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Bioengineering

Murine Tendons के बायोमैकेनिकल परीक्षण

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60280
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Department of Orthopedic Surgery, Columbia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

Summary

प्रोटोकॉल कस्टम फिट 3 डी मुद्रित जुड़नार के उपयोग के माध्यम से murine tendons के लिए कुशल और reproduible तन्य परीक्षण विधियों का वर्णन करता है.

Abstract

Tendon विकार आम हैं, सभी उम्र के लोगों को प्रभावित, और अक्सर दुर्बल कर रहे हैं. ऐसे विरोधी भड़काऊ दवाओं के रूप में मानक उपचार, पुनर्वास, और शल्य चिकित्सा की मरम्मत, अक्सर असफल. आदेश में कण्डरा समारोह को परिभाषित करने और नए उपचार की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने के लिए, पशु मॉडल से tendons के यांत्रिक गुण सही ढंग से निर्धारित किया जाना चाहिए. Murine पशु मॉडल अब व्यापक रूप से कण्डरा विकारों का अध्ययन और tendinopathies के लिए उपन्यास उपचार का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है; हालांकि, माउस tendons के यांत्रिक गुणों का निर्धारण चुनौतीपूर्ण रहा है. इस अध्ययन में, एक नई प्रणाली कण्डरा यांत्रिक परीक्षण के लिए विकसित किया गया था जिसमें 3 डी-मुद्रित जुड़नार शामिल हैं जो क्रमशः सुप्रास्पिनाटस टेंडन और अहिल्या tendons का यांत्रिक परीक्षण करने के लिए ह्यूमरस और कैल्केनस के एनाटॉमी से मेल खाते हैं। इन जुड़नार देशी हड्डी शरीर रचना विज्ञान, ठोस मॉडलिंग, और additives विनिर्माण के 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग कर विकसित किए गए थे। नए दृष्टिकोण artifactual मनोरंजक विफलताओं का सफाया (उदा., विकास प्लेट विफलता पर विफलता के बजाय कण्डरा में), समग्र परीक्षण समय में कमी आई, और reproducibility वृद्धि हुई. इसके अलावा, इस नई विधि आसानी से अन्य murine tendons और अन्य जानवरों से tendons परीक्षण के लिए अनुकूल है.

Introduction

टेंडन विकार आम हैं और उम्र बढ़ने , पुष्ट और सक्रिय आबादी1,2,3के बीच अत्यधिक प्रचलित हैं . संयुक्त राज्य अमेरिका में, 16.4 लाख संयोजी ऊतक चोटों हर साल4 रिपोर्ट कर रहे हैं और सभी चोट से संबंधित चिकित्सक कार्यालय का दौरा3,5,6,7, के 30% के लिए खाते 8. सबसे अधिक प्रभावित साइटों रोटेटर कफ, Achilles कण्डरा, और पेटलार कण्डरा9शामिल हैं। हालांकि गैर ऑपरेटिव और ऑपरेटिव उपचार की एक किस्म का पता लगाया गया है, विरोधी भड़काऊ दवाओं सहित, पुनर्वास, और शल्य चिकित्सा की मरम्मत, परिणाम गरीब रहते हैं, समारोह के लिए सीमित वापसी और विफलता की उच्च दरों के साथ5, 6. इन गरीब नैदानिक परिणामों tendinopathy को समझने के लिए और उपन्यास उपचार दृष्टिकोण विकसित करने की मांग बुनियादी और translational अध्ययन प्रेरित किया है.

टेन्सिल जैवयांत्रिक गुण- कण्डरा फलन को परिभाषित करने वाले प्राथमिक मात्रात्मक परिणाम हैं। इसलिए, tendinopathy और उपचार प्रभावकारिता की प्रयोगशाला विशेषता कण्डरा तन्य गुणों का एक कठोर परीक्षण शामिल करना चाहिए. अनेक अध्ययनों में चूहों , भेड़ों, कुत्तों और खरगोशों के रूप में पशु मॉडलों से टेंडन के जैव यांत्रिक गुणों का निर्धारण करने के तरीकों का वर्णन किया गया है10,11,12. हालांकि, कुछ अध्ययनों में murine tendons के biomechanical गुणों का परीक्षण किया है, मुख्य रूप से तन्यता परीक्षण के लिए छोटे ऊतकों पकड़ में कठिनाइयों के कारण. के रूप में murine मॉडल यंत्रकांश का अध्ययन tendinopathy के लिए कई फायदे हैं, आनुवंशिक हेरफेर सहित, व्यापक अभिकर्मक विकल्प, और कम लागत, biomechanically परीक्षण murine ऊतकों के लिए सटीक और कुशल तरीकों के विकास की जरूरत है.

tendons के यांत्रिक गुणों का ठीक से परीक्षण करने के लिए, ऊतक पकड़ इंटरफ़ेस या विकास प्लेट के fracturing पर फिसल या artifactual फाड़ के बिना, प्रभावी ढंग से पकड़ लिया जाना चाहिए। कई मामलों में, विशेष रूप से छोटे tendons के लिए, हड्डी एक छोर पर पकड़ लिया है और कण्डरा दूसरे छोर पर पकड़ लिया है. अस्थियों को आमतौर पर एपॉक्सी राल13 और पॉलीमेथिलमेथैक्रिलेट14,15जैसे पदार्थों में उन्हें एम्बेड करके सुरक्षित किया जाता है . Tendons अक्सर sandpaper की दो परतों के बीच रखा जाता है, cyanoacrylate के साथ चिपके हुए, और संपीड़न clamps का उपयोग कर सुरक्षित (यदि पार अनुभाग फ्लैट है) या एक जमे हुए माध्यम में (यदि पार अनुभाग बड़ा है)15,16,17 . इन विधियों को बायोमैकेनिकल रूप से परीक्षण करने वाले मरिन टेंडन पर लागू किया गया है, लेकिन नमूनों के छोटे आकार और वृद्धि प्लेट के अनुपालन के कारण चुनौतियां उत्पन्न होती हैं, जो कभी भी18को प्रमाणित नहीं करती हैं। उदाहरण के लिए, murine humeral सिर का व्यास केवल कुछ मिलीमीटर है, इस प्रकार हड्डी की पकड़ मुश्किल बना. विशेष रूप से, murine supraspinatus tendon-to-bone नमूनों का तन्य परीक्षण अक्सर कण्डरा या कण्डरा enthesis में बजाय विकास प्लेट पर विफलता में परिणाम. इसी प्रकार, अहिल्या कण्डरा का बायोमैकेनिकल परीक्षण चुनौतीपूर्ण है। हालांकि Achilles कण्डरा अन्य murine tendons की तुलना में बड़ा है, कैल्केनस छोटा है, इस हड्डी की पकड़ मुश्किल बना रही है. हड्डी को हटाया जा सकता है, उसके बाद दो कण्डरा समाप्त होता है पकड़; हालांकि, यह कण्डरा-से-हड्डी लगाव के परीक्षण को रोकता है। अन्य समूहों कस्टम बनाया जुड़नारकाउपयोग कर कैल्केनस हड्डी पकड़ रिपोर्ट19 ,20, clamps द्वारा लंगर21, स्वयं इलाज प्लास्टिक सीमेंट22 में फिक्सिंग या एक शंकु आकार स्लॉट का उपयोग कर22, अभी तक इन पूर्व तरीकों कम reproducibility, उच्च मनोरंजक विफलता दर, और थकाऊ तैयारी आवश्यकताओं द्वारा सीमित रहते हैं.

वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य murine tendons के तन्य biomechanical परीक्षण के लिए एक सटीक और कुशल विधि विकसित करने के लिए किया गया था, उदाहरण के रूप में supraspinatus और Achilles tendons पर ध्यान केंद्रित. देशी हड्डी शरीर रचना विज्ञान, ठोस मॉडलिंग, और योज्य विनिर्माण से 3 डी पुनर्निर्माण का एक संयोजन का उपयोग करना, एक उपन्यास विधि हड्डियों पकड़ करने के लिए विकसित किया गया था. इन जुड़नार प्रभावी ढंग से हड्डियों को सुरक्षित, विकास प्लेट विफलता को रोका, नमूना तैयारी समय में कमी आई, और परीक्षण reproducibility वृद्धि हुई. नई विधि आसानी से चूहों और अन्य जानवरों में अन्य murine tendons के रूप में के रूप में अच्छी तरह से tendons परीक्षण करने के लिए अनुकूल है.

