bloc en utilisant l'os de l'humérus comme moule. Si vous utilisez le logiciel spécifié dans le Tableau des Matériaux,suivez les étapes suivantes :
        1. Insérer la partie design (humérus) et la base de moule (bloc de cylindre) dans un assemblage provisoire. Dans la fenêtre d'assemblage, sélectionnez le bloc et cliquez sur Modifier la composante de la barre d'outils d'assemblage.
        2. Cliquez sur Insérer 'gt; Caractéristiques 'gt; Cavité. Sélectionnez La mise à l'échelle uniforme et entrez 0 % comme valeur à l'échelle dans toutes les directions.
      9. Supprimer la partie osseuse et enregistrer l'assemblage en tant que partie.
      10. Ouvrez la partie (cylindre avec cavité). Couper la pièce le long du plan sagittal pour créer deux composants symétriques qui s'adaptent à l'os antérieurement et postérieurement (par exemple, deux demi-cylindres, comme on le voit dans la figure 1).
        REMARQUE : Deux composants sont conçus qui s'adaptent à l'os antérieurement et postérieurement. Le composant antérieur comprend une cavité en forme de sphérique moitié étendue du côté antérieur de la tête humérale jusqu'à l'attachement du tendon supraspinatus. La cavité postérieure de composant est formée comme la partie postérieure de l'humérus (c.-à-d., côté postérieur de la tête humérale, tuberosity deltoïde, et epicondyle médial et latéral).
      11. Enregistrez chaque composant en tant que partie de fichier séparée.
      12. Pour le composant antérieur, assurez-vous que la tête humérale est encastrée dans la cavité de la pièce en définissant les tolérances appropriées.
        REMARQUE: Dans la présente étude, en utilisant le logiciel spécifié dans le Tableau des matériaux, il est suggéré de suivre les étapes ci-dessous:
        1. Créez une coupe en rotation pour lisser la géométrie de maille de la cavité. Créez un croquis pour la coupe en imitant la géométrie de la cavité et en ajoutant un dégagement de localisation.
          REMARQUE : Le dégagement permet l'assemblage libre et le démontage entre l'os et le composant antérieur.
      13. Modifier le composant postérieur pour imiter la géométrie de la cavité pour créer une coupe qui ajoute le dégagement, comme décrit ci-dessus pour le composant antérieur.
      14. Faire une coupe dans le plan transversal à partir du haut de la composante postérieure jusqu'à la crête du tubercule plus grand / moindre.
        REMARQUE : Comme on le voit dans la figure 1 et la figure 2, le composant postérieur comprend une coupe qui crée une ouverture à l'attachement du tendon.
      15. Créez un ajustement serré entre les deux composants pour permettre un assemblage et un démontage libres.
        REMARQUE : Un ajustement de trou-arbre avec un dégagement lâche de fonctionnement a été créé pour les montages dans l'étude courante.
      16. Créez des modèles de miroirs 3D pour chaque composant de l'appareil pour le membre opposé (c.-à-d. à gauche ou à droite).
      17. Ajouter une dîme sur le fond des appareils pour distinguer entre les côtés gauche et droit.
      18. Enregistrer toutes les pièces de montage dans le format de fichier standard STL en préparation pour l'impression 3D.
    2. Os de tendon d'Achille-calcaneus
      1. Suivez les mêmes étapes que décrites ci-dessus pour le luminaire supraspinatus-humeral tête.
        REMARQUE: Un seul ensemble de montages est nécessaire pour l'Achille-calcaneal, puisque l'anatomie des os de calcanée gauche et droite est presque symétrique.

