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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Biomechanische Prüfung von Murine tendons

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60280
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Department of Orthopedic Surgery, Columbia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

Summary

Das Protokoll beschreibt effiziente und reproduzierbare zahnfeste biomechanische Prüfverfahren für murine Sehnen durch die Verwendung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Vorrichtungen.

Abstract

Sehnenerkrankungen sind häufig, betreffen Menschen jeden Alters und sind oft schwächend. Standardbehandlungen, wie entzündungshemmende Medikamente, Rehabilitation und chirurgische Reparatur, scheitern oft. Um die Sehnenfunktion zu definieren und die Wirksamkeit neuer Behandlungen nachzuweisen, müssen die mechanischen Eigenschaften von Sehnen aus Tiermodellen genau bestimmt werden. Murine Tiermodelle sind heute weit verbreitet, um Sehnenerkrankungen zu studieren und neuartige Behandlungen für Tendinopathien zu bewerten; Die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften von Maussehnen war jedoch eine Herausforderung. In dieser Studie wurde ein neues System für die mechanische Nehneprüfung entwickelt, das 3D-gedruckte Vorrichtungen enthält, die genau mit den Anatomien des Humerus und calcaneus übereinstimmen, um supraspinatus Sehnen bzw. Achillessehnen mechanisch zu testen. Diese Vorrichtungen wurden mit 3D-Rekonstruktionen der nativen Knochenanatomie, Feststoffmodellierung und additiver Fertigung entwickelt. Der neue Ansatz eliminierte artefaktische Greiffehler (z. B. Versagen am Ausfall der Wachstumsplatte anstelle der Sehne), verringerte die Gesamttestzeit und erhöhte Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ist diese neue Methode leicht anpassbar, um andere murine Sehnen und Sehnen von anderen Tieren zu testen.

Introduction

Sehnenerkrankungen sind häufig und weit verbreitet unter den alternden, athletischen und aktiven Populationen1,2,3. In den Vereinigten Staaten werden jährlich 16,4 Millionen Bindegewebsverletzungen gemeldet4 und machen 30 % aller verletzungsbedingten Arztbesuche3,5,6,7, 8. Die am häufigsten betroffenen Stellen sind die Rotatormanschette, Achillessehne und Patellasehne9. Obwohl eine Vielzahl von nicht-operativen und operativen Behandlungen erforscht wurden, einschließlich entzündungshemmender Medikamente, Rehabilitation und chirurgische Reparatur, die Ergebnisse bleiben schlecht, mit begrenzter Rückkehr zur Funktion und hohe Ausfallraten5, 6. Diese schlechten klinischen Ergebnisse haben grundlegende und translationale Studien motiviert, die darauf abzielen, die Teninopathie zu verstehen und neue Behandlungsansätze zu entwickeln.

Zug-biomechanische Eigenschaften sind die primären quantitativen Ergebnisse, die die Sehnenfunktion definieren. Daher muss die Laborcharakterisierung der Tendinopathie und die Wirksamkeit der Behandlung eine strenge Prüfung der Sehnenzugeigenschaften umfassen. Zahlreiche Studien haben Methoden beschrieben, um die biomechanischen Eigenschaften von Sehnen von Tiermodellen wie Ratten, Schafe, Hunde und Kaninchen10,11,12zu bestimmen. Jedoch, wenige Studien haben die biomechanischen Eigenschaften der murinen Sehnen getestet, vor allem aufgrund der Schwierigkeiten beim Greifen der kleinen Gewebe für Zugtests. Da murine Modelle zahlreiche Vorteile für die mechanistische Untersuchung der Tendinopathie haben, einschließlich genetischer Manipulation, umfangreiche Reagenzoptionen und kostengünstiger Kosten, ist die Entwicklung präziser und effizienter Methoden zur biomechanischen Prüfung von murinen Geweben erforderlich.

Um die mechanischen Eigenschaften von Sehnen richtig zu testen, muss das Gewebe effektiv gegriffen werden, ohne zu rutschen oder Artefakt an der Griffschnittstelle zu reißen oder die Wachstumsplatte zu zerbrechen. In vielen Fällen, insbesondere bei kurzen Sehnen, wird der Knochen an einem Ende und die Sehne am anderen Ende gegriffen. Knochen werden in der Regel durch Einbettung in Materialien wie Epoxidharz13 und Polymethylmethacrylat14,15gesichert. Sehnen werden oft zwischen zwei Schichten Schleifpapier platziert, mit Cyanoacrylat geklebt und mit Kompressionsklemmen gesichert (wenn der Querschnitt flach ist) oder in einem gefrorenen Medium (wenn der Querschnitt groß ist)15,16,17 . Diese Methoden wurden auf biomechanisch getestetmurine Sehnen angewendet, aber Herausforderungen entstehen aufgrund der geringen Größe der Proben und der Übereinstimmung der Wachstumsplatte, die nie ossifies18. Zum Beispiel beträgt der Durchmesser des murinen Humeralkopfes nur wenige Millimeter, was das Greifen des Knochens erschwert. Insbesondere führt die Zugprüfung von murinen supraspinatus Sehnen-Knochen-Proben oft zu einem Versagen an der Wachstumsplatte und nicht an der Sehne oder an der Sehnenenenthese. Ebenso ist die biomechanische Prüfung der Achillessehne eine Herausforderung. Obwohl die Achillessehne größer ist als andere murine Sehnen, ist der Calcaneus klein, was das Greifen dieses Knochens erschwert. Der Knochen kann entfernt werden, gefolgt von Greifer der beiden Sehnenenden; Dies schließt jedoch die Prüfung der Sehnen-Knochen-Befestigung aus. Andere Gruppen berichten, dass der Kalkknochen mit maßgefertigten Vorrichtungen19,20, Verankerung durch Klemmen21, Fixierung in selbsthärtenden Kunststoffzement22 oder mit einem konischen Formschlitz22, aber diese Frühere Methoden bleiben durch geringe Reproduzierbarkeit, hohe Greiffehlerraten und mühsame Vorbereitungsanforderungen begrenzt.

Ziel der aktuellen Studie war es, eine genaue und effiziente Methode zur zugfesten biomechanischen Prüfung von murinen Sehnen zu entwickeln, wobei der Schwerpunkt auf den Supraspinatus- und Achillessehnen als Beispiel lag. Mit einer Kombination aus 3D-Rekonstruktionen aus nativer Knochenanatomie, Solid-Modellierung und additiver Fertigung wurde eine neuartige Methode entwickelt, um die Knochen zu greifen. Diese Vorrichtungen sicherten effektiv die Knochen, verhinderten Wachstumsplattenversagen, verkürzten die Probenvorbereitungszeit und erhöhten die Reproduzierbarkeit der Tests. Die neue Methode ist leicht anpassbar, um andere murine Sehnen sowie Sehnen bei Ratten und anderen Tieren zu testen.

