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Immunology and Infection

इमेजिंग मानव इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स

Published: December 26, 2019 doi: 10.3791/60312
Automatic Translation
*1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, *1,2
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-Universidad Autónoma de Madrid, 2Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols CSIC-UAM, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, 3Unidad de Audiovisuales, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स गठन और बाद में इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स की ओर बाद में ध्रुवीकृत गुप्त यातायात दोनों को चित्रित करता है। सेलुलर कंजूगेट्स एक सुपरएंटीजन-स्पंदित राजी सेल (एंटीजन-पेश सेल के रूप में कार्य) और एक जुरकैट क्लोन (एक प्रभावक सहायक टी लिंफोसाइट के रूप में कार्य) के बीच बनाए गए थे।

Abstract

विधि का उद्देश्य एक इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स (आईएस) उत्पन्न करना है, जो एंटीजन-पेश सेल (एपीसी) और एक प्रभावक सहायक टी लिंफोसाइट (Th) सेल द्वारा गठित सेल-टू-सेल कंजुगेशन का एक उदाहरण है, और के पहले चरणों के अनुरूप छवियों को रिकॉर्ड करना है। गठन और बाद में तस्करी की घटनाओं (एपीसी और वें सेल में दोनों में होने वाली) है । इन घटनाओं अंततः आईएस में ध्रुवीकृत स्राव के लिए नेतृत्व करेंगे । इस प्रोटोकॉल में, जुरकैट कोशिकाओं को स्टेफिलोकोकस एंटोटॉक्सिन ई (देखें) के साथ चुनौती दी गई- एक सेल सिनेप्स मॉडल के रूप में रजी कोशिकाओं का उपयोग किया गया था, क्योंकि इस प्रयोगात्मक प्रणाली की निकटता जैविक वास्तविकता (Th सेल-एपीसी सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स) के लिए थी। यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण में सेल-टू-सेल कंजुगन, समय-चूक अधिग्रहण, व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (WFFM) शामिल है जिसके बाद छवि प्रसंस्करण (अधिग्रहण के बाद डेकोनोवुटिशन) शामिल है। यह छवियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात (SNR) में सुधार करता है, लौकिक संकल्प को बढ़ाता है, उभरते सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स में कई फ्लोरोक्रोम के सिंक्रोनाइज्ड अधिग्रहण की अनुमति देता है और फ्लोरेसेंस ब्लीचिंग को कम करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल एंड पॉइंट सेल निर्धारण प्रोटोकॉल (पैराफॉर्मलडिहाइड, एसीटोन या मेथनॉल) के साथ अच्छी तरह से मेल खाता है, जो आगे इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और विश्लेषण की अनुमति देगा। यह प्रोटोकॉल लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (एलएससीएम) और अन्य अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ भी संगत है। एक मुख्य चेतावनी के रूप में, केवल उन टी सेल-एपीसी सीमाओं (जिसे इंटरफेस कहा जाता है) जो जेड-एक्सिस के साथ फोकस विमान के लिए सही 90 डिग्री कोण पर थे, उन्हें ठीक से इमेज और विश्लेषण किया जा सकता है। अन्य प्रयोगात्मक मॉडल मौजूद हैं जो जेड आयाम और निम्नलिखित छवि विश्लेषणों में इमेजिंग को सरल बनाते हैं, लेकिन ये दृष्टिकोण एपीसी की जटिल, अनियमित सतह का अनुकरण नहीं करते हैं, और आईएस में गैर-शारीरिक बातचीत को बढ़ावा दे सकते हैं। इस प्रकार, यहां उपयोग किया जाने वाला प्रयोगात्मक दृष्टिकोण आईएस में होने वाली कुछ जैविक जटिलताओं का पुन: पेश करने और सामना करने के लिए उपयुक्त है।

Introduction

विधि का मुख्य लक्ष्य इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स (आईएस) सेल-टू-सेल एंजुगेट्स उत्पन्न करना है जो एक एंटीजन-पेश सेल (एपीसी) द्वारा गठित किया गया है जो देखने के सुपरएंटीजन और एक प्रभावक वें सेल के साथ स्पंदित होता है, और इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स गठन और बाद में तस्करी की घटनाओं (एपीसी और टीएच सेल दोनों में होने वाली) के पहले चरणों के अनुरूप छवियों को पंजीकृत करने के लिए, जो अंततः आईएस में ध्रुवीकृत स्राव का कारण बनेगा। एपीसी पर एमएचसी-II से बंधे एंटीजन के लिए उनके सेल रिसेप्टर (टीसीआर) के बंधन पर टी लिम्फोसाइट्स द्वारा आईएस की स्थापना एंटीजन-विशिष्ट, विनोदी और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं1,2में शामिल एक अत्यंत गतिशील, निंदनीय और महत्वपूर्ण उदाहरण का आयोजन करती है। आईएस को एक विशेष सुप्रांतिक सक्रियण परिसर (स्मैक) पैटर्न के गठन से परिभाषित किया गया है जो एक ऐक्टिन पुनर्गठन प्रक्रिया3की विशेषता है। पर एक एपीसी के साथ टी लिम्फोसाइट्स द्वारा निर्माण है, आईएस की ओर गुप्त vesicles के ध्रुवीकरण को सिनैप्टिक गैप पर ध्रुवीकृत स्राव में फंसाया प्रतीत होता है । यह केंद्रित मशीनरी स्पष्ट रूप से टी लिम्फोसाइट्स की महत्वपूर्ण गुप्त प्रभावक भूमिकाओं की प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए एक शानदार विनियमित स्तर के साथ प्रतिरक्षा प्रणाली की आपूर्ति करती प्रतीत होती है, जबकि दर्शक कोशिकाओं की गैर-विशिष्ट, साइटोकिन-मध्यस्थउत्तेजना को कम करती है, सक्रियण-प्रेरित सेल डेथ (एआईसीडी)4के माध्यम से अप्रासंगिक लक्ष्य कोशिकाओं और अपोप्टिक आत्महत्या की हत्या करती है।

आईएस का परिणाम टी लिंफोसाइट और एपीसी दोनों की प्रकृति पर भिन्न होता है। एमएचसी-II से जुड़े एंटीजन को प्रदर्शित करने वाले एपीसी के साथ टी कोशिकाओं (आमतौर पर सीडी4 + कोशिकाओं) का सिनैप्टिक संपर्क टी सेल (साइटोकिन स्राव, प्रसार, आदि) की सक्रियता पैदा करता है और कुछ उदाहरणों में एआईसीडी4के माध्यम से एपोप्टोसिस। MHC-I से जुड़े एंटीजन पेश एपीसी के साथ बातचीत करने वाले साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (सीटीएल) (सीटीएल) (मुख्य रूप से सीडी8 + कोशिकाओं) के लिए, परिणाम एंटीजन के साथ सीटीएल के पूर्व-उत्तेजना या नहीं पर अलग है। इस प्रकार, एपीसी पर एंटीजन-एमएचसी-आई परिसरों की पहचान करने वाले भोले सीटीएलएस लक्ष्य कोशिकाओं को नष्ट करने और विभाजित करने के लिए "प्राइम्ड" हैं। प्राइम्ड सीटीएल भी लक्ष्य कोशिकाओं (यानी, वायरस या ट्यूमर कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं) एंटीजन विशिष्ट सेल संहार5,6का उत्पादन के साथ synapses स्थापित करते हैं ।

इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स में एक्सोसोम्स का ध्रुवीकृत स्राव प्रासंगिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं7में शामिल अनुसंधान का एक विकासशील और चुनौतीपूर्ण क्षेत्र है । यह प्रदर्शित किया गया है कि इंट्राल्यूमिनल वेसिकल्स (आईएलवी) ले जाने वाले मल्टीवेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) एंटीजन के साथ टीसीआर उत्तेजना पर आईएस8,9 (वीडियो 1)की ओर ध्रुवीकृत परिवहन का अनुभव करते हैं। सिनैप्टिक झिल्ली पर इन एमवीबी का संलयन उनके डिग्रेनुलेशन और आईएलवी को सिनैप्टिक फांक8,10के लिए एक्सोसोम के रूप में छोड़ने को प्रेरित करता है । यह Th-प्रकार के जुरकैट कोशिकाओं द्वारा गठित होता है जिन्हें एपीसी11,टीसीआर-उत्तेजित सीडी 4+ लिम्फोब्लास्ट और प्राइमेड सीटीएल के रूप में कार्य करने वाली सुपरएंटीजन-लेपित राजी कोशिकाओं के साथ चुनौती दी गई थी। इस प्रकार, जुरकैट कोशिकाओं द्वारा बनाए गए सिनेप्स एक्सोसोम के ध्रुवीकृत गुप्त यातायात का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल का गठन करते हैं। इसके अलावा, जांच के कई दशकों से पता चला है कि टीसीआर सिग्नलिंग में कई बुनियादी अंतर्दृष्टि बदल टी सेल लाइनों के साथ अध्ययन से आया है, और वास्तव में सबसे अच्छा इन मॉडल प्रणालियों के ज्ञात Jurkat ल्यूकेमिक टी सेल लाइन12है ।

पूरी तरह से विकसित आईएस का गठन कई महत्वपूर्ण जैविक परिणामपैदा करता है, जिसमें टीएच कोशिकाओं की सक्रियता, भोले सीटीएल की सक्रियता या एजिप्ड सीटीएल द्वारा लक्षित सेल हत्या, एनेर्गी या एआईसीडी5के अलावा शामिल है। इसलिए, टी लिम्फोसाइट्स द्वारा दो प्रमुख प्रकार के गुप्त रूप ों की स्थापना की जाती है जिसके परिणामस्वरूप बहुत विविध होता है, लेकिन इसी प्रकार महत्वपूर्ण, प्रतिरक्षा प्रभावककार्य1,6,13। एक तरफ, प्राइम्ड साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (सीटीएलएस) से आईएस की ओर लिटिक कणिकाओं (जिसे "गुप्त lysosomes" कहा जाता है) के तेजी से ध्रुवीकरण (सेकंड से लेकर कुछ मिनट तक) को प्रेरित करता है। लिटिक कणिकाओं का डिग्रेनुलेशन स्राव छिद्र और ग्रैनज़ीम को सिनैप्टिक फांक14में प्रेरित करता है, जो प्रो-एपोप्टिक अणु हैं। स्रावित पेरफोरिन और ग्रैनज़ीम बाद में लक्ष्यकोशिकाओंकी हत्या के लिए प्रेरित करते हैं। सीटीएलएस अस्थायी सिनेप्स विकसित करते हैं, जो केवल कुछ मिनट तक चलते हैं, क्योंकि लक्ष्य कोशिकाओं कीहत्या3,17की होती है। संभवतः यह इस परिस्थिति के कारण है कि इष्टतम सीटीएल कार्य के लिए एक त्वरित और अस्थायी संपर्क की आवश्यकता होती है ताकि कई लक्षित कोशिकाओं3,17को यथासंभव अधिक से अधिक घातक हमलों को वितरित किया जा सके । इसके विपरीत, जुरकैट कोशिकाओं जैसे Th लिम्फोसाइट्स स्थिर, लंबे समय से खड़े होते हैं (10-30 किमी से घंटे तक) उत्पन्न होते हैं, क्योंकि यह साइटोकिन्स3,17को उत्तेजित करने के दिशात्मक और लगातार स्राव के लिए आवश्यक प्रतीत होता है। साइटोकिन्स भी गुप्त vesicles में संलग्न हैं और उनमें से कुछ (यानी, आईएल-2, आईएफएन-) आईएस17 और स्राव के लिए ध्रुवीकृत परिवहन का अनुभव करते हैं। आईएस की एक आवश्यक विशेषता टी सेल और एपीसी(वीडियो 1)के बीच अन्वेषणात्मक, कमजोर और क्षणिक संपर्कों का गठन है जो एक मजबूत बातचीत और परिपक्व आईएस की स्थापना का उत्पादन कर सकता है, यह प्रदान करते हुए कि टीसीआर कॉग्नेट एंटीजन-एमएचसी परिसरों की पहचान करता है और उचित सह-उत्तेजक कनेक्शन5स्थापित किए जाते हैं । प्रारंभिक संपर्कों की शुरुआत और परिपक्व, पूरी तरह से उत्पादक आईएस की स्थापना, स्वाभाविक रूप से स्टोचस्टिक, तेज और अतुल्यकालिक प्रक्रियाएं5,18हैं। इसके अलावा, सेल-टू-सेल19के निर्माण में एक दुर्लभ आवृत्ति है, जो इमेजिंग तकनीकों के लिए एक चुनौती का गठन कर सकती है (कृपया परिणाम और चर्चा अनुभागों का उल्लेख करें)।

टी लिम्फोसाइट्स में माइक्रोट्यूबबुल-ऑर्गनाइजिंग सेंटर (एमटीओसी) और स्रावक कणिकाओं के ध्रुवीकरण की जांच करने में एक और मुख्य चुनौती यह है कि पूरी प्रक्रिया तेज (सेकंड से कुछ मिनट), विशेष रूप से सीटीएल में है। इन तथ्यों को ध्यान में रखते हुए, सबसे जल्दी दृष्टिकोण एक अंत बिंदु रणनीति है जिसमें APC/लक्ष्य कोशिकाओं और टी lymphocytes संयुक्त रूप से मिश्रित कर रहे है और कम गति केंद्रीकरण से एकाग्र, सेल के पक्ष में सेल संजूगेट निर्माण, कई मिनट के लिए इनक्यूबेटेड, तय है और बाद में के लिए मूल्यांकन का सामना करना पड़ा MTOC और/या स्रावक vesicles की ओर स्थानांतरण20है . इस दृष्टिकोण की दो महत्वपूर्ण सीमाएं हैं: कोई जीवंत तस्करी डेटा प्राप्त नहीं किया गया था और पृष्ठभूमि MTOC/गुप्त कणिकाओं ध्रुवीकरण के उच्च स्तर प्राप्त किए गए थे, शायद स्थापना18के उदासीन चरित्र के कारण । इसके अलावा, टीसीआर-उत्तेजित, प्रारंभिक सिग्नलिंग घटनाओं (यानी, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम उगता है, ऐक्टिन पुनर्गठन) और गुप्त वेसिकल ध्रुवीकरण के बीच कोई भी संबंध जांच करने के लिए समस्याग्रस्त है। इस प्रकार, जीवित कोशिकाओं में आईएस की उपयुक्त इमेजिंग के लिए अनिवार्य प्रावधान सेल-टू-सेल संजूगेट मूर्तकरण को बढ़ाने के लिए, आईएस की पीढ़ी को सिंक्रोनाइज़ करने के लिए और जब संभव हो, परिभाषित माइक्रोस्कोप XY क्षेत्रों और जेड पदों पर सेलुलर संजूगेट्स की स्थापना की गारंटी देने के लिए गठबंधन करते हैं। इन सभी समस्याओं से बचने के लिए कई रणनीतियां विकसित की गई हैं। इन तरीकों, उनके लाभों और कमजोरियों को समझाना इस पेपर के दायरे से बाहर है । कृपया इन महत्वपूर्ण बिंदुओं से निपटने के लिए पहले प्रकाशित समीक्षाओं का उल्लेख करें1,4,5,21.

