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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Teste biomecânico de tendões murinos

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60280
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Department of Orthopedic Surgery, Columbia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

Summary

O protocolo descreve métodos de teste biomecânicos de tração eficientes e reprodutíveis para tendões murinos através do uso de luminárias impressas em 3D personalizadas.

Abstract

As desordens do tendão são comuns, afetam povos de todas as idades, e são frequentemente debilitantes. Tratamentos padrão, como drogas anti-inflamatórias, reabilitação e reparo cirúrgico, muitas vezes falham. A fim de definir a função tendínea e demonstrar a eficácia de novos tratamentos, as propriedades mecânicas dos tendões de modelos animais devem ser determinadas com precisão. Os modelos animais murinos são agora amplamente utilizados para estudar distúrbios tendíneos e avaliar novos tratamentos para tendinopatias; no entanto, determinar as propriedades mecânicas dos tendões do mouse tem sido desafiador. Neste estudo, um novo sistema foi desenvolvido para testes mecânicos tendinosos que incluem luminárias impressas em 3D que correspondem exatamente às anatomias do úmero e do calcâneo para testar mecanicamente tendões supraespinal e tendões de Aquiles, respectivamente. Estes dispositivos elétricos foram desenvolvidos usando reconstruções 3D de anatomia óssea nativa, modelagem sólida e manufatura aditiva. A nova abordagem eliminou falhas de preensão vesícula (por exemplo, falha na falha da placa de crescimento em vez do tendão), tempo de teste global diminuído e maior reprodutibilidade. Além disso, este novo método é prontamente adaptável para o teste de outros tendões e tendões murinos de outros animais.

Introduction

As desordens tendíneas são comuns e altamente prevalentes entre as populaçõesdeenvelhecimento, Atléticoe ativo1,2,3. Nos Estados Unidos, 16,4 milhões lesões do tecido conjuntivo são relatadas a cada ano4 e respondem por 30% de todas as visitas de consultório médico relacionadas a lesões3,5,6,7, a 8. Os sítios mais comumente afetados incluem o manguito rotador, o tendão de Aquiles e o tendão patelar9. Embora uma variedade de tratamentos não operativos e operativos tenha sido explorada, incluindo fármacos anti-inflamatórios, reabilitação e reparação cirúrgica, os resultados permanecem pobres, com retorno limitado à função e altas taxas de falha5, a 6. Estes resultados clínicos pobres motivaram estudos básicos e translacional que procuram compreender a tendinopatia e desenvolver aproximações novas do tratamento.

As propriedades biomecânicas elásticas são os desfechos quantitativos primários que definem a função tendínea. Conseqüentemente, a caracterização do laboratório da tendinopatia e da eficácia do tratamento deve incluir um teste rigoroso de propriedades elásticas do tendão. Inúmeros estudos descreveram métodos para determinar as propriedades biomecânicas de tendões de modelos animais como ratos, ovinos, cães e coelhos10,11,12. No entanto, poucos estudos testaram as propriedades biomecânicas dos tendões murinos, principalmente devido às dificuldades em prender os pequenos tecidos para testes de tração. Como os modelos murinos têm inúmeras vantagens para o estudo mecanisticamente tendinopatia, incluindo a manipulação genética, extensas opções de reagentes e baixo custo, o desenvolvimento de métodos precisos e eficientes para testar biomecanicamente os tecidos murinos é necessário.

A fim testar corretamente as propriedades mecânicas dos tendões, o tecido deve ser agarrado eficazmente, sem deslizar ou rasgar vesícula na relação do aperto ou no fraturamento da placa do crescimento. Em muitos casos, particularmente para tendões curtos, o osso é agarrado em uma extremidade e o tendão é agarrado na outra extremidade. Os ossos são tipicamente fixados incorporando-os em materiais tais como aresina de colaEpoxy13 e o polimetilmetacrilato14,15. Os tendões são frequentemente colocados entre duas camadas de lixa, coladas com cianoacrilato, e fixadas usando grampos de compressão (se a seção transversal é plana) ou em um meio congelado (se a seção transversal é grande)15,16,17 . Estes métodos têm sido aplicados a testes biomecânicos de tendões murinos, mas os desafios surgem devido ao pequeno tamanho dos espécimes e à conformidade da placa de crescimento, que nunca ossifica18. Por exemplo, o diâmetro da cabeça úmero murino é somente alguns milímetros, assim fazendo a preensão do osso difícil. Especificamente, os testes de tração de amostras de tendão-osso murino supraespinal muitas vezes resultam em falha na placa de crescimento, em vez de no tendão ou na entese do tendão. Da mesma forma, o teste biomecânico do tendão de Aquiles é desafiador. Embora o tendão de Aquiles seja maior do que outros tendões murinos, o calcâneo é pequeno, dificultando a preensão deste osso. O osso pode ser removido, seguido por agarrar as duas extremidades do tendão; Entretanto, isto impede o teste do acessório do tendão-à-osso. Outros grupos relatam prender o osso do calcâneo usando dispositivos elétricos feitos medida19,20, ancorando pelas braçadeiras21, fixando no cimento plástico22 da cura do auto ou usando um entalhe cônico22, contudo estes os métodos anteriores permanecem limitados pela baixa reprodutibilidade, por taxas de falha de preensão elevadas, e por exigências tediosas da preparação.

O objetivo do presente estudo foi desenvolver um método preciso e eficiente para testes biomecânicos de tração de tendões murinos, com foco nos tendões supraespinal e Aquiles como exemplos. Usando uma combinação de reconstruções 3D da anatomia nativa do osso, da modelagem contínua, e da fabricação aditiva, um método novo foi desenvolvido para segurar os ossos. Estes dispositivos elétricos efetivamente garantiu os ossos, impediu a falha da placa de crescimento, diminuição do tempo de preparação do espécime, e aumento da reprodutibilidade do teste. O novo método é prontamente adaptável para testar outros tendões murinos, bem como tendões em ratos e outros animais.

