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Bioengineering

マウス腱の生体力学的試験

Published: October 15, 2019
doi:
10.3791/60280
, , ,
1Department of Orthopedic Surgery,Columbia University, 2Department of Biomedical Engineering,Columbia University

Summary

このプロトコルは、カスタムフィット3Dプリント器具の使用を通じて、マウス腱の効率的で再現性の高い引張生体力学的試験方法について説明します。

Abstract

腱障害は一般的であり、すべての年齢の人々に影響を与え、しばしば衰弱している。抗炎症薬、リハビリテーション、外科的修復などの標準的な治療法は、しばしば失敗します。腱機能を定義し、新しい治療法の有効性を実証するためには、動物モデルからの腱の機械的特性を正確に決定する必要があります。マウス動物モデルは現在、腱障害を研究し、腱症の新しい治療法を評価するために広く使用されています。しかし、マウス腱の機械的特性を決定することは困難でした。本研究では、それぞれ上頭症腱とアキレス腱を機械的にテストするために、ヒューマラスとカルカヌスの解剖学に正確に一致する3Dプリント器具を含む腱機械試験用に新しいシステムが開発された。これらの器具は、ネイティブ骨解剖学、固体モデリング、および添加剤製造の3D再構成を使用して開発されました。この新しいアプローチにより、実際のグリップの失敗(腱ではなく成長プレートの故障など)が排除され、全体的な試験時間が減少し、再現性が向上しました。さらに、この新しい方法は、他の動物からの他のマウス腱や腱のテストに容易に適応可能である。

Introduction

腱障害は、老化、運動、および活性集団1、2、3の間で一般的で非常に一般的である。米国では、毎年1,640万人の結合組織損傷が報告され、すべての傷害関連の医師のオフィス訪問の3、5、6、7の30%を占めています。 8.最も一般的に影響を受ける部位には、回転子カフ、アキレス腱、膝蓋腱9が含まれる。抗炎症薬、リハビリテーション、外科的修復など、様々な非手術・手術治療が検討されているが、結果は依然として乏しく、機能への回帰が限られ、故障率が高い5 6.これらの貧弱な臨床結果は、腱症を理解し、新しい治療アプローチを開発しようとする基礎的および翻訳的研究を動機づけています。

引張生体力学的特性は、腱機能を定義する主要な定量的結果である。したがって、腱症および治療有効性の実験室的特徴付けは、腱引張特性の厳密な試験を含む必要があります。ラット、ヒツジ、イヌ、ウサギ10、11、12などの動物モデルから腱の生体力学的特性を決定する方法を数多くの研究が記載されている。しかし、主に引張試験のために小さな組織をつかむのが難しいため、マウス腱の生体力学的特性をテストした研究はほとんどありません。マウスモデルは、遺伝子操作、広範な試薬の選択肢、低コストなど、機械的に腱症を研究するための多くの利点を有するので、マウス組織を生体的にテストする正確で効率的な方法の開発が必要とされています。

腱の機械的特性を適切にテストするためには、組織を効果的につかむ必要があり、グリップ界面で滑ったり、実際に引き裂いたり、成長板を破砕したりする必要があります。多くの場合、特に短い腱の場合、骨は一方の端でつかまれ、腱はもう一方の端でつかまれる。骨は、典型的には、エポキシ樹脂13およびポリメチルメタクリレート14、15などの材料にそれらを埋め込むことによって確保される。腱は、多くの場合、サンドペーパーの2つの層の間に配置され、シアノクリレートで接着され、圧縮クランプ(断面が平らな場合)または凍結媒体(断面が大きい場合)15、16、17を使用して固定されています。.これらの方法は、生体力学的にマウス腱をテストするために適用されているが、試料のサイズが小さく、成長プレートのコンプライアンスが原因で問題が生じ、18を振動させない。例えば、マウスの頭の直径はわずか数ミリメートルで、骨のつかみにくくなります。具体的には、マウス上頭腱から骨までのサンプルの引張試験は、腱や腱のエンテシスではなく成長板で失敗することがよくあります。同様に、アキレス腱の生体力学的試験は困難である。アキレス腱は他のマウス腱よりも大きいが、カルカヌエウスは小さく、この骨のつかみ取りが困難である。骨を取り除き、その後に2つの腱の端をつかみます。しかし、これは腱と骨の付着のテストを妨げる。他のグループは、カスタムメイドの器具19、20、クランプ21による固定、自己硬化プラスチックセメント22で固定または円錐形スロット22を使用して、カルカインの骨をつかむ報告します。以前の方法は、再現性が低く、高いグリップ故障率、および退屈な準備要件によって制限されたままです。