2. Essais biomécaniques des tendons murines

  1. Préparation des spécimens et mesure transversale de la zone
    1. Disséquer le muscle-tendon-os d'intérêt dans la préparation pour l'essai mécanique tendu. Dans la présente étude, les spécimens d'os de muscle supraspinatus - tendon - d'humérus (N-10, 5 mâles, 5 femelles) et de muscle gastrocnemius - spécimens d'os de tendon-calcaneus d'Achille (N-12, 6 mâles, 6 femelles) ont été isolés des souris c57BL/6J de 8 semaines.
      1. Dissection du muscle supraspinatus - tendon - spécimen d'os d'humérus
        1. Euthanasier une souris selon la procédure approuvée par l'IACUC. Placez la souris en position couchée. Faire une incision dans la peau au-dessus du coude de l'avant-paw vers l'épaule.
        2. Retirez soigneusement la peau avec dissection émoussée de sorte que la musculature de l'épaule soit visible. Enlever le tissu entourant l'humérus jusqu'à ce que l'os soit exposé et peut être maintenu solidement avec des forceps.
        3. Tenez l'humérus avec des forceps et retirez soigneusement les muscles deltoïde et trapèze pour exposer l'arc coracoacromial. Identifiez l'articulation acromioclaviculaire et séparez soigneusement la clavicule de l'acromion avec une lame de scalpel.
        4. En prenant soin de ne pas endommager le tendon supraspinatus et son attachement osseux, enlever le muscle de son attachement scapulaire à l'aide d'une lame de scalpel. En prenant soin de ne pas endommager le tendon supraspinatus et son attachement osseux, détachez la tête humérale du glenoid; à l'aide d'une lame de scalpel, lacérer la capsule articulaire et l'infraspinatus, les sous-scapularis et les tendons mineurs.
        5. Désarticuler l'articulation du coude pour séparer l'humérus de l'ulna et du rayon. Isoler l'humérus - tendon supraspinatus - spécimen musculaire et nettoyer l'excès de tissus mous sur l'humérus et la tête humérale.
      2. Dissection du tendon d'Achille - échantillon d'os de calcanésien
        1. Euthanasier une souris selon la procédure approuvée par l'IACUC. Placez la souris en position couchée. En prenant soin de ne pas endommager le tendon d'Achille et son attachement osseux, enlever la peau avec dissection émoussée de sorte que la musculature autour de la cheville et les articulations du genou est exposée.
        2. À l'aide d'une lame de scalpel, à partir du tendon d'Achille - attachement calcanésien, détachez soigneusement le muscle gastrocnemius de ses attaches proximales.
        3. Désarticulement soigneusement le calcaneus des différents os adjacents. Isoler le tendon d'Achille - spécimen de calcanée et nettoyer l'excès de tissus mous.
    2. Déterminer la zone transversale du tendon à l'aide d'une tomographie microcomputée.
      REMARQUE: Pour le scanner utilisé dans la présente étude (Tableau des matériaux),les paramètres recommandés sont: scan à une énergie de 55 kVP, Al 0.25 filtre, à une résolution de 5 'm.
      1. Mélanger la poudre d'agarose dans de l'eau ultrapure et cuire au micro-ondes pendant 1-3 min jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute. Il est utile de micro-ondes pour 30-45 s, arrêter et tourbillonner, puis continuer vers une ébullition. Remplissez les cryotubes jusqu'aux trois quarts d'agarose. Laisser refroidir l'agarose pendant environ 5-10 min.
      2. Suspendre le spécimen dans le cryotube en insérant l'os à l'envers.
        REMARQUE: Seul l'os doit être dans le gel d'agarose. Le tendon et le muscle doivent être suspendus à l'extérieur.
    3. Après l'analyse, retirer délicatement le muscle du tendon à l'aide de lalame de scalpel. Insérer le spécimen dans l'appareil imprimé en 3D.
      REMARQUE : Les poignées sont réutilisables pour chaque test. N'utilisez pas de colle ou d'époxy dans l'appareil; l'os est tenu dans une crise de presse.
    4. Insérez et collez le tendon entre un papier de soie mince plié (2 cm x 1 cm) et pincez la construction à l'aide de poignées minces. Fixez l'appareil imprimé 3D avec le spécimen dans les poignées d'essai.
    5. Insérer l'échantillon et les poignées dans un bain d'essai de phosphate tamponné saline (PBS) à 37 oC (c.-à-d., la température corporelle de la souris23).
  2. Test de tension
    1. Effectuer un test mécanique tendu sur un cadre d'essai de matériaux.
      REMARQUE : Pour le cadre d'essai utilisé dans la présente étude (Tableau des matériaux), le protocole recommandé est le :
      1. Définissez la longueur de la jauge comme la distance entre l'attachement du tendon et l'adhérence supérieure.
      2. Précondition avec 5 cycles entre 0,05 N et 0,2 N.
      3. Tenir pendant 120 s.
      4. Utilisez une tension à l'échec de 0,2%/s.
    2. Recueillir des données de déformation de charge.
    3. Calculez la souche comme le déplacement par rapport à la longueur initiale de la jauge du tendon.
    4. Calculez le stress comme la force divisée par la zone transversale du tendon initial (mesurée à partir du microCT).
    5. Si vous êtes intéressé par le comportement viscoélastique, effectuez une relaxation du stress avant le test de tension à l'échec et utilisez les données pour calculer des paramètres tels que A, B, C, tau1, et tau2 du modèle viscoélastique quasi linéaire24.
    6. À partir de la courbe de déformation de la charge, calculez la rigidité (pente de la partie linéaire de la courbe), la force maximale et le travail à effectuer (la zone sous la courbe jusqu'à la force de rendement).
      1. Identifiez la partie linéaire en choisissant une fenêtre de points dans la courbe de charge-déformation qui maximise la valeur R2 pour une régression linéaire des moindres carrés25.
      2. Déterminer la rigidité comme la pente de la partie linéaire de la courbe de charge-déplacement25,26.
    7. À partir de la courbe de contrainte, calculez le modulus (pente de la partie linéaire de la courbe), la résistance (stress maximal) et la résilience (zone sous la courbe jusqu'à ce que le stress de rendement).
      REMARQUE : À l'aide de l'algorithme RANSAC, la souche de rendement (valeur x) est définie comme le premier point où le y-fit a dévié de plus de 0,5 % de la valeur de stress prévue (valeur y). Le stress de rendement est la valeur y correspondante de la souche de rendement.
      REMARQUE : En plus de la charge de tension monotone jusqu'à l'échec décrite dans la présente étude, la charge cyclique peut fournir des renseignements importants sur la fatigue des tendons et/ou les propriétés viscoélastiques. Par exemple, Freedman et coll. ont signalé des propriétés de fatigue des tendons murines d'Achille27.
    8. Après l'achèvement de l'essai tendu, effectuez un balayage microcomputé de tomographie de l'os entier, par exemple, scannent l'humérus et les échantillons de calcaneus.
      REMARQUE: Pour le scanner utilisé dans la présente étude (Tableau des matériaux),les paramètres recommandés sont: scan à une énergie de 55 kVP, Al 0.25 filtre, à une résolution de 6 'm.
      1. Répétez les étapes 1.1.2.1-1.1.2.2.
    9. Répétez l'étape 1.1.3.
    10. Utilisez un programme de visualisation 3D compatible avec le scanner pour créer un modèle 3D rendu en volume de l'objet numérisé.
      REMARQUE : Le programme utilisé dans la présente étude est répertorié dans le Tableau des matériaux.
    11. Déterminez le mode de défaillance et la zone du site de défaillance en inspectant l'objet 3D.
  3. Analyse statistique : Afficher tous les résultats de l'échantillon comme moyen d'écart type (DD). Faites des comparaisons entre les groupes à l'aide des tests t de l'élève (à deux queues et non appariés). Définir l'importance comme p 'lt; 0.05.
    REMARQUE : Le logiciel statistique utilisé dans la présente étude est répertorié dans le Tableau des matériaux.