तथ्य यह है कि वें लिम्फोसाइट्स द्वारा बनाया गया है लंबे समय से रहते थे, और परिस्थिति है कि वें लिम्फोसाइट्स MTOC में, लिम्फोकिन युक्त स्रावदा कणिकाओं और MVB कई मिनट से लेने के लिए घंटे के लिए कदम है और22 को गोदी बनाता है Th-APC यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर इमेजिंग के लिए एक आदर्श उंमीदवार है ।

Protocol

1. राजी कोशिकाओं का पालन करने के लिए स्लाइड की तैयारी

  1. एक 8 माइक्रोवेल चैंबर स्लाइड (प्लास्टिक के नीचे कक्ष स्लाइड) के लिए प्रति अच्छी तरह से फाइब्रोनेक्टिन (१०० μg/mL) के १५० μL जोड़ें और यह 30 मेंस के लिए 30 min के लिए इनक्यूबेट ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे । यह आसंजन सब्सट्रेट अच्छी तरह से नीचे (चरण 2) के लिए राजी कोशिकाओं के बंधन की अनुमति देगा, जुरकैट कोशिकाओं (चरण 4) कोशिकाओं के साथ रहने वाले संजोए हुए गठन, और समय-चूक माइक्रोस्कोपी कैप्चर (चरण 6), और बाद में वैकल्पिक पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) निर्धारण (चरण 7) के साथ भी संगत है।
    नोट: एसीटोन निर्धारण के लिए, फाइब्रोनेक्टिन के बजाय ग्लास बॉटम चैंबर स्लाइड और पॉली-एल-लाइसिन (20 μg/mL) का उपयोग करें, क्योंकि एसीटोन प्लास्टिक को भंग करता है। 8 माइक्रोवेल चैंबर स्लाइड (1 सेमी2 अच्छी तरह से, 300 μL अधिकतम मात्रा) या समकक्ष एक लचीला और उपयुक्त प्रारूप है।
  2. एस्पिरेट फाइब्रोनेक्टिन 200 माइक्रोन स्वचालित पिपेट का उपयोग करके और प्रत्येक अच्छी तरह से 200 माइक्रोन पीबीएस के साथ 2 00 माइक्रोन के साथ कोमल झटकों के साथ 2 मिन के लिए धोएं। इस धोने को एक और बार दोहराएं। चैंबर स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 सप्ताह के लिए पीबीएस के साथ इस स्तर पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. चैंबर स्लाइड और 7-अमीनो-4-क्लोरोमेथिलकोमारिन (CMAC) लेबलिंग के लिए राजी कोशिकाओं का आसंजन

  1. एक शंखनाद के 10 मिलीएल (1-2 x 106 कोशिकाओं/mL) एक 15 मिलीस, वी नीचे ट्यूब के लिए राजी कोशिकाओं की पूर्व संस्कृति हस्तांतरण । अच्छी तरह से मिलाएं और Neubauer कक्ष या समकक्ष पर कोशिकाओं की गिनती करने के लिए 10 μL का उपयोग करें।
  2. कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 300 x ग्राम पर शेष कोशिकाओं को केंद्रित करें। एस्पिरेट और अतिशयोक्ति को त्यागदें।
  3. धीरे से गर्म पूर्ण संस्कृति माध्यम में सेल गोली को फिर से निलंबित (RPMI १६४० 10% FCS, 2 mM ग्लूटामाइन, 10 mM HEPES, १०० U/mL पेनिसिलिन, और १०० μg/mL streptomycin) के साथ पूरक १०६ कोशिकाओं की एकाग्रता पर/ नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करें:
    (]]प्रारंभिक एक्स वीप्रारंभिक = []अंतिम एक्स वीफाइनल),जहां प्रारंभिक सेल एकाग्रताका प्रतिनिधित्व करता है, Vप्रारंभिक = सेल निलंबन की प्रारंभिक मात्रा, [] अंतिम =अंतिम = अंतिम सेल एकाग्रता, Vअंतिम = सेल निलंबन की अंतिम मात्रा ।
    नोट: प्रारंभिक संस्कृति की कोशिका एकाग्रता के आधार पर, आवश्यकता से अधिक कोशिकाओं को इकट्ठा करना संभव है लेकिन संभावित समस्याओं को रोकने के लिए प्रयोग के अंत तक संस्कृति (37 डिग्री सेल्सियस) में शेष कोशिकाओं को बनाए रखना महत्वपूर्ण है (चरण 2.6 देखें)।
  4. लेबल राजी कोशिकाओं सिनैप्टिक conjugate गठन के दौरान उनकी पहचान के लिए अनुमति देने के लिए । इस प्रयोग में, 7-अमीनो-4-क्लोरोमेथिलकोमारिन (CMAC) लेबलिंग चरण 2.4.2 में किया जाता है।
    1. संस्कृति माध्यम में राजी कोशिकाओं की आवश्यक संख्या को 2 मिलीएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें। 8 माइक्रोवेल चैंबर स्लाइड के लिए, सेल निलंबन के कुल 1.6 mL की आवश्यकता है (200 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से)।
    2. 10 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए सीएमएसी जोड़ें । कैमैक प्रकाश के प्रति संवेदनशील होने के बाद से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब को कवर करके कोशिकाओं को अंधेरे में रखें । 200 माइक्रोन युक्त 2 x 105 राजी कोशिकाओं प्रति 1 सेमी2 अच्छी तरह से आवश्यक हैं। इस प्रकार, यदि 8 कुओं को तैयार करने की आवश्यकता है, तो 1.6 x 106 राजी कोशिकाओं की आवश्यकता होती है।
      नोट: सेल ट्रैकर ब्लू (CMAC, यूवी उत्तेजना और नीले उत्सर्जन) के साथ राजी कोशिकाओं लेबलिंग उन्हें वें कोशिकाओं से अलग जब सिनैप्टिक conjugates बनते हैं । यह रंगना पीएफए और एसीटोन फिक्सेटिव के साथ संगत है और आगे इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रक्रियाओं की अनुमति देता है। प्रकाश प्रदर्शनी से बचने की कोशिश करें। सीएफएसी के साथ एक पूल में राजी कोशिकाओं की लेबलिंग के बाद रजी कोशिकाओं के आसंजन से पहले फिर से निलंबन के बाद फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड चैंबर स्लाइड्स में विभिन्न कुओं के बीच CMAC के साथ राजी कोशिकाओं की सजातीय लेबलिंग सुनिश्चित करता है ।
  5. CMAC-दाग कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और, चरण 1.2 से कक्ष स्लाइड में पीबीएस की आकांक्षा के बाद, सेल निलंबन के 200 माइक्रोन को 1.1-1.2 चरण में तैयार फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड कक्ष स्लाइड के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें। चैंबर स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 को 30 मिन-1 एच के लिए इनक्यूबेट करते हैं।
    नोट: आसंजन और CMAC लेबलिंग एक साथ इस कदम पर हो जाएगा और यह समय बचाता है । कृपया ध्यान रखें कि राजी कोशिकाएं जल्दी तलछट होंगी और सीडिंग से पहले सेल निलंबन में सजातीय एकाग्रता बनाए रखने के लिए सावधानी बरतने की जरूरत है। केंद्रीकरण द्वारा इस स्तर पर CMAC धोना आवश्यक नहीं है, क्योंकि CMAC धोने को चरण 2.7 पर अधिक आसानी से किया जाएगा (जब लेबल रजी कोशिकाओं को पहले से ही कक्ष स्लाइड का पालन किया जाता है)। चूंकि CMAC बड़े अतिरिक्त में सेल निलंबन में मौजूद है, नीले रंग की फ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि नीले रंग की कोशिकाओं को अलग करने के लिए बहुत अधिक है। CMAC धोने के बाद चरण 2.7 में सेल CMAC फ्लोरेसेंस की जांच करें।
  6. सुनिश्चित करें कि पंचायती राजस्द कन पर कक्ष स्लाइड के कोमल मिलाते हुए कुओं के नीचे राजी कोशिकाओं का पालन किया जाता है। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं एक दूसरे के बीच अंतराल प्रदर्शित करती हैं और अनुकूल नहीं हैं(चित्रा 1,मध्य पैनल)। कोशिका संगम का 50-60% उपयुक्त है।
    1. यदि अधिकांश कोशिकाएं कक्ष स्लाइड का कुशलतापूर्वक पालन करती हैं और कोई सेल अंतराल नहीं देखा जाता है, तो प्रत्येक अच्छी तरह से गर्म पूर्ण माध्यम से धोएं और सेल अतिरिक्त को अलग करने के लिए 200 माइक्रोन स्वचालित पाइप के साथ माध्यम को फिर से निलंबित करें। प्रत्येक पुनर्संकचरण चरण के बाद संगम की जांच करें।
    2. यदि कोशिकाएं पालन नहीं करती हैं, तो आसंजन चरण को फिर से दोहराएं और आसंजन समय और/या सेल संख्या बढ़ाएं।
      नोट: यहां रुकना संभव है, चैंबर स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 रातोंरात (ओ/एन) पर इनक्यूबेट करें और अगले दिन प्रोटोकॉल जारी रखें। कृपया अगले दिन इस बात की पुष्टि करें कि राजी कोशिकाओं का पालन किया जाता है और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके CMAC-लेबल किया जाता है ।
  7. अतिरिक्त CMAC को खत्म करने और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप(चित्रा 1)के साथ नीले उत्सर्जन की जांच करने के लिए गर्म पूरक आरपीएमआई के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से फिर से ध्यान से धोएं।
    नोट: विसर्जन तेल (चिपचिपा और चिपचिपा) और उच्च संख्यात्मक अपर्चर तेल उद्देश्यों के उपयोग से बचने के लिए, अतिरिक्त लंबी दूरी (यानी, 20x या 40x) उद्देश्यों का उपयोग फ्लोअरसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके CMAC लेबलिंग की जल्दी से जांच करने के लिए किया जा सकता है।

