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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Pruebas biomecánicas de tendones murinos

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60280
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Department of Orthopedic Surgery, Columbia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

Summary

El protocolo describe métodos de ensayo biomecánicos de tracción eficientes y reproducibles para tendones murinos mediante el uso de accesorios impresos en 3D de ajuste personalizado.

Abstract

Los trastornos del tendón son comunes, afectan a personas de todas las edades y a menudo son debilitantes. Los tratamientos estándar, como los antiinflamatorios, la rehabilitación y la reparación quirúrgica, a menudo fallan. Con el fin de definir la función del tendón y demostrar la eficacia de los nuevos tratamientos, las propiedades mecánicas de los tendones de los modelos animales deben determinarse con precisión. Los modelos animales murinos ahora se utilizan ampliamente para estudiar trastornos tendinosos y evaluar nuevos tratamientos para las tendinopatías; sin embargo, determinar las propiedades mecánicas de los tendones del ratón ha sido un reto. En este estudio, se desarrolló un nuevo sistema para pruebas mecánicas de tendones que incluye accesorios impresos en 3D que coinciden exactamente con las anatomías del húmero y el calcáneo para probar mecánicamente los tendones supraespinatus y los tendones de Aquiles, respectivamente. Estos accesorios fueron desarrollados utilizando reconstrucciones 3D de anatomía ósea nativa, modelado sólido y fabricación aditiva. El nuevo enfoque eliminó las fallas de agarre artifreales (por ejemplo, fallas en la falla de la placa de crecimiento en lugar de en el tendón), disminuyó el tiempo total de prueba y aumentó la reproducibilidad. Además, este nuevo método es fácilmente adaptable para probar otros tendones y tendones murinos de otros animales.

Introduction

Los trastornos del tendón son comunes y muy frecuentes entre las poblaciones de envejecimiento, atletismo y activa1,2,3. En los Estados Unidos, 16,4 millones de lesiones por tejido conectivo se reportan cada año4 y representan el 30% de todas las visitas al consultorio médico relacionadas con lesiones3,5,6,7, 8. Los sitios más comúnmente afectados incluyen el manguito rotador, tendón de Aquiles, y tendón rotuliano9. Aunque se han explorado una variedad de tratamientos no quirúrgicos y operativos, incluyendo medicamentos antiinflamatorios, rehabilitación y reparación quirúrgica, los resultados siguen siendo pobres, con un retorno limitado a la función y altas tasas de falla5, 6. Estos malos resultados clínicos han motivado los estudios básicos y traslacionales que buscan comprender la tendinopatía y desarrollar nuevos enfoques de tratamiento.

Las propiedades biomecánicas de tracción son los principales resultados cuantitativos que definen la función del tendón. Por lo tanto, la caracterización de laboratorio de la tendinopatía y la eficacia del tratamiento deben incluir una prueba rigurosa de las propiedades de la tensión del tendón. Numerosos estudios han descrito métodos para determinar las propiedades biomecánicas de los tendones a partir de modelos animales como ratas, ovejas, perros y conejos10,11,12. Sin embargo, pocos estudios han probado las propiedades biomecánicas de los tendones murinos, principalmente debido a las dificultades para agarrar los tejidos pequeños para las pruebas de tracción. Como los modelos murinos tienen numerosas ventajas para el estudio mecanicistamente tendinopatía, incluyendo la manipulación genética, amplias opciones de reactivos y bajo costo, se necesita el desarrollo de métodos precisos y eficientes para probar biomecánicamente los tejidos murinos.

Con el fin de probar adecuadamente las propiedades mecánicas de los tendones, el tejido debe ser agarrado eficazmente, sin resbalones o desgarros artifes reales en la interfaz de agarre o fractura de la placa de crecimiento. En muchos casos, particularmente para tendones cortos, el hueso se agarra en un extremo y el tendón se agarra en el otro extremo. Los huesos se fijan típicamente incrustándolos en materiales como resina epoxi13 y polimetilmetacrilato14,15. Los tendones a menudo se colocan entre dos capas de papel de lija, pegados con cianoacrilato, y asegurados mediante abrazaderas de compresión (si la sección transversal es plana) o en un medio congelado (si la sección transversal es grande)15,16,17 . Estos métodos se han aplicado a tendones murinas de ensayo biomecánicos, pero surgen desafíos debido al pequeño tamaño de los especímenes y al cumplimiento de la placa de crecimiento, que nunca osifie18. Por ejemplo, el diámetro de la cabeza hueral murina es de sólo unos pocos milímetros, lo que dificulta el agarre del hueso. Específicamente, las pruebas de tracción de muestras de tendón-hueso de supraespinato murino a menudo resultan en falla en la placa de crecimiento en lugar de en el tendón o en la entesis del tendón. Del mismo modo, las pruebas biomecánicas del tendón de Aquiles son desafiantes. Aunque el tendón de Aquiles es más grande que otros tendones murinos, el calcáneo es pequeño, lo que dificulta el agarre de este hueso. El hueso se puede extraer, seguido de agarrar los dos extremos del tendón; sin embargo, esto impide la prueba de la unión de tendón a hueso. Otros grupos informan de agarrar el hueso de calcáneo utilizando accesorios hechos a medida19,20, anclaje por abrazaderas21, fijación en cemento plástico autocurado22 o utilizando una ranura de forma cónica22, sin embargo, estos métodos anteriores siguen estando limitados por la baja reproducibilidad, las altas tasas de fallas de agarre y los requisitos tediosos de preparación.

El objetivo del estudio actual fue desarrollar un método preciso y eficiente para las pruebas biomecánicas de tracción de los tendones murinos, centrándose en los tendones supraespinato y Aquiles como ejemplos. Utilizando una combinación de reconstrucciones 3D de la anatomía ósea nativa, modelado sólido y fabricación aditiva, se desarrolló un método novedoso para agarrar los huesos. Estos accesorios aseguraron eficazmente los huesos, evitaron fallas en la placa de crecimiento, disminuyeron el tiempo de preparación de la muestra y aumentaron la reproducibilidad de las pruebas. El nuevo método es fácilmente adaptable para probar otros tendones murinos, así como tendones en ratas y otros animales.