今回の研究の目的は、マウス腱の引張生体力学的検査のための正確かつ効率的な方法を開発し、例として上脊椎およびアキレス腱に焦点を当てた。ネイティブ骨解剖学、固体モデリング、添加物製造からの3D再構成を組み合わせて、骨をつかむ新しい方法を開発しました。これらの器具は骨を効果的に確保し、成長板の故障を防ぎ、検体の調製時間を減らし、テストの再現性を高めた。この新しい方法は、ラットや他の動物の腱と同様に、他のマウス腱をテストするために容易に適応可能である。

Protocol

動物研究は、コロンビア大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました.この研究で使用されたマウスはC57BL/6Jの背景を有し、ジャクソン研究所(バーハーバー、ME、米国)から購入した。彼らは病原体を含まないバリア条件で収容され、食物と水のアドリビタムを提供された。 1. 骨を握るためのカスタムフィット3Dプリント器具の開発 骨画像取得と3D骨?…

Representative Results

3Dプリントされた器具は、8週齢のマウス上脊椎間およびアキレス腱をテストするために使用された。すべての機械的にテストされたサンプルは、引張試験後のマイクロCTスキャン、目視検査、およびビデオ分析によって特徴づけられるように、封入で失敗しました。本研究室における上脊椎腱試験の前の方法と現在の方法の1対1の比較を図3に示す。前の方法28,29,30では、…

Discussion

マウス動物モデルは、腱障害を研究するために一般的に使用されますが、その機械的特性の特徴付けは困難であり、文献では珍しいです。このプロトコルの目的は、マウス腱の引張試験のための時間効率が良く、再現可能な方法を記述することです。新しい方法では、サンプルのテストに必要な時間が数時間から数分に短縮され、以前の方法で一般的な問題であった主要なグリップアーティ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

研究はNIH/NIAMS(R01 AR055580、R01 AR057836)によって支持された。

Materials

Agarose Fisher Scientific BP160-100 Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose 
Bruker microCT  Bruker BioSpin Corp Skyscan 1272  Used by authors
ElectroForce  TA Instruments 3200 Testing platform
Ethanol 200 Proof Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips Custom made Used by authors
Kimwipes Kimberly-Clark  S-8115 As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan) Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
MilliQ water (Ultrapure water) Millipore Sigma QGARD00R1 (or related purifier) 100 ml 
Meshmixer Autodesk http://www.meshmixer.com/ Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS  Stratasys LTD Precision Prototyping
Objet Studio Stratasys LTD Used by authors with 3D printer
PBS – Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 10010031 2.5 L of 10% PBS 
S&T Forceps Fine Science Tools 00108-11 Used by authors
Scalpel Blade – #11 Fine Science Tools 10011-00 Used by authors
Scalpel Handle – #3 Fine Science Tools 10003-12 Used by authors
SkyScan 1272 Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
Skyscan CT-Vox Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SkyScan NRecon Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SolidWorks CAD Dassault Systèmes SolidWorks Research Subsription Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue Loctite 234790 As suggested in protocol
Testing bath Custom made Used by authors
Thin film grips  Custom made Used by authors
VeroWhitePlus Stratasys LTD NA 3D printing material used by authors
WinTest  WinTest Software Used by authors to collect data
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References