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Protocol

Tierstudien wurden vom Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, hatten einen C57BL/6J-Hintergrund und wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) gekauft. Sie wurden unter pathogenfreien Barrierebedingungen untergebracht und mit Nahrung und Wasser ad libitum versorgt.

1. Entwicklung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Vorrichtungen zum Greifen von Knochen

  1. Knochenbildaufnahme und 3D-Knochenmodellbau
    1. Sezieren Sie den Knochen von Interesse in Vorbereitung für 3D-Modellerstellung und 3D-Knochen-Griff-Druck; Humerus und Calcaneus werden als Beispiele im aktuellen Protokoll verwendet.
      HINWEIS: Detaillierte Anweisungen zur Sezieren von Knochen-Tendon-Muskelproben für mechanische Tests sind in Schritt 2.1.1 vorgesehen. Die folgenden Schritte sollten befolgt werden, um Knochen zu isolieren, um 3D-gedruckte Knochengriffe zu erstellen.
      1. Zerlegung des Humerus: Euthanisieren Sie eine Maus nach IACUC-zugelassenem Verfahren. Entfernen Sie die Haut der oberen Extremität, entfernen Sie alle Muskeln über dem Humerus, disartikulieren Sie den Ellenbogen und die Glenohumeralgelenke und entfernen Sie sorgfältig alle am Humerus befestigten Bindegewebe.
      2. Zerlegung des Calcaneus: Euthanisieren sie eine Maus nach IACUC-zugelassenem Verfahren. Entfernen Sie die Haut der unteren Extremität, entfernen Sie das Achillessehnen-Calcaneus-Gelenk und die Gelenke zwischen Calcaneus und anderen Fußknochen und entfernen Sie sorgfältig alle Amkandgewebe, die am Calcaneus befestigt sind.
    2. Führen Sie einen mikroberechneten Tomographie-Scan des gesamten Knochens durch, z. B. scannen Sie die Humerus- und Calcaneus-Proben.
      HINWEIS: Je nach verwendetem Scanner sind die Einstellungen unterschiedlich. Für den in der aktuellen Studie verwendeten Scanner (Materialtabelle) sind die empfohlenen Einstellungen: Scan bei einer Energie von 55 kVP, Al 0,25 Filter, mit einer Auflösung von 6 m.
      1. Agarosepulver in Reinstwasser und Mikrowelle 1-3 min mischen, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Es ist hilfreich, Mikrowelle für 30-45 s, anhalten und wirbeln, und dann weiter in Richtung eines Kochens. Füllen Sie Kryoröhren bis zu drei Viertel voll mit Agarose. Lassen Sie die Agarose ca. 5-10 min abkühlen.
      2. Fügen Sie Knochen in das Agarose-Gel ein (dies verhindert Bewegungsartefakte während des Scannens). Legen Sie ein Kryotube mit Knochen in den Scanner ein.
        HINWEIS: Für den in der aktuellen Studie verwendeten Scanner wurde für alle Scans ein automatischer 16-Positionen-Probenwechsler verwendet. Dieser Scanner kann die Vergrößerung automatisch entsprechend der Größe und Form einer Stichprobe auswählen.
    3. Rekonstruieren Sie mikrocomputerische Tomographie-Scan-Projektionsbilder in Querschnittsbilder. Verwenden Sie empfohlene Parameter für die Scanner-Software-Kombination des Experimentierers.
      HINWEIS: Für das in der aktuellen Studie verwendete Programm (Materialtabelle) wird empfohlen, die folgenden Rekonstruktionsparameter zu verwenden: Glättung: 0-2, Strahlhärtekorrektur: 45, Ring artefaktreduktion: 4-9 und Scheiben in 16-Bit TIFF zu rekonstruieren format.
    4. Erstellen Sie ein 3D-Modell und speichern Sie es in einem Standard-STL-Format, das mit den meisten 3D-Druckern und Rapid Prototyping kompatibel ist. Führen Sie für das in der aktuellen Studie verwendete Programm (Tabelle der Materialien)folgendes aus:
      1. Wählen Sie den Befehl Datei > Öffnen, um das Datei-Dataset zu öffnen. Öffnen Sie das Dialogfeld Datei > Einstellungen, und wählen Sie die Registerkarte Erweitert aus.
      2. Verwenden Sie den adaptiven Renderingalgorithmus, um die 3D-Modelle zu erstellen. Dieser Algorithmus minimiert die Anzahl der Facettendreiecke und sorgt für glattere Oberflächendetails. Verwenden Sie 10 als Lokalitätsparameter; Dieser Parameter definiert den Abstand in Pixel nxen zum benachbarten Punkt, der zum Suchen des Objektrahmens verwendet wird. Minimieren Sie die Toleranz auf 0,1, um die Dateigröße zu verringern.
        HINWEIS: Nach dem Öffnen des Datasets werden die Bilder auf der Seite "Rohbilder" angezeigt.
      3. Um das Volumen von Interesse (VOI) anzugeben, wählen Sie manuell zwei Bilder aus, die als Ober- und Unterseite des ausgewählten VOI-Bereichs festgelegt werden sollen.
      4. Wechseln zur zweiten Seite, Region of Interest. Wählen Sie den Interessenbereich manuell auf einem einzelnen Querschnittsbild aus.
        HINWEIS: Der ausgewählte Bereich wird rot hervorgehoben (d. h. der Humerusquerschnitt).
      5. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt alle 10–15 Querschnittsbilder.
      6. Wechseln Zur dritten Seite Binäre Auswahl. Klicken Sie im Histogrammmenü auf Von Dataset. Die Histogrammverteilung der Helligkeit aus allen Bildern des Datasets wird angezeigt. Klicken Sie auch im Histogrammmenü auf das Menü 3D-Modelldatei erstellen.
    5. Speichern Sie ein 3D-Modell des Bones im STL-Dateiformat.
    6. Verfeinern Sie das Netz: Bearbeiten Sie das Netz, um die Größe der STL-Datei zu reduzieren und sie mit jedem computergestützten Designprogramm kompatibel zu machen. Führen Sie für das in der aktuellen Studie verwendete Programm (Tabelle der Materialien) die folgenden Schritte aus:
      1. Importieren Sie das Netz, und wählen Sie alle zum Bearbeiten aus. Wählen Sie Aus dem Toolset Bearbeitenreduzieren aus. Wählen Sie dann Triangle Budget aus dem Toolset Ziel reduzieren aus. Reduzieren Sie die Tri-Anzahl und akzeptieren Sie Änderungen. Speichern Sie die neu reduzierte Datei im STL-Format, indem Sie Exportieren als...
  2. Design von kundenspezifischen Knochenbefestigungen
    1. Supraspinatus Sehnen-Humeralknochen