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Protocol

पशु अध्ययन कोलंबिया विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. इस अध्ययन में इस्तेमाल चूहे एक C57BL/6J पृष्ठभूमि के थे और जैक्सन प्रयोगशाला (बार हार्बर, ME, संयुक्त राज्य अमेरिका) से खरीदे गए थे। उन्हें रोगज़नक़-मुक्त बाधा स्थितियों में रखा गया था और उन्हें भोजन और जल प्रवेश प्रदान किया गया था।

1. मनोरंजक हड्डी के लिए कस्टम फिट 3 डी मुद्रित जुड़नार का विकास

  1. हड्डी छवि अधिग्रहण और 3 डी हड्डी मॉडल निर्माण
    1. 3 डी मॉडल निर्माण और 3 डी हड्डी पकड़ मुद्रण के लिए तैयार करने में ब्याज की हड्डी विच्छेदन; ह्यूमरस और कैल्केनस का उपयोग वर्तमान प्रोटोकॉल में उदाहरण के रूप में किया जाता है।
      नोट: यांत्रिक परीक्षण के लिए हड्डी-टेंटन-मांसपेशी नमूनों को विभाजित करने के लिए विस्तृत निर्देश चरण 2.1.1 में प्रदान किए जाते हैं। 3 डी मुद्रित हड्डी पकड़ बनाने के उद्देश्य के लिए हड्डियों को अलग करने के लिए निम्नलिखित चरणों का पालन किया जाना चाहिए.
      1. ह्यूमरस का विच्छेदन: IACUC-अनुमोदित प्रक्रिया के अनुसार एक माउस को यूथेनाइज़ करें। ऊपरी extremity त्वचा निकालें, humerus पर सभी मांसपेशियों को हटाने, कोहनी और glenohumeral जोड़ों disarticulate, और ध्यान से humerus से जुड़े सभी संयोजी ऊतकों को हटा दें.
      2. कैल्केनस का विच्छेदन: IACUC-अनुमोदित प्रक्रिया के अनुसार एक माउस को यूथेनाइज़ करें। निचले extremity त्वचा निकालें, Achilles कण्डरा-कैल्केनस संयुक्त और कैल्केनस और अन्य पैर हड्डियों के बीच जोड़ों disarticulate, और ध्यान से कैल्केनस से जुड़े सभी संयोजी ऊतकों को हटा दें।
    2. पूरी हड्डी के एक माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी स्कैन करें, उदा., ह्यूमरस और कैल्केनस नमूनों को स्कैन करें।
      नोट: उपयोग किए गए स्कैनर के आधार पर, सेटिंग्स भिन्न होंगी. वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त स्कैनर के लिए (सामग्री की तालिका),अनुशंसित सेटिंग्स हैं: 55 kVP की ऊर्जा पर स्कैन, अल 0.25 फिल्टर, 6 डिग्री उ के एक संकल्प पर.
      1. अल्ट्राप्यूरे पानी में अगारोस पाउडर मिलाएं और 1-3 मिनट के लिए माइक्रोवेव करें जब तक कि अग्रोहा पूरी तरह से भंग न हो जाए। यह 30-45 एस, बंद करो और चक्कर के लिए माइक्रोवेव करने के लिए उपयोगी है, और फिर एक फोड़ा की ओर जारी है. एग्रोस से भरा तीन-चौथाई तक क्रायोट्यूब भरें। के बारे में 5-10 मिनट के लिए agarose शांत करते हैं.
      2. agarose जेल में हड्डी डालें (यह स्कैनिंग के दौरान आंदोलन कलाकृतियों को रोकने जाएगा). स्कैनर में हड्डी के साथ एक cryotube डालें.
        नोट: वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल स्कैनर के लिए, एक 16 स्थिति स्वत: नमूना परिवर्तक सभी स्कैन के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह स्कैनर स्वचालित रूप से एक नमूने के आकार और आकार के अनुसार आवर्धन का चयन कर सकते हैं.
    3. पुन: निर्माण microcomputed टोमोग्राफी स्कैन प्रक्षेपण छवियों को पार अनुभाग छवियों में. प्रयोगकर्ता के स्कैनर/सॉफ्टवेयर संयोजन के लिए अनुशंसित पैरामीटर का उपयोग करें.
      नोट: वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल कार्यक्रम के लिए (सामग्री की तालिका) यह निम्नलिखित पुनर्निर्माण मापदंडों का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है: चिकनाई: 0-2, बीम कठोर सुधार: 45, अंगूठी कलाकृति में कमी: 4-9 और 16 बिट झगड़ा में स्लाइस के पुनर्निर्माण के लिए स्वरूप.
    4. एक 3 डी मॉडल बनाएँ और सबसे 3 डी प्रिंटर और तेजी से प्रोटोटाइप के साथ संगत एक मानक STL प्रारूप में सहेजें. वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त कार्यक्रम के लिए (सामग्री तालिका) निम्नलिखित कार्य करें:
      1. फ़ाइल डेटासेट खोलने के लिए आदेश फ़ाइल का चयन करें और खोलें. संवाद फ़ाइल को खोलें और प्राथमिकताएँ बनाएँ और उन्नत टैब का चयन करें.
      2. 3 डी मॉडल का निर्माण करने के लिए अनुकूली प्रतिपादन एल्गोरिथ्म का उपयोग करें। इस एल्गोरिथ्म पहलू त्रिकोण की संख्या को कम करता है और चिकनी सतह विस्तार प्रदान करता है. इलाके पैरामीटर के रूप में 10 का उपयोग करें; यह पैरामीटर ऑब्जेक्ट बॉर्डर ढूँढने के लिए उपयोग किए गए पड़ोसी बिंदु के पिक्सेल में दूरी को परिभाषित करता है. फ़ाइल का आकार कम करने के लिए 0.1 करने के लिए सीमा को कम करें।
        नोट: डेटासेट खोलने के बाद, छवियाँ "Raw छवियाँ" पृष्ठ में दिखाए जाते हैं।
      3. ब्याज की मात्रा (VOI) निर्दिष्ट करने के लिए, मैन्युअल रूप से चयनित वीओआई रेंज के ऊपर और नीचे के रूप में स्थापित करने के लिए दो छवियों का चयन करें।
      4. दूसरे पृष्ठ पर ले जाएँ, ब्याज का क्षेत्र| मैन्युअल रूप से एक पार अनुभाग छवि पर ब्याज के क्षेत्र का चयन करें।
        नोट: चयनित क्षेत्र लाल रंग में प्रकाश डाला जाएगा (यानी, humerus पार अनुभागीय क्षेत्र).
      5. पिछले कदम हर 10-15 पार अनुभाग छवियों को दोहराएँ.
      6. तीसरे पृष्ठ बाइनरी चयनपर जाएँ | हिस्टोग्राम मेनू पर, डेटासेट सेक्लिक करें. डेटासेट की सभी छवियों से चमक का हिस्टोग्राम वितरण दिखाया जाएगा। इसके अलावा हिस्टोग्राम मेनू पर, एक 3 डी मॉडल फ़ाइल बनाएँ मेनू पर क्लिक करें.
    5. STL फ़ाइल स्वरूप में हड्डी के एक 3 डी मॉडल सहेजें.
    6. जाल को परिष्कृत करें: STL फ़ाइल के आकार को कम करने और इसे किसी भी ठोस मॉडलिंग कंप्यूटर-सहायता प्राप्त डिजाइन प्रोग्राम के साथ संगत बनाने के लिए जाल को हेरफेर करें। वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त कार्यक्रम के लिए (सामग्री तालिका), नीचे दिए गए चरणों का पालन करें:
      1. आयात जाल और संपादित करने के लिए सभी का चयन करें। टूलसेट संपादित करेंसे कम करें चुनें. फिर, टूलसेट से त्रिभुज बजट का चयन करें लक्ष्य कम करें. त्रि गणना कम करें और परिवर्तन स्वीकार करें. के रूप में निर्यात का चयन करके STL स्वरूप में नए कम फ़ाइल को पुन: सहेजें...