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Protocol

Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Columbia. Camundongos utilizados neste estudo foram de um fundo C57BL/6J e foram comprados no laboratório Jackson (Bar Harbor, ME, EUA). Eles foram alojados em condições de barreira livre de patógenos e foram fornecidos alimentos e água ad libitum.

1. desenvolvimento de Custom-Fit 3D impresso luminárias para prender o osso

  1. Aquisição de imagem óssea e construção de modelos ósseos 3D
    1. Dissecar o osso do interesse na preparação para a criação do modelo 3D e a impressão do aperto do osso 3D; o úmero e o calcâneo são usados como exemplos no protocolo atual.
      Nota: instruções detalhadas para dissecar espécimes osso-tendão-músculo para testes mecânicos são fornecidas na etapa 2.1.1. Os seguintes passos devem ser seguidos para isolar os ossos com a finalidade de criar apertos ósseos impressos em 3D.
      1. Dissecção do úmero: Eutanizar um rato por procedimento aprovado pelo IACUC. Remova a pele da extremidade superior, remova todos os músculos sobre o úmero, desarticule o cotovelo e as junções glenoumeral, e remova com cuidado todos os tecidos conexivos Unidos ao úmero.
      2. Dissecção do calcâneo: Eutanizar um rato por procedimento aprovado pelo IACUC. Remova a pele da extremidade mais baixa, desarticule a junção do tendão-calcâneo de Aquiles e as junções entre o calcâneo e os outros ossos do pé, e remova com cuidado todos os tecidos conexivos Unidos ao calcâneo.
    2. Realize uma tomografia computadorizada de todo o osso, por exemplo, analise as amostras de úmero e calcâneo.
      Observação: dependendo do scanner usado, as configurações serão diferentes. Para o scanner utilizado no estudo atual (tabela de materiais), as configurações recomendadas são: digitalizar a uma energia de 55 kVp, Al 0,25 filtro, com uma resolução de 6 μm.
      1. Misture o pó do agarose na água ultrapura e na microonda para 1-3 minutos até que o agarose esteja dissolvido completamente. É útil para microondas para 30-45 s, parar e redemoinho, e depois continuar para ferver. Encha os criotubos até três quartos cheios com agarose. Deixe o agarose esfriar por cerca de 5-10 min.
      2. Insira o osso no gel de agarose (isso impedirá artefatos de movimento durante a digitalização). Insira um criotubo com osso no scanner.
        Nota: para o scanner utilizado no estudo atual, um trocador automático de amostras de 16 posições foi usado para todos os exames. Este scanner pode selecionar automaticamente a ampliação de acordo com o tamanho e a forma de uma amostra.
    3. Reconstrua imagens da projeção da varredura do tomography microcomputado em imagens do cross-section. Use os parâmetros recomendados para a combinação de scanner/software do experimentador.
      Nota: para o programa utilizado no presente estudo (tabela de materiais) recomenda-se a utilização dos seguintes parâmetros de reconstrução: suavização: 0-2, correção de endurecimento por feixe: 45, redução de artefactos em anel: 4-9 e para reconstruir fatias em TIFF de 16 bits Formato.
    4. Crie um modelo 3D e salve em um formato STL padrão compatível com a maioria das impressoras 3D e prototipagem rápida. Para o programa utilizado no estudo atual (tabela de materiais), faça o seguinte:
      1. Selecione o arquivo de comando > abrir para abrir o conjunto de dados de arquivo. Abra o arquivo de diálogo > preferências e selecione a guia avançado .
      2. Use o algoritmo de renderização adaptável para construir os modelos 3D. Este algoritmo minimiza o número de triângulos faceta e fornece detalhes de superfície mais suaves. Use 10 como o parâmetro de localidade; Este parâmetro define a distância em pixels para o ponto vizinho usado para localizar a borda do objeto. Minimize a tolerância para 0,1 para diminuir o tamanho do arquivo.
        Nota: depois de abrir o conjunto de dados, as imagens são mostradas na página "imagens RAW".
      3. Para especificar o volume de juros (VOI), selecione manualmente duas imagens para definir como a parte superior e inferior do intervalo VOI selecionado.
      4. Mover para a segunda página, região de interesse. Selecione manualmente a região de interesse em uma única imagem de seção transversal.
        Observação: a região selecionada será destacada em vermelho (ou seja, a área de corte transversal do úmero).
      5. Repita a etapa anterior a cada 10 – 15 imagens de seção transversal.
      6. Mover para a terceira página seleção binária. No menu do histograma, clique em do conjunto de dados. A distribuição do histograma de brilho de todas as imagens do conjunto de dados será mostrada. Também no menu do histograma, clique no menu criar um arquivo de modelo 3D .
    5. Salve um modelo 3D do osso no formato de arquivo STL.
    6. Refine a malha: manipule a malha para reduzir o tamanho do arquivo STL e torne-o compatível com qualquer programa de design assistido por computador de modelagem sólida. Para o programa utilizado no estudo atual (tabela de materiais), siga os passos abaixo:
      1. Importe malha e selecione tudo para editar. Escolha reduzir do conjunto de ferramentas Editar. Em seguida, selecione orçamento do triângulo no conjunto de ferramentas reduzir destino. Reduza a contagem tri e aceite as alterações. Salve novamente o arquivo recém-reduzido no formato STL escolhendo Exportar como...