      1. Verwenden Sie ein solides Modellierungsprogramm mit computergestütztem Design, um ein maßgeschneidertes Modell für Humerusgreifvorrichtungen zu erstellen(Abbildung 1, Ergänzende Dateien).
        HINWEIS: Das in der aktuellen Studie verwendete Programm ist in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
      2. Öffnen Sie die STL-Formatdatei des Humerusknochens in einem soliden Modellierungsprogramm, und speichern Sie sie als Teiledatei.
        HINWEIS: Für die in der aktuellen Studie verwendete Software (Materialtabelle) wurde das 3D-Knochenobjekt im SLDPRT-Format gespeichert.
      3. Öffnen Sie die Bauteildatei, und erstellen Sie manuell drei anatomisch relevante Ebenen (d. h. sagittal, koronal, quer).
        1. Definieren Sie manuell die sagittale Ebene, um die supraspinatus Sehnenbefestigung bei der größeren Tuberosität zu durchschneiden. Stellen Sie sicher, dass der 3D-Block die sagittale Ebene als Symmetrieebene enthält. Um dies zu erreichen, fügen Sie bei Bedarf Material aus dem Block hinzu oder schneiden Sie es aus.
          HINWEIS: Diese Symmetrieebene stellt sicher, dass sich beim Einsetzen der Probe in die Vorrichtungen die Sehnen- und Sehnenbefestigung in der Mittelachse der Vorrichtung befindet.
      4. Messen Sie die Abmessungen des Knochens entlang jeder der drei Ebenen (z. B. Höhe, Breite, Länge).
      5. Messen Sie die Abmessungen der mechanischen Prüfgriffe, an denen die 3D-gedruckte Vorrichtung befestigt wird.
      6. Beginnen Sie mit dem Entwerfen eines festen Blockteils (z. B. eines Volumenzylinders).
        1. Stellen Sie sicher, dass jede Dimension des Blocks mindestens 5 mm größer ist als die Abmessungen des Humerus.
        2. Berücksichtigen Sie Konstruktionseinschränkungen aus mechanischen Prüfgriffen (d.h. stellen Sie sicher, dass die 3D-gedruckte Vorrichtung in den mechanischen Prüfgriffen frei montiert und demontiert werden kann).
      7. Erstellen Sie ein Baugruppenmodell mit zwei Komponenten: dem Volumenkörperblock und dem rechten oder linken Humerusknochen. Definieren Sie die Ausrichtung des Knochens innerhalb des Blocks (d. h. den Winkel zwischen Sehne und Knochen). Stellen Sie sicher, dass das gesamte Knochenvolumen in den Block passt.
      8. Erstellen Sie einen Hohlraum im Block mit dem Humerusknochen als Schimmel. Wenn Sie die in der Tabelle der Materialienangegebene Software verwenden, führen Sie die folgenden Schritte aus:
        1. Legen Sie das Konstruktionsteil (Humerus) und den Formboden (Zylinderblock) in eine Zwischenbaugruppe ein. Wählen Sie im Baugruppenfenster den Block aus, und klicken Sie auf der Symbolleiste Baugruppe auf Komponente bearbeiten.
        2. Klicken Sie auf Einfügen > Features > Kavität. Wählen Sie Uniform Scaling aus, und geben Sie 0 % als Wert ein, der in alle Richtungen skaliert werden soll.
      9. Unterdrücken Sie das Bone-Teil, und speichern Sie die Baugruppe als Teil.
      10. Offener Teil (Zylinder mit Hohlraum). Schneiden Sie das Teil entlang der sagittalen Ebene, um zwei symmetrische Komponenten zu erstellen, die anterior und nachträbig in den Knochen passen (z. B. zwei halbe Zylinder, wie in Abbildung 1dargestellt).
        HINWEIS: Zwei Komponenten sind so konzipiert, dass sie anterior und nachträbe in den Knochen passen. Die vordere Komponente enthält einen halb kugelförmigen Hohlraum, der von der vorderen Seite des Humeralkopfes bis zur supraspinatus Sehnenbefestigung verlängert wird. Die hintere Komponente Hohlraum ist wie der hintere Teil des Humerus geformt (d. h. hintere Seite des Humeralkopfes, Delta-Tuberosität, und mediale und laterale Epicondyle).
      11. Speichern Sie jede Komponente als separates Dateiteil.
      12. Stellen Sie für die vordere Komponente sicher, dass der Humeralkopf in den Hohlraum des Teils eingebettet ist, indem Sie geeignete Toleranzen definieren.
        ANMERKUNG: In der aktuellen Studie wird vorgeschlagen, die folgenden Schritte auszuführen:
        1. Erstellen Sie einen gedrehten Schnitt, um die Netzgeometrie des Hohlraums zu glätten. Erstellen Sie eine Skizze für den Schnitt, indem Sie die Hohlraumgeometrie emulieren und einen Positionsabstand hinzufügen.
          HINWEIS: Der Abstand ermöglicht eine freie Montage und Demontage zwischen dem Knochen und der vorderen Komponente.
      13. Ändern Sie die hintere Komponente, um die Hohlraumgeometrie zu imitieren, um einen Schnitt zu erstellen, der frei wird, wie oben für die vordere Komponente beschrieben.
      14. Machen Sie einen Schnitt in der Querebene von der Oberseite der hinteren Komponente bis zum Kamm des größeren/kleineren Tuberkels.
        HINWEIS: Wie in Abbildung 1 und Abbildung 2zu sehen, enthält die hintere Komponente einen Schnitt, der eine Öffnung am Sehnenaufsatz erzeugt.
      15. Erstellen Sie eine enge Passform zwischen den beiden Komponenten, um eine freie Montage und Demontage zu ermöglichen.
        HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde für die Vorrichtungen eine Lochwellenpassung mit einem lockeren Laufabstand erstellt.
      16. Erstellen Sie 3D-Spiegelmodelle für jede Komponente der Halterung für die gegenüberliegende Extremität (d. h. links oder rechts).
      17. Fügen Sie eine Ätze auf der Unterseite der Vorrichtungen hinzu, um zwischen der linken und rechten Seite zu unterscheiden.
      18. Speichern Sie alle Befestigungsteile im STL-Standarddateiformat zur Vorbereitung auf den 3D-Druck.
    2. Achillessehnen-Calcaneus-Knochen
      1. Befolgen Sie die oben beschriebenen Schritte für supraspinatus-humerale Kopfbefestigung.
        HINWEIS: Für die Achilleskalkung ist nur ein Satz von Vorrichtungen erforderlich, da die Anatomie der linken und rechten Calcaneus-Knochen nahezu symmetrisch ist.