  2. कस्टम फिट हड्डी जुड़नार के डिजाइन
    1. सुप्रास्पिनटस कण्डरा-हुमेरल अस्थि
      1. humerus मनोरंजक स्थिरता के एक कस्टम फिट मॉडल बनाने के लिए एक ठोस मॉडलिंग कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन प्रोग्राम का उपयोग करें (चित्र 1, पूरक फ़ाइलें).
        नोट: वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त कार्यक्रम सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध है।
      2. एक ठोस मॉडलिंग कार्यक्रम में humerus हड्डी के STL प्रारूप फ़ाइल खोलें और एक भाग फ़ाइल के रूप में बचाने के लिए.
        नोट: वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के लिए (सामग्री की तालिका),3 डी हड्डी वस्तु SLDPRT प्रारूप में सहेजा गया था.
      3. भाग फ़ाइल खोलें और मैन्युअल रूप से तीन शारीरिक रूप से प्रासंगिक विमानों (यानी, sagittal, कोरोनल, अनुप्रस्थ) बनाएँ।
        1. अधिक से अधिक ट्यूबरसिटी पर अधिस्पिनाटस कण्डरा लगाव के माध्यम से कटौती करने के लिए धनु तल को मैन्युअल रूप से परिभाषित करें। सुनिश्चित करें कि 3 डी ब्लॉक समरूपता के एक विमान के रूप में sagittal विमान शामिल हैं। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, यदि आवश्यक हो तो ब्लॉक से सामग्री जोड़ें या काटें।
          नोट: समरूपता के इस विमान सुनिश्चित करता है कि जब नमूना जुड़नार में डाला जाता है कण्डरा और कण्डरा लगाव स्थिरता के केंद्रीय अक्ष में स्थित हैं.
      4. तीन विमानों में से प्रत्येक के साथ हड्डी के आयाम ों को मापने (यानी, ऊंचाई, चौड़ाई, लंबाई).
      5. यांत्रिक परीक्षण पकड़ जहां 3 डी मुद्रित स्थिरता संलग्न किया जाएगा के आयामों को मापने.
      6. एक ठोस ब्लॉक हिस्सा (उदा., एक ठोस सिलेंडर) डिजाइन करके शुरू करें।
        1. सुनिश्चित करें कि ब्लॉक के प्रत्येक आयाम humerus के आयामों से कम से कम 5 मिमी अधिक है.
        2. यांत्रिक परीक्षण पकड़ से डिजाइन की कमी के लिए खाता (यानी, सुनिश्चित करें कि 3 डी मुद्रित स्थिरता इकट्ठा किया जा सकता है और यांत्रिक परीक्षण पकड़ में स्वतंत्र रूप से disassembled).
      7. दो घटकों के साथ एक विधानसभा मॉडल बनाएँ: ठोस ब्लॉक और या तो सही है या छोड़ दिया humerus हड्डी. ब्लॉक के भीतर हड्डी के अभिविन्यास को परिभाषित करें (यानी, कण्डरा और हड्डी के बीच कोण)। सुनिश्चित करें कि पूरी हड्डी की मात्रा ब्लॉक के अंदर फिट बैठता है।
      8. मोल्ड के रूप में ह्यूमरस हड्डी का उपयोग कर ब्लॉक में एक गुहा बनाएँ। सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट सॉफ्टवेयर काउपयोग करते हैं, तो निम्न चरणों का पालन करें:
        1. एक अंतरिम विधानसभा में डिजाइन हिस्सा (humerus) और मोल्ड आधार (सिलेंडर ब्लॉक) डालें. असेंबली विंडो में, ब्लॉक का चयन करें, और असेंबली उपकरण पट्टी से घटक संपादित करें क्लिक करें।
        2. सम्मिलित करें पर क्लिक करें gt; सुविधाएँ gt; गुहा| यूनिफ़ॉर्म स्केलिंग का चयन करें और 0% को सभी दिशाओं में स्केल करने के लिए मान के रूप में दर्ज करें.
      9. हड्डी भाग को दबाऔर एक भाग के रूप में विधानसभा को बचाने के.
      10. खुला हिस्सा (गुहिका के साथ सिलेंडर)। दो सममित घटक बनाने के लिए धनु तल के साथ भाग को काटें जो पूर्वकाल और पश्च रूप से हड्डी को फिट करते हैं (उदा., दो आधे सिलेंडर, जैसा कि चित्र 1में देखा गया है)।
        नोट: दो घटकों कि हड्डी पूर्वकाल और पीछे फिट डिजाइन किए हैं. पूर्वकाल घटक में एक आधा गोलाकार आकार का गुहा शामिल है जो हुमेरल सिर के पूर्ववर्ती पक्ष से अधिस्पिनाटस कण्डरा लगाव तक विस्तारित है। पश्च घटक गुहा ह्यूमरस के पश्च भाग की तरह आकार का होता है (यानी, ह्यूमरल हेड के पीछे की ओर, डेल्टोइड ट्यूबरसिटी, और मध्यस्थ और पार्श्व एपिकोन्डिल)।
      11. प्रत्येक घटक को एक अलग फ़ाइल भाग के रूप में सहेजें.
      12. पूर्ववर्ती घटक के लिए, सुनिश्चित करें कि humeral सिर उचित tolerances को परिभाषित करके भाग की गुहा में एम्बेडेड है.
        नोट: वर्तमान अध्ययन में, सामग्री की तालिकामें निर्दिष्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, यह नीचे दिए गए चरणों का पालन करने के लिए सुझाव दिया है:
        1. गुहा के जाल ज्यामिति चिकनी करने के लिए एक रिवाल्वर कटौती बनाएँ। गुहा ज्यामिति की नकल और एक स्थान निकासी जोड़कर कटौती के लिए एक संक्षिप्त वर्णन बनाएँ।
          नोट: निकासी मुक्त विधानसभा और हड्डी और पूर्वकाल घटक के बीच disassembly के लिए अनुमति देता है.
      13. पूर्वकाल घटक के लिए ऊपर वर्णित के रूप में निकासी कहते हैं कि एक कट बनाने के लिए गुहा ज्यामिति की नकल करने के लिए पीछे घटक को संशोधित करें।
      14. पीछे के घटक के ऊपर से अधिक से अधिक / कम ट्यूबरकल के शिखर तक शुरू होने वाले अनुप्रस्थ विमान में कटौती करें।
        नोट: जैसा कि चित्र 1 और चित्र 2में देखा गया है, पीछे के घटक में एक कट शामिल है जो कण्डरा अनुलग्नक पर एक खोलने का कारण बनाता है।
      15. मुक्त विधानसभा और disassembly के लिए अनुमति देने के लिए दो घटकों के बीच एक सुखद फिट बनाएँ.
        नोट: एक ढीला चल निकासी के साथ एक छेद-शफ्ट फिट वर्तमान अध्ययन में जुड़नार के लिए बनाया गया था.
      16. विपरीत अंग (यानी, बाएँ या दाएँ) के लिए स्थिरता के प्रत्येक घटक के लिए 3 डी दर्पण मॉडल बनाएँ।
      17. बाएं और दाएं पक्षों के बीच अंतर करने के लिए जुड़नार के तल पर एक आदि जोड़ें।
      18. 3 डी मुद्रण के लिए तैयारी में STL मानक फ़ाइल स्वरूप में सभी स्थिरता भागों सहेजें।
    2. अहिल्या कण्डरा-कैल्केनस हड्डी
      1. supraspinatus-humeral सिर स्थिरता के लिए ऊपर वर्णित के रूप में एक ही कदम का पालन करें.
        नोट: जुड़नार का केवल एक सेट Achilles-कैल्केनियल के लिए आवश्यक है, क्योंकि बाएं और दाएं कैल्केनस हड्डियों की शरीर रचना लगभग सममित है।