3. CMAC की पल्स - स्टेफिलोकोकल एंटोटॉक्सिन ई के साथ राजी कोशिकाओं लेबल

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से स्टेफिलोकोकल एंटोटॉक्सिन ई (देखें, 1 μg/mL) जोड़ें । देखें आसानी से सेल संस्कृति माध्यम में पतला किया जा सकता है (१०० μg/mL पर काम समाधान) देखें जमे हुए स्टॉक (पीबीएस में 1 मिलीग्राम/mL) से । प्रति 200 माइक्रोवेल के प्रति 100x वर्किंग सॉल्यूशन के 2 माइक्रोन का उपयोग करें।
    सावधानी: इस चरण के लिए दस्ताने का उपयोग करें और बायोहैज़र्ड बॉक्स में उपयोग की गई टिप का निपटान करें।
  2. चैंबर स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 को कम से कम 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करते हैं। देखें प्रभाव कम से कम 3-4 घंटे तक रहता है।
    नोट: देखें आवश्यक होने पर विभिन्न समय बिंदुओं पर कुओं में जोड़ा जा सकता है, यदि अलग समय-चूक सेटअप की योजना बनाई जाती है (चरण 5) और/या अंतिम बिंदु प्रयोगों (चरण 6) के लिए स्टार्ट टाइम पॉइंट के आधार पर।

4. जुरकैट कोशिकाओं की तैयारी

  1. इस प्रयोग के लिए जुरकैट कोशिकाओं (1-2 x 106 कोशिकाओं/mL) की पहले से बढ़ती संस्कृति का उपयोग करें । मानक संस्कृति फ्लास्क से या मानक इलेक्ट्रोपोशन प्रोटोकॉल के बाद पिछले ट्रांसफेक्शन से कोशिकाओं का उपयोग करें, जैसा कि पहले23वर्णित था। जुरकैट कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन जीवित कोशिकाओं में गुप्त कणिकाओं के यातायात के समय चूक दृश्य की अनुमति देगा। उदाहरण के लिए, जब GFP-CD63 (एमवीबी का एक मार्कर) व्यक्त किया जाता है तो जीएफपी-सीडी63-सजाए गए वेसिकल्स(वीडियो 1)के आंदोलन को रिकॉर्ड किया जा सकता है।
  2. चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। यदि मृत कोशिकाओं की अधिकता (>20-30%) मनाया जाता है, मानक प्रोटोकॉल24का उपयोग करके Ficoll घनत्व ढाल केंद्रीकरण प्रदर्शन, मृत कोशिकाओं की अधिकता को खत्म करने के लिए (मृत कोशिकाओं जीवित कोशिकाओं की तुलना में उच्च घनत्व प्रदर्शन) का उपयोग करने से पहले (चर्चा देखें) ।
  3. कोशिकाओं को 15 मीटर ट्यूब, वी-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें, और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिनती के लिए 10 माइक्रोन का उपयोग करें।
  4. शेष कोशिकाओं को केंद्रित करें जैसा कि चरण 2.2 में वर्णित है। सुपरनेट को त्यागें और ताजा, गर्म संस्कृति माध्यम का उपयोग करकेराजी कोशिकाओं (1 x 10 6/mL) के रूप में एक ही एकाग्रता पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें । चरण2.2-2.3 का पालन करें।
  5. चरण 4 की प्रतीक्षा करते हुए संस्कृति में जुरकैट कोशिकाओं (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)को बनाए रखें।
    नोट: दूसरे विकल्प (ट्रांसफेक्शन) में जीवित कोशिकाओं की संख्या पहले की तुलना में काफी कम होने वाली है। इस प्रकार, प्रयोग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के लिए एक उच्च प्रारंभिक सेल संस्कृति मात्रा का उपयोग करने पर विचार करें। इलेक्ट्रोपोराशन क्यूवेट और ट्रांसफेक्शन प्रति 10 x 106 जुरकैट कोशिकाओं से, केवल 2-4 x 106 जुरकैट कोशिकाएं 48 घंटे के ट्रांसफेक्शन के बाद जीवित रहेंगी और इनमें से कुछ कोशिकाएं फिकॉल स्टेप के दौरान खो जाएंगी। इस प्रकार, एक इलेक्ट्रोपोराशन क्यूवेट आम तौर पर 8 माइक्रो कुओं (1.6 x 106 ट्रांससंक्रमित जुरकैट कोशिकाओं की जरूरत) से पालन देखें-स्पंदित राजी कोशिकाओं को चुनौती देने के लिए पर्याप्त है।

5. राजी और जुरकैट प्रकोष्ठों की सह-सीडिंग

  1. चेंबर स्लाइड्स में देखें मैकसी लेबल, देखें-स्पंदित, पालन राजी कोशिकाओं को इनक्यूबेटर से बाहर 3.2 से। इस स्तर पर मैकसी को धोना आवश्यक नहीं है क्योंकि यह पहले चरण 2.7 में किया गया था।
  2. एस्पिरेट ध्यान से प्रत्येक कुएं की संस्कृति माध्यम, एक-एक करके, एक स्वचालित 200 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके कुएं के एक कोने से। कुएं में मध्यम को पूरी तरह से सूखने न दें।
  3. तुरंत सेल संस्कृति माध्यम (1 x 10 6/mL) चरण ४.५में तैयार में resuspended Jurkat कोशिकाओं के २०० μL के साथ माध्यम की जगह । यदि समय चूक इमेजिंग किया जाता है, तो इस चरण के तुरंत बाद 6 चरण में जाएं, क्योंकि जुरकैट कोशिकाएं तलछट और सिनैप्टिक को बहुत जल्दी संजोए रखती हैं। सुविधा के लिए, देखें-स्पंदित, राजी कोशिकाओं का पालन किया है कि इस स्तर पर Jurkat कोशिकाओं के साथ सीडिंग प्राप्त नहीं है जब तक जुरकैट कोशिकाओं के साथ बाद में चुनौती सेल संस्कृति माध्यम के साथ बनाए रखा जाना चाहिए । यह लचीले ढंग से अतिरिक्त समय चूक या रिवर्स गतिज, अंत बिंदु प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए Jurkat कोशिकाओं के साथ बाद में चुनौती की अनुमति देगा ।
  4. यदि एक समय चूक के लिए प्रदर्शन किया जा रहा है, जल्दी से 6 कदम के लिए आगे बढ़ें । इसमें माइक्रोस्कोप स्टेज इनक्यूबेटर पर 1-2 घंटे के लिए सह-संस्कृति या 37 डिग्री सेल्सियस पर समकक्ष, 5% सीओ2 सिनैप्टिक कॉन्जुगेट गठन और एक साथ छवि अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए शामिल है। यदि अंत बिंदु विश्लेषण, लेकिन कोई समय चूक, सह संस्कृति की अवधि के बाद गठन की कल्पना है माइक्रोस्कोप का उपयोग कर (चित्रा 1में के रूप में) कोशिकाओं फिक्सिंग से पहले (चरण 7) ।