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Protocol

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia. Los ratones utilizados en este estudio eran de un fondo C57BL/6J y fueron comprados en the Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Estaban alojados en condiciones de barrera libre de patógenos y se les proporcionaba alimentos y agua ad libitum.

1. Desarrollo de accesorios impresos en 3D para agarrar hueso

  1. Adquisición de imagen ósea y construcción de modelos óseos 3D
    1. Diseccionar el hueso de interés en la preparación para la creación de modelos 3D y la impresión de agarre óseo 3D; el húmero y el calcáneo se utilizan como ejemplos en el protocolo actual.
      NOTA: En el paso 2.1.1 se proporcionan instrucciones detalladas para diseccionar muestras de hueso-tendón-músculo para pruebas mecánicas. Se deben seguir los siguientes pasos para aislar los huesos con el fin de crear pinzamientos óseos impresos en 3D.
      1. Disección del húmero: Euthanize un ratón por procedimiento aprobado por la IACUC. Retire la piel de las extremidades superiores, retire todos los músculos sobre el húmero, desarticula el codo y las articulaciones glenohumerales, y retire cuidadosamente todos los tejidos conectivos unidos al húmero.
      2. Disección del calcáneo: Euthanize un ratón por procedimiento aprobado por la IACUC. Retire la piel inferior de las extremidades, desarticula las articulaciones del tendón-calcáneo de Aquiles y las articulaciones entre calcáneo y otros huesos del pie, y retire cuidadosamente todos los tejidos conectivos unidos al calcáneo.
    2. Realice una tomografía microcalculada de todo el hueso, por ejemplo, escanee las muestras de húmero y calcáneo.
      NOTA: Dependiendo del escáner utilizado, los ajustes serán diferentes. Para el escáner utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales),los ajustes recomendados son: escanear a una energía de 55 kVP, filtro Al 0.25, a una resolución de 6 m.
      1. Mezclar el polvo de agarosa en agua ultrapura y microondas durante 1-3 minutos hasta que la agarosa se disuelva por completo. Es útil para microondas para 30-45 s, detener y girar, y luego continuar hacia un hervor. Llena criotubos hasta tres cuartos llenos de agarosa. Deje que la agarosa se enfríe durante unos 5-10 min.
      2. Inserte hueso en el gel de agarosa (esto evitará artefactos de movimiento durante el escaneo). Inserte un criotubo con hueso en el escáner.
        NOTA: Para el escáner utilizado en el estudio actual, se utilizó un cambiador automático de muestras de 16 posiciones para todos los escaneos. Este escáner puede seleccionar automáticamente la ampliación de acuerdo con el tamaño y la forma de una muestra.
    3. Reconstruya imágenes de proyección de tomografía microcalculada en imágenes de sección transversal. Utilice los parámetros recomendados para la combinación de escáner/software del experimentador.
      NOTA: Para el programa utilizado en el estudio actual(Tabla de Materiales)se recomienda utilizar los siguientes parámetros de reconstrucción: Suavizado: 0-2, Corrección de endurecimiento de haz: 45, Reducción de artefacto de anillo: 4-9 y para reconstruir rodajas en TIFF de 16 bits Formato.
    4. Cree un modelo 3D y guárdelo en un formato STL estándar compatible con la mayoría de las impresoras 3D y la creación rápida de prototipos. Para el programa utilizado en el estudio actual (Tabla de materiales), haga lo siguiente:
      1. Seleccione el comando Archivo > Abrir para abrir el dataset de archivos. Abra el cuadro de diálogo Archivo > Preferencias y seleccione la pestaña Avanzadas.
      2. Utilice el algoritmo de representación adaptable para construir los modelos 3D. Este algoritmo minimiza el número de triángulos facetas y proporciona un detalle de superficie más suave. Utilice 10 como parámetro de localidad; este parámetro define la distancia en píxeles al punto vecino utilizado para buscar el borde del objeto. Minimice la tolerancia a 0,1 para reducir el tamaño del archivo.
        NOTA: Después de abrir el conjunto de datos, las imágenes se muestran en la página "Imágenes en bruto".
      3. Para especificar el volumen de interés (VOI), seleccione manualmente dos imágenes para establecerlas como la parte superior e inferior del rango de VOI seleccionado.
      4. Vaya a la segunda página, Región de interés. Seleccione manualmente la región de interés en una sola imagen de sección transversal.
        NOTA: La región seleccionada se resaltará en rojo (es decir, el área transversal del húmero).
      5. Repita el paso anterior cada 10–15 imágenes de sección transversal.
      6. Vaya a la tercera página Selección binaria. En el menú del histograma, haga clic en Desde conjunto de datos. Se mostrará la distribución del histograma del brillo de todas las imágenes del conjunto de datos. También en el menú del histograma, haga clic en el menú Crear un archivo de modelo 3D.
    5. Guarde un modelo 3D del hueso en formato de archivo STL.
    6. Refinar la malla: Manipule la malla para reducir el tamaño del archivo STL y hacerla compatible con cualquier programa de diseño asistido por ordenador de modelado sólido. Para el programa utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales), siga los pasos que se indican a continuación:
      1. Importe malla y seleccione todo para editar. Seleccione Reducir en el conjunto de herramientas Editar. A continuación, seleccione Presupuesto de triángulo en el conjunto de herramientas Reducir destino. Reduzca el recuento de tri y acepte los cambios. Vuelva a guardar el archivo recién reducido en formato STL seleccionando Exportar como...