  2. Projeto de dispositivos elétricos do osso do costume-ajuste
    1. Osso tendão-úmero de supraspinatus
      1. Use um programa de desenho assistido por computador de modelagem sólida para criar um modelo de ajuste personalizado de dispositivo elétrico de preensão de úmero (Figura 1, arquivos suplementares).
        Nota: o programa utilizado no estudo atual está listado na tabela de materiais.
      2. Abra o arquivo de formato STL do osso úmero em um programa de modelagem sólida e salve como um arquivo de peça.
        Nota: para o software utilizado no estudo atual (tabela de materiais), o objeto ósseo 3D foi salvo no formato SLDPRT.
      3. Abra o arquivo de peça e crie manualmente três planos anatomicamente relevantes (ou seja, sagital, coronal, transversal).
        1. Definir manualmente o plano sagital para cortar através do acessório do tendão do supraespinal na tuberosidade maior. Assegure-se de que o bloco 3D contenha o plano sagital como um plano de simetria. Para conseguir isso, adicione ou corte material do bloco, se necessário.
          Nota: este plano de simetria assegura que quando o espécime é introduzido nos dispositivos elétricos o tendão e o acessório do tendão são situados no eixo central do dispositivo elétrico.
      4. Medir as dimensões do osso ao longo de cada um dos três planos (ou seja, altura, largura, comprimento).
      5. Meça as dimensões dos apertos mecânicos do teste onde o dispositivo elétrico impresso 3D será Unido.
      6. Comece por projetar uma peça de bloco sólido (por exemplo, um cilindro sólido).
        1. Assegure-se de que cada dimensão do bloco seja pelo menos 5 milímetros maior do que as dimensões do úmero.
        2. Conta para restrições de design de alças de testes mecânicos (ou seja, garantir que o dispositivo elétrico impresso em 3D pode ser montado e desmontado livremente nos apertos de teste mecânicos).
      7. Crie um modelo de montagem com dois componentes: o bloco sólido e o osso do úmero direito ou esquerdo. Definir a orientação do osso dentro do bloco (ou seja, o ângulo entre o tendão e o osso). Assegure-se de que todo o volume ósseo caiba dentro do bloco.
      8. Crie uma cavidade no bloco usando o osso do úmero como o molde. Se estiver usando o software especificado na tabela de materiais, siga as seguintes etapas:
        1. Insira a peça de design (úmero) e a base do molde (bloco de cilindros) em uma montagem provisória. Na janela de montagem, selecione o bloco e clique em Editar componente na barra de ferramentas do assembly .
        2. Clique em inserir > recursos > cavidade. Selecione dimensionamento uniforme e insira 0% como o valor a ser dimensionado em todas as direções.
      9. Suprimir a parte óssea e salvar a montagem como uma peça.
      10. Parte aberta (cilindro com cavidade). Corte a peça ao longo do plano sagital para criar dois componentes simétricos que se encaixam no osso anterioramente e posteriormente (por exemplo, dois cilindros de meio, como visto na Figura 1).
        Nota: dois componentes são projetados que cabem o osso anteriormente e posterior. O componente anterior inclui uma meia cavidade esférica-dada forma estendida do lado anterior da cabeça úmero até o acessório do tendão do supraespinal. A cavidade do componente posterior é moldada como a parte posterior do úmero (i.e., lado posterior da cabeça do úmero, tuberosidade deltóide e epicôndilo medial e lateral).
      11. Salve cada componente como uma parte separada do arquivo.
      12. Para o componente anterior, assegure-se de que a cabeça do úmero esteja encaixada na cavidade da peça definindo tolerâncias apropriadas.
        Nota: no estudo atual, usando o software especificado na tabela de materiais, sugere-se seguir os passos abaixo:
        1. Crie um corte revolvido para suavizar a geometria da malha da cavidade. Crie um esboço para o corte emulando a geometria da cavidade e adicionando uma folga locacional.
          Nota: a folga permite a montagem e desmontagem livres entre o osso e o componente anterior.
      13. Modifique o componente posterior para imitar a geometria da cavidade para criar um corte que adicione folga, como descrito acima para o componente anterior.
      14. Faça um corte no plano transversal a partir do topo do componente posterior até a crista do tubérculo maior/menor.
        Nota: como visto na Figura 1 e na Figura 2, o componente posterior inclui um corte que cria uma abertura no acessório do tendão.
      15. Crie um ajuste confortável entre os dois componentes para permitir a montagem e desmontagem livres.
        Nota: um furo-eixo cabido com uma folga running frouxa foi criado para os dispositivos elétricos no estudo atual.
      16. Crie modelos de espelhos 3D para cada componente do acessório para o membro oposto (ou seja, esquerda ou direita).
      17. Adicione um etch na parte inferior dos dispositivos elétricos para distinguir entre os lados esquerdo e direito.
      18. Salve todas as peças de fixação no formato de arquivo padrão STL em preparação para impressão 3D.
    2. Tendão de Aquiles-osso calcâneo
      1. Siga as mesmas etapas descritas acima para o dispositivo elétrico principal supraspinatus-humeral.
        Nota: apenas um conjunto de luminárias é necessário para o calcâneo-Aquiles, uma vez que a anatomia dos ossos do calcâneo esquerdo e direito é quase simétrica.