6. उभरते सिनैप्टिक कंजूगेट्स की समय चूक इमेजिंग

  1. इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप और इन्क्यूबेशन चैंबर तैयार करें। वीडियो 1 में दिखाए गए उदाहरण के लिए, विस्तृत माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स चित्रा 2में दिखाई जाती हैं।
    नोट: यदि एक समय चूक प्रयोग की योजना बनाई है, सभी माइक्रोस्कोप सेटिंग्स और पूरक (परिवेश सेल संस्कृति कक्ष, आदि) का पालन राजी कोशिकाओं के साथ चैंबर स्लाइड करने के लिए जुरकैट निलंबन जोड़ने से पहले तैयार किया जाना चाहिए । निम्नलिखित चरणों को वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप(सामग्री की तालिका) केलिए वर्णित किया गया है। हालांकि, सेल कल्चर इनक्यूबेटर से लैस किसी भी उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. एक 60x तेल विसर्जन, उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें जब ध्रुवीकृत यातायात इमेजिंग ।
    2. सुनिश्चित करें कि स्वचालित फोकस सिस्टम चालू है और नीचे की सतह से बंधे राजी कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित करने के लिए ऑफसेट को समायोजित करें। कृपया चित्रा 1, वीडियो 1 और वीडियो 2का उल्लेख करें।
  2. चरण 5.3 में पालन राजी कोशिकाओं वाले प्रत्येक कुएं के लिए जुरकैट के अलावा, जल्दी से माइक्रोवेल चैंबर स्लाइड का पता लगाएं पूर्व-गर्म (1-2 एच) माइक्रोस्कोप स्टेज इनक्यूबेटर (यानी, ओकोलैब) पर और माइक्रोस्कोप के साथ कुछ XY पदों का चयन करें, जिनमें यह है उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप फोकस में गिरने वाली एक जुरकैट-ट्रांससंक्रमित कोशिका द्वारा किए गए एक उभरते गठन को रिकॉर्ड करने की संभावना है।
  3. एक पूर्व गर्म माइक्रोस्कोप चरण इनक्यूबेटर का उपयोग करें क्योंकि यह देखा गया था कि तापमान स्थिर चरण स्थिर एक्स, वाई, जेड पदों को बनाए रखता है। एक सुविधाजनक XY क्षेत्र के लिए मानदंड हैं: अच्छी तरह से केंद्रित और गैर-अनुकूल राजी कोशिकाएं (यानी, कोशिकाओं के बीच अंतराल प्रदर्शित करना) और ट्रांससंक्रमित जुरकैट कोशिकाओं की उपस्थिति (इसे ट्रांसमिशन और यूवी या जीएफपी चैनलों के संयोजन से जांचा जा सकता है)। जुरकैट कोशिकाएं कक्ष स्लाइड पर बहुत जल्दी (कुछ मिनट) तलछट करेंगी, और उभरते सिनेप्स को छवि देने की संभावना समय के साथ कम हो जाएगी(चित्रा 1)। यह संभव है या तो निर्धारित समय चूक के बाद प्रयोग खत्म करने के लिए या चरण 7 के लिए आगे बढ़ना और बाद में प्रतिरक्षण और विश्लेषण के लिए conjugates तय ।
    नोट: उचित लौकिक संकल्प (प्रति फ्रेम 1-2 मिन) के साथ एक साथ, बहु-अच्छी तरह से समय-चूक अधिग्रहण के लिए 4 अलग-अलग माइक्रोवेल तक 16 अलग-अलग माइक्रोस्कोप क्षेत्रों का चयन करना संभव है। सीमा विविध फ्लोरोक्रोम की संख्या और तीव्रता (कैमरा प्रदर्शनी को प्रभावित करने) दोनों पर निर्भर करती है(CMAC के अलावा व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संख्या पर निर्भर)। फ्रेम दर बढ़ाने का एक तरीका सीएफपी (यानी, एन = 8, जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है) के लिए प्रत्येक "एन" समय फ्रेम में से केवल एक में सीएफएसी चैनल के लिए रिकॉर्डिंग है), क्योंकि राजी कोशिकाओं को अच्छी तरह से नीचे का पालन किया जाता है और आसानी से जुरकैट कोशिकाओं के रूप में स्थानांतरित नहीं होता है। इसके अलावा, यह सेल व्यवहार्यता को लाभ पहुंचाता है, क्योंकि लगातार यूवी प्रकाश जोखिम कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है। हर 1 मिनट या उससे कम समय सीमा दर को 1 फ्रेम में समायोजित करने की कोशिश करें (यानी, वीडियो 1में 20 एस प्रति फ्रेम, चित्रा 2)क्योंकि एमवीबी के ध्रुवीकरण को पूरा करने के लिए कुछ मिनट से घंटों तक लगते हैं। इस मल्टीचैनल कैप्चर को करने के लिए मोटराइज्ड एपि-फ्लोरेसेंस बुर्ज और उपयुक्त बैंड-पास फ्लोरेसेंस फिल्टर या समकक्ष से लैस माइक्रोस्कोप आवश्यक है।

7. सिनैप्टिक कंजूगेट्स और फिक्सेशन का एंड पॉइंट गठन

  1. यदि केवल एक एंडपॉइंट प्रयोग की योजना बनाई जाती है (सिनैप्टिक कॉन्जूगेट गठन की अनुमति देने के लिए 1-2 घंटे ऊष्मायन उपयुक्त है), तो चैंबर स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 1-2 घंटे के लिए 5% सीओ2. संस्कृति अवधि के बाद संजूगेट गठन की जांच करें (चित्रा 1में के रूप में) और, बाद में, एसीटोन या पीएफए के साथ conjugates तय (निर्धारण एंटीजन और एंटीबॉडी पर निर्भर करेगा बाद प्रतिरक्षण में इस्तेमाल किया जाएगा) । इस मामले में ऊष्मायन के लिए माइक्रोस्कोप स्टेज इनक्यूबेटर की आवश्यकता नहीं होती है। कृपया किसी उदाहरण के लिए वीडियो 3 का उल्लेख करें।
  2. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, एफसीएस के बिना गर्म आरपीएमआई (37 डिग्री सेल्सियस) माध्यम के साथ कोमल मिलाते हुए अच्छी तरह से धोएं (सीरम से एल्बुमिन एसीटोन निर्धारण के साथ उपजी हो सकती है)। एस्पिरेट और प्रत्येक अच्छी तरह से पीएफए या पूर्व ठंडा एसीटोन के 200 μL जोड़ें। कक्ष स्लाइड कमरे के तापमान (आरटी) पर या बर्फ पर, क्रमशः, 20 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: एसीटोन निर्धारण के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर एसीटोन को प्री-चिल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर चैंबर स्लाइड को प्री-चिल करें। प्लास्टिक के ढक्कन निकालें जब एसीटोन का उपयोग 8 अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम कक्ष स्लाइड में सुसंस्कृत कोशिकाओं को ठीक करने के लिए किया जाता है।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के साथ दो बार धोएं और शमन समाधान (पीबीएस, 50 एमएम एनएच4सीएल) के 200 माइक्रोन जोड़ें। कक्ष स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते हैं।
    नोट: इस स्तर पर कक्ष स्लाइड प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने से पहले कम से कम एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक रह सकता है, जैसा कि8वर्णित है। ढक्कन वाष्पीकरण को रोकता है।

8. इमेज प्रोसेसिंग

  1. अधिग्रहण के बाद छवि deconvolution (यानी Huygens deconvolution या समकक्ष, सामग्री की तालिका)समय चूक श्रृंखला के प्रदर्शन और/ एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर (यानी, Huygens में "वाइड फील्ड" ऑप्टिकल विकल्प का उपयोग करके) और सही ऑप्टिकल मापदंडों को नियोजित करके डिकोवोल्यूट। माइक्रोस्कोप4के मापा बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) की छवि प्रसंस्करण के लिए डेकोनोवोलुशन आवश्यक है।
  2. वैकल्पिक रूप से, माइक्रोस्कोप फ़ाइलों से मेटाडेटा में शामिल ऑप्टिकल मापदंडों के स्वचालित लोड करके आदर्शीकृत पीएसएफ की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। इन ऑप्टिकल पैरामीटरों में फ्लोरोक्रोम तरंगदैर्ध्य, अपवर्तन सूचकांक, उद्देश्य का संख्यात्मक एपर्चर, और इमेजिंग तकनीक (कॉन्फोकल, वाइड-फील्ड, आदि) शामिल हैं। 4.
  3. इसके बाद, इमेजिंग सॉफ्टवेयर पीएसएफ और विविध डेकोनोवोलुशन एल्गोरिदम (यानी, क्यूएमएलई और ह्यूगेन्स सॉफ़्टवेयर में सीएमएलई) का उपयोग करता है, एक कदम-दर-कदम संचयी, गणना प्रक्रिया में, जिसके परिणामों की तुलना में लगातार कल्पना की जा सकती है और उपयोगकर्ता द्वारा आवश्यक होने पर (या फिर से शुरू) किया जा सकता है। इस स्तर पर उपयोगकर्ता convolutions की संख्या बदल सकते है और/या शोर अनुपात के लिए संकेत और deconvolution फिर से शुरू । डेकोवोलुशन सॉफ्टवेयर समय चूक श्रृंखला (एक्स, वाई, टी)(वीडियो 2)और जेड-स्टैक (एक्स, वाई, जेड)(वीडियो 3)के साथ अच्छी तरह से काम करता है। डेकोवोल्यूट किए गए चैनलों को बाद में सीएफएसी, रॉ चैनल में मिला दिया गया था, क्योंकि साइटोसोलिक, डिफ्यूज फ्लोरोक्रोम4,9से सुधार नहीं करते हैं।