  2. Diseño de accesorios de hueso de ajuste personalizado
    1. Hueso tendinésal-humeral de Supraspinatus
      1. Utilice un programa de diseño asistido por ordenador de modelado sólido para crear un modelo personalizado de fijación de agarre de húmero(Figura 1, Archivos suplementarios).
        NOTA: El programa utilizado en el estudio actual aparece en la Tabla de materiales.
      2. Abra el archivo de formato STL del hueso del húmero en un programa de modelado sólido y guárdelo como un archivo de pieza.
        NOTA: Para el software utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales),el objeto óseo 3D se guardó en formato SLDPRT.
      3. Abra el archivo de pieza y cree manualmente tres planos anatómicamente relevantes (es decir, sagitales, coronales, transversales).
        1. Definir manualmente el plano sagital para cortar a través del apego del tendón supraespinato en la mayor tuberosidad. Asegúrese de que el bloque 3D contiene el plano sagital como un plano de simetría. Para ello, añada o corte material del bloque si es necesario.
          NOTA: Este plano de simetría garantiza que cuando se inserta la muestra en los accesorios, el tendón y el accesorio del tendón se encuentran en el eje central del accesorio.
      4. Mida las dimensiones del hueso a lo largo de cada uno de los tres planos (es decir, altura, anchura, longitud).
      5. Mida las dimensiones de las pinzas de prueba mecánicas donde se conectará el accesorio impreso en 3D.
      6. Comience diseñando una pieza de bloque sólido (por ejemplo, un cilindro sólido).
        1. Asegúrese de que cada dimensión del bloque sea al menos 5 mm mayor que las dimensiones del húmero.
        2. Tenga en cuenta las limitaciones de diseño de las pinzas de prueba mecánicas (es decir, asegúrese de que el accesorio impreso en 3D se pueda montar y desmontar libremente en las empuñaduras de prueba mecánicas).
      7. Cree un modelo de ensamblaje con dos componentes: el bloque sólido y el hueso del húmero derecho o izquierdo. Defina la orientación del hueso dentro del bloque (es decir, el ángulo entre el tendón y el hueso). Asegúrese de que todo el volumen óseo se ajuste dentro del bloque.
      8. Cree una cavidad en el bloque utilizando el hueso del húmero como molde. Si utiliza el software especificado en la Tabla de materiales, siga estos pasos:
        1. Inserte la pieza de diseño (húmero) y la base del molde (bloque de cilindros) en un conjunto intermedio. En la ventana de ensamblaje, seleccione el bloque y haga clic en Editar componente en la barra de herramientas Ensamblaje.
        2. Haga clic en Insertar > Operaciones > Cavidad. Seleccione Escala uniforme e introduzca 0% como valor para escalar en todas las direcciones.
      9. Suprima la pieza ósea y guarde el ensamblaje como una pieza.
      10. Pieza abierta (cilindro con cavidad). Corte la pieza a lo largo del plano sagital para crear dos componentes simétricos que se ajusten al hueso anterior y posteriormente (por ejemplo, dos medio cilindros, como se ve en la Figura 1).
        NOTA: Dos componentes están diseñados que se ajustan al hueso anterior y posteriormente. El componente anterior incluye una cavidad de forma esférica media extendida desde el lado anterior de la cabeza humeral hasta el accesorio del tendón supraespinato. La cavidad del componente posterior tiene la forma de la parte posterior del húmero (es decir, el lado posterior de la cabeza humeral, la tuberosidad deltoides y el epicóndilo medial y lateral).
      11. Guarde cada componente como una pieza de archivo independiente.
      12. Para el componente anterior, asegúrese de que el cabezal humeral esté incrustado en la cavidad de la pieza definiendo las tolerancias adecuadas.
        NOTA: En el estudio actual, utilizando el software especificado en la Tabla de Materiales,se sugiere seguir los pasos a continuación:
        1. Cree un corte rallado para suavizar la geometría de malla de la cavidad. Cree un croquis para el corte emulando la geometría de la cavidad y añadiendo una holgura de ubicación.
          NOTA: El espacio libre permite un montaje y desmontaje gratuitos entre el hueso y el componente anterior.
      13. Modifique el componente posterior para imitar la geometría de la cavidad para crear un corte que añada holgura, como se ha descrito anteriormente para el componente anterior.
      14. Realice un corte en el plano transversal a partir de la parte superior del componente posterior hasta la cresta del tubérculo mayor/menor.
        NOTA: Como se ve en la Figura 1 y la Figura 2, el componente posterior incluye un corte que crea una abertura en el accesorio de tendón.
      15. Cree un ajuste ajustado entre los dos componentes para permitir el montaje y el desmontaje gratuitos.
        NOTA: Se ha creado un ajuste de eje de agujero con una holgura de carrera suelta para los accesorios en el estudio actual.
      16. Cree modelos de espejo 3D para cada componente de la luminaria para la extremidad opuesta (es decir, izquierda o derecha).
      17. Añade un etch en la parte inferior de los accesorios para distinguir entre los lados izquierdo y derecho.
      18. Guarde todas las piezas de fijación en formato de archivo estándar STL como preparación para la impresión 3D.
    2. Hueso tendones-calcáneo de Aquiles
      1. Siga los mismos pasos descritos anteriormente para el accesorio de cabeza supraespinato-humeral.
        NOTA: Sólo un conjunto de accesorios es necesario para el Aquiles-calcaneal, ya que la anatomía de los huesos del calcáneo izquierdo y derecho es casi simétrica.