2. murine tendons के Biomechanical परीक्षण

  1. चश्मा तैयारी और पार अनुभागीय क्षेत्र माप
    1. तन्य यांत्रिक परीक्षण के लिए तैयार करने में ब्याज की मांसपेशी-टेंडन-हड्डी को अलग करें। वर्तमान अध्ययन में, supraspinatus मांसपेशियों - कण्डरा - humerus हड्डी नमूने (एन $ 10, 5 पुरुष, 5 महिला) और gastrocnemius मांसपेशियों - Achilles कण्डरा-कैल्केनस हड्डी नमूना (एन $ 12, 6 पुरुष, 6 महिला) 8 सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों से अलग थे।
      1. अधिस्पिनाटस मांसपेशी का विच्छेदन - कण्डरा - ह्यूमरस हड्डी नमूना
        1. IACUC-अनुमोदित प्रक्रिया के अनुसार एक माउस Euthanize. माउस को प्रवण स्थिति में रखें. कंधे की ओर फोरपाव की कोहनी के ऊपर से त्वचा में एक चीरा बनाओ।
        2. ध्यान से कुंद विच्छेदन के साथ त्वचा को हटाने के लिए इतना है कि कंधे की पेशी दिखाई देता है. Humerus आसपास के ऊतक निकालें जब तक हड्डी उजागर है और forceps के साथ सुरक्षित रूप से आयोजित किया जा सकता है.
        3. संदंश के साथ ह्यूमरस को पकड़ो और कोराकोक्रोमी आर्क को बेनकाब करने के लिए डेल्टोइड और ट्रैपेजियस मांसपेशियों को सावधानी से हटा दें। एक्रोमोइक्लेव्युलर जोड़ की पहचान करें और ध्यान से एक स्केलपेल ब्लेड के साथ एक्रोमियन से क्लैविकल को अलग करें।
        4. superspinatus कण्डरा और उसके बोनी लगाव को नुकसान नहीं करने के लिए ध्यान रखना, एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर अपने स्कैपुलर लगाव से मांसपेशियों को हटा दें। देखभाल करने के लिए superspinatus कण्डरा और उसके बोनी लगाव को नुकसान नहीं, glenoid से humeral सिर अलग; स्कैल्पल ब्लेड का उपयोग करके, संयुक्त कैप्सूल और इन्फ्रास्पिनेटस, सबस्कैपुलरिस, और टेरेस माइनर टेंडन को रेट करें।
        5. यूमना और त्रिज्या से ह्यूमरस को अलग करने के लिए कोहनी के जोड़ को अलग करना। ह्यूमरस को अलग करें - अधिस्पिनेटस कण्डरा - मांसपेशी नमूना और ह्यूमरस और ह्यूमेरल सिर पर अतिरिक्त नरम ऊतकों को साफ करें।
      2. अहिल्या कण्डरा का विच्छेदन - कैल्केनस हड्डी का नमूना
        1. IACUC-अनुमोदित प्रक्रिया के अनुसार एक माउस Euthanize. माउस को प्रवण स्थिति में रखें. ध्यान रखने के लिए Achilles कण्डरा और उसके बोनी लगाव को नुकसान नहीं, कुंद विच्छेदन के साथ त्वचा को हटा इतना है कि टखने और घुटने के जोड़ों के आसपास पेशी उजागर है.
        2. एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना, Achilles कण्डरा पर शुरू - कैल्केनस लगाव, ध्यान से इसके निकट संलग्नक से गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों को अलग करें।
        3. विभिन्न सन्निकट अस्थियों से कैल्केनस को सावधानीपूर्वक विघटित किया जाता है। अहिल्या कण्डरा को अलग करें - कैल्केनस नमूना और अतिरिक्त नरम ऊतकों को साफ करें।
    2. माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी का उपयोग करके कण्डरा के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र का निर्धारण करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल स्कैनर के लिए (सामग्री की तालिका),की सिफारिश की सेटिंग्स हैं: 55 kVP की एक ऊर्जा पर स्कैन, अल 0.25 फिल्टर, 5 डिग्री के एक संकल्प पर.
      1. अल्ट्राप्यूरे पानी में अगारोस पाउडर मिलाएं और 1-3 मिनट के लिए माइक्रोवेव करें जब तक कि अग्रोहा पूरी तरह से भंग न हो जाए। यह 30-45 एस, बंद करो और चक्कर के लिए माइक्रोवेव करने के लिए उपयोगी है, और फिर एक फोड़ा की ओर जारी है. एग्रोस से भरा तीन-चौथाई तक क्रायोट्यूब भरें। के बारे में 5-10 मिनट के लिए agarose शांत करते हैं.
      2. हड्डी को उल्टा करके क्रायोट्यूब में नमूना निलंबित करें।
        नोट: केवल हड्डी agarose जेल में होना चाहिए. कण्डरा और मांसपेशियों के बाहर निलंबित किया जाना चाहिए.
    3. स्कैन के बाद, धीरे स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर कण्डरा से मांसपेशियों को हटा दें। 3 डी मुद्रित स्थिरता में नमूना डालें.
      नोट: पकड़ प्रत्येक परीक्षण के लिए पुन: प्रयोज्य हैं. स्थिरता में गोंद या एपॉक्सी का उपयोग न करें; हड्डी एक प्रेस फिट में आयोजित किया जाता है.
    4. सम्मिलित करें और एक तह पतली ऊतक कागज (2 सेमी x 1 सेमी) के बीच कण्डरा गोंद और पतली फिल्म पकड़ का उपयोग कर निर्माण दबाना. परीक्षण पकड़ में नमूना के साथ 3 डी मुद्रित स्थिरता संलग्न.
    5. 37 डिग्री सेल्सियस (यानी, माउस शरीर का तापमान23) पर फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के परीक्षण स्नान में नमूना और पकड़ डालें।
  2. टेन्सिल परीक्षण
    1. एक सामग्री परीक्षण फ्रेम पर तन्य यांत्रिक परीक्षण प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया परीक्षण फ्रेम के लिए (सामग्री की तालिका),की सिफारिश की प्रोटोकॉल है:
      1. गेज लंबाई को ऊपरी पकड़ से कण्डरा लगाव से दूरी के रूप में परिभाषित करें।
      2. 0.05 N और 0.2 N के बीच 5 चक्र ों के साथ पूर्व शर्त
      3. 120 एस के लिए पकड़ो.
      4. 0.2%/s की विफलता के लिए एक तनाव का प्रयोग करें।
    2. लोड-विरूपण डेटा एकत्रित करें.
    3. विकृति की गणना कण्डरा की प्रारंभिक गेज लंबाई के सापेक्ष विस्थापन के रूप में कीजिए।
    4. प्रारंभिक कण्डरा क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र (जैसे माइक्रोसीटी से मापा जाता है) द्वारा विभाजित बल के रूप में दबाव की गणना करें।
    5. यदि विस्कोलोचाइड व्यवहार में रुचि रखते हैं, तो तनाव परीक्षण से पहले एक तनाव छूट का प्रयोग करें और डेटा का उपयोग करने के लिए पैरामीटर की गणना करने के लिए इस तरह के ए, बी, सी, tau1, और tau2 अर्धरेखीय विस्कोलोचाइड मॉडल24से .
    6. भार विरूपण वक्र से, कठोरता (वक्र के रैखिक भाग की ढाल), अधिकतम बल, और उपज के लिए कार्य (वक्र के नीचे का क्षेत्र उपज बल तक) की गणना करें।
      1. लोड-विरूपण वक्र में बिंदुओं की एक विंडो का चयन करके रेखीय भाग की पहचान करें जो रेखीय कम से कम वर्गों प्रतिगमन25के लिए R2 मान को अधिकतम करता है।
      2. कठोरता को भार विस्थापन वक्र25,26के रैखिक भाग की प्रवणता के रूप में निर्धारित करें।
    7. प्रतिबल विकृति वक्र से, मापांक (वक्र के रैखिक भाग की ढाल), शक्ति (अधिकतम प्रतिबल), और लचीलापन (वक्र के नीचे का क्षेत्र उपज तनाव तक)।
      नोट: RANSAC एल्गोरिथ्म का उपयोग कर, उपज तनाव (x-मान) पहले बिंदु के रूप में परिभाषित किया गया है जब y-fit अपेक्षित दबाव मान (y-मान) की 0.5% से अधिक विचलित है। उपज प्रतिबल उपज विकृति का संगत y-मान है।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में वर्णित विफलता के लिए मोनोटोनिक तन्य लोड करने के अलावा, चक्रीय लोडिंग कण्डरा थकान और/या चिपचिपा प्रत्यास्थ गुणों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, फ्रीडमैन एट अल. ने मौरीन अहिल्या कण्डरा27के थकान गुणों की सूचना दी।
    8. तन्य परीक्षण के पूरा होने के बाद, पूरी हड्डी के एक microcomputed टोमोग्राफी स्कैन प्रदर्शन, उदा.
      नोट: वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल स्कैनर के लिए (सामग्री की तालिका),की सिफारिश की सेटिंग्स हैं: 55 kVP की एक ऊर्जा पर स्कैन, अल 0.25 फिल्टर, 6 डिग्री के एक संकल्प पर.
      1. 1.1.2.1-1.1.2.2 चरणों को दोहराएँ.
    9. चरण 1.1.3 दोहराएँ.
    10. स्कैन किए गए ऑब्जेक्ट का वॉल्यूम-रेंडर किए गए 3D मॉडल बनाने के लिए स्कैनर के साथ संगत 3D दृश्यावलोकन प्रोग्राम का उपयोग करें.
      नोट: वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त कार्यक्रम सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध है।
    11. 3D ऑब्जेक्ट का निरीक्षण करविफलता मोड और विफलता साइट क्षेत्र निर्धारित करें।
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण: सभी नमूना परिणामों को माध्य के रूप में दिखाएँ - मानक विचलन (एसडी)। छात्र के टी-परीक्षणों (दो-पुच्छ और अयुग्मित) का उपयोग करने वाले समूहों के बीच तुलना करें. 0.05 के रूप में महत्व सेट करें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध है।