Representative Results

हमने ज्यूरकैट-राजी प्रतिरक्षा सिनेप्स उत्पन्न करने और आईएस के गठन के शुरुआती दौर को ठीक से छवि बनाने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का पालन किया है। हमारा उद्देश्य20 पहले MTOC के ध्रुवीकरण और आईएस के प्रति गुप्त मशीनरी का अध्ययन करने के लिए पीछा जल्दी दृष्टिकोण में सुधार करने के लिए किया गया था । ये दृष्टिकोण एक अंतिम बिंदु रणनीति पर आधारित थे जो आईएस गठन या शुरुआती सिनैप्टिक घटनाओं की इमेजिंग की अनुमति नहीं देते थे, क्योंकि इन रणनीतियों में गठन अनिवार्य मिश्रित, केंद्रीकृत कोशिकाओं की गोली में हुआ है, लेकिन माइक्रोस्कोप पर नहीं। हमारा प्रोटोकॉल इस मुख्य चेतावनी से बचने के लिए डिज़ाइन किया गया था, क्योंकि दृष्टिकोण एक उपयुक्त सेल एकाग्रता (चरण 2 और 3) के उपयोग पर आधारित था, सेल-टू-सेल के गठन के पक्ष में अपने माइक्रोस्कोप चैंबर स्लाइड (8 माइक्रो वेल चैंबर स्लाइड) पर कॉन्जुगेट्स है, जो पूर्व-गर्म माइक्रोस्कोप चरण इनक्यूबेटर (चरण 4 में) पर चढ़कर है। यह रणनीति आईएस गठन को प्रेरित करती है, साथ ही समय-चूक इमेजिंग कैप्चर(वीडियो 1)के लिए।

चित्रा 1 सिनैप्टिक जुरकट-राजी कंजूगेट्स का प्रतिनिधित्व करता है जो प्रोटोकॉल (चरण 5.2) का पालन करते हुए प्राप्त किए गए थे। छवि एक प्रतिनिधि, समय चूक प्रयोग से पहले फ्रेम का प्रतिनिधित्व करता है । 2 x 105 राजी कोशिकाओं और 2 x 105 ज्यूरीकोशिकाओं को 1 सेमी2 अच्छी तरह से जोड़ा गया था। ऊपरी पैनल ट्रांसमिटेंस चैनल दिखाता है, मध्य पैनल में CMAC (ब्लू) चैनल (राजी कोशिकाएं) होती हैं, और निचले पैनल दोनों ट्रांसमिशन प्लस CMAC विलय चैनलों को दिखाता है। पीले तीर कुछ सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स को संदर्भ के रूप में लेबल करते हैं, जबकि हरे तीर एक जुरकैट सेल और कई राजी कोशिकाओं (जटिल कंजुगेट्स) द्वारा बनाए गए सिनैप्टिक कंजुगेट्स का संकेत देते हैं। कम सेल सांद्रता (1 सेमी2 अच्छी तरह से 105 या उससे कम कोशिकाएं) जटिल सेलुलर कॉन्जुगेट्स के गठन को दरकिनार कर देगी, लेकिन ध्रुवीकृत यातायात के बाद के विश्लेषण के लिए पर्याप्त सेल कॉन्जुगेट्स नहीं हो सकते हैं (नीचे देखें), कि बदले में उभरते सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स को खोजने और छवि बनाने की संभावना भी कम हो जाएगी।

चित्रा 2 वीडियो 1के अनुरूप एक प्रतिनिधि समय चूक प्रयोग में उपयुक्त सॉफ्टवेयर (यानी, NIKON NIS_AR) का उपयोग करके दो अलग-अलग फ्लोरोक्रोम (CMAC और GFP-CD63) के एक साथ कैप्चर के लिए उपयोग किए जाने वाले इमेजिंग मापदंडों के अनुरूप स्क्रीनशॉट का प्रतिनिधित्व करता है।

वीडियो 1 (इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स, रॉ) जीएफपी-सीडी63 (मल्टीवेसिकुलर बॉडीज-एमवीबी, ग्रीन वेसिकल्स का मार्कर) व्यक्त करने वाले एक जुरकैट टी लिम्फोसाइट का प्रतिनिधित्व करता है और 1 ज्यूरेट सेल और 2 राजी कोशिकाओं के बीच डबल सिनेप्स का गठन, नीले रंग में (उनमें से एक निगलने से गुजरता है)। सिनेप्स क्षेत्रों की ओर जुरकैट सेल के अंदर एमवीबी का एक साथ आंदोलन दर्ज किया गया था (एफएफपी-सीडी63 के लिए हर 20 सेकंड में फ्रेम दर = 1 फ्रेम; वीडियो प्रजनन गति = 2 फ्रेम प्रति एस)। सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स को ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल (चरण 6.2) का पालन करते हुए प्राप्त और चित्रित किया गया था, जिसने उभरते सिनेप्स(वीडियो 1)की इमेजिंग की अनुमति दी थी। जीएफपी-सीडी63 और सीएफएसी फ्लोरेसेंस दोनों चैनलों का एक साथ कब्जा एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर (यानी एनआईएस-एआर, टेबल ऑफ मैटेरियल) काउपयोग करके किया गया था। वीडियो एक प्रतिनिधि, समय चूक प्रयोग से कच्चे डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । प्रयोग के साथ एक स्थिर ध्यान देने का आश्वासन देने के लिए, ग्लास बॉटम से बंधे राजी कोशिकाओं के संबंध में स्वचालित फोकस प्रणाली को एक उपयुक्त ऑफसेट के साथ परिभाषित किया गया था।

वीडियो 2 (इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स, डेकोनोवोल्यूशन के बाद) वीडियो 1से मेल खाती है, लेकिन जीएफपी-सीडी63 फ्लोरेसेंस चैनल छवियों का डेकोनोवोलुशन एक उपयुक्त डेकोनोवोलुशन सॉफ्टवेयर (यानी, ह्यूगेंस) को नियोजित करके किया गया था, "वाइड फील्ड" ऑप्टिकल विकल्प और उचित ऑप्टिकल मापदंडों (चरण 8) का उपयोग करके। इस डिकोवोल्यूट किए गए चैनल को बाद में सीएफएसी, रॉ चैनल में मर्ज कर दिया गया । संकेत से शोर अनुपात और छवि के तीखेपन दोनों में सुधार स्पष्ट है। डेकोवोलुशन अधिग्रहण के बाद किया गया था, जैसा कि ऊपर वर्णित है। डेकोवोलुशन सॉफ्टवेयर के बारे में विशिष्ट विवरण के लिए कृपया4का उल्लेख करें ।