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Representative Results

Des montages 3D-imprimés ont été employés pour examiner le supraspinatus murine de 8 semaines et les tendons d'Achille. Tous les échantillons testés mécaniquement ont échoué à l'enthèse, comme caractérisé par des balayages de microCT, l'inspection visuelle, et l'analyse vidéo après des essais tendus. Une comparaison en tête-à-tête des méthodes précédentes et actuelles pour l'essai du tendon supraspinatus dans notre laboratoire est montrée dans la figure 3. Dans la méthode précédente28,29,30, l'os de l'humérus a été incorporé dans l'époxy et un trombone a été placé sur la tête humérale dans un effort pour prévenir la fracture de la plaque de croissance. 4-6 heures ont été nécessaires pour permettre à l'époxy de guérir complètement (Figure 3), permettant seulement 6-8 spécimens à tester dans une journée typique. Une autre limitation de l'approche a été l'efficacité dépendante de l'utilisateur du placement de trombone pour prévenir la fracture de la plaque de croissance. Les résultats des tests utilisant ces méthodes antérieures étaient très variables, avec des coefficients de variation de l'ordre de 30 % pour la plupart des paramètres et des taux d'échec des plaques de croissance d'environ 10 % à 20 %. Comme le résume la figure 3, le temps de préparation des échantillons utilisant les nouvelles méthodes a été réduit à 5 à 10 minutes, ce qui rend pratique le test de 16 à 20 échantillons par jour. En outre, les échecs de plaque de croissance ont été éliminés.