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Representative Results

3 डी मुद्रित जुड़नार 8 सप्ताह पुराने murine superspinatus और Achilles tendons परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. सभी यंत्रवत् परीक्षण नमूनों enthesis में विफल रहा, के रूप में microCT स्कैन, दृश्य निरीक्षण, और तन्य परीक्षण के बाद वीडियो विश्लेषण की विशेषता. हमारी प्रयोगशाला में अधिस्पिनाटस टेंडन परीक्षण के लिए पिछले और वर्तमान विधियों की एक-से-एक तुलना चित्र 3 में दर्शायागया है। पिछले विधिमें 28,29,30, humerus हड्डी epoxy में एम्बेडेड था और एक कागज क्लिप विकास प्लेट फ्रैक्चर को रोकने के प्रयास में humeral सिर पर रखा गया था. 4-6 घंटे के लिए पूरी तरह से इलाज के लिए epoxy के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक थे (चित्र 3),केवल 6-8 नमूनों के लिए एक विशिष्ट दिन में परीक्षण किया जा करने के लिए अनुमति देता है. दृष्टिकोण की एक और सीमा विकास प्लेट फ्रैक्चर को रोकने के लिए कागज क्लिप प्लेसमेंट के उपयोगकर्ता पर निर्भर प्रभावशीलता थी. इन पूर्व विधियों का उपयोग कर परीक्षण परिणाम अत्यधिक चर रहे थे, के आदेश पर भिन्नता के गुणांक के साथ 30% सबसे पैरामीटर और विकास प्लेट विफलता दरों के लिए लगभग 10%-20%. जैसा कि चित्र 3में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है, नए तरीकों का उपयोग करके नमूना तैयारी समय को 5-10 मिनट तक कम कर दिया गया था, जिससे प्रति दिन 16-20 नमूनों का परीक्षण करना व्यावहारिक हो गया था। इसके अलावा, विकास प्लेट विफलताओं को समाप्त कर दिया गया.

अन्य लोगों द्वारा मौरीन टेंडन के परीक्षण के लिए रिपोर्ट की गई कार्यप्रणाली की तुलना में14,15,17,25,28,29,30,31 ,32,33, नए तरीकों और अधिक कुशल और पुन: उत्पादन योग्य थे. अधिस्पिनाटस tendons के लिए, संरचनात्मक गुण जैसे अधिकतम लोड (3.8 - 0.6 N) और कठोरता (12.7 ] 1.8 N/mm), साथ ही साथ सामान्यीकृत सामग्री गुण जैसे अधिकतम तनाव (8.7 ] 3.0 MPa), और मापांक (51.7 ] 13.5 MPa) के काफी कम गुणांक था साहित्य(तालिका 1)के परिणामों की तुलना में भिन्नताएँ । दुखकण् ठ कण्डरा के लिए, यांत्रिक गुण जैसे अधिकतम भार (7.8 ] 1.1 छ) और कठोरता (13.2 ] 1.9 N/mm) में साहित्य19,21,22 के परिणामों की तुलना में विभिन्नता के कम गुणांक थे। ,32,33,34,35,36,37,38, जबकि अधिकतम तनाव (24.2 ] 5.4 MPa ) और मापांक (73.2 ] 22-1 म.प्र.) में साहित्य में रिपोर्ट किए गए विभिन्न रूपों के गुणांक थे (सारणी 2)।

पशु लिंग का अधिस्पिनाटस और अहिल्या कण्डरा के यांत्रिक गुणों पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा (चित्र 4) जब पुरुष और महिला supraspinatus tendons की तुलना, वहाँ अधिकतम बल में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी (च े 0.002) और उपज के लिए काम(च $ 0.008). कठोरता के लिए दो समूहों के बीच रुझान थे(च र् 0ण्057), प्रतिबल(च र् 0ण्68), मापांक(च र् 061) तथा लचीलापन(च र् 0ण्078)। जब पुरुष और महिला Achilles tendons की तुलना, वहाँ अधिकतम तनाव में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी (p $ 0.0006) और लचीलापन (p $ 0.0019). उत्पादन के लिए कार्य के लिए दो समूहों के बीच रुझान थे (च र् 0ण्079), तथा मापांक(च र् 0ण्74) तथा अधिकतम बल(च र् 0ण् 1880) तथा कठोरता(च र् 0.6759) के लिए कोई अंतर नहीं था।