2. Pruebas biomecánicas de tendones murinos

  1. Preparación de muestras y medición de área transversal
    1. Diseccionar el músculo-tendón-hueso de interés en la preparación para pruebas mecánicas de tracción. En el estudio actual, el músculo supraespinatus - tendón - muestras óseas del húmero (N-10, 5 machos, 5 hembras) y músculo gastrocnemius - especímenes óseos del tendón-calcaneus de Aquiles (N-12, 6 machos, 6 hembras) fueron aislados de ratones C57BL/6J de 8 semanas de edad.
      1. Disección del músculo supraespinato - tendón - muestra ósea húmero
        1. Eutanasia un ratón por procedimiento aprobado por la IACUC. Coloque el ratón en una posición propensa. Haga una incisión en la piel desde arriba del codo de la pata delantera hacia el hombro.
        2. Retire cuidadosamente la piel con disección contundente para que la musculatura del hombro sea visible. Retire el tejido que rodea el húmero hasta que el hueso esté expuesto y pueda mantenerse firmemente con fórceps.
        3. Sostenga el húmero con fórceps y retire cuidadosamente los músculos deltoides y trapecios para exponer el arco coracoacromial. Identifique la articulación acromioclavicular y separe cuidadosamente la clavícula del acromion con una cuchilla de bisturí.
        4. Teniendo cuidado de no dañar el tendón supraespinato y su fijación ósea, retire el músculo de su fijación escapularia usando una cuchilla de bisturí. Teniendo cuidado de no dañar el tendón supraespinato y su apego óseo, separar la cabeza humeral del glenoide; usando una cuchilla del bisturí, lacera la cápsula articular y los tendones subespinatus, subescapularis y teres menores.
        5. Desarticula la articulación del codo para separar el húmero del cúbito y el radio. Aislar el húmero - tendón supraespinato - espécimen muscular y limpiar el exceso de tejidos blandos en el húmero y la cabeza húeral.
      2. Disección del tendón de Aquiles - muestra ósea de calcáneo
        1. Eutanasia un ratón por procedimiento aprobado por la IACUC. Coloque el ratón en una posición propensa. Teniendo cuidado de no dañar el tendón de Aquiles y su apego óseo, retire la piel con disección contundente para que la musculatura alrededor de las articulaciones del tobillo y la rodilla se exponga.
        2. Usando una hoja de bisturí, comenzando en el tendón de Aquiles - accesorio calcáneo, separar cuidadosamente el músculo gastrocnemius de sus accesorios proximales.
        3. Desarticula cuidadosamente el calcáneo de los diversos huesos adyacentes. Aísle el tendón de Aquiles - espécimen de calcáneo y limpie el exceso de tejidos blandos.
    2. Determinar el área transversal del tendón mediante microtomografía.
      NOTA: Para el escáner utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales),los ajustes recomendados son: escanear a una energía de 55 kVP, filtro Al 0.25, a una resolución de 5 m.
      1. Mezclar el polvo de agarosa en agua ultrapura y microondas durante 1-3 minutos hasta que la agarosa se disuelva por completo. Es útil para microondas para 30-45 s, detener y girar, y luego continuar hacia un hervor. Llena criotubos hasta tres cuartos llenos de agarosa. Deje que la agarosa se enfríe durante unos 5-10 min.
      2. Suspenda la muestra en el criotubo insertando el hueso al revés.
        NOTA: Sólo el hueso debe estar en el gel de agarosa. El tendón y el músculo deben suspenderse al aire libre.
    3. Después de la exploración, retire suavemente el músculo del tendón usando la cuchilla del bisturí. Inserte la muestra en el accesorio impreso en 3D.
      NOTA: Los pinzamientos son reutilizables para cada prueba. No utilice pegamento o epoxi en el aparato; el hueso se mantiene en un ajuste de prensa.
    4. Inserte y pegue el tendón entre un papel de tejido fino doblado (2 cm x 1 cm) y sujete la construcción con empuñaduras de película delgadas. Coloque el accesorio impreso en 3D con la muestra en las empuñaduras de prueba.
    5. Inserte la muestra y las empuñaduras en un baño de prueba de solución salina tamponada de fosfato (PBS) a 37 oC (es decir, temperatura corporal del ratón23).
  2. Pruebas de tracción
    1. Realice pruebas mecánicas de tracción en un marco de prueba de material.
      NOTA: Para el marco de prueba utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales),el protocolo recomendado es:
      1. Defina la longitud del medidor como la distancia desde el accesorio del tendón hasta el pinzamiento superior.
      2. Condición previa con 5 ciclos entre 0,05 N y 0,2 N.
      3. Espera 120 s.
      4. Utilice una tensión de fallo del 0,2%/s.
    2. Recopilar datos de deformación de carga.
    3. Calcule la deformación unitaria como el desplazamiento en relación con la longitud inicial del medidor del tendón.
    4. Calcule la tensión como la fuerza dividida por el área transversal del tendón inicial (medida a partir de microCT).
    5. Si está interesado en el comportamiento viscoelástico, realice una relajación de tensión antes de que la prueba de tensión se incumpla y utilice los datos para calcular parámetros como A, B, C, tau1 y tau2 a partir del modelo viscoelástico cuasilineal24.
    6. A partir de la curva de deformación de carga, calcule la rigidez (pendiente de la parte lineal de la curva), la fuerza máxima y el trabajo a ceder (el área bajo la curva hasta la fuerza de rendimiento).
      1. Identifique la parte lineal eligiendo una ventana de puntos en la curva de deformación de carga que maximice el valor R2 para una regresión lineal de mínimos cuadrados25.
      2. Determine la rigidez como la pendiente de la parte lineal de la curva de desplazamiento de carga25,26.
    7. A partir de la curva de tensión unitaria, calcule el módulo (pendiente de la parte lineal de la curva), la fuerza (tensión máxima) y la resiliencia (área debajo de la curva hasta la tensión de rendimiento).
      NOTA: Utilizando el algoritmo RANSAC, la deformación unitaria de rendimiento (valor x) se define como el primer punto cuando el ajuste y se ha desviado más del 0,5% del valor de tensión esperado (valor y). La tensión de rendimiento es el valor y correspondiente de la deformación unitaria de rendimiento.
      NOTA: Además de la carga de tracción motónica a fallo descrita en el estudio actual, la carga cíclica puede proporcionar información importante sobre la fatiga del tendón y/o las propiedades viscoelásticas. Por ejemplo, Freedman et al. informaron propiedades de fatiga de los tendones de Aquiles murino27.
    8. Después de completar las pruebas de tracción, realice una tomografía microcomputada de todo el hueso, por ejemplo, escanee las muestras de húmero y calcáneo.
      NOTA: Para el escáner utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales),los ajustes recomendados son: escanear a una energía de 55 kVP, filtro Al 0.25, a una resolución de 6 m.
      1. Repita los pasos 1.1.2.1–1.1.2.2.
    9. Repita el paso 1.1.3.
    10. Utilice un programa de visualización 3D compatible con el escáner para crear un modelo 3D representado por volumen del objeto escaneado.
      NOTA: El programa utilizado en el estudio actual aparece en la Tabla de materiales.
    11. Determine el modo de error y el área del sitio de error inspeccionando el objeto 3D.
  3. Análisis estadístico: Mostrar todos los resultados de la muestra como media - desviación estándar (SD). Haga comparaciones entre grupos utilizando las pruebas t del alumno (de dos colas y sin emparejar). Establezca la importancia como p < 0.05.
    NOTA: El software estadístico utilizado en el estudio actual aparece en la Tabla de materiales.