Comparé à la méthodologie rapportée par d'autres pour l'essai des tendons murine14,15,17,25,28,29,30,31 ,32,33, les nouvelles méthodes étaient plus efficaces et reproductibles. Pour les tendons supraspinatus, les propriétés structurelles telles que la charge maximale (3,8 à 0,6 N) et la rigidité (12,7 à 1,8 N/mm), ainsi que les propriétés des matériaux normalisés telles que le stress maximal (8,7 à 3,0 MPa) et le modulus (51,7 à 13,5 MPa) avaient des coefficients considérablement plus faibles de variations par rapport aux résultats de la littérature (tableau 1). Pour le tendon d'Achille, les propriétés mécaniques telles que la charge maximale (7,8 à 1,1 N) et la rigidité (13,2 à 1,9 N/mm) avaient des coefficients de variationplus plus faibles que les résultats de la littérature19,21,22 ,32,33,34,35,36,37,38, tandis que le stress maximum (24,2 à 5,4 MPa) et modulus (73,2 22.1 MPa) avait des coefficients de variations semblables à ceux rapportés dans la littérature (tableau 2).

Le sexe animal a eu un effet significatif sur les propriétés mécaniques des tendons supraspinatus et d'Achille (figure 4). En comparant les tendons supraspinatus mâles et femelles, il y a eu des augmentations significatives de la force maximale(p - 0,002) et du travail pour produire(p - 0,008). Il y avait des tendances entre les deux groupes pour la rigidité(p - 0,057), le stress(p - 0,068), le modulus(p - 0,061) et la résilience(p - 0,078). En comparant les tendons d'Achille mâles et femelles, il y a eu des augmentations significatives du stress maximal(p - 0,0006) et de la résilience(p - 0,0019). Il y avait des tendances entre les deux groupes pour le rendement du travail(p - 0,079), et le modulus(p - 0,074) et aucune différence pour la force maximale(p - 0,1880) et la rigidité(p - 0,6759).