Figure 1
चित्रा 1: humerus (ऊपर पंक्ति) और कैल्केनस (नीचे पंक्ति) के लिए जुड़नार के प्रतिनिधि 3 डी मॉडल. (ए) हड्डियों के 3 डी मॉडल. (बी) जुड़नार के अलग मॉडल. (सी)जुड़नार के इकट्ठे मॉडल. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि 3 डी मुद्रित जुड़नार. (क)ह्यूमरस और अधिस्पिनाटस कण्डरा के बीच 180 डिग्री के कोण पर 8 सप्ताह पुराने चूहों के अधिस्पिनाटस कण्डरा के जैव यांत्रिक परीक्षण के लिए निचरन। (बी)ह्यूमरस और अधिस्पिनाटस कण्डरा के बीच 135 डिग्री के कोण पर 8 सप्ताह पुराने चूहों के अधिस्पिनाटस कण्डरा के जैव यांत्रिक परीक्षण के लिए निचरन। (ग)कैल्केनस और अहिल्या कण्डरा के बीच 120 डिग्री के कोण पर मरिन अहिल्या कण्डरा के जैव यांत्रिक परीक्षण के लिए फिक्सचर। (घ)ह्यूमेरस और अधिस्पिनाटस कण्डरा के बीच 180 डिग्री के कोण पर वयस्क स्प्रैग डावले चूहों के अधिस्पिनाटस कण्डरा के जैव यांत्रिक परीक्षण के लिए निश् चरता। स्केल बार: 5 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: murine superspinatus tendons के यांत्रिक परीक्षण के लिए पिछले और वर्तमान तरीकों की तुलना. (ए) पिछले नमूना तैयारी विधियों यांत्रिक परीक्षण से पहले हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया: humerus हड्डी को स्थिर करने के लिए humeral सिर तक epoxy में potted किया गया था, एक कागज क्लिप humeral सिर पर रखा गया था विकास प्लेट फ्रैक्चर को रोकने के लिए, और, epoxy के इलाज के लिए, नमूनों यांत्रिक परीक्षण से पहले 4-6 घंटे के लिए कमरे के तापमान में छोड़ दिया गया. (ख) वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त विशेष तैयारी विधियाँ (चरण 1-2 और 2.1.4): ऊपर बाईं ओर एक ठोस मॉडलिंग कार्यक्रम द्वारा उत्पादित जुड़नार के 3D प्रतिनिधित्व को दर्शाता है। 3 डी मुद्रित जुड़नार पुन: प्रयोज्य और आसानी से इकट्ठे और disassembled हैं. नमूना की हड्डी अंत जुड़नार में डाला जाता है, विकास की थाली हासिल करने और मनोरंजक और परीक्षण के लिए कण्डरा को उजागर. कण्डरा अंत एक मुड़ा हुआ पतली ऊतक कागज के बीच चिपके हुए है और पकड़ में डाला. प्रत्येक नमूने के लिए तैयारी समय 10-15 मिनट है. (ग)प्रतिनिधि भार-विरूपण वर्तमान विधियों का उपयोग करते हुए अधिस्पिनाटस टेण्डर के तन्य परीक्षण के लिए वक्र। (घ)अधिस्पिनाटस कण्डरा के तन्य परीक्षण के लिए प्रतिनिधि भार-विरूपण वक्र जो वृद्धि प्लेट विफलता दर्शाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: अधिस्पिनेटस (एसएसटी) और अहिल्या (एएचटी) कण्डरा के यांत्रिक गुणों पर यौन प्रभाव। अयुग्मित टी-परीक्षणों (*सेक्स प्रभाव, पी एंड एलटी; 0.05) के आधार पर कई यांत्रिक गुणों पर सेक्स का महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा। मतलब के रूप में दिखाया गया डेटा - मानक विचलन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: माइक्रोसीटी से क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र माप। (क)अधिस्पिनाटस कण्डरा की लंबाई के साथ न्यूनतम क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र माप। (B)अहिल्या कण्डरा की लंबाई के साथ न्यूनतम क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र माप। केवल टेंडन उचित माप के लिए चुना जाना चाहिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

संरचनात्मक गुण सामग्री गुण
जानवरों अधिकतम बल (N) कठोरता (N/ अधिकतम तनाव (Mpa) मॉडुलस (एमपीए)
लेखक एन पृष्ठभूमि मतलब जेड एसडी COV(%) मतलब जेड एसडी सीओवी (%) मतलब जेड एसडी सीओवी (%) मतलब जेड एसडी सीओवी (%)
Beason एट अल कंधे और कोहनी सर्जरी के जर्नल (2013)15 10 C57Bl/6 0.93 डिग्री 0.34 36.56 95.1[39.8] 41.85 3.40$1.56 45.88 312.8$127.0 40.60
बेल एट अल ऑर्थोपेडिक रिसर्च के जर्नल (2014)31 6 C57Bl/6 १.२२ ] 0.52 42.62 2.37 ] 1.6 67.51 Nr Nr
Cong एट अल विकलांग अनुसंधान के जर्नल (2018)17 8 C57Bl/6 5.38 ] 2.404 # 44.68 4.25 ] 1.67 # 39.29 Nr Nr
कोनिज़ो एट अल एनल्स ऑफ बायोमेडिकल इंजीनियरिंग (2014)32 10 एनआर (डीबी/+) Nr 84.44 [ 27.23 *] 32.25 Nr 476 ] 186.27* 39.13
Connizzo एट अल जर्नल ऑफ बायोमेडिकल इंजीनियरिंग (2013)14 Nr C57/बीएल6 Nr Nr Nr 297 ] 148.90* 50.13
Deymier एट अल Acta Biomaterialia (2019)28 12 सीडी-1 आईजीएस माउस (डब्ल्यूटी) 5.0 $ 0.7 14 9.2 $ 2.9 31.52 33 ] 35 106.06 Nr
Eekhoff एट अल जर्नल ऑफ बायोमेडिकल इंजीनियरिंग (2017)33 13 एल्न +/ Nr 8.50 $ 2.95 34.71 5.96 ] 3.23 54.19 101.2 ] 50.8 50.20
Killian एट अल FASEB जर्नल (2016)29 8 C57BL/6 Nr Nr 7.79 ] 2.61* 33.50 58.32 ] 31.73* 54.41
श्वार्ट्ज एट अल हड्डी (2014)25 20 सीडी-1 आईजीएस माउस (डब्ल्यूटी) 4.11 $ 0.79* 19.22 8.58 ] 3.78* 44.06 12.29 ] 5.95* 48.41 133.80 $ 59.41* 44.40
श्वार्ट्ज एट अल विकास (2015)30 12 (रोसा-डीटीए (डीटीए) x Gli1-CreERT2 ) ScxCre; स्मोफ़ल/फ्ल (डब्ल्यूटी) 4.16 $ 0.29* 6.97 11.04 $ 1.98* 17.93 26.24 ] 5.81 22.14 121.89 ] 44.18 36.25
औसत COV 27.34 औसत COV 38.64 औसत COV 51.70 औसत COV 45.02
नई विधि 10 C57BL/6J 3.79 ] 0.62 16.41 12.73 ] 1.81 14.20 8.71 ] 3.04 34.91 51.67 ] 13.54 26.20

तालिका 1: अधिस्पिनाटस टेंडन के यांत्रिक गुण। साहित्य में रिपोर्ट किए गए लोगों की तुलना में नए तरीकों का उपयोग करके अनुमानित संरचनात्मक और सामग्री गुणों के लिए भिन्नता (सीओवी) का माध्य एसडी और गुणांक। [एनआर: रिपोर्ट नहीं, * आंकड़ा (ओं) से अनुमानित, [ मानक विचलन रिपोर्ट मानक त्रुटि से गणना की, [ ऑप्टिकल दाग लाइनों का उपयोग कर मापा विरूपण].