वीडियो 3 (इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स, फिक्सिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के बाद) एक निश्चित के जेड-स्टैक (जेड-स्टेप आकार = 0.8 माइक्रोन, 5 फ्रेम) का प्रतिनिधित्व करता है प्रोटोकॉल (एसीटोन निर्धारण) के चरण 6 के बाद संजोना है। निर्धारण के बाद, एफ-ऐक्टिन (ग्रीन), एंटी-सीडी63 की कल्पना करने के लिए एफ-ऐक्टिन (ग्रीन), एंटी-सीडी63 की कल्पना करके मानक प्रोटोकॉल25 के बाद प्रतिरक्षण किया गया था, एमटीओसी (लाल) की कल्पना करने के लिए विरोधी-ट्यूबलिन। सीबीएसी (ब्लू) राजी सेल को लेबल करता है। बाद में संजूगेट को एपिफ्लोरेसेंस द्वारा इमेज किया गया था और कई चैनल "वाइड फील्ड" ऑप्टिकल विकल्प और उचित ऑप्टिकल मापदंडों (चरण 7) का उपयोग करके डिकोवोल्यूट किए गए थे। deconvoluted चैनलों को बाद में सीएफएसी, कच्चे चैनल में विलय कर दिया गया, जैसा कि विभिन्न पैनलों (सीएफएसी प्लस ट्रांसमिटेंस-ट्रांस, सीएफएसी प्लस फेलोडिन, सीएफएसी प्लस एंटी-सीडी63 और सीएफएसी प्लस एंटी-एंटी-ट्यूबलिन, क्रमशः) में इंगित किया गया था। सफेद तीर सिनेप्स लेबल करता है, जबकि हरे तीर एमवीबी लेबल और पीले तीर MTOC लेबल। एमवीबी और एमटीओसी ध्रुवीकरण के विस्तृत परिमाणीकरण को कहीं और25बताया गया है ।

यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण में सेल-टू-सेल कॉन्जुगेट्स का गठन शामिल है और साथ ही, व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (डब्ल्यूएफएफएम) द्वारा समय-चूक अधिग्रहण छवि प्रसंस्करण (अधिग्रहण के बाद डेकोनोवोल्यूशन) द्वारा किया जाता है। इस रणनीति ने छवियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात (SNR) में सुधार किया, उनके लौकिक संकल्प को बढ़ाया, और उभरते सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स4में कई फ्लोरोक्रोम के सिंक्रोनाइज्ड अधिग्रहण की अनुमति दी। इसके अलावा, प्रोटोकॉल बाद के अंत बिंदु सेल निर्धारण विधियों (पैराफॉर्मलडिहाइड, एसीटोन या मेथनॉल) के साथ अच्छी तरह से मेल खाता है, जो आगे प्रतिरक्षण धुंधला औरविश्लेषण 25 (वीडियो 3)की अनुमति देगा। यह प्रोटोकॉल लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और अन्य अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ भी संगत है।

Figure 1
चित्रा 1: सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स के प्रतिनिधि डबल आकार माइक्रोस्कोपी क्षेत्र। छवि प्रोटोकॉल के बाद एक प्रतिनिधि, समय-चूक प्रयोग से पहले फ्रेम का प्रतिनिधित्व करती है। ऊपरी पैनल ट्रांसमिटेंस चैनल, मिडिल पैनल CMAC चैनल (राजी सेल) और निचले पैनल दोनों विलय चैनलों से पता चलता है । पीले तीर संदर्भ के रूप में कुछ सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स को लेबल करते हैं। हरे तीर जटिल सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स (यानी, एक से अधिक राजी सेल के साथ सिनेप्स की स्थापना करने वाले एक जुरकैट सेल) का संकेत देते हैं। 40x ईडब्ल्यूडी (0.6 एनए) उद्देश्य के साथ कब्जा कर लिया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: समय चूक माइक्रोस्कोप सेटिंग्स। छवि वीडियो 1के अनुरूप एक प्रतिनिधि समय चूक प्रयोग में उपयुक्त सॉफ्टवेयर (यानी, निकॉन NIS_AR) का उपयोग करके दो अलग-अलग फ्लोरोक्रोम (सीएफएसी और जीएफपी-सीडी63) के एक साथ कैप्चर के लिए उपयोग किए जाने वाले इमेजिंग मापदंडों के अनुरूप कई स्क्रीनशॉट से मेल खाती है। GFP-CD63 चैनल के लिए प्रत्येक फ्रेम हर 20 एस पर कब्जा कर लिया गया था । प्रयोग के साथ सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए जीएफपी चैनल के लिए आठ फ्रेम में से केवल एक यूवी चैनल के लिए केवल एक फ्रेम पर कब्जा कर लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Video 1
वीडियो 1: एफएफपी-सीडी63, कच्चे डेटा को व्यक्त करते हुए एक जुरकैट सेल द्वारा बनाए गए इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स। सेल ट्रैकर ब्लू (सीएमएसी, ब्लू) के साथ लेबल की गई राजी बी कोशिकाओं को जीएफपी-सीडी638 व्यक्त करने वाले जुरकैट कोशिकाओं के साथ 30 मिन और सिनेप्स के लिए देखें के साथ स्पंदित किया गया था । जीएफपी-सीडी63 और सीएफएसी चैनलों के अनुरूप समय-चूक (20 एस प्रति फ्रेम; वीडियो प्रजनन गति = 2 फ्रेम प्रति एस) और एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाया गया है। 60x प्लान एपीओ (1.4 एनए) उद्देश्य के साथ कैप्चर किया गया। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Video 2
वीडियो 2: एक जुरकैट सेल द्वारा बनाई गई इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स जीएफपी-सीडी63 को व्यक्त करते हुए, डेकोनोलुयूशन के बाद। वीडियो 1के समान, लेकिन छवियों को एक डेकोवोलुशन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डिकोवोल्यूट किया गया था। बेहतर संकेत से शोर अनुपात और बढ़ाया तीखापन, ध्यान फ्लोरेसेंस से बाहर संदूषक के उन्मूलन के कारण, स्पष्ट है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Video 3
वीडियो 3: फिक्स्ड और इम्यूनोदाग इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स। छवि प्रोटोकॉल के चरण 7 और बाद में प्रतिरक्षण के बाद एक प्रतिनिधि तय सिनैप्टिक कॉन्जुगेट दिखाती है। सीएमएसी (ब्लू) लेबल राजी कोशिकाएं, ट्रांसमिटेंस (ट्रांस) सिनैप्टिक कॉन्जुगेट (सफेद तीर), फालोडिन लेबल एफ-ऐक्टिन (ग्रीन), एंटी-सीडी63 लेबल एमवीबी (मजेंटा, ग्रीन एरो) और एंटी-ट्यूबलिन लेबल एमटीओसी (लाल, पीला तीर), क्रमशः। इन चैनलों को एपिफ्लोरेसेंस द्वारा चित्रित किया गया था, जो संकेत के अनुसार डिकोवोल्यूट और विलय किया गया था। वीडियो में एक जेड-स्टैक (जेड-स्टेप साइज = 0.8 माइक्रोन, 5 फ्रेम) शामिल हैं। सफेद तीर सिनैप्टिक संपर्क क्षेत्र को लेबल करता है, जबकि हरे तीर एमवीबी को लेबल करते हैं और पीले तीर एमटीओसी लेबल करते हैं। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Discussion

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि सभी सिनेप्स ऑप्टिकल धुरी के लिए आदर्श रूप से लंबवत उन्मुख नहीं होंगे। इस तकनीक का उपयोग करके, प्रतिरक्षा सिनेप्स इमेजिंग के लिए आदर्श अभिविन्यास को प्रभावित करने का कोई तरीका नहीं है। इस समस्या को ठीक करने के लिए, हम बाद के विश्लेषणों से बाहर निकलते हैं जो सभी बेतरतीब ढंग से कैप्चर किए गए सिनेप्स हैं जो अंततः आदर्श मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं। ये सिनेप्स, उपयुक्त रूप से पर्याप्त, बहुत बार नहीं हैं। हालांकि, कई प्रयोगात्मकदृष्टिकोणों काउपयोग करके इस सीमा को दरकिनार करना संभव है।

ध्रुवीकृत सीडी63 रिलीज (डिग्रेन्युनुलेशन) को अन्य पूरक तकनीकों जैसे सीडी63 (सेल सतह पर सीडी63 पुनर्स्थानीयकरण) के जीवित कोशिकाओं (तय नहीं किया गया है और पार्मिबिलाइज्ड नहीं), चरण 6 के बाद, और बाद में धोने और निर्धारण, जैसा कि पहले8दिखाया गया था। इसके अलावा, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंगविश्लेषण9,25 द्वारा एक्सोसोम8,9 और एक्सोसोम क्वाटिफिकेशन पर सीडी63 रिलीज किया जा सकता है। ये दृष्टिकोण निश्चित रूप से हमारे प्रोटोकॉल के साथ संगत हैं, बशर्ते जीवित कोशिकाओं की कोशिका सतह प्रतिरक्षण के बाद निर्धारण किया जा रहा हो।