Figure 1
Figure 1 : Modèles 3D représentatifs d'appareils pour l'humérus (rangée supérieure) et le calcaneus (rangée inférieure). (A) Modèles 3D des os. (B) Modèles démontés des appareils. (C) Modèles assemblés des appareils. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Appareils imprimés 3D représentatifs. (A) Fixation pour l'essai biomécanique des tendons de supraspinatus des souris vieilles de 8 semaines à un angle de 180 degrés entre l'humérus et le tendon de supraspinatus. (B) Fixation pour l'essai biomécanique des tendons de supraspinatus des souris vieilles de 8 semaines à un angle de 135 degrés entre l'humérus et le tendon supraspinatus. (C) Fixation pour l'essai biomécanique des tendons d'Achille murines à un angle de 120 degrés entre le calcaneus et le tendon d'Achille. (D) Fixation pour l'essai biomécanique des tendons supraspinatus des rats adultes de Sprague Dawley à un angle de 180 degrés entre l'humérus et le tendon supraspinatus. Barre d'échelle : 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison des méthodes antérieures et actuelles pour l'essai mécanique des tendons de supraspinatus murine. (A) Méthodes antérieures de préparation d'échantillons utilisées en laboratoire avant les essais mécaniques : l'humérus était mis en pot en époxy jusqu'à la tête humérale pour stabiliser l'os, un trombone a été placé au-dessus de la tête humérale pour prévenir la fracture de la plaque de croissance, et, pour que l'époxy guérisse, les spécimens ont été laissés dans la température ambiante pendant 4-6 heures avant l'essai mécanique. (B) Méthodes de préparation de spécimens utilisées dans la présente étude (Étapes 1.2 et 2.1.4): En haut à gauche montre une représentation 3D des appareils tel que produit par un programme de modélisation solide. Les luminaires imprimés 3D sont réutilisables et facilement assemblés et démontés. L'extrémité osseuse du spécimen est insérée dans les appareils, fixant la plaque de croissance et exposant le tendon pour la préhension et l'essai. L'extrémité tendineuse est collée entre un papier de soie mince plié et insérée dans les poignées. Le temps de préparation pour chaque spécimen est de 10 à 15 minutes. (C) Courbes représentatives de charge-déformation pour l'essai tendu du tendon de supraspinatus utilisant des méthodes actuelles. (D) Courbe de déformation de charge représentative pour l'essai de tension du tendon de supraspinatus montrant une défaillance de plaque de croissance. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Effet sexuel sur les propriétés mécaniques des tendons supraspinatus (SST) et Achille (ACHT). Il y avait un effet significatif du sexe sur bon nombre des propriétés mécaniques basées sur des tests t non appariés (effet sexe, p 'lt; 0.05). Données indiquées comme écart moyen et standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Mesure transversale de la zone à partir du microCT. (A) Mesure transversale minimale de la zone le long de la longueur du tendon supraspinatus. (B) Mesure minimale de la zone transversale le long de la longueur du tendon d'Achille. Seul le tendon proprement dit doit être sélectionné pour la mesure. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Propriétés structurelles Propriétés matérielles
Animaux Force maximale (N) Rigidité (N/mm) Stress maximum (Mpa) Modulus (MPa)
auteur n milieu Moyenne et SD COV (%) Moyenne et SD COV (%) Moyenne et SD COV (%) Moyenne et SD COV (%)
Beason et coll. Journal of Shoulder and Elbow Surgery (2013)15 10 C57Bl/6 0,93 à 0,34 36.56 95,1 à 39,8 41.85 3,40 à 1,56 45.88 312,8 à 127,0 40.60
Bell et coll. Journal of Orthopaedic Research (2014)31 6 C57Bl/6 1,22 à 0,52 42.62 2,37 à 1,6 67.51 Nr Nr
Cong et coll. Journal of Orthopaedic Research (2018)17 8 C57Bl/6 5,38 à 2,404 # 44.68 4,25 à 1,67 # 39.29 Nr Nr
Connizzo et coll. Annals of Biomedical Engineering (2014)32 10 NR (db/ ) Nr 84,44 euros 27,23 euros 32.25 Nr 476 à 186,27 euros 39.13
Connizzo et coll. Journal of Biomedical Engineering (2013)14 Nr C57/BL6 Nr Nr Nr 297 à 148,90 euros 50.13
Deymier et coll. Acta Biomaterialia (2019)28 12 CD-1 IGS Souris (WT) 5,0 à 0,7 14 9,2 à 2,9 31.52 De 33 à 35 ans 106.06 Nr
Eekhoff et coll. Journal of Biomedical Engineering (2017)33 13 Eln et Eln Nr 8,50 à 2,95 34.71 5,96 à 3,23 54.19 De 101,2 à 50,8 50.20
Killian et coll. FASEB Journal (2016)29 8 C57BL/6 Nr Nr 7,79 euros à 2,61 euros 33.50 58,32 euros 31,73 euros 54.41
Schwartz et coll. Bone (2014)25 20 CD-1 IGS Souris (WT) 4,11 à 0,79 19.22 8,58 à 3,78 euros 44.06 12,29 euros à 5,95 euros 48.41 133,80 euros 59,41 euros 44.40
Schwartz et coll. Development (2015)30 12 (Rosa-DTA (DTA) x Gli1-CreERT2 ) ScxCre; Smofl/fl (WT) 4,16 à 0,29 6.97 11,04 à 1,98 17.93 26,24 à 5,81 22.14 121,89 à 44,18 36.25
COV moyen 27.34 COV moyen 38.64 COV moyen 51.70 COV moyen 45.02
Nouvelle méthode 10 C57BL/6J 3,79 à 0,62 16.41 12,73 à 1,81 14.20 8,71 à 3,04 34.91 51,67 à 13,54 26.20

Tableau 1 : Propriétés mécaniques des tendons supraspinatus. Moyenne - DD et coefficient de variation (COV) pour les propriétés structurelles et matérielles estimées à l'aide de nouvelles méthodes par rapport à ceux rapportés dans la littérature. [NR : non déclaré, estimé à partir de la figure (s), écart standard calculé à partir de l'erreur standard signalée, déformation mesurée à l'aide de lignes de taches optiques].