2. testes biomecânicos de tendões murinos

  1. Preparação de amostras e medição da área transversal
    1. Dissecar o músculo-tendão-osso do interesse na preparação para o teste mecânico elástico. No estudo atual, espécimes do osso do músculo-tendão-úmero do supraespinal (n = 10, 5 machos, 5 fêmeas) e músculo do gastrocnêmio-espécimes do osso do tendão-calcâneo de Aquiles (n = 12, 6 machos, 6 fêmeas) foram isolados dos ratos C57Bl/6J velhos da semana 8.
      1. Dissecção do espécime do osso do músculo-tendão-úmero do supraespinal
        1. Eutanizar um rato por procedimento aprovado pelo IACUC. Posicione o mouse em uma posição propensa. Faça uma incisão na pele de cima do cotovelo da pata para o ombro.
        2. Retire cuidadosamente a pele com dissecção contundente para que a musculatura do ombro seja visível. Retire o tecido em torno do úmero até que o osso é exposto e pode ser mantido firmemente com fórceps.
        3. Segure o úmero com fórceps e Retire cuidadosamente os músculos deltóide e trapézios para expor o arco coracoacromial. Identifique a articulação acromioclavicular e separe cuidadosamente a clavícula do acrômio com uma lâmina de bisturi.
        4. Tomando o cuidado para não danificar o tendão do supraespinal e seu acessório ósseo, remova o músculo de seu acessório escapular usando uma lâmina do bisturi. Tomando o cuidado para não danificar o tendão do supraespinal e seu acessório ósseo, separe a cabeça úmero do glenoid; usando uma lâmina de bisturi, dilacerar a cápsula articular e os tendões infraspinatus, subscapularis e teres Minor.
        5. Desarticular a articulação do cotovelo para separar o úmero da ulna e do raio. Isole o espécime do tendão-músculo do úmero-supraespinal e limpe fora dos tecidos macios excedentes no úmero e na cabeça úmero.
      2. Dissecção do tendão de Aquiles-amostra óssea do calcâneo
        1. Eutanizar um rato por procedimento aprovado pelo IACUC. Posicione o mouse em uma posição propensa. Tomando o cuidado para não danificar o tendão de Aquiles e seu acessório ósseo, remova a pele com dissecção sem corte de modo que a musculatura em torno das junções do tornozelo e do joelho esteja exposta.
        2. Usando uma lâmina do bisturi, começando no acessório do tendão-calcâneo de Achilles, retire com cuidado o músculo do gastrocnêmio de seus anexos proximal.
        3. Desarticular cuidadosamente o calcâneo dos vários ossos adjacentes. Isolar o tendão de Aquiles-calcâneo espécime e limpar o excesso de tecidos moles.
    2. Determine a área transversal do tendão usando tomografia computadorizada.
      Nota: para o scanner utilizado no estudo atual (tabela de materiais), as configurações recomendadas são: digitalizar a uma energia de 55 kVp, Al 0,25 filtro, com uma resolução de 5 μm.
      1. Misture o pó do agarose na água ultrapura e na microonda para 1-3 minutos até que o agarose esteja dissolvido completamente. É útil para microondas para 30-45 s, parar e redemoinho, e depois continuar para ferver. Encha os criotubos até três quartos cheios com agarose. Deixe o agarose esfriar por cerca de 5-10 min.
      2. Suspenda o espécime no criotubo introduzindo o osso upside-down.
        Nota: apenas o osso deve estar no gel de agarose. O tendão e o músculo devem ser suspensos lá fora.
    3. Após a varredura, remova delicadamente o músculo do tendão usando a lâmina do bisturi. Insira a amostra no dispositivo impresso em 3D.
      Nota: as alças são reutilizáveis para cada teste. Não use cola ou epóxi no dispositivo elétrico; o osso é mantido em um ajuste da imprensa.
    4. Insira e cole o tendão entre um papel de tecido fino dobrado (2 cm x 1 cm) e prenda a construção usando apertos de filme fino. Fixe o dispositivo impresso 3D com a amostra nos apertos de teste.
    5. Insira a amostra e as alças em um banho de teste de fosfato salina tamponado (PBS) a 37 ° c (ou seja, a temperatura do corpo do mouse23).
  2. Testes de tração
    1. Execute o teste mecânico elástico em um frame de teste material.
      Observação: para o quadro de teste usado no estudo atual (tabela de materiais), o protocolo recomendado é:
      1. Defina o comprimento do calibre como a distância do acessório do tendão à aderência superior.
      2. Pré-requisito com 5 ciclos entre 0, 5 N e 0,2 N.
      3. Segure por 120 s.
      4. Use uma tensão à falha de 0.2%/s.
    2. Colete dados de deformação de carga.
    3. Calcule a deformação como o deslocamento em relação ao comprimento do calibre inicial do tendão.
    4. Calcule o stress como a força dividida pela área transversal do tendão inicial (medida do microCT).
    5. Se estiver interessado em comportamento viscoelástico, realize um relaxamento de estresse antes do teste de tensão para falha e use os dados para calcular parâmetros como a, B, C, Tau1 e Tau2 do modelo viscoelástico equações24.
    6. A partir da curva de deformação da carga, calcule a rigidez (inclinação da porção linear da curva), a força máxima e o trabalho a produzir (a área a curva até a força de escoamento).
      1. Identifique a porção linear escolhendo uma janela de pontos na curva de deformação de carga que maximiza o valor de R2 para uma regressão linear de mínimos quadrados25.
      2. Determine a rigidez como a inclinação da porção linear da curva de deslocamento de carga25,26.
    7. A partir da curva de deformação de tensão, calcule o módulo (inclinação da porção linear da curva), a força (tensão máxima) e a resiliência (área a curva até a tensão de escoamento).
      Nota: usando o algoritmo RANSAC, a deformação de rendimento (valor x) é definida como o primeiro ponto quando o ajuste y se desviou mais de 0,5% do valor de tensão esperado (valor y). A tensão de escoamento é o valor y correspondente da cepa de escoamento.
      Nota: além do carregamento de tração monotônico à falha descrita no estudo atual, o carregamento cíclico pode fornecer informações importantes sobre a fadiga do tendão e/ou propriedades viscoelásticas. Por exemplo, Freedman et al. relataram Propriedades de fadiga dos tendões murinos de Aquiles27.
    8. Após a conclusão do teste de tração, realize uma tomografia computadorizada de todo o osso, por exemplo, analise as amostras de úmero e calcâneo.
      Nota: para o scanner utilizado no estudo atual (tabela de materiais), as configurações recomendadas são: digitalizar a uma energia de 55 kVp, Al 0,25 filtro, com uma resolução de 6 μm.
      1. Repita as etapas 1.1.2.1 – 1.1.2.2.
    9. Repita a etapa 1.1.3.
    10. Use um programa de visualização 3D compatível com o scanner para criar um modelo 3D renderizado por volume do objeto digitalizado.
      Nota: o programa utilizado no estudo atual está listado na tabela de materiais.
    11. Determine o modo de falha e a área do site de falha inspecionando o objeto 3D.
  3. Análise estatística: mostrar todos os resultados da amostra como média ± desvio padrão (DP). Fazer comparações entre grupos usando testes t de Student (bicaudal e não emparelhado). Definir significância como p < 0, 5.
    Nota: o software estatístico utilizado no presente estudo está listado na tabela de materiais.