संरचनात्मक गुण सामग्री गुण
जानवरों अधिकतम बल (N) कठोरता (N/ अधिकतम तनाव (Mpa) युवा मापांक (एमपीए)
लेखक एन पृष्ठभूमि मतलब जेड एसडी COV(%) मतलब जेड एसडी सीओवी (%) मतलब जेड एसडी सीओवी (%) मतलब जेड एसडी सीओवी (%)
Boivin एट अल मांसपेशियों, लिगामेंट और Tendons जर्नल (2014)19 6 गैर मधुमेह दुबला नियंत्रण चूहों 8.1 $ 0.6 7.41 3.9 $ 0.7 17.95 Nr 16 ] 3.7 23.13
कोनिज़ो एट अल एनल्स ऑफ बायोमेडिकल इंजीनियरिंग (2014)32 10 डी बी/+ Nr 20.39 ] 2.43* 11.92 Nr 152.94 ] 44.12* 28.85
Eekhoff एट अल जर्नल ऑफ बायोमैकेनिकल इंजीनियरिंग (2017)33 8 एल्न +/ Nr 18.86 ] 3.37 17.87 10.55 ] 2.97 28.15 443.8 ] 131.7 29.68
Mikic एट अल. ऑर्थोपेडिक अनुसंधान के जर्नल (2006)34 20 C57BL/6-J x 129SV/जे Nr Nr 18 ] 5 27.78 61 ] 20 32.79
Probst एट अल खोजी सर्जरी के जर्नल (2000)22 20 बीएएलबी/ 8.4 $ 1.1 13.10 6.3 ] 1.2 19.05 Nr Nr
शू एट अल सहकर्मी जम्मू (2018)21 9 C57BL/6 9.6 ] 3.84 39.96 8.19 ] 3.63 44.32 27.55 ] 10.54 38.26 Nr
Sikes एट अल ऑर्थोपेडिक अनुसंधान के जर्नल (2018)35 7 C57BL/6 Nr Nr 19.53 ] 7.03 0.36 62.82 ] 20.20 32.16
वांग एट अल ऑर्थोपेडिक रिसर्च के जर्नल (2006)36 9 A/J 8.4 $ 1.2 14.29 12.2 ] 2.8 22.95 78.2 $ 8.6 11.00 713.9 ] 203.7 28.53
वांग एट अल ऑर्थोपेडिक रिसर्च के जर्नल (2006)36 8 C57BL/6J 10.2 $ 1.4 13.73 13.1 $ 2.5 19.08 97.4 $ 11.4 11.70 765.1 $ 179.6 23.47
वांग एट अल ऑर्थोपेडिक रिसर्च के जर्नल (2006)36 7 C3H/HeJ 12.5 $ 1.7 13.60 14.1 ] 3.2 22.70 97.5 $ 10.9 11.18 708.6 ] 127.8 18.04
वांग एट अल ऑर्थोपेडिक रिसर्च के जर्नल (2011)37 7 C57BL/6 6.6 ] 1.7 25.76 8.2 $ 1.4 17.07 13.4 ] 3.7 27.61 86.8 ] 15.5 17.86
झांग एट अल मैट्रिक्स जीवविज्ञान (2016)38 Nr सीडी-1 और C57BL/ 6.73 ] 3.74* 55.57 12.03 ] 3.34* 27.76 25.4 $ 15.14* 59.61 632.31 $ 113.79* 18.00
औसत COV 22.93 औसत COV 22.07 औसत COV 23.96 औसत COV 25.25
नई विधि 12 C57BL/6J 7.8 $ 1.08 13.91 13.19 ] 1.86 14.08 24.16 ] 5.42 22.45 73.17 ] 16.14 22.06

तालिका 2: अहिल्या कण्डरा के यांत्रिक गुण| इस बीच , साहित्य में रिपोर्ट किए गए लोगों की तुलना में नए तरीकों का उपयोग करके अनुमानित संरचनात्मक और भौतिक गुणों के लिए एसडी और सीओवी। [एनआर: रिपोर्ट नहीं, * आंकड़ा (ओं) से अनुमानित, [ मानक विचलन रिपोर्ट मानक त्रुटि से गणना].

पूरक फ़ाइलें. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें. 

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Discussion

Murine पशु मॉडल आमतौर पर कण्डरा विकारों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन उनके यांत्रिक गुणों की विशेषता चुनौतीपूर्ण और साहित्य में असामान्य है. इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य murine tendons के तन्य परीक्षण के लिए एक समय कुशल और पुन: उत्पादन विधि का वर्णन है. नई विधियों घंटे से मिनट के लिए एक नमूना का परीक्षण करने के लिए आवश्यक समय कम और पिछले तरीकों में एक आम समस्या थी कि एक प्रमुख मनोरंजक कलाकृति का सफाया.

इस प्रोटोकॉल में वर्णित कई कदम यांत्रिक रूप से परीक्षण murine superspinatus और Achilles tendons का उत्पादन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. सबसे पहले, कदम 1.1.4 वांछित हड्डी के एक 3 डी मॉडल बनाने के लिए आवश्यक है; हालांकि, इस स्कैन के लिए उपयोग किए जाने वाले सामान्यतया उच्च रिज़ॉल्यूशन के कारण, फ़ाइल का आकार ठोस मॉडलिंग प्रोग्राम के साथ उपयोग करने के लिए बहुत बड़ा हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर सफलतापूर्वक फ़ाइल के आकार को कम (चरण 1.1.6) और संरक्षित वस्तु ज्यामिति, हालांकि अन्य सॉफ्टवेयर भी इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए प्रभावी हो सकता है. दूसरा, प्रत्येक परमाणु साइट विशिष्ट डिजाइन मानदंड प्रभावी मनोरंजक के लिए विचार किया है. supraspinatus कण्डरा स्थिरता के डिजाइन के लिए, यह करने के लिए महत्वपूर्ण है: (i) विकास प्लेट विफलता को रोकने के लिए humeral सिर सुरक्षित (कदम 1.2.1.12), (ii) एक निकासी फिट है कि परीक्षण के दौरान मोल्ड से humerus हड्डी को अलग करने से बचा जाता है परिभाषित (कदम 1.2.1.12.1) और (पपप) गुदराणा की लंबी धुरी (चरण 1-2-1-7) के साथ 180 डिग्री कोण बनाने के लिए ह्यूमरस हड्डी को उन्मुख करें। Achilles कण्डरा स्थिरता डिजाइन के लिए, यह करने के लिए महत्वपूर्ण है: (i) एक निकासी फिट है कि परीक्षण के दौरान स्थिरता से बाहर फिसल के बिना छोटे कैल्केनस हड्डी पकड़ को परिभाषित करने और (ii) लंबे अक्ष के साथ एक 120 डिग्री कोण (30 डिग्री plantar flexion) बनाने के लिए कैल्केनस हड्डी उन्मुख कण्डरा की. तीसरा, कण्डरा पार अनुभागीय क्षेत्र का सही माप (चरण 2.1.2) सामग्री गुणों के निर्धारण के लिए इंजीनियरिंग तनाव की ठीक से गणना करने के लिए महत्वपूर्ण है। सुपरस्पिनाटस कण्डरा के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र को मापने के लिए, हम सलाह देते हैं कि हड्डी-टेंटन-मांसपेशी के माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी स्कैन एक फ्लैट बॉटम के साथ क्रायोट्यूब में निलंबित किए गए नमूने, साथ ही हड्डी को अपगोरोस के साथ ट्यूब में उल्टा रखा गया है। केवल ह्यूमरस हड्डी को अगारोस जेल में डाला जाना चाहिए, जबकि कण्डरा और मांसपेशियों के साथ ह्यूमरल सिर को हवा में स्कैन किया जाना चाहिए। के रूप में supraspinatus कण्डरा एक splayed ज्यामिति है के रूप में यह हड्डी में सम्मिलित करता है, पार अनुभागीय क्षेत्र को मापने के लिए सबसे सुसंगत तरीका कण्डरा की लंबाई के साथ न्यूनतम पार अनुभागीय क्षेत्र निर्धारित करने के लिए है. इसी तरह की प्रक्रिया Achilles कण्डरा के पार अनुभागीय क्षेत्र को मापने के लिए किया जाना चाहिए. Achilles कण्डरा के लिए, उच्च संकल्प microcomputed टोमोग्राफी स्कैन दो अलग ऊतकों से पता चलता है: कण्डरा उचित और आसपास के म्यान, जो एक हल्का छाया के रूप में प्रकट होता है. Achilles कण्डरा के लिए न्यूनतम पार अनुभागीय क्षेत्र का लगातार अनुमान लगाने के लिए, केवल कण्डरा उचित माप के लिए चुना जाना चाहिए (चित्र 5). अंत में, पकड़ पुन: प्रयोज्य हैं और नमूना से नमूना करने के लिए छोटे रूपों उनकी प्रभावशीलता को प्रभावित नहीं करते. प्रत्येक हड्डी एक बार स्कैन किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, वर्तमान अध्ययन के लिए, छोड़ humerus, सही humerus, और calcaneus) और एक 3 डी मॉडल प्रत्येक हड्डी के लिए बनाया जाना चाहिए. इसके अलावा, एक ही उम्र के जानवरों के लिए, हड्डी ज्यामिति लगभग समान है, इस प्रकार एक ही स्थिरता सभी नमूनों के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पांडुलिपि में, 3 डी मुद्रित जुड़नार 8 सप्ताह पुराने चूहों के लिए विशिष्ट (skeletally परिपक्व वयस्क चूहों) tendons परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. यह अलग पुरुष और महिला जुड़नार बनाने के लिए आवश्यक नहीं था. अन्य आयु समूहों के लिए (उदाहरण के लिए, 4 सप्ताह पुराने चूहों) या अद्वितीय हड्डी phenotypes के साथ चूहों, यह सिफारिश की है कि जुड़नार कि हड्डियों के विशेष geometries फिट निर्मित कर रहे हैं.