Propriétés structurelles Propriétés matérielles
Animaux Force maximale (N) Rigidité (N/mm) Stress maximum (Mpa) Modulus de Young (MPa)
auteur n milieu Moyenne et SD COV (%) Moyenne et SD COV (%) Moyenne et SD COV (%) Moyenne et SD COV (%)
Boivin et coll. Muscles, Ligaments and Tendons Journal (2014)19 6 Souris maigres non diabétiques 8,1 à 0,6 7.41 3,9 à 0,7 17.95 Nr De 16 à 3,7 23.13
Connizzo et coll. Annals of Biomedical Engineering (2014)32 10 db / Nr 20,39 euros à 2,43 euros 11.92 Nr 152,94 euros 44,12 euros 28.85
Eekhoff et coll. Journal of Biomechanical Engineering (2017)33 8 Eln et Eln Nr 18,86 à 3,37 17.87 10,55 à 2,97 28.15 443,8 à 131,7 29.68
Mikic et coll. Journal of Orthopaedic Research (2006)34 20 C57BL/6-J x 129SV/J Nr Nr 18 à 5 27.78 De 61 à 20 ans 32.79
Probst et coll. Journal of Investigative Surgery (2000)22 20 BALB/c 8,4 à 1,1 13.10 De 6,3 à 1,2 19.05 Nr Nr
Shu et coll. Peer J (2018)21 9 C57BL/6 De 9,6 à 3,84 39.96 8,19 à 3,63 44.32 27,55 à 10,54 38.26 Nr
Sikes et coll. Journal of Orthopaedic Research (2018)35 7 C57BL/6 Nr Nr 19,53 à 7,03 0.36 62,82 à 20,20 32.16
Wang et coll. Journal of Orthopaedic Research (2006)36 9 A/J 8,4 à 1,2 14.29 De 12,2 à 2,8 22.95 78,2 à 8,6 11.00 713,9 à 203,7 28.53
Wang et coll. Journal of Orthopaedic Research (2006)36 8 C57BL/6J 10,2 à 1,4 13.73 13,1 à 2,5 19.08 97,4 à 11,4 11.70 765,1 à 179,6 23.47
Wang et coll. Journal of Orthopaedic Research (2006)36 7 C3H/HeJ 12,5 à 1,7 13.60 14,1 à 3,2 22.70 97,5 à 10,9 11.18 708,6 à 127,8 18.04
Wang et coll. Journal of Orthopaedic Research (2011)37 7 C57BL/6 6,6 à 1,7 25.76 8,2 à 1,4 17.07 De 13,4 à 3,7 27.61 86,8 à 15,5 17.86
Zhang et coll. Matrix Biology (2016)38 Nr CD-1 et C57BL/6J 6,73 à 3,74 55.57 12.03 à 3.34 27.76 25,4 à 15,14 59.61 632,31 euros 113,79 euros 18.00
COV moyen 22.93 COV moyen 22.07 COV moyen 23.96 COV moyen 25.25
Nouvelle méthode 12 C57BL/6J 7,8 à 1,08 13.91 13,19 à 1,86 14.08 24.16 à 5.42 22.45 73,17 à 16,14 22.06

Tableau 2 : Propriétés mécaniques des tendons d'Achille. Moyenne - DD et COV pour les propriétés structurelles et matérielles estimées à l'aide de nouvelles méthodes par rapport à ceux rapportés dans la littérature. [NR : non déclaré, - estimé à partir de la figure (s), écart standard calculé à partir de l'erreur standard signalée].

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Discussion

Les modèles animaux de Murine sont couramment employés pour étudier des désordres de tendon, mais la caractérisation de leurs propriétés mécaniques est provocante et rare dans la littérature. Le but de ce protocole est de décrire une méthode efficace et reproductible de temps pour l'essai tendu des tendons murins. Les nouvelles méthodes ont réduit le temps nécessaire pour tester un échantillon d'heures en minutes et ont éliminé un artefact de préhension majeur qui était un problème commun dans les méthodes précédentes.