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Representative Results

Los accesorios impresos en 3D se utilizaron para probar el supraespinato murino de 8 semanas de edad y los tendones de Aquiles. Todas las muestras analizadas mecánicamente fallaron en la entesis, como se caracteriza por escaneos microCT, inspección visual y análisis de video después de pruebas de tracción. En la Figura 3se muestra una comparación uno a uno de los métodos anteriores y actuales para las pruebas de tendón supraespinato en nuestro laboratorio. En el método anterior28,29,30, el hueso del húmero estaba incrustado en epoxi y se colocó un clip de papel sobre la cabeza humeral en un esfuerzo por evitar la fractura de la placa de crecimiento. 4-6 horas fueron necesarias para permitir que el epoxi se cure completamente(Figura 3), permitiendo que sólo 6-8 muestras sean probadas en un día típico. Otra limitación del enfoque fue la eficacia dependiente del usuario de la colocación del clip de papel para prevenir la fractura de la placa de crecimiento. Los resultados de las pruebas utilizando estos métodos anteriores fueron muy variables, con coeficientes de variación en el orden del 30% para la mayoría de los parámetros y tasas de fallade de la placa de crecimiento de aproximadamente 10%–20%. Como se resume en la Figura 3,el tiempo de preparación de muestras utilizando los nuevos métodos se redujo a 5-10 minutos, por lo que era práctico probar de 16 a 20 muestras por día. Además, se eliminaron las fallas en las placas de crecimiento.

En comparación con la metodología reportada por otros para el ensayo de tendones murinos14,15,17,25,28,29,30,31 ,32,33, los nuevos métodos eran más eficientes y reproducibles. En el caso de los tendones supraespinatos, las propiedades estructurales, como la carga máxima (3,8 x 0,6 N) y la rigidez (12,7 x 1,8 N/mm), así como las propiedades de material normalizadas, como la tensión máxima (8,7 x 3,0 MPa) y el módulo (51,7 x 13,5 MPa) tenían coeficientes de espesor es muy inferior esdecir variaciones en comparación con los resultados de la literatura (Tabla 1). En el caso del tendón de Aquiles, las propiedades mecánicas, como la carga máxima (7,8 x 1,1 N) y la rigidez (13,2 a 1,9 N/mm) tenían coeficientes de variación más bajos en comparación con los resultados de la literatura19,21,22 ,32,33,34,35,36,37,38, mientras que la tensión máxima (24,2 x 5,4 MPa) y el módulo (73,2 22.1 MPa) tenía coeficientes de variaciones similares a los indicados en la literatura (Tabla 2).

El sexo animal tuvo un efecto significativo en las propiedades mecánicas de los tendones supraespinato y Aquiles(Figura 4). Cuando se comparan los tendones supraespinatos masculinos y femeninos, hubo aumentos significativos en la fuerza máxima(p a 0,002) y el trabajo para ceder (p - 0,008). Hubo tendencias entre los dos grupos de rigidez(p - 0,057), tensión (p - 0,068), módulo (p - 0,061) y resiliencia (p - 0,078). Cuando se comparan los tendones de Aquiles masculinos y femeninos, hubo aumentos significativos en la tensión máxima(p a 0,0006) y la resiliencia(p a 0,0019). Hubo tendencias entre los dos grupos para que el trabajo se rinde (p - 0,079), y el módulo (p - 0,074) y no hay diferencia para la fuerza máxima (p - 0,1880) y la rigidez (p - 0,6759).