2. Biomechanische Prüfung von murinen Sehnen

  1. Probenvorbereitung und Querschnittsflächenmessung
    1. Sezieren Sie den Muskel-Tendon-Knochen von Interesse in vorbereitung für Zugmechanische Tests. In der aktuellen Studie wurden supraspinatus muscle - tendon - humerus bone specimens (N=10, 5 male, 5 female) und gastrocnemius muscle - Achilles sehnenkalcaneus Knochenproben (N=12, 6 männlich, 6 weiblich) von 8 Wochen alten C57BL/6J Mäusen isoliert.
      1. Zerlegung des supraspinatus Muskels - Sehne - HumerusKnochen Probe
        1. Euthanisieren Sie eine Maus pro IACUC-zugelassenem Verfahren. Positionieren Sie die Maus in einer anfälligen Position. Machen Sie einen Schnitt in der Haut von oberhalb des Ellenbogens der Vorderpfote in Richtung Schulter.
        2. Entfernen Sie vorsichtig die Haut mit stumpfer Sezierung, so dass die Muskulatur der Schulter sichtbar ist. Entfernen Sie das Gewebe, das den Humerus umgibt, bis der Knochen freigelegt ist und mit Zangen sicher gehalten werden kann.
        3. Halten Sie den Humerus mit Derpalle und entfernen Sie vorsichtig die Deltoid- und Trapezmuskeln, um den korakokomromialen Bogen freizulegen. Identifizieren Sie das akromioklavikuläre Gelenk und trennen Sie das Schlüsselbein vorsichtig mit einer Skalpellklinge vom Akromion.
        4. Achten Sie darauf, die supraspinatus Sehne und ihre knöcherne Befestigung nicht zu beschädigen, entfernen Sie den Muskel aus seiner skapitulären Befestigung mit einem Skalpellklinge. Achten Sie darauf, die supraspinatus Sehne und ihre knöcherne Befestigung nicht zu beschädigen, lösen Sie den Humeralkopf vom Glenoid; mit einer Skalpellklinge die Gelenkkapsel und den Infraspinatus, subscapularis und teres kleinere Sehnen schnüren.
        5. Disarticulate das Ellenbogengelenk, um den Humerus von der Ulna und Radius zu trennen. Isolieren Sie den Humerus - supraspinatus Sehne - Muskelprobe und reinigen Sie überschüssige Sweichgewebe auf dem Humerus und Humeralkopf.
      2. Zerlegung der Achillessehne - Calcaneus Knochenprobe
        1. Euthanisieren Sie eine Maus pro IACUC-zugelassenem Verfahren. Positionieren Sie die Maus in einer anfälligen Position. Achten Sie darauf, die Achillessehne und ihre knöcherne Anhaftung nicht zu beschädigen, entfernen Sie die Haut mit stumpfer Sektion, so dass die Muskulatur um die Knöchel- und Kniegelenke freigelegt wird.
        2. Mit einem Skalpellklinge, beginnend an der Achillessehne - Calcaneus-Anhaftung, lösen Sie den Magen-Darm-Muskel vorsichtig von seinen proximalen Anhaftungen.
        3. Die Calcaneus werden vorsichtig von den verschiedenen angrenzenden Knochen entfernt. Isolieren Sie die Achillessehne - Calcaneus Probe und reinigen Sie überschüssiges Weichgewebe.
    2. Bestimmen Sie den Querschnittsbereich der Sehne mittels Mikrotomographie.
      HINWEIS: Für den scanner, der in der aktuellen Studie (Tabelle der Materialien) verwendet wird, sind die empfohlenen Einstellungen: Scan bei einer Energie von 55 kVP, Al 0.25 Filter, mit einer Auflösung von 5 'm.
      1. Agarosepulver in Reinstwasser und Mikrowelle 1-3 min mischen, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Es ist hilfreich, Mikrowelle für 30-45 s, anhalten und wirbeln, und dann weiter in Richtung eines Kochens. Füllen Sie Kryoröhren bis zu drei Viertel voll mit Agarose. Lassen Sie die Agarose ca. 5-10 min abkühlen.
      2. Setzen Sie die Probe im Kryotube auf, indem Sie den Knochen auf den Kopf stellen.
        HINWEIS: Nur der Knochen sollte sich im Agarose-Gel begeben. Die Sehne und der Muskel sollten außen suspendiert werden.
    3. Nach dem Scan, entfernen Sie vorsichtig Muskel von der Sehne mit Skalpellklinge. Setzen Sie die Probe in die 3D-gedruckte Leuchte ein.
      HINWEIS: Die Griffe sind für jeden Test wiederverwendbar. Verwenden Sie keinen Kleber oder Epoxid in der Vorrichtung; der Knochen wird in einer Presseform gehalten.
    4. Setzen und kleben Sie die Sehne zwischen einem gefalteten dünnen Tissuepapier (2 cm x 1 cm) und klemmen Sie das Konstrukt mit dünnen Foliengriffen. Befestigen Sie die 3D-gedruckte Halterung mit dem Muster in die Prüfgriffe.
    5. Setzen Sie die Probe und die Griffe in ein Prüfbad mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) bei 37 °C (d. h. Mauskörpertemperatur23) ein.
  2. Zugprüfung
    1. Führen Sie eine zugmechanische Prüfung an einem Materialprüfrahmen durch.
      ANMERKUNG: Für den in der aktuellen Studie verwendeten Testrahmen (Tabelle der Werkstoffe) ist das empfohlene Protokoll:
      1. Definieren Sie die Spurweite als Abstand von der Sehnenbefestigung zum oberen Griff.
      2. Voraussetzung mit 5 Zyklen zwischen 0,05 N und 0,2 N.
      3. Halten Sie für 120 s.
      4. Verwenden Sie eine Spannung bis zum Ausfall von 0,2%/s.
    2. Sammeln Sie Lastverformungsdaten.
    3. Berechnen Sie die Dehnung als Verschiebung relativ zur Anfangsspurlänge der Sehne.
    4. Berechnen Sie die Spannung als Kraft geteilt durch den anfänglichen Sehnenquerschnitt (gemessen von microCT).
    5. Wenn Sie an viskoelastischem Verhalten interessiert sind, führen Sie eine Spannungsentspannung vor dem Spannungstest durch, um einen Fehler zu verursachen, und verwenden Sie die Daten, um Parameter wie A, B, C, Tau1 und tau2 aus dem quasilinearen viskoelastischen Modell24zu berechnen.
    6. Berechnen Sie aus der Lastverformungskurve die Steifigkeit (Neigung des linearen Teils der Kurve), die maximale Kraft und die zu erlegende Arbeit (die Fläche unter der Kurve bis zur Streckgrenze).
      1. Identifizieren Sie den linearen Teil, indem Sie ein Fenster mit Punkten in der Last-Verformungskurve auswählen, das denR2-Wert für eine lineare Regression mit den kleinsten Quadraten25maximiert.
      2. Bestimmen Sie die Steifigkeit als Steigung des linearen Teils der Lastverschiebungskurve25,26.
    7. Berechnen Sie aus der Spannungsdehnungskurve den Modul (Neigung des linearen Teils der Kurve), die Festigkeit (maximale Spannung) und die Widerstandsfähigkeit (Bereich unter der Kurve bis zur Streckgrenze).
      ANMERKUNG: Mit dem RANSAC-Algorithmus wird der Ertragsstamm (x-Wert) als erster Punkt definiert, an dem die y-Anpassung mehr als 0,5 % des erwarteten Spannungswerts (y-Wert) abgewichen ist. Die Ertragsspannung ist der entsprechende y-Wert der Ertragsspannung.
      HINWEIS: Zusätzlich zu der in der aktuellen Studie beschriebenen monotonen Zugbelastung bis zum Ausfall kann die zyklische Belastung wichtige Informationen über Sehnenermüdung und/oder viskoelastische Eigenschaften liefern. Zum Beispiel berichteten Freedman et al. Über Ermüdungserscheinungen der murinen Achillessehnen27.
    8. Führen Sie nach Abschluss der Zugprüfung einen mikroberechneten Tomographie-Scan des gesamten Knochens durch, z. B. scannen Sie die Humerus- und Calcaneus-Proben.
      HINWEIS: Für den scanner, der in der aktuellen Studie (Tabelle der Materialien) verwendet wird, sind die empfohlenen Einstellungen: Scan bei einer Energie von 55 kVP, Al 0.25 Filter, mit einer Auflösung von 6 'm.
      1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2.1–1.1.2.2.
    9. Wiederholen Sie Schritt 1.1.3.
    10. Verwenden Sie ein 3D-Visualisierungsprogramm, das mit dem Scanner kompatibel ist, um ein volumengerendertes 3D-Modell des gescannten Objekts zu erstellen.
      HINWEIS: Das in der aktuellen Studie verwendete Programm ist in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
    11. Bestimmen Sie den Fehlermodus und den Fehlerstellenbereich, indem Sie das 3D-Objekt überprüfen.
  3. Statistische Auswertung: Zeigen Sie alle Stichprobenergebnisse als Mittelwert an, Standardabweichung (SD). Vergleichen Sie Gruppen mit T-Tests von Schülern (zweischwänzige und ungepaarte). Signifikanz als p < 0,05 festlegen.
    HINWEIS: Die in der aktuellen Studie verwendete statistische Software ist in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