डिजाइन और जुड़नार के 3 डी मुद्रण के बाद, reproducibility और दृष्टिकोण की दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, एक ही पृष्ठभूमि और योजना बनाई अध्ययन की उम्र के चूहों से 10 कण्डरा नमूने आम तौर पर परीक्षण किया जाना चाहिए (सही नमूना आकार ऊतक के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और पशु मॉडल). इन टेंडनों के यांत्रिक गुणों को यह सुनिश्चित करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए कि संरचनात्मक और भौतिक गुणों के लिए विभिन्नता के गुणांक अपेक्षित सीमा के भीतर हैं, जैसा कि तालिका 1 और तालिका 2में वर्णित है। इन पायलट परीक्षणों को यह भी पुष्टि करनी चाहिए कि कृत्रिम विफलताएँ (उदा., ग्रोथ प्लेट विफलता) नहीं होती हैं। डिजाइन के कई चक्र, प्रोटोटाइप, और सत्यापन के लिए supraspinatus और Achilles tendons वर्तमान कागज में वर्णित के अलावा अन्य tendons के लिए वांछित परिणाम प्राप्त करने की जरूरत हो सकती है.

कई समूहों ने मौरीन टेंडन के यांत्रिक गुणों की सूचना दी है। इन अध्ययनों में विविधताओं के गुणांक आम तौर पर उच्च रहे हैं, अक्सर यह मुश्किल तुलना समूहों के बीच मतभेद लेने के लिए कर रही है. इसके अलावा, विभिन्न अध्ययनों के बीच मनोरंजक ऊतक में methodological मतभेद यह निर्धारित करने के लिए मुश्किल है कि विफलता गुण कण्डरा के लिए प्रासंगिक हैं या artifactual पकड़ विफलताओं के कारण बनाता है. मौजूदा पद्धतियों के साथ नए परीक्षण विधियों की तुलना करने के लिए, एक साहित्य समीक्षा की गई और 20 अध्ययनों के परिणामों को संक्षेप में प्रस्तुत किया गया (तालिका 1 और तालिका 2)। साहित्य में, supraspinatus कण्डरा यांत्रिक परीक्षण के लिए, अधिकतम बल के लिए भिन्नता के औसत गुणांक, कठोरता, अधिकतम तनाव, और मापांक थे 27%, 39%, 52%, और 45%, क्रमशः. Achilles कण्डरा यांत्रिक परीक्षण के लिए, अधिकतम बल, कठोरता, अधिकतम तनाव, और मापांक के लिए भिन्नता के औसत गुणांक थे 23%, 22%, 24%, और 25%, क्रमशः. वर्तमान अध्ययन में, murine tendons परीक्षण के लिए नई विधि भिन्नता के supraspinatus कण्डरा गुणांक और 6%-39% भिन्नता के Achilles कण्डरा गुणांक ों में कमी के एक 32%-63% कमी के परिणामस्वरूप.

हड्डियों को पकड़ के लिए कोई वर्तमान मानक पद्धति नहीं है, इस प्रकार यह स्पष्ट नहीं है कि किस हद तक artifactual मनोरंजक मुद्दों ने murine tendons के कथित यांत्रिक गुणों को प्रभावित किया है। अधिकांश समूहए एपॉक्सी राल13, पॉलीमेथिलमेथैक्रिलेट (पीएमएमए)14,15,या सायनोक्रिलेट16 का उपयोग करके ह्यूमरस हड्डी को पकड़ते हुए रिपोर्ट करते हैं और पीएमएमए14की दूसरी कोटिंग लगाकर ह्यूमरल सिर को सुरक्षित करते हैं , कस्टम स्थिरता का उपयोग कर39 और / इसी प्रकार, अन्य समूह कस्टम-निर्मित जुड़नार19,20, clamps21द्वारा लंगर , स्वयं प्लास्टिक सीमेंट22 का इलाज या एक शंकु आकार का उपयोग कर का उपयोग कर बहुत छोटे कैल्केनस हड्डी की पकड़ की रिपोर्ट स्लॉट22| हालांकि, इन विधियों कम reproducibility, उच्च artifactual विफलता दर, और समय लेने वाली तैयारी आवश्यकताओं द्वारा सीमित रहते हैं। इस अध्ययन में प्रस्तुत नए तरीकों artifactual पकड़ विफलताओं का सफाया कर दिया है और नमूनों की संख्या है कि एक दिन में परीक्षण किया जा सकता है तीन गुना है. इसके अलावा, इन तरीकों supraspinatus और Achilles tendons तक ही सीमित नहीं हैं, के रूप में वे आसानी से बड़े पशु मॉडल से अन्य murine tendons और tendons परीक्षण के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. बड़े जानवरों से tendons परीक्षण करने के लिए, तथापि, 3 डी मुद्रित स्थिरता सामग्री के मापांक पर्याप्त उच्च होना चाहिए कि यह कण्डरा की ताकत के सापेक्ष अनुरूप नहीं है परीक्षण किया जा रहा है.

कई अध्ययनों से पता चला है कि कण्डरा विकारों में लिंग आधारित अंतर यह दर्शाता है कि कण्डरा चोटकेबाद महिलाओं ने उपचार के बाद कार्य में कमी की है40 ,41,42. वर्तमान अध्ययन में, सेक्स murine tendons के यांत्रिक गुणों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा. के रूप में स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) द्वारा निर्देशित, हम पशु मॉडल जहां कण्डरा यांत्रिक गुण मापा जाएगा के अनुसंधान डिजाइन में एक जैविक चर के रूप में सेक्स के लिए लेखांकन की सिफारिश.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन को एनआईएच / एन आई एम एस (आर01 एआर055580, आर01 एआर057836) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100 Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose 
Bruker microCT  Bruker BioSpin Corp Skyscan 1272  Used by authors
ElectroForce  TA Instruments 3200 Testing platform
Ethanol 200 Proof Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips Custom made Used by authors
Kimwipes Kimberly-Clark  S-8115 As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan) Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
MilliQ water (Ultrapure water) Millipore Sigma QGARD00R1 (or related purifier) 100 ml 
Meshmixer Autodesk http://www.meshmixer.com/ Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS  Stratasys LTD Precision Prototyping
Objet Studio Stratasys LTD Used by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 10010031 2.5 L of 10% PBS 
S&T Forceps Fine Science Tools 00108-11 Used by authors
Scalpel Blade - #11 Fine Science Tools 10011-00 Used by authors
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools 10003-12 Used by authors
SkyScan 1272 Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
Skyscan CT-Vox Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SkyScan NRecon Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SolidWorks CAD Dassault Systèmes SolidWorks Research Subsription Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue Loctite 234790 As suggested in protocol
Testing bath Custom made Used by authors
Thin film grips  Custom made Used by authors
VeroWhitePlus Stratasys LTD NA 3D printing material used by authors
WinTest  WinTest Software Used by authors to collect data

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बायोइंजीनियरिंग अंक 152 3 डी मुद्रण योज्य विनिर्माण कण्डरा murine tendons enthesis biomechanics
Murine Tendons के बायोमैकेनिकल परीक्षण
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Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham,… More

Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. J. Vis. Exp. (152), e60280, doi:10.3791/60280 (2019).

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