  1. Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
  2. Thomopoulos, S., Parks, W. C., Rifkin, D. B., Derwin, K. A. Mechanisms of tendon injury and repair. Journal of Orthopaedic Research. 33, 832-839 (2016).
  3. Scott, A., Ashe, M. C. Common Tendinopathies in the Upper and Lower Extremities. Current Sports Medicine Reports. 5, 233-241 (2006).
  4. Praemer, A., Furner, S., Rice, D. P. Musculoskeletal Conditions in the United States. American Academy of Orthopaedic Surgeons. , (1992).
  5. Nourissat, G., Berenbaum, F., Duprez, D. Tendon injury: From biology to tendon repair. Nature Reviews Rheumatology. 11, 223-233 (2015).
  6. Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. 86, 219-224 (2004).
  7. Sher, J. S., Uribe, J. W., Posada, A., Murphy, B. J., Zlatkin, M. B. Abnormal findings on magnetic resonance images of asymptomatic shoulders. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77, 10-15 (1995).
  8. Ker, R. F., Wang, X. T., Pike, A. V. Fatigue quality of mammalian tendons. The Journal of Experimental Biology. 203, 1317-1327 (2000).
  9. Wilson, J. J., Best, T. M. Common overuse tendon problems: A review and recommendations for treatment. American Family Physician. 72, 811-818 (2005).
  10. Fleischer, J., et al. Biomechanical strength and failure mechanism of different tubercula refixation methods within the framework of an arthroplasty for shoulder fracture. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research. 103, 165-169 (2017).
  11. West, J. R., Juncosa, N., Galloway, M. T., Boivin, G. P., Butler, D. L. Characterization of in vivo Achilles tendon forces in rabbits during treadmill locomotion at varying speeds and inclinations. Journal of Biomechanics. 37, 1647-1653 (2004).
  12. Cavinatto, L., et al. Early versus late repair of rotator cuff tears in rats. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27, 606-613 (2018).
  13. Potter, R., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The developing shoulder has a limited capacity to recover after a short duration of neonatal paralysis. Journal of Biomechanics. 47, 2314-2320 (2014).
  14. Connizzo, B. K., Sarver, J. J., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Effect of Age and Proteoglycan Deficiency on Collagen Fiber Re-Alignment and Mechanical Properties in Mouse Supraspinatus Tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021019 (2013).
  15. Beason, D. P., et al. Hypercholesterolemia increases supraspinatus tendon stiffness and elastic modulus across multiple species. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22, 681-686 (2013).
  16. Miller, K. S., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J. Collagen fiber re-alignment in a neonatal developmental mouse supraspinatus tendon model. Annals of Biomedical Engineering. 40, 1102-1110 (2012).
  17. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2780-2788 (2018).
  18. Thomopoulos, S., Birman, V., Genin, G. M. Structural Interfaces and Attachments in Biology. Infection and Immunity. 35, (2013).
  19. Boivin, G. P., et al. Biomechanical properties and histology of db/db diabetic mouse Achilles tendon. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 4, 280-284 (2014).
  20. Ansorge, H. L., Adams, S., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Mechanical, Compositional, and Structural Properties of the Post-natal Mouse Achilles Tendon. Annals of Biomedical Engineering. 39, 1904-1913 (2011).
  21. Shu, C. C., Smith, M. M., Appleyard, R. C., Little, C. B., Melrose, J. Achilles and tail tendons of perlecan exon 3 null heparan sulphate deficient mice display surprising improvement in tendon tensile properties and altered collagen fibril organisation compared to C57BL/6 wild type mice. PeerJ. 6, 5120 (2018).
  22. Probst, A., et al. A new clamping technique for biomechanical testing of tendons in small animals. Journal of Investigative Surgery. 13, 313-318 (2000).
  23. Talan, M. Body temperature of C57BL/6J mice with age. Experimental Gerontology. 19, 25-29 (1984).
  24. Newton, M. D., et al. The influence of testing angle on the biomechanical properties of the rat supraspinatus tendon. Journal of Biomechanics. 49, 4159-4163 (2016).
  25. Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55, 44-51 (2014).
  26. Gimbel, J. A., Van Kleunen, J. P., Williams, G. R., Thomopoulos, S., Soslowsky, L. J. Long durations of immobilization in the rat result in enhanced mechanical properties of the healing supraspinatus tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 400-404 (2006).
  27. Freedman, B. R., Sarver, J. J., Buckley, M. R., Voleti, P. B., Soslowsky, L. J. Biomechanical and structural response of healing Achilles tendon to fatigue loading following acute injury. Journal of Biomechanics. 47, 2028-2034 (2014).
  28. Deymier, A. C., et al. The multiscale structural and mechanical effects of mouse supraspinatus muscle unloading on the mature enthesis. Acta Biomaterialia. 83, 302-313 (2019).
  29. Killian, M. L., Thomopoulos, S. Scleraxis is required for the development of a functional tendon enthesis. FASEB Journal. 30, 301-311 (2016).
  30. Schwartz, A. G., Long, F., Thomopoulos, S. Enthesis fibrocartilage cells originate from a population of Hedgehog-responsive cells modulated by the loading environment. Development. 142, 196-206 (2015).
  31. Bell, R., Taub, P., Cagle, P., Flatow, E. L., Andarawis-Puri, N. Development of a mouse model of supraspinatus tendon insertion site healing. Journal of Orthopaedic Research. 33, 25-32 (2014).
  32. Connizzo, B. K., Bhatt, P. R., Liechty, K. W., Soslowsky, L. J. Diabetes Alters Mechanical Properties and Collagen Fiber Re-Alignment in Multiple Mouse Tendons. Annals of Biomedical Engineering. 42, 1880-1888 (2014).
  33. Eekhoff, J. D., et al. Functionally Distinct Tendons From Elastin Haploinsufficient Mice Exhibit Mild Stiffening and Tendon-Specific Structural Alteration. Journal of Biomechanical Engineering. 139, 111003 (2017).
  34. Mikic, B., Bierwert, L., Tsou, D. Achilles tendon characterization in GDF-7 deficient mice. Journal of Orthopaedic Research. 24, 831-841 (2006).
  35. Sikes, K. J., et al. Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).
  36. Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains. Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).
  37. Wang, V. M., et al. Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5. Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).
  38. Zhang, K., et al. Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model. Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).
  39. Rooney, S. I., et al. Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model. American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).
  40. Galasso, O., et al. Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears. Arthroscopy – Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).
  41. Sarver, D. C., et al. Sex differences in tendon structure and function. Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).
  42. Razmjou, H., et al. Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66 (2011).

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Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. J. Vis. Exp. (152), e60280, doi:10.3791/60280 (2019).
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