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Representative Results

3D-gedruckte Vorrichtungen wurden verwendet, um 8 Wochen alte murine supraspinatus und Achillessehnen zu testen. Alle mechanisch getesteten Proben scheiterten an der Enthese, die durch MikroCT-Scans, visuelle Inspektion und Videoanalyse nach Zugversuchen gekennzeichnet ist. Abbildung 3zeigt einen 1:1-Vergleich der bisherigen und aktuellen Methoden zur supraspinatus-Sehnenprüfung in unserem Labor . Bei der vorherigen Methode28,29,30wurde der Humerusknochen in Epoxid eingebettet und eine Büroklammer über den Humeralkopf gelegt, um eine Wachstumsplattenfraktur zu verhindern. 4-6 Stunden waren notwendig, damit das Epoxid vollständig aushärten konnte (Abbildung 3), so dass nur 6-8 Proben an einem typischen Tag getestet werden konnten. Eine weitere Einschränkung des Ansatzes war die benutzerabhängige Wirksamkeit der Büroklammerplatzierung zur Verhinderung von Wachstumsplattenfrakturen. Die Testergebnisse mit diesen früheren Methoden waren sehr variabel, mit Variationskoeffizienten in der Größenordnung von 30% für die meisten Parameter und Wachstumsraten von etwa 10% bis 20%. Wie in Abbildung 3zusammengefasst, wurde die Probenvorbereitungszeit mit den neuen Methoden auf 5–10 Minuten verkürzt, so dass es praktisch ist, 16 bis 20 Proben pro Tag zu testen. Darüber hinaus wurden Ausfällen von Wachstumsplatten eliminiert.

Im Vergleich zu Dermethodik, die von anderen für die Prüfung von murinen Sehnen14,15,17,25,28,29,30,31 berichtet wird ,32,33, die neuen Methoden waren effizienter und reproduzierbarer. Bei supraspinatus Sehnen, strukturellen Eigenschaften wie maximaler Last (3,8 x 0,6 N) und Steifigkeit (12,7 x 1,8 N/mm) sowie normalisierte Materialeigenschaften wie maximale Spannung (8,7 x 3,0 MPa) und Modul (51,7 x 13,5 MPa) hatten deutlich niedrigere Koeffizienten von Abweichungen gegenüber den Ergebnissen der Literatur (Tabelle 1). Bei der Achillessehne wiesen mechanische Eigenschaften wie maximale Belastung (7,8 x 1,1 N) und Steifigkeit (13,2 x 1,9 N/mm) niedrigere Variationskoeffizienten auf als die Ergebnisse aus der Literatur19,21,22 ,32,33,34,35,36,37,38, während maximale Spannung (24,2 x 5,4 MPa) und Modul (73,2 x 22.1 MPa) hatten ähnliche Variationskoeffizienten wie in der Literatur (Tabelle 2).

Tiersex hatte einen signifikanten Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften der Supraspinatus- und Achillessehnen (Abbildung 4). Beim Vergleich der männlichen und weiblichen Supraspinatussehnen ergaben sich signifikante Erhöhungen der maximalen Kraft(p = 0,002) und der Ausbeute (p = 0,008). Zwischen den beiden Gruppen gab es Trends für Steifigkeit (p = 0,057), Spannung (p = 0,068), Modul (p = 0,061) und Belastbarkeit (p = 0,078). Beim Vergleich der männlichen und weiblichen Achillessehne kam es zu signifikanten Zunahmen der maximalen Belastung(p = 0,0006) und der Belastbarkeit(p = 0,0019). Es gab Trends zwischen den beiden Gruppen für die Arbeit zu ertrag (p = 0,079), und Modulus (p = 0,074) und keine Differenz für maximale Kraft (p = 0,1880) und Steifigkeit (p = 0,6759).