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Representative Results

os dispositivos elétricos 3D-Printed foram usados para testar o supraespinal murino velho de 8 semanas e os tendões de Achilles. Todas as amostras testadas mecanicamente falharam na entese, caracterizada por exames de microtomografia, inspeção visual e análise de vídeo após testes de tração. Uma comparação um-para-um dos métodos anteriores e atuais para o teste do tendão do supraespinal em nosso laboratório é mostrada na Figura 3. No método anterior28,29,30, o osso do úmero foi encaixado na cola Epoxy e um grampo de papel foi coloc sobre a cabeça úmero em um esforço para impedir a fratura da placa do crescimento. 4-6 horas foram necessárias para permitir a cura da epoxi totalmente (Figura 3), permitindo que apenas 6-8 espécimes sejam testados em um dia típico. Uma limitação mais adicional da aproximação era a eficácia usuário-dependente da colocação do grampo de papel para impedir a fratura da placa do crescimento. Os resultados dos testes utilizando estes métodos anteriores foram altamente variáveis, com coeficientes de variação na ordem de 30% para a maioria dos parâmetros e taxas de falha de placa de crescimento de aproximadamente 10% – 20%. Como resumido na Figura 3, o tempo de preparo dos espécimes utilizando os novos métodos foi diminuído para 5 – 10 minutos, tornando-o prático para testar 16 – 20 amostras por dia. Além disso, as falhas da placa de crescimento foram eliminadas.

Comparado com a metodologia relatada por outros para o teste de tendões murinos14,15,17,25,28,29,30,31 ,32,33, os novos métodos foram mais eficientes e reprodutíveis. Para os tendões do supraespinal, as propriedades estruturais como a carga máxima (3,8 ± 0,6 n) e a rigidez (12,7 ± 1,8 n/mm), bem como as propriedades do material normalizado, como o estresse máximo (8,7 ± 3,0 MPa) e o módulo (51,7 ± 13,5 MPa), apresentaram coeficientes consideravelmente mais baixos de variações comparadas aos resultados da literatura (tabela 1). Para o tendão de Aquiles, propriedades mecânicas como carga máxima (7,8 ± 1,1 n) e rigidez (13,2 ± 1,9 n/mm) apresentaram menores coeficientes de variações em relação aos resultados da literatura19,21,22 ,32,33,34,35,36,37,38, Considerando que a tensão máxima (24,2 ± 5,4 MPa) e o módulo (73,2 ± 22,1 MPa) apresentaram coeficientes de variações semelhantes aos relatados na literatura (tabela 2).

O sexo animal teve efeito significativo nas propriedades mecânicas do supraespinal e dos tendões de Aquiles (Figura 4). Ao comparar os tendões do supraespinal masculino e feminino, houve aumentos significativos na força máxima (p = 0, 2) e trabalho para o rendimento (p = 0, 8). Houve tendência entre os dois grupos para rigidez (p = 0, 57), estresse (p = 0, 68), módulo (p = 0, 61) e resiliência (p = 0, 78). Ao comparar tendões de Aquiles masculinos e femininos, houve aumentos significativos no estresse máximo (p = 0, 6) e resiliência (p = 0, 19). Houve tendência entre os dois grupos para o trabalho de produção (p = 0, 79), e módulo (p = 0, 74) e não houve diferença para força máxima (p = 0,1880) e rigidez (p = 0,6759).