हमें कोशिकाओं की आदर्श संख्या मिली है (8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में 1 सेमी2 अच्छी तरह से) 4 x 105 कोशिकाएं (2 x 105 राजी कोशिकाएं और 2 x 105 ज्यूकैट कोशिकाएं) हैं क्योंकि वे कुएं के नीचे कुशलतापूर्वक पालन करते हैं। प्लास्टिक के लिए बाध्यकारी दक्षता (फाइब्रोनेक्टिन का उपयोग करना), या ग्लास बॉटम (पॉली-एल-लिसिन का उपयोग करना) माइक्रोस्लाइड आमतौर पर एक समस्या नहीं है। उच्च सेल संख्या का पालन कोशिकाओं के बीच कोई अंतराल पैदा कर सकते हैं और बाद में, जटिल सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स(चित्रा 1); दोनों स्थितियां वांछनीय नहीं हैं जब एकल सेल-टू-सेल संजूगेट्स को इमेजअप करने की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, एमटीओसी या गुप्त कणिका ध्रुवीकरण प्रयोग। कोशिकाओं की कम संख्या से conjugates खोजने की संभावना कम हो सकती है, खासकर जब ट्रांससंक्रमित जुरकैट कोशिकाओं को सिनेप्स उत्पन्न करने के लिए एपीसी के साथ चुनौती दी जाती है। कृपया ध्यान दें कि हमने देखा है कि प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले माइक्रोस्कोप एक्स/वाई चरण पर एक तापमान स्थिर चरण इनक्यूबेटर (यानी, 1-2 घंटे पहले से मंच/माइक्रोस्कोप सेटअप को स्थिर करने के लिए) स्थिर एक्स, वाई, जेड मापदंडों को बनाए रखता है, जो उचित इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है । स्वचालित फोकस सिस्टम अंततः छोटे जेड विविधताओं की भरपाई करेगा।

जब इलेक्ट्रोपॉरेज जैसी कुछ जीन ट्रांसड्यूक्शन तकनीकों का उपयोग जुरकैट क्लोन(वीडियो 1)में फ्लोरोसेंट चिमेरिक प्रोटीन (यानी जीएफपी-सीडी63) को व्यक्त करने के लिए किया जाता है, तो कोशिकाओं का काफी अंश विद्युतीकरण के बाद मर सकता है। यह एक समस्या हो सकती है क्योंकि मृत कोशिकाएं सिनेप्स नहीं बनाती हैं, जब वे जीवित, ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं पर अधिक होते हैं, तो वे वें कोशिकाओं को जीवित करके किए गए कंजूगेट्स के गठन में हस्तक्षेप कर सकते हैं। हमने पाया है कि संजूगेट गठन कदम से पहले मानक प्रोटोकॉल का पालन करके ट्रांससंक्रमित संस्कृतियों से मृत कोशिकाओं का सावधानीपूर्वक उन्मूलन वास्तव में छवि संजूगेट्स को ठीक से छवि संजूगेट्स करने की संभावना को बढ़ा सकता है। इसके अलावा, कम ट्रांसफेक्शन क्षमता (<20%) इसके बाद से एक महत्वपूर्ण चेतावनी हो सकती है, जो एक मध्यम संजूगेट गठन दक्षता (लगभग 60%)25के साथ संयुक्त है, ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं द्वारा बनाए गए कंजूगेट्स को खोजने की संभावना कम हो जाएगी। यह कोई समस्या नहीं है जब गैर-ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं का उपयोग अंतिम बिंदु प्रयोगों और बाद में निर्धारण में संजूगेट्स प्राप्त करने के लिए किया जाता है। 8 माइक्रोवेल चैंबर स्लाइड पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के साथ संगत हैं। इससे विभिन्न उद्देश्यों के साथ उपरोक्त प्रोटोकॉल का लचीलापन बढ़ता है। एसीटोन के साथ निर्धारण प्लास्टिक के नीचे कुओं के साथ चैंबर स्लाइड का उपयोग करते समय विचार करने के लिए एक समस्या हो सकती है। हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 8 माइक्रोवेल माइक्रोस्कोप चैंबर स्लाइड हैं जिनमें ग्लास बॉटम्स होते हैं, जो एसीटोन निर्धारण के साथ संगत होते हैं। प्लास्टिक के ढक्कन तब हटा दें जब एसीटोन का उपयोग 8 माइक्रोवेल ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड में सुसंस्कृत कोशिकाओं को ठीक करने के लिए किया जाता है।

यह सिफारिश की जाती है कि माइक्रोस्कोप एक मोटराइज्ड एक्सवाई चरण, मोटराइज्ड एपि-फ्लोरेसेंस बुर्ज और ऑटोमैटिक फोकस सिस्टम (जैसे, परफेक्ट फोकस सिस्टम) या समकक्ष सप्लीमेंट से लैस है। जब बहु-अच्छी तरह से अधिग्रहण की आवश्यकता होतीहै,तो स्वचालित फोकस प्रणाली प्रयोग के साथ एक स्थिर ध्यान सुनिश्चित करेगी। पिछला अनुभव इंगित करता है कि राजी कोशिकाओं पर उचित फोकस ऑफसेट स्थापित करके, दोनों टी कोशिकाओं के आंदोलन(वीडियो 1)और XY बहु-बिंदु प्रयोगों में माइक्रोस्कोप चरण/कक्ष स्लाइड आंदोलनों को मुआवजा दिया जा सकता है । यह वास्तव में मल्टीवेल समय चूक पर कब्जा करने के लिए सुविधाजनक है ।

एक काले और सफेद, पंचरोमेटिक और कूल्ड चार्ज्ड डिवाइस (सीडीडी) कैमरे का उपयोग किया गया था लेकिन उच्च संवेदनशीलता, फ्लोरेसेंस वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (SCMOS) कैमरा वांछनीय है, क्योंकि इससे कैमरा एक्सपोजर समय कम हो जाएगा और अस्थायी संकल्प में वृद्धि होगी। लघु कैमरा एक्सपोजर बार हम इस्तेमाल किया है (रैंकिंग फार्म १०० एमएस से ५०० एमएस) स्वचालित फ्लोरेसेंस शटर के साथ संयुक्त लंबे समय चूक पर कब्जा (24 घंटे तक) एक पर्याप्त समय संकल्प के साथ (1 फ्रेम प्रति मिनट या उससे कम, 16 XY पदों के लिए) महत्वपूर्ण फ्लोरेसेंस ब्लीचिंग के बिना और/या सेल व्यवहार्यता में नुकसान की अनुमति देता है । मोटर चालित चरण बहु-बिंदु (XY) कैप्चर की अनुमति देता है और आदर्श अभिविन्यास में उभरते और विकासशील सिनेप्स को खोजने और छवि बनाने का मौका बढ़ाता है, लेकिन मल्टीवेल चैंबर स्लाइड में छवि अधिग्रहण की अनुमति भी देता है जब विभिन्न ज्यूरकैट क्लोन को एक साथ25संयुग्मित करने की आवश्यकता होती है। गुप्त कणिकाओं के यातायात का विश्लेषण करते समय सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए उद्देश्य का उच्च संख्यात्मक एपर्चर (यानी 60x, 1.4) आवश्यक है।

राजी-SEE-Jurkat एक अच्छी तरह से स्थापित इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स मॉडल है कि शोधकर्ताओं के असंख्य द्वारा इस्तेमाल किया गया है के बाद से यह मूल रूप से11वर्णित किया गया है का गठन किया । हमने अपने प्रोटोकॉल को इस मॉडल के लिए अनुकूलित किया है ताकि गठन के शुरुआती दौर को ठीक से छवि दी जा सके। हमारा उद्देश्य20 पहले MTOC के ध्रुवीकरण और आईएस के प्रति गुप्त मशीनरी का अध्ययन करने के लिए पीछा जल्दी दृष्टिकोण में सुधार करने के लिए किया गया था । यह उल्लेखनीय है कि इस प्रोटोकॉल के साथ किए गए कंजूगेट्स सिनेप्स में एफ-ऐक्टिन पुनर्गठन का उत्पादन करते हैं, जो एक विहित स्मैक को विन्यास करते हैं, एमवीबी ध्रुवीकृत यातायात25को सहवर्ती रूप से। इन महत्वपूर्ण घटनाओं का विश्लेषण और मान्यता भी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी25द्वारा