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative 3D-Modelle von Vorrichtungen für den Humerus (obere Reihe) und den Calcaneus (untere Reihe). (A) 3D-Modelle der Knochen. (B) Zerlegte Modelle der Leuchten. (C) Montierte Modelle der Leuchten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative 3D-gedruckte Leuchten. (A) Vorrichtung zur biomechanischen Prüfung von supraspinatus Sehnen von 8 Wochen alten Mäusen in einem Winkel von 180° zwischen Humerus und Supraspinatussehne. (B) Vorrichtung zur biomechanischen Prüfung von supraspinatus Sehnen von 8 Wochen alten Mäusen in einem Winkel von 135° zwischen Humerus und Supraspinatussehne. (C) Vorrichtung zur biomechanischen Prüfung von murinen Achillessehnen in einem Winkel von 120° zwischen Calcaneus und Achillessehne. (D) Vorrichtung zur biomechanischen Prüfung von supraspinatus Sehnen von erwachsenen Sprague Dawley Ratten in einem Winkel von 180° zwischen Humerus und supraspinatus Sehne. Maßstabsleiste: 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Vergleich früherer und aktueller Methoden zur mechanischen Prüfung von murinen Supraspinatussehnen. (A) Frühere Probenvorbereitungsverfahren, die in unserem Labor vor der mechanischen Prüfung verwendet wurden: Der Humerus wurde in Epoxid bis zum Humeralkopf vergossen, um den Knochen zu stabilisieren, eine Büroklammer wurde über den Humeralkopf gelegt, um Wachstumsplattenbrüche zu verhindern, und für die Aushärtung des Epoxids wurden die Proben 4-6 Stunden vor der mechanischen Prüfung in Raumtemperatur gelassen. (B) In der aktuellen Studie verwendete Probenvorbereitungsmethoden (Schritte 1.2 und 2.1.4): Oben links zeigt eine 3D-Darstellung der Vorrichtungen, wie sie von einem soliden Modellierungsprogramm erzeugt werden. Die 3D-gedruckten Vorrichtungen sind wiederverwendbar und lassen sich einfach montieren und demontieren. Das Knochenende der Probe wird in die Vorrichtungen eingeführt, um die Wachstumsplatte zu sichern und die Sehne zum Greifen und Testen freizulegen. Das Sehnenende wird zwischen einem gefalteten dünnen Gewebepapier geklebt und in die Griffe eingeführt. Die Vorbereitungszeit für jedes Exemplar beträgt 10–15 Minuten. (C) Repräsentative Lastverformungskurven für Zugversuche von Supraspinatussehnen mit aktuellen Methoden. (D) Repräsentative Lastverformungskurve für Zugversuche an supraspinatus Sehne, die einen Wachstumsplattenfehler aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Geschlechtseffekt auf die mechanischen Eigenschaften von Supraspinatus (SST) und Achilles (ACHT) Sehnen. Es gab eine signifikante Wirkung des Geschlechts auf viele der mechanischen Eigenschaften basierend auf ungepaarten T-Tests (*Sex-Effekt, p < 0,05). Die als Mittelwert dargestellten Daten - Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Querschnittsflächenmessung von microCT. (A) Minimale Querschnittsflächenmessung entlang der Länge der Supraspinatussehne. (B) Minimale Querschnittsflächenmessung entlang der Länge der Achillessehne. Für die Messung sollte nur die eigentliche Sehne ausgewählt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Strukturelle Eigenschaften Materialeigenschaften
Tiere Max. Kraft (N) Steifigkeit (N/mm) Max Stress (Mpa) Modul (MPa)
autor N hintergrund Mittelwert bei SD COV(%) Mittelwert bei SD COV (%) Mittelwert bei SD COV (%) Mittelwert bei SD COV (%)
Beason et al. Journal of Shoulder and Elbow Surgery (2013)15 10 C57Bl/6 0,93 bis 0,34 36.56 95,1 bis 39,8 € 41.85 3,40 bis 1,56 45.88 312,8 bis 127,0 40.60
Bell et al. Journal of Orthopaedic Research (2014)31 6 C57Bl/6 1,22 € 0,52 42.62 2,37 x 1,6 67.51 Nr Nr
Cong et al. Journal of Orthopaedic Research (2018)17 8 C57Bl/6 5,38 € 2,404 # 44.68 4,25 € 1,67 # 39.29 Nr Nr
Connizzo et al. Annals of Biomedical Engineering (2014)32 10 NR (db/+) Nr 84,44 bei 27,23 € 32.25 Nr 476 x 186,27* 39.13
Connizzo et al. Journal of Biomedical Engineering (2013)14 Nr C57/BL6 Nr Nr Nr 297 x 148,90* 50.13
Deymier et al. Acta Biomaterialia (2019)28 12 CD-1 IGS Maus (WT) 5,0 x 0,7 14 9,2 x 2,9 31.52 33 x 35 106.06 Nr
Eekhoff et al. Journal of Biomedical Engineering (2017)33 13 Eln +/+ Nr 8,50 x 2,95 34.71 5,96 € 3,23 54.19 101,2 x 50,8 50.20
Killian et al. FASEB Journal (2016)29 8 C57BL/6 Nr Nr 7,79 x 2,61* 33.50 58,32 bei 31,73* 54.41
Schwartz et al. Bone (2014)25 20 CD-1 IGS Maus (WT) 4,11 bis 0,79* 19.22 8,58 x 3,78* 44.06 12,29 x 5,95* 48.41 133,80 x 59,41* 44.40
Schwartz et al. Entwicklung (2015)30 12 (Rosa-DTA (DTA) x Gli1-CreERT2 ) ScxCre; Smofl/fl (WT) 4,16 bis 0,29* 6.97 11,04 x 1,98* 17.93 26,24 € 5,81 22.14 121,89 € 44,18 36.25
Durchschnittliche COV 27.34 Durchschnittliche COV 38.64 Durchschnittliche COV 51.70 Durchschnittliche COV 45.02
Neue Methode 10 C57BL/6J 3,79 € 0,62 16.41 12,73 € 1,81 14.20 8,71 € 3,04 34.91 51,67 € 13,54 26.20

Tabelle 1: Mechanische Eigenschaften von supraspinatus Sehnen. Mittelwert sD und Variationskoeffizient (COV) für strukturelle und materielle Eigenschaften, die mit neuen Methoden im Vergleich zu den in der Literatur beschriebenen Methoden geschätzt werden. [NR: nicht gemeldet, * geschätzt aus Abbildung(en), Standardabweichung berechnet aus gemeldetem Standardfehler, gemessene Verformung mit optischen Fleckenlinien].