Figure 1
Figura 1: modelos 3D representativos dos dispositivos elétricos para o úmero (fileira superior) e o calcâneo (fileira inferior). (A) modelos 3D dos ossos. (B) modelos desmontados dos dispositivos elétricos. (C) modelos montados dos dispositivos elétricos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: dispositivos elétricos impressos 3D representativos. (A) dispositivo elétrico para o teste biomecânico de tendões do supraespinal de ratos velhos de 8 semanas em um ângulo de 180 ° entre o tendão do úmero e do supraespinal. (B) dispositivo elétrico para o teste biomecânico de tendões do supraespinal de ratos velhos de 8 semanas em um ângulo de 135 ° entre o tendão do úmero e do supraespinal. (C) fixação para testes biomecânicos de tendões murinos de Aquiles em um ângulo de 120 ° entre o calcâneo e o tendão de Aquiles. (D) dispositivo elétrico para o teste biomecânico de tendões do supraespinal de ratos adultos de Sprague Dawley em um ângulo de 180 ° entre o tendão do úmero e do supraespinal. Barra de escala: 5 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: comparação dos métodos prévios e atuais para o teste mecânico de tendões murino supraespinal. (A) métodos prévios de preparação de amostras utilizados em nosso laboratório antes do teste mecânico: o úmero foi potted na cola Epoxy até a cabeça úmero para estabilizar o osso, um grampo de papel foi coloc sobre a cabeça úmero para impedir a fratura da placa do crescimento, e, para a cola Epoxy para curar, os espécimes foram deixados na temperatura ambiente por 4-6 horas antes do teste mecânico. (B) métodos de preparação de amostras utilizados no estudo atual (etapas 1,2 e 2.1.4): o canto superior esquerdo mostra uma representação 3D dos dispositivos elétricos como produzidos por um programa de modelagem sólida. Os dispositivos elétricos impressos 3D são reutilizáveis e facilmente montados e desmontados. A extremidade do osso do espécime é inserida nos dispositivos elétricos, prendendo a placa do crescimento e expondo o tendão para prender e testar. A extremidade do tendão é colada entre um papel de tecido fino dobrado e inserida nas alças. O tempo de preparação para cada espécime é de 10 – 15 minutos. (C) curvas representativas da carga-deformação para o teste elástico do tendão do supraespinal usando métodos atuais. (D) curva representativa da carga-deformação para o teste elástico do tendão do supraespinal que mostra uma falha da placa do crescimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: efeito sexual sobre as propriedades mecânicas dos tendões supraespinal (SST) e Aquiles (ACHT). Houve efeito significativo do sexo em muitas das propriedades mecânicas com base em testes t não pareados (* efeito sexual, p < 0, 5). Dados mostrados como média ± desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: medição da área transversal da Microtc. (A) medida mínima da área transversal ao longo do comprimento do tendão do supraespinal. (B) medição mínima da área transversal ao longo do comprimento do tendão de Aquiles. Somente o tendão apropriado deve ser selecionado para a medida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Propriedades estruturais Propriedades do material
Animais Força máxima (N) Rigidez (N/mm) Max stress (MPa) Módulo (MPa)
Autor N Fundo Média ± DP COV (%) Média ± DP COV (%) Média ± DP COV (%) Média ± DP COV (%)
Beason et al. revista de cirurgia de ombro e cotovelo (2013)15 10 C57Bl/6 0,93 ± 0,34 36,56 95.1 ± = 41,85 3.40 ± 1.56 45,88 312.8 ± 127.0 40,60
Bell et al. revista de pesquisa ortopédica (2014)31 6 C57Bl/6 1,22 ± 0,52 42,62 2,37 ± 1,6 67,51 Nr Nr
Cong et al. revista de pesquisa ortopédica (2018)17 8 C57Bl/6 5,38 ± 2,404 # 44,68 4,25 ± 1,67 # 39,29 Nr Nr
Connizzo et al. anais de Engenharia Biomédica (2014)32 10 NR (DB/+) Nr 84,44 ± 27,23 * † 32,25 Nr 476 ± 186,27 * 39,13
Connizzo et al. revista de Engenharia Biomédica (2013)14 Nr C57/BL6 Nr Nr Nr 297 ± 148,90 * 50,13
Deymier et al. acta Biomaterialia (2019)28 12 Rato de CD-1 IGS (WT) 5,0 ± 0,7 14 9,2 ± 2,9 31,52 33 ± 35 106, 6 Nr
EEKHOFF et al. revista de Engenharia Biomédica (2017)33 13 ELN +/+ Nr 8,50 ± 2,95 34,71 5,96 ± 3,23 54,19 101,2 ± 50,8 50,20
Killian et al. FASEB Journal (2016)29 8 C57BL/6 Nr Nr 7,79 ± 2,61 * 33,50 58,32 ± 31,73 * 54,41
Schwartz et al. Bone (2014)25 20 Rato de CD-1 IGS (WT) 4,11 ± 0,79 * 19,22 8,58 ± 3,78 * 44, 6 12,29 ± 5,95 * 48,41 133,80 ± 59,41 * 44,40
Schwartz et al. desenvolvimento (2015)30 12 (Rosa-DTA (DTA) x Gli1-CreERT2) O ScxCre; Smofl/FL (WT) 4,16 ± 0,29 * 6,97 11, 4 ± 1,98 * 17,93 26,24 ± 5,81 22,14 121,89 ± 44,18 36,25
Média COV 27,34 Média COV 38,64 Média COV 51,70 Média COV 45, 2
Método New 10 C57BL/6J 3,79 ± 0,62 16,41 12,73 ± 1,81 14,20 8,71 ± 3, 4 34,91 51,67 ± 13,54 26,20

Tabela 1: propriedades mecânicas dos tendões do supraespinal. Média ± DP e coeficiente de variação (COV) para as propriedades estruturais e materiais estimadas por meio de novos métodos comparados aos relatados na literatura. [NR: não relatado, * estimado a partir de figura (s), # desvio padrão calculado a partir de erro padrão relatado, † deformação medida usando linhas de mancha óptica].