Plusieurs étapes décrites dans ce protocole sont essentielles pour produire des montages efficaces testant mécaniquement le supraspinatus murine et les tendons d'Achille. Tout d'abord, l'étape 1.1.4 est nécessaire pour créer un modèle 3D de l'os désiré; cependant, en raison de la résolution généralement élevée utilisée pour cette analyse, la taille du fichier peut être trop grande pour être utilisée avec des programmes de modélisation solides. Le logiciel utilisé dans ce protocole a réussi à réduire la taille du fichier (étape 1.1.6) et a préservé la géométrie de l'objet, bien que d'autres logiciels peuvent également être efficaces pour y parvenir. Deuxièmement, chaque site anatomique a des critères de conception spécifiques à considérer pour une préhension efficace. Pour la conception de l'appareil de tendon supraspinatus, il est essentiel de : (i) fixer la tête humérale pour empêcher la défaillance de plaque de croissance (étape 1.2.1.12), (ii) définir un ajustement de dégagement qui évite le désengagement de l'os d'humérus du moule pendant l'essai (étape 1.2.1.12.1) et (iii) orienter l'os de l'humérus pour former un angle de 180 degrés avec le long axe du tendon (étape 1.2.1.7). Pour la conception de l'appareil du tendon d'Achille, il est essentiel de : (i) définir un ajustement de dégagement qui saisit le petit os calcanésien sans glisser hors de l'appareil pendant l'essai et (ii) orienter l'os calcaneus pour former un angle de 120 degrés (flexion plantaire de 30 degrés) avec le long axe du tendon. Troisièmement, une mesure précise de la zone transversale du tendon (étape 2.1.2) est essentielle pour calculer correctement le stress technique pour déterminer les propriétés des matériaux. Pour mesurer la zone transversale du tendon supraspinatus, nous recommandons des balayages microcomputed de tomographie du spécimen os-tendon-muscle suspendu dans un cryotube avec un fond plat, avec l'os maintenu à l'envers dans le tube avec l'agarose. Seul l'os de l'humérus doit être inséré dans le gel agarose, tandis que la tête humérale avec le tendon et le muscle attachés doivent être numérisés dans l'air. Comme le tendon supraspinatus a une géométrie étalée comme il s'insère dans l'os, la façon la plus cohérente de mesurer la zone transversale est de déterminer la zone transversale minimale le long de la longueur du tendon. Une procédure similaire devrait être suivie pour mesurer la zone transversale du tendon d'Achille. Pour le tendon d'Achille, les tomodensitométries microcomputées à haute résolution révèlent deux tissus distincts : le tendon proprement dit et la gaine environnante, qui apparaît comme une teinte plus claire. Pour estimer uniformément la zone transversale minimale du tendon d'Achille, seul le tendon approprié doit être sélectionné pour la mesure (figure 5). Enfin, les poignées sont réutilisables et de petites variations d'un échantillon à l'autre n'affectent pas leur efficacité. Chaque os doit être numérisé une fois (p. ex., pour l'étude actuelle, l'humérus gauche, l'humérus droit et le calcanésien) et un modèle 3D devrait être créé pour chaque os. En outre, pour les animaux du même âge, la géométrie osseuse est presque identique, de ainsi le même appareil peut être utilisé pour l'essai de tous les spécimens. Dans ce manuscrit, des luminaires imprimés en 3D spécifiques à des souris de 8 semaines (souris adultes d'âge squelettique) ont été utilisés pour tester les tendons. Il n'était pas nécessaire de créer des luminaires masculins et féminins distincts. Pour d'autres groupes d'âge (p. ex., souris de 4 semaines) ou souris présentant des phénotypes osseux uniques, il est recommandé de fabriquer des appareils qui correspondent aux géométries particulières des os.

Après la conception et l'impression 3D des appareils, afin d'assurer la reproductibilité et l'efficacité de l'approche, 10 échantillons de tendon provenant de souris du même milieu et de l'âge de l'étude prévue devraient généralement être testés (la taille exacte de l'échantillon peut varier selon le tissu et modèle animal). Les propriétés mécaniques de ces tendons doivent être déterminées afin de s'assurer que les coefficients de variation des propriétés structurelles et matérielles se situent dans la fourchette prévue, comme décrit dans le tableau 1 et le tableau 2. Ces essais pilotes devraient également confirmer qu'il n'y a pas de défaillances artifréelles (p. ex., défaillance de la plaque de croissance). Plusieurs cycles de conception, de prototypage et de validation peuvent être nécessaires pour obtenir les résultats souhaités pour les tendons autres que les tendons supraspinatus et d'Achille décrits dans l'article actuel.