Strukturelle Eigenschaften Materialeigenschaften
Tiere Max. Kraft (N) Steifigkeit (N/mm) Max Stress (Mpa) Young-Modul (MPa)
autor N hintergrund Mittelwert bei SD COV(%) Mittelwert bei SD COV (%) Mittelwert bei SD COV (%) Mittelwert bei SD COV (%)
Boivin et al. Muscles, Ligaments and Tendons Journal (2014)19 6 Nicht-diabetische Lean Control Mäuse 8,1 bis 0,6 7.41 3,9 x 0,7 17.95 Nr 16 x 3,7 23.13
Connizzo et al. Annals of Biomedical Engineering (2014)32 10 db/+ Nr 20,39 x 2,43* 11.92 Nr 152,94 x 44,12* 28.85
Eekhoff et al. Journal of Biomechanical Engineering (2017)33 8 Eln +/+ Nr 18,86 € 3,37 17.87 10,55 € 2,97 28.15 443,8 € 131,7 29.68
Mikic et al. Journal of Orthopaedic Research (2006)34 20 C57BL/6-J x 129SV/J Nr Nr 18 x 5 27.78 61 x 20 32.79
Probst et al. Journal of Investigative Surgery (2000)22 20 BALB/c 8,4 x 1,1 13.10 6,3 x 1,2 19.05 Nr Nr
Shu et al. Peer J (2018)21 9 C57BL/6 9,6 x 3,84 39.96 8,19 € 3,63 44.32 27,55 € 10,54 38.26 Nr
Sikes et al. Journal of Orthopaedic Research (2018)35 7 C57BL/6 Nr Nr 19,53 € 7,03 0.36 62,82 € 20,20 32.16
Wang et al. Journal of Orthopaedic Research (2006)36 9 A/J 8,4 x 1,2 14.29 12,2 € 2,8 22.95 78,2 € 8,6 11.00 713,9 € 203,7 28.53
Wang et al. Journal of Orthopaedic Research (2006)36 8 C57BL/6J 10,2 x 1,4 13.73 13,1 x 2,5 19.08 97,4 € 11,4 11.70 765,1 bis 179,6 23.47
Wang et al. Journal of Orthopaedic Research (2006)36 7 C3H/HeJ 12,5 x 1,7 13.60 14,1 x 3,2 22.70 97,5 € 10,9 11.18 708,6 bei 127,8 18.04
Wang et al. Journal of Orthopaedic Research (2011)37 7 C57BL/6 6,6 x 1,7 25.76 8,2 x 1,4 17.07 13,4 x 3,7 27.61 86,8 x 15,5 17.86
Zhang et al. Matrix Biologie (2016)38 Nr CD-1 und C57BL/6J 6,73 x 3,74* 55.57 12,03 € 3,34* 27.76 25,4 x 15,14* 59.61 632,31 bei 113,79* 18.00
Durchschnittliche COV 22.93 Durchschnittliche COV 22.07 Durchschnittliche COV 23.96 Durchschnittliche COV 25.25
Neue Methode 12 C57BL/6J 7,8 x 1,08 13.91 13,19 € 1,86 14.08 24,16 € 5,42 22.45 73,17 € 16,14 22.06

Tabelle 2: Mechanische Eigenschaften der Achillessehnen. Mittelwert für Die Struktur- und Materialeigenschaften, die mit neuen Methoden geschätzt werden, im Vergleich zu denen, die in der Literatur berichtet werden. [NR: nicht gemeldet, * geschätzt aus Abbildung(en), Standardabweichung berechnet aus gemeldetem Standardfehler].

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Discussion

Murine Tiermodelle werden häufig verwendet, um Sehnenstörungen zu studieren, aber die Charakterisierung ihrer mechanischen Eigenschaften ist eine Herausforderung und in der Literatur ungewöhnlich. Der Zweck dieses Protokolls ist es, eine zeiteffiziente und reproduzierbare Methode zur Zugprüfung von murinen Sehnen zu beschreiben. Die neuen Methoden reduzierten die Zeit, die zum Testen einer Probe erforderlich war, von Stunden auf Minuten und eliminierten ein wichtiges Greifartefakt, das in früheren Methoden ein häufiges Problem darstellte.

Mehrere in diesem Protokoll beschriebene Schritte sind entscheidend, um effektive Vorrichtungen zu produzieren, die murine Supraspinatus und Achillessehnen mechanisch testen. Zunächst ist Schritt 1.1.4 erforderlich, um ein 3D-Modell des gewünschten Knochens zu erstellen. Aufgrund der in der Regel hohen Auflösung, die für diesen Scan verwendet wird, ist die Dateigröße jedoch möglicherweise zu groß, um sie mit Solid-Modellierungsprogrammen zu verwenden. Die in diesem Protokoll verwendete Software hat die Größe der Datei (Schritt 1.1.6) und die beibehaltene Objektgeometrie erfolgreich reduziert, obwohl andere Softwares auch effektiv sein können, um dies zu erreichen. Zweitens hat jeder anatomische Standort spezifische Konstruktionskriterien, die für ein effektives Greifen zu berücksichtigen sind. Für die Konstruktion der supraspinatus Sehnenbefestigung ist es entscheidend: (i) den Humeralkopf zu sichern, um ein Versagen der Wachstumsplatte zu verhindern (Schritt 1.2.1.12), (ii) eine Clearance-Passform zu definieren, die das Ablösen des Humerusknochens aus der Form während der Prüfung vermeidet (Schritt 1.2.1.12.1) und (iii) den Humerusknochen zu einem 180°-Winkel mit der langen Sehne (Schritt 1.2.1.7) zu orientieren. Für das Achillessehnen-Befestigungsdesign ist es wichtig: (i) eine Freipassform zu definieren, die den kleinen Calcaneus-Knochen ohne Ausrutschen aus der Halterung während der Prüfung greift, und (ii) den Calcaneus-Knochen so auszurichten, dass er mit der langen Achse einen 120°-Winkel (30° Plantar-Flexion) bildet. der Sehne. Drittens ist eine genaue Messung der Sehnenquerschnittsfläche (Schritt 2.1.2) entscheidend, um die technische Belastung für die Bestimmung der Materialeigenschaften richtig zu berechnen. Zur Messung des Querschnittsbereichs der Supraspinatussehne empfehlen wir mikrorechnerische Tomographie-Scans der Knochen-Tendon-Muskel-Probe, die in einem Kryotube mit flachem Boden ausgesetzt ist, wobei der Knochen kopfüber in der Röhre mit Agarose gehalten wird. Nur der Humerusknochen sollte in das Agarose-Gel eingeführt werden, während der Humeralkopf mit der Sehne und dem Muskel in der Luft gescannt werden sollte. Da die supraspinatus-Sehne eine gespreizte Geometrie hat, während sie in den Knochen einfügt, besteht die konsequenteste Möglichkeit, die Querschnittsfläche zu messen, darin, die minimale Querschnittsfläche entlang der Länge der Sehne zu bestimmen. Ein ähnliches Verfahren sollte befolgt werden, um den Querschnittsbereich der Achillessehne zu messen. Für die Achillessehne zeigen hochauflösende Mikrocomputertomographie-Scans zwei unterschiedliche Gewebe: die eigentliche Sehne und die umgebende Hülle, die als hellerer Farbton erscheint. Um den minimalen Querschnittsbereich für die Achillessehne konsequent abzuschätzen, sollte nur die eigentliche Sehne für die Messung ausgewählt werden (Abbildung 5). Schließlich sind die Griffe wiederverwendbar, und kleine Abweichungen von Probe zu Probe haben keinen Einfluss auf ihre Wirksamkeit. Jeder Knochen sollte einmal gescannt werden (z. B. für die aktuelle Studie, linker Humerus, rechter Humerus und Calcaneus) und für jeden Knochen sollte ein 3D-Modell erstellt werden. Darüber hinaus ist bei gleichaltrigen Tieren die Knochengeometrie nahezu identisch, so dass für die Prüfung aller Proben die gleiche Vorrichtung verwendet werden kann. In diesem Manuskript wurden 3D-gedruckte Vorrichtungen speziell für 8 Wochen alte Mäuse (skelettreife erwachsene Mäuse) verwendet, um Sehnen zu testen. Es war nicht notwendig, getrennte männliche und weibliche Vorrichtungen zu schaffen. Für andere Altersgruppen (z. B. 4 Wochen alte Mäuse) oder Mäuse mit einzigartigen Knochenphänotypen wird empfohlen, Halterungen herzustellen, die zu den jeweiligen Geometrien der Knochen passen.