Propriedades estruturais Propriedades do material
Animais Força máxima (N) Rigidez (N/mm) Max stress (MPa) Módulo de Young (MPa)
Autor N Fundo Média ± DP COV (%) Média ± DP COV (%) Média ± DP COV (%) Média ± DP COV (%)
Boivin et al. jornal dos músculos, ligamentos e tendões (2014)19 6 Camundongos não diabéticos de controle enxuto 8,1 ± 0,6 7,41 3,9 ± 0,7 17,95 Nr 16 ± 3,7 23,13
Connizzo et al. anais de Engenharia Biomédica (2014)32 10 DB/+ Nr 20,39 ± 2,43 * 11,92 Nr 152,94 ± 44,12 * 28,85
EEKHOFF et al. jornal de engenharia biomecânica (2017)33 8 ELN +/+ Nr 18,86 ± 3,37 17,87 10,55 ± 2,97 28,15 443,8 ± 131,7 29,68
Mikic et al. jornal de pesquisa ortopédica (2006)34 20 C57BL/6-J x 129SV/J Nr Nr 18 ± 5 27,78 61 ± 20 32,79
Probst et al. jornal de cirurgia investigativa (2000)22 20 BALB/c 8,4 ± 1,1 13,10 6,3 ± 1,2 19, 5 Nr Nr
Shu et al. peer J (2018)21 9 C57BL/6 9,6 ± 3,84 39,96 8,19 ± 3,63 44,32 27,55 ± 10,54 38,26 Nr
Sikes et al. jornal de pesquisa ortopédica (2018)35 7 C57BL/6 Nr Nr 19,53 ± 7, 3 0,36 62,82 ± 20,20 32,16
Wang et al. revista de pesquisa ortopédica (2006)36 9 A/J 8,4 ± 1,2 14,29 12,2 ± 2,8 22,95 78,2 ± 8,6 11, 0 713,9 ± 203,7 28,53
Wang et al. revista de pesquisa ortopédica (2006)36 8 C57BL/6J 10,2 ± 1,4 13,73 13,1 ± 2,5 19, 8 97,4 ± 11,4 11,70 765,1 ± 179,6 23,47
Wang et al. revista de pesquisa ortopédica (2006)36 7 C3H/HeJ 12,5 ± 1,7 13,60 14,1 ± 3,2 22,70 97,5 ± 10,9 11,18 708,6 ± 127,8 18, 4
Wang et al. revista de pesquisa ortopédica (2011)37 7 C57BL/6 6,6 ± 1,7 25,76 8,2 ± 1,4 17, 7 13,4 ± 3,7 27,61 86,8 ± 15,5 17,86
Zhang et al. biologia matricial (2016)38 Nr CD-1 e C57BL/6J 6,73 ± 3,74 * 55,57 12, 3 ± 3,34 * 27,76 25,4 ± 15,14 * 59,61 632,31 ± 113,79 * 18, 0
Média COV 22,93 Média COV 22, 7 Média COV 23,96 Média COV 25,25
Método New 12 C57BL/6J 7,8 ± 1, 8 13,91 13,19 ± 1,86 14, 8 24,16 ± 5,42 22,45 73,17 ± 16,14 22, 6

Tabela 2: propriedades mecânicas dos tendões de Aquiles. Média ± DP e COV para as propriedades estruturais e materiais estimadas por meio de novos métodos comparados aos relatados na literatura. [NR: não relatado, * estimado a partir de figura (s), # desvio padrão calculado a partir de erro padrão relatado].

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Discussion

Os modelos animais murinos são comumente usados para estudar distúrbios tendinosos, mas a caracterização de suas propriedades mecânicas é desafiadora e incomum na literatura. A finalidade deste protocolo é descrever um método eficiente e reprodutível do tempo para o teste elástico de tendões murino. Os novos métodos reduziram o tempo necessário para testar uma amostra de horas a minutos e eliminaram um artefato importante que era um problema comum em métodos anteriores.

Diversas etapas descritas neste protocolo são críticas para produzir dispositivos elétricos eficazes que testam mecanicamente o supraespinal e os tendões de Aquiles murino. Primeiramente, a etapa 1.1.4 é necessária para criar um modelo 3D do osso desejado; no entanto, devido à alta resolução normalmente usada para essa verificação, o tamanho do arquivo pode ser muito grande para ser usado com programas de modelagem sólidos. O software usado neste protocolo reduziu com sucesso o tamanho do arquivo (etapa 1.1.6) e a geometria preservada do objeto, embora outros softwares também possam ser eficazes para conseguir isso. Em segundo, cada local anatômico tem critérios de projeto específicos a considerar para prender eficaz. Para o projeto do dispositivo elétrico do tendão do supraespinal, é crítico para: (i) fixar a cabeça úmero para impedir a falha da placa do crescimento (etapa 1.2.1.12), (II) definir um ajuste do afastamento que evite o desengate do osso do úmero do molde durante o teste (etapa 1.2.1.12.1) e (III) orientar o osso do úmero para formar um ângulo de 180 ° com o eixo longo do tendão (passo 1.2.1.7). Para o projeto do dispositivo elétrico do tendão de Achilles, é crítico para: (i) definir um ajuste do afastamento que aperta o osso pequeno do calcâneo sem deslizar para fora do dispositivo elétrico durante o teste e (II) orientar o osso do calcâneo para dar forma a um ângulo de 120 ° (flexão plantar de 30 °) com o eixo longo do tendão. A terceira, medida exata da área transversal do tendão (etapa 2.1.2) é crítica para calcular corretamente o esforço da engenharia para a determinação de propriedades materiais. Para medir a área transversal do tendão do supraespinal, nós recomendamos varreduras do tomography microcomputado do espécime do osso-tendão-músculo suspendido em um criotubo com uma parte inferior lisa, com o osso prendido de cabeça para baixo no tubo com agarose. Somente o osso do úmero deve ser introduzido no gel do agarose, quando a cabeça úmero com o tendão e o músculo Unido forem escaneadas no ar. Como o tendão do supraespinal tem uma geometria espalhados enquanto insere no osso, a maneira a mais consistente de medir a área transversal é determinar a área transversal mínima ao longo do comprimento do tendão. Um procedimento similar deve ser seguido para medir a área transversal do tendão de Aquiles. Para o tendão de Aquiles, as varreduras de alta resolução do tomography microcomputado revelam dois tecidos distintos: o tendão apropriado e a bainha circunvizinha, que aparece como uma máscara mais clara. Para estimar consistentemente a área de corte transversal mínima para o tendão de Aquiles, apenas o tendão adequado deve ser selecionado para a medida (Figura 5). Por fim, as alças são reutilizáveis e pequenas variações da amostra para a amostra não afetam a sua eficácia. Cada osso deve ser escaneado uma vez (por exemplo, para o estudo atual, o úmero esquerdo, o úmero direito e o calcâneo) e um modelo 3D deve ser criado para cada osso. Além, para animais da mesma idade, a geometria do osso é quase idêntica, assim o mesmo dispositivo elétrico pode ser usado para o teste de todos os espécimes. Neste manuscrito, os dispositivos elétricos impressos 3D específicos aos ratos velhos de 8 semanas (ratos adultos esqueleticamente maduros) foram usados para testar tendões. Não foi necessário criar luminárias masculinas e femininas separadas. Para outros grupos etários (por exemplo, camundongos velhos de 4 semanas) ou camundongos com fenótipos ósseos únicos, recomenda-se que os acessórios que se encaixam nas geometrias específicas dos ossos sejam fabricados.