Figure 1
Figura 1: Modelos 3D representativos de accesorios para el húmero (fila superior) y el calcáneo (fila inferior). (A) modelos 3D de los huesos. (B) Modelos desmontados de los accesorios. (C) Modelos ensamblados de los accesorios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Accesorios impresos en 3D representativos. (A) Fijación para pruebas biomecánicas de tendones supraespinatos de ratones de 8 semanas de edad en un ángulo de 180o entre el húmero y el tendón supraespinato. (B) Sujeción para pruebas biomecánicas de tendones supraespinatos de ratones de 8 semanas de edad en un ángulo de 135o entre el húmero y el tendón supraespinato. (C) Fijación para pruebas biomecánicas de tendones de Aquiles murinos en un ángulo de 120o entre el pantáneo y el tendón de Aquiles. (D) Fijación para pruebas biomecánicas de tendones supraespinatos de ratas AdultSprague Dawley en un ángulo de 180o entre el húmero y el tendón supraespinato. Barra de escala: 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Comparación de métodos anteriores y actuales para pruebas mecánicas de tendones de supraespinato murino. (A) Métodos previos de preparación de muestras utilizados en nuestro laboratorio antes de las pruebas mecánicas: el húmero estaba en maceta en epoxi hasta la cabeza humeral para estabilizar el hueso, se colocó un clip de papel sobre la cabeza humeral para evitar la fractura de la placa de crecimiento, y, para que el epoxi se cure, los especímenes se dejaron a temperatura ambiente durante 4-6 horas antes de las pruebas mecánicas. (B) Métodos de preparación de muestras utilizados en el estudio actual (Pasos 1.2 y 2.1.4): La parte superior izquierda muestra una representación 3D de los accesorios producidos por un programa de modelado sólido. Los accesorios impresos en 3D son reutilizables y se montan y desmontan fácilmente. El extremo óseo de la muestra se inserta en los accesorios, asegurando la placa de crecimiento y exponiendo el tendón para agarre y pruebas. El extremo del tendón se pega entre un papel de tejido delgado doblado y se inserta en las empuñaduras. El tiempo de preparación para cada espécimen es de 10-15 minutos. (C) Curvas representativas de deformación de carga para pruebas de tracción del tendón supraespinato utilizando métodos actuales. (D) Curva representativa de deformación de carga para pruebas de tracción del tendón supraespinato que muestra un fallo de la placa de crecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Efecto sexual sobre las propiedades mecánicas de los tendones supraespinato (SST) y Aquiles (ACHT). Hubo un efecto significativo del sexo en muchas de las propiedades mecánicas basadas en pruebas t no emparejadas (*efecto sexual, p < 0.05). Datos mostrados como media - desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Medición del área transversal a partir de microCT. (A) Medición mínima del área transversal a lo largo de la longitud del tendón supraespinato. (B) Medición mínima del área transversal a lo largo de la longitud del tendón de Aquiles. Sólo se debe seleccionar el tendón adecuado para la medición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Propiedades estructurales Propiedades del material
Animales Fuerza máxima (N) Rigidez (N/mm) Estrés máximo (Mpa) Módulo (MPa)
Autor N Fondo Media- SD COV(%) Media- SD COV (%) Media- SD COV (%) Media- SD COV (%)
Journal of Shoulder and Elbow Surgery (2013)15 10 C57Bl/6 0,93 x 0,34 36.56 95,1 x 39,8o 41.85 3,40 x 1,56 45.88 312,8-127,0 40.60
Journal of Orthopaedic Research (2014)31 6 C57Bl/6 1,22 a 0,52 42.62 2,37 x 1,6 67.51 Nr Nr
Journal of Orthopaedic Research (2018)17 8 C57Bl/6 5,38 x 2.404 # 44.68 4,25 x 1,67 # 39.29 Nr Nr
Annals of Biomedical Engineering (2014)32 10 NR (db/+) Nr 84,44 a 27,23 * 32.25 Nr 476 x 186,27* 39.13
Journal of Biomedical Engineering (2013)14 Nr C57/BL6 Nr Nr Nr 297 x 148,90* 50.13
Acta Biomaterialia (2019)28 12 Ratón CD-1 IGS (WT) 5,0 a 0,7 14 9,2 x 2,9 31.52 33 x 35 106.06 Nr
Journal of Biomedical Engineering (2017)33 13 Eln +/+ Nr 8,50 x 2,95 34.71 5,96 x 3,23 54.19 101,2 a 50,8 50.20
FASEB Journal (2016)29 8 C57BL/6 Nr Nr 7,79 x 2,61* 33.50 58,32 a 31,73* 54.41
Bone (2014)25 20 Ratón CD-1 IGS (WT) 4,11 a 0,79* 19.22 8,58 x 3,78* 44.06 12,29 x 5,95* 48.41 133,80 a 59,41* 44.40
Desarrollo (2015)30 12 (Rosa-DTA (DTA) x Gli1-CreERT2 ) ScxCre; Smofl/fl (WT) 4,16 x 0,29* 6.97 11,04 a 1,98* 17.93 26,24 x 5,81 22.14 121,89 a 44,18 36.25
Promedio de COV 27.34 Promedio de COV 38.64 Promedio de COV 51.70 Promedio de COV 45.02
Nuevo método 10 C57BL/6J 3,79 a 0,62 16.41 12,73 a 1,81 14.20 8,71 a 3,04 34.91 51,67 a 13,54 26.20

Tabla 1: Propiedades mecánicas de los tendones supraespinatos. Media: SD y coeficiente de variación (COV) para las propiedades estructurales y materiales estimadas utilizando nuevos métodos en comparación con los reportados en la literatura. [NR: no notificado, * estimado a partir de la(s) figura(s), la desviación estándar calculada a partir del error estándar notificado, la deformación medida mediante líneas de manchas ópticas].