Un certain nombre de groupes ont rapporté les propriétés mécaniques des tendons murins. Le coefficient des variations dans ces études est généralement élevé, ce qui rend souvent difficile de prendre en compte les différences entre les groupes de comparaison. En outre, les différences méthodologiques dans la préhension des tissus entre les diverses études, il est difficile de déterminer si les propriétés de l'échec sont pertinentes pour le tendon ou en raison de défaillances d'adhérence artifactual. Pour comparer les nouvelles méthodes d'essai avec les méthodologies existantes, une revue de la littérature a été effectuée et les résultats de 20 études ont été résumés (tableau 1 et tableau 2). Dans la littérature, pour l'essai mécanique de tendon de supraspinatus, les coefficients moyens de variation pour la force maximale, la rigidité, le stress maximum, et le modulus étaient 27%, 39%, 52%, et 45%, respectivement. Pour les essais mécaniques du tendon d'Achille, les coefficients moyens de variation pour la force maximale, la rigidité, le stress maximal et le modulus étaient de 23 %, 22 %, 24 % et 25 %, respectivement. Dans la présente étude, la nouvelle méthode d'essai des tendons murins a eu comme conséquence une réduction de 32%-63% des coefficients de tendon de supraspinatus de variation et de 6%-39% de réduction des coefficients de variation de tendon d'Achille.

Il n'existe pas de méthodologie standard actuelle pour la préhension des os, de fait qu'il n'est pas clair dans quelle mesure les problèmes de préhension artifactual ont affecté les propriétés mécaniques signalées des tendons murins. La plupart des groupes rapportent saisir l'os de l'humérus en utilisant la résine époxy13, polymethylmethacrylate (PMMA)14,15, ou cyanoacrylate16 et la fixation de la tête humérale en appliquant un deuxième revêtement de PMMA14, à l'aide d'un luminaire personnalisé39 et/ou l'insertion d'un trombone25,28,30. De même, d'autres groupes rapportent la préhension de l'os calcaneus beaucoup plus petit utilisant des montages faits sur commande19,20, l'ancrage par des pinces21,fixant dans le ciment plastique d'auto-traitement22 ou utilisant une forme conique fente22. Cependant, ces méthodes restent limitées par une faible reproductibilité, des taux d'échec artifactual élevés élevés et des exigences de préparation fastidieuses. Les nouvelles méthodes présentées dans cette étude ont éliminé les défaillances d'adhérence artifactual et ont triplé le nombre de spécimens qui peuvent être testés en une journée. En outre, ces méthodes ne se limitent pas aux tendons supraspinatus et d'Achille, car elles sont facilement adaptées à l'essai d'autres tendons et tendons murines à partir de modèles animaux plus grands. Pour tester les tendons de plus grands animaux, cependant, le modulus du matériel d'appareil imprimé 3D doit être assez élevé pour qu'il ne soit pas conforme par rapport à la force du tendon testé.

Plusieurs études ont montré des différences fondées sur le sexe dans les troubles tendineux indiquant que les femmes ont une fonction réduite après le traitement après une blessure au tendon40,41,42. Dans la présente étude, le sexe a eu un effet significatif sur les propriétés mécaniques des tendons murins. Selon les Conseils nationaux de la santé (NIH), nous recommandons de tenir compte du sexe comme variable biologique dans la conception de la recherche de modèles animaux où les propriétés mécaniques du tendon seront mesurées.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

L'étude a été soutenue par le NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100 Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose 
Bruker microCT  Bruker BioSpin Corp Skyscan 1272  Used by authors
ElectroForce  TA Instruments 3200 Testing platform
Ethanol 200 Proof Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips Custom made Used by authors
Kimwipes Kimberly-Clark  S-8115 As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan) Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
MilliQ water (Ultrapure water) Millipore Sigma QGARD00R1 (or related purifier) 100 ml 
Meshmixer Autodesk http://www.meshmixer.com/ Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS  Stratasys LTD Precision Prototyping
Objet Studio Stratasys LTD Used by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 10010031 2.5 L of 10% PBS 
S&T Forceps Fine Science Tools 00108-11 Used by authors
Scalpel Blade - #11 Fine Science Tools 10011-00 Used by authors
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools 10003-12 Used by authors
SkyScan 1272 Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
Skyscan CT-Vox Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SkyScan NRecon Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SolidWorks CAD Dassault Systèmes SolidWorks Research Subsription Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue Loctite 234790 As suggested in protocol
Testing bath Custom made Used by authors
Thin film grips  Custom made Used by authors
VeroWhitePlus Stratasys LTD NA 3D printing material used by authors
WinTest  WinTest Software Used by authors to collect data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham,… More

Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. J. Vis. Exp. (152), e60280, doi:10.3791/60280 (2019).

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