Após o projeto e a impressão 3D dos dispositivos elétricos, para assegurar a reprodutibilidade e a eficiência da aproximação, 10 amostras do tendão dos ratos do mesmo fundo e idade do estudo planejado devem tipicamente ser testadas (o tamanho exato da amostra pode variar dependendo do tecido e modelo animal). As propriedades mecânicas desses tendões devem ser determinadas para garantir que os coeficientes de variação para as propriedades estruturais e materiais estejam dentro do intervalo esperado, conforme descrito na tabela 1 e na tabela 2. Esses testes-piloto também devem confirmar que não ocorrem falhas artifáticos (por exemplo, falha na placa de crescimento). Vários ciclos de design, prototipagem e validação podem ser necessários para alcançar os resultados desejados para tendões diferentes dos tendões supraespinal e Aquiles descritos no presente artigo.

Vários grupos relataram as propriedades mecânicas dos tendões murinos. O coeficiente de variações nesses estudos é tipicamente elevado, muitas vezes dificultando a retirada das diferenças entre os grupos de comparação. Além disso, as diferenças metodológicas na preensão tecidual entre os vários estudos dificultam a determinação de se as propriedades de falha são relevantes para o tendão ou devido a falhas de aderência artifactuais. Para comparar os novos métodos de teste com as metodologias existentes, foi realizada uma revisão da literatura e os resultados de 20 estudos foram resumidos (tabela 1 e tabela 2). Na literatura, para o teste mecânico do tendão do supraespinal, os coeficientes médios da variação para a força máxima, a rigidez, o esforço máximo, e o módulo eram 27%, 39%, 52%, e 45%, respectivamente. Para o teste mecânico do tendão de Aquiles, os coeficientes médios de variação para força máxima, rigidez, estresse máximo e módulo foram 23%, 22%, 24% e 25%, respectivamente. No presente estudo, o novo método de teste de tendões murinos resultou em uma redução de 32% – 63% dos coeficientes de variação do tendão supraespinal e redução de 6% – 39% nos coeficientes de variação do tendão de Aquiles.

Não há nenhuma metodologia padrão atual para os ossos de preensão, assim não é obscuro a que extensão as edições de preensão vesícula afetaram propriedades mecânicas relatadas de tendões murino. A maioria de grupos relatam prender o osso do úmero usando a resina de cola Epoxy13, o polimetilmetacrilato (PMMA)14,15, ou o cianoacrilato16 e fixar a cabeça úmero aplicando um segundo revestimento de PMMA14, usando o dispositivo elétrico feito encomenda39 e/ou introduzindo um grampo de papel25,28,30. Similarmente, outros grupos relatam a preensão do osso muito menor do calcâneo usando dispositivos elétricos feito-à-medida19,20, ancorando pelas braçadeiras21, reparando no cimento plástico22 da cura do auto ou usando uma forma cónica slot22. No entanto, esses métodos permanecem limitados por baixa reprodutibilidade, altas taxas de falha vesícula e requisitos de preparação demorados. Os novos métodos apresentados neste estudo eliminaram falhas de aderência artifactuais e triplicaram o número de espécimes que podem ser testados em um dia. Além disso, estes métodos não são limitados aos tendões do supraespinal e do Achilles, porque são adaptados facilmente a testar outros tendões e tendões murino dos modelos animais maiores. No entanto, para testar tendões de animais maiores, o módulo do material de fixação impressa em 3D deve ser suficientemente alto para que não seja compatível com a força do tendão que está sendo testado.

Vários estudos têm demonstrado diferenças sexuais em distúrbios tendinosos, indicando que as mulheres têm função reduzida após o tratamento após lesão tendínea40,41,42. No presente estudo, o sexo teve um efeito significativo nas propriedades mecânicas dos tendões murinos. Como orientado pelos institutos nacionais de saúde (NIH), recomendamos a contabilização do sexo como uma variável biológica no desenho de pesquisa de modelos animais onde as propriedades mecânicas tendíneas serão medidas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O estudo foi apoiado pelo NIH/NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100 Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose 
Bruker microCT  Bruker BioSpin Corp Skyscan 1272  Used by authors
ElectroForce  TA Instruments 3200 Testing platform
Ethanol 200 Proof Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips Custom made Used by authors
Kimwipes Kimberly-Clark  S-8115 As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan) Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
MilliQ water (Ultrapure water) Millipore Sigma QGARD00R1 (or related purifier) 100 ml 
Meshmixer Autodesk http://www.meshmixer.com/ Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS  Stratasys LTD Precision Prototyping
Objet Studio Stratasys LTD Used by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 10010031 2.5 L of 10% PBS 
S&T Forceps Fine Science Tools 00108-11 Used by authors
Scalpel Blade - #11 Fine Science Tools 10011-00 Used by authors
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools 10003-12 Used by authors
SkyScan 1272 Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
Skyscan CT-Vox Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SkyScan NRecon Bruker BioSpin Corp Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SolidWorks CAD Dassault Systèmes SolidWorks Research Subsription Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue Loctite 234790 As suggested in protocol
Testing bath Custom made Used by authors
Thin film grips  Custom made Used by authors
VeroWhitePlus Stratasys LTD NA 3D printing material used by authors
WinTest  WinTest Software Used by authors to collect data

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References

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Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham,… More

Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. J. Vis. Exp. (152), e60280, doi:10.3791/60280 (2019).

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