Propiedades estructurales Propiedades del material
Animales Fuerza máxima (N) Rigidez (N/mm) Estrés máximo (Mpa) Módulo de Young (MPa)
Autor N Fondo Media- SD COV(%) Media- SD COV (%) Media- SD COV (%) Media- SD COV (%)
Muscles, Ligaments and Tendons Journal (2014)19 6 Ratones de control magro no diabéticos 8,1 a 0,6 7.41 3,9 a 0,7 17.95 Nr 16 x 3,7 23.13
Annals of Biomedical Engineering (2014)32 10 db/+ Nr 20,39 x 2,43* 11.92 Nr 152,94 a 44,12* 28.85
Journal of Biomechanical Engineering (2017)33 8 Eln +/+ Nr 18,86 a 3,37 17.87 10,55 x 2,97 28.15 443,8 a 131,7 29.68
Journal of Orthopaedic Research (2006)34 20 C57BL/6-J x 129SV/J Nr Nr 18 x 5 27.78 61 x 20 32.79
Journal of Investigative Surgery (2000)22 20 BALB/c 8,4 x 1,1 13.10 6,3 á 1,2 19.05 Nr Nr
Peer J (2018)21 9 C57BL/6 9,6 x 3,84 39.96 8,19 a 3,63 44.32 27,55 a 10,54 38.26 Nr
Journal of Orthopaedic Research (2018)35 7 C57BL/6 Nr Nr 19,53 a 7,03 0.36 62,82 a 20,20 32.16
Journal of Orthopaedic Research (2006)36 9 A/J 8,4 x 1,2 14.29 12,2 x 2,8 22.95 78,2 a 8,6 11.00 713,9 a 203,7 28.53
Journal of Orthopaedic Research (2006)36 8 C57BL/6J 10,2 x 1,4 13.73 13,1 a 2,5 19.08 97,4 x 11,4 11.70 765,1 a 179,6 23.47
Journal of Orthopaedic Research (2006)36 7 C3H/HeJ 12,5 x 1,7 13.60 14,1 a 3,2 22.70 97,5 a 10,9 11.18 708,6 a 127,8 18.04
Journal of Orthopaedic Research (2011)37 7 C57BL/6 6,6 a 1,7 25.76 8,2 x 1,4 17.07 13,4 x 3,7 27.61 86,8 a 15,5 17.86
Matrix Biology (2016)38 Nr CD-1 y C57BL/6J 6,73 x 3,74* 55.57 12,03 a 3,34* 27.76 25,4 x 15,14* 59.61 632,31 a 113,79* 18.00
Promedio de COV 22.93 Promedio de COV 22.07 Promedio de COV 23.96 Promedio de COV 25.25
Nuevo método 12 C57BL/6J 7,8 a 1,08 13.91 13,19 a 1,86 14.08 24,16 x 5,42 22.45 73,17 a 16,14 22.06

Tabla 2: Propiedades mecánicas de los tendones de Aquiles. Media: SD y COV para las propiedades estructurales y materiales estimadas utilizando nuevos métodos en comparación con los reportados en la literatura. [NR: no notificado, * estimado a partir de la(s) figura(s), la desviación estándar calculada a partir del error estándar notificado].

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Discussion

Los modelos animales murinos se utilizan comúnmente para estudiar trastornos del tendón, pero la caracterización de sus propiedades mecánicas es desafiante y poco común en la literatura. El propósito de este protocolo es describir un método eficiente en el tiempo y reproducible para las pruebas de tracción de los tendones murinos. Los nuevos métodos redujeron el tiempo necesario para probar una muestra de horas a minutos y eliminaron un artefacto de agarre importante que era un problema común en métodos anteriores.

Varios pasos descritos en este protocolo son críticos para producir accesorios eficaces que prueban mecánicamente los tendones murinos y Aquiles. En primer lugar, el paso 1.1.4 es necesario para crear un modelo 3D del hueso deseado; sin embargo, debido a la resolución típicamente alta utilizada para este análisis, el tamaño del archivo puede ser demasiado grande para su uso con programas de modelado sólidos. El software utilizado en este protocolo redujo con éxito el tamaño del archivo (paso 1.1.6) y la geometría de objetos conservados, aunque otros softwares también pueden ser eficaces para lograr esto. En segundo lugar, cada sitio anatómico tiene criterios de diseño específicos a tener en cuenta para un agarre eficaz. Para el diseño del accesorio del tendón supraespinato, es fundamental: (i) asegurar la cabeza humeral para evitar el fallo de la placa de crecimiento (paso 1.2.1.12), (ii) definir un ajuste de aclaramiento que evite separar el hueso del húmero del molde durante las pruebas (paso 1.2.1.12.1) y (iii) orientar el hueso del húmero para formar un ángulo de 180o con el eje largo del tendón (paso 1.2.1.7). Para el diseño del accesorio de tendón de Aquiles, es fundamental: (i) definir un ajuste de separación que agarre el pequeño hueso del calcáneo sin resbalar fuera del accesorio durante las pruebas y (ii) orientar el hueso del calcáneo para formar un ángulo de 120o (flexión plantar de 30o) con el eje largo del tendón. En tercer lugar, la medición precisa del área transversal del tendón (paso 2.1.2) es fundamental para calcular correctamente la tensión de ingeniería para la determinación de las propiedades del material. Para medir el área transversal del tendón supraespinato, recomendamos exploraciones de tomografía microcomputada de la muestra hueso-tendón-músculo suspendida en un criotubo con un fondo plano, con el hueso sostenido boca abajo en el tubo con agarosa. Sólo el hueso del húmero debe insertarse en el gel de agarosa, mientras que la cabeza humeral con el tendón y el músculo unidos debe ser escaneado en el aire. Como el tendón supraespinato tiene una geometría splayed a medida que se inserta en el hueso, la forma más consistente de medir el área transversal es determinar el área transversal mínima a lo largo de la longitud del tendón. Se debe seguir un procedimiento similar para medir el área transversal del tendón de Aquiles. Para el tendón de Aquiles, las tomografías microcalculadas de alta resolución revelan dos tejidos distintos: el tendón adecuado y la vaina circundante, que aparece como un tono más claro. Para estimar consistentemente el área transversal mínima para el tendón de Aquiles, sólo se debe seleccionar el tendón adecuado para la medición(Figura 5). Por último, los pinzamientos son reutilizables y las pequeñas variaciones de una muestra a una muestra no afectan a su eficacia. Cada hueso debe ser escaneado una vez (por ejemplo, para el estudio actual, húmero izquierdo, húmero derecho y calcáneo) y se debe crear un modelo 3D para cada hueso. Además, para animales de la misma edad, la geometría ósea es casi idéntica, por lo que el mismo accesorio se puede utilizar para el ensayo de todos los especímenes. En este manuscrito, se utilizaron accesorios impresos en 3D específicos de ratones de 8 semanas de edad (ratones adultos esqueléticamente maduros) para probar tendones. No era necesario crear accesorios separados masculinos y femeninos. Para otros grupos de edad (por ejemplo, ratones de 4 semanas de edad) o ratones con fenotipos óseos únicos, se recomienda que se fabriquen accesorios que se ajusten a las geometrías particulares de los huesos.