Nach dem Entwurf und dem 3D-Druck der Vorrichtungen sollten zur Gewährleistung der Reproduzierbarkeit und Effizienz des Ansatzes in der Regel 10 Sehnenproben von Mäusen mit demselben Hintergrund und Alter der geplanten Studie getestet werden (die genaue Probengröße kann je nach Gewebe und Tiermodell). Die mechanischen Eigenschaften dieser Sehnen sollten bestimmt werden, um sicherzustellen, dass die Variationskoeffizienten für strukturelle und materielle Eigenschaften innerhalb des erwarteten Bereichs liegen, wie in Tabelle 1 und Tabelle 2beschrieben. Diese Pilottests sollten auch bestätigen, dass Artefaktfehler (z. B. Wachstumsplattenfehler) nicht auftreten. Mehrere Zyklen des Designs, des Prototypings und der Validierung können erforderlich sein, um die gewünschten Ergebnisse für andere Sehnen als die im aktuellen Papier beschriebenen Supraspinatus- und Achillessehnen zu erzielen.

Eine Reihe von Gruppen haben die mechanischen Eigenschaften von murinen Sehnen berichtet. Der Variationskoeffizient in diesen Studien ist in der Regel hoch, was es oft schwierig macht, Unterschiede zwischen den Vergleichsgruppen aufzuzeigen. Darüber hinaus erschweren methodische Unterschiede in der Gewebeentnahme zwischen den verschiedenen Studien die Feststellung, ob Versagenseigenschaften für die Sehne oder durch artefaktische Griffausfälle relevant sind. Um die neuen Testmethoden mit den bestehenden Methoden zu vergleichen, wurde eine Literaturrecherche durchgeführt und die Ergebnisse aus 20 Studien zusammengefasst (Tabelle 1 und Tabelle 2). In der Literatur lagen die durchschnittlichen Variationskoeffizienten für maximale Kraft, Steifigkeit, maximale Spannung und Modul für supraspinatus-Sehnenmechanische Tests bei 27 %, 39 %, 52 % bzw. 45 %. Bei mechanischen Achillessehnentests betrugen die durchschnittlichen Variationskoeffizienten für maximale Kraft, Steifigkeit, maximale Spannung und Modul 23 %, 22 %, 24 % bzw. 25 %. In der aktuellen Studie führte die neue Methode zur Untersuchung muriner Sehnen zu einer Verringerung der supraspinatus-Sehnenkoeffizienten um 32 %-63 % und einer Verringerung der Achillessehnenkoeffizienten um 6 %-39 %.

Es gibt keine aktuelle Standardmethodik für das Greifen von Knochen, daher ist unklar, inwieweit artefaktische Greifprobleme die gemeldeten mechanischen Eigenschaften von murinen Sehnen beeinflusst haben. Die meisten Gruppen berichten, dass der Humerusknochen mit Epoxidharz13, Polymethylmethacrylat (PMMA)14,15oder Cyanoacrylat16 und Der Humeralkopf durch Auftragen einer zweiten Beschichtung von PMMA14, mit benutzerdefinierter Vorrichtung39 und/oder Einlegen einer Büroklammer25,28,30. In ähnlicher Weise berichten andere Gruppen, dass der viel kleinere Calcaneus-Knochen mit maßgefertigten Vorrichtungen19,20, Verankerung durch Klemmen21, Fixierung in selbsthärtendem Kunststoffzement22 oder mit einer konischen Form Steckplatz22. Diese Methoden bleiben jedoch durch geringe Reproduzierbarkeit, hohe Artefaktausfallraten und zeitaufwändige Vorbereitungsanforderungen begrenzt. Die neuen Methoden, die in dieser Studie vorgestellt wurden, haben Artefakt-Griffausfälle beseitigt und die Anzahl der Proben verdreifacht, die an einem Tag getestet werden können. Darüber hinaus sind diese Methoden nicht auf die Supraspinatus- und Achillessehnen beschränkt, da sie leicht an die Prüfung anderer muriner Sehnen und Sehnen aus größeren Tiermodellen angepasst werden können. Um Sehnen von größeren Tieren zu testen, muss der Modul des 3D-gedruckten Befestigungsmaterials jedoch so hoch sein, dass er im Verhältnis zur Festigkeit der getesteten Sehne nicht konform ist.

Mehrere Studien haben geschlechtsspezifische Unterschiede bei Sehnenerkrankungen gezeigt, die darauf hindeuten, dass Frauen nach der Behandlung nach Sehnenverletzung40,41,42die Funktion reduziert haben. In der aktuellen Studie hatte Sex einen signifikanten Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften von murinen Sehnen. Wie von den National Institutes of Health (NIH) geleitet, empfehlen wir, Das Geschlecht als biologische Variable im Forschungsdesign von Tiermodellen zu berücksichtigen, in denen sehnenmechanische Eigenschaften gemessen werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Studie wurde vom NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100 Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose 
Bruker microCT  Bruker BioSpin Corp Skyscan 1272  Used by authors
ElectroForce  TA Instruments 3200 Testing platform
Ethanol 200 Proof Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips Custom made Used by authors
Kimwipes Kimberly-Clark  S-8115 As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan) Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
MilliQ water (Ultrapure water) Millipore Sigma QGARD00R1 (or related purifier) 100 ml 
Meshmixer Autodesk http://www.meshmixer.com/ Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS  Stratasys LTD Precision Prototyping
Objet Studio Stratasys LTD Used by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 10010031 2.5 L of 10% PBS 
S&T Forceps Fine Science Tools 00108-11 Used by authors
Scalpel Blade - #11 Fine Science Tools 10011-00 Used by authors
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools 10003-12 Used by authors
SkyScan 1272 Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
Skyscan CT-Vox Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SkyScan NRecon Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SolidWorks CAD Dassault Systèmes SolidWorks Research Subsription Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue Loctite 234790 As suggested in protocol
Testing bath Custom made Used by authors
Thin film grips  Custom made Used by authors
VeroWhitePlus Stratasys LTD NA 3D printing material used by authors
WinTest  WinTest Software Used by authors to collect data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biomechanische Prüfung von Murine tendons
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Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham,… More

Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. J. Vis. Exp. (152), e60280, doi:10.3791/60280 (2019).

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