Después del diseño y la impresión 3D de los accesorios, para garantizar la reproducibilidad y la eficiencia del enfoque, 10 muestras de tendón de ratones del mismo fondo y edad del estudio planificado normalmente deben ser probadas (el tamaño exacto de la muestra puede variar dependiendo del tejido y modelo animal). Las propiedades mecánicas de estos tendones deben determinarse para garantizar que los coeficientes de variación de las propiedades estructurales y materiales estén dentro del rango esperado, como se describe en el Cuadro 1 y en el Cuadro 2. Estas pruebas piloto también deben confirmar que no se producen fallos artifreales (por ejemplo, fallos en la placa de crecimiento). Pueden ser necesarios múltiples ciclos de diseño, prototipado y validación para lograr los resultados deseados para tendones distintos de los tendones supraespinato y Aquiles descritos en el documento actual.

Varios grupos han informado de las propiedades mecánicas de los tendones murinos. El coeficiente de variaciones en estos estudios es típicamente alto, a menudo dificultando la captación de diferencias entre los grupos de comparación. Además, las diferencias metodológicas en el agarre de tejido entre los diversos estudios dificultan determinar si las propiedades de falla son relevantes para el tendón o debido a fallas de agarre artifas. Para comparar los nuevos métodos de ensayo con las metodologías existentes, se realizó un examen bibliográfico y se resumieron los resultados de 20 estudios (Tabla 1 y Tabla 2). En la literatura, para las pruebas mecánicas del tendón supraespinato, los coeficientes medios de variación de la fuerza máxima, la rigidez, la tensión máxima y el módulo fueron del 27%, 39%, 52% y 45%, respectivamente. Para las pruebas mecánicas del tendón de Aquiles, los coeficientes medios de variación de la fuerza máxima, la rigidez, la tensión máxima y el módulo fueron del 23%, 22%, 24% y 25%, respectivamente. En el estudio actual, el nuevo método para probar los tendones murinos resultó en una reducción del 32%-63% de los coeficientes de variación del tendón supraespinato y una reducción del 6%-39% en los coeficientes de variación del tendón de Aquiles.

No existe una metodología estándar actual para agarrar huesos, por lo que no está claro en qué medida los problemas de agarre artifreales han afectado las propiedades mecánicas reportadas de los tendones murinos. La mayoría de los grupos informan de agarrar el hueso del húmero mediante el uso de resina epoxi13, polimetilmetacrilato (PMMA)14,15,o cianoacrilato16 y asegurar la cabeza humeral mediante la aplicación de un segundo recubrimiento de PMMA14, utilizando el accesorio personalizado39 y/o insertando un clip de papel25,28,30. Del mismo modo, otros grupos informan de agarre del hueso de calcáneo mucho más pequeño utilizando accesorios hechos a medida19,20, anclaje por abrazaderas21, fijación en cemento plástico autocurado22 o utilizando una forma cónica ranura22. Sin embargo, estos métodos siguen estando limitados por la baja reproducibilidad, las altas tasas de fallas artísticas y los requisitos de preparación que consumen mucho tiempo. Los nuevos métodos presentados en este estudio han eliminado las fallas de agarre artifreales y han triplicado el número de muestras que se pueden probar en un día. Además, estos métodos no se limitan a los tendones supraespinato y Aquiles, ya que se adaptan fácilmente a la prueba de otros tendones y tendones murinos de modelos animales más grandes. Para probar tendones de animales más grandes, sin embargo, el módulo del material de fijación impreso en 3D debe ser lo suficientemente alto como para que no sea compatible con la fuerza del tendón que se está probando.

Varios estudios han demostrado diferencias basadas en el sexo en los trastornos del tendón que indican que las mujeres tienen una función reducida después del tratamiento después de una lesión en el tendón40,41,42. En el estudio actual, el sexo tuvo un efecto significativo en las propiedades mecánicas de los tendones murinos. Según lo guiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH), recomendamos contabilizar el sexo como una variable biológica en el diseño de investigación de modelos animales donde se medirán las propiedades mecánicas del tendón.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El estudio fue apoyado por los NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100 Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose 
Bruker microCT  Bruker BioSpin Corp Skyscan 1272  Used by authors
ElectroForce  TA Instruments 3200 Testing platform
Ethanol 200 Proof Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips Custom made Used by authors
Kimwipes Kimberly-Clark  S-8115 As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan) Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
MilliQ water (Ultrapure water) Millipore Sigma QGARD00R1 (or related purifier) 100 ml 
Meshmixer Autodesk http://www.meshmixer.com/ Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS  Stratasys LTD Precision Prototyping
Objet Studio Stratasys LTD Used by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 10010031 2.5 L of 10% PBS 
S&T Forceps Fine Science Tools 00108-11 Used by authors
Scalpel Blade - #11 Fine Science Tools 10011-00 Used by authors
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools 10003-12 Used by authors
SkyScan 1272 Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
Skyscan CT-Vox Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SkyScan NRecon Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SolidWorks CAD Dassault Systèmes SolidWorks Research Subsription Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue Loctite 234790 As suggested in protocol
Testing bath Custom made Used by authors
Thin film grips  Custom made Used by authors
VeroWhitePlus Stratasys LTD NA 3D printing material used by authors
WinTest  WinTest Software Used by authors to collect data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioingeniería Número 152 Impresión 3D fabricación aditiva tendón tendones murinos entesis biomecánica
Pruebas biomecánicas de tendones murinos
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Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham,… More

Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. J. Vis. Exp. (152), e60280, doi:10.3791/60280 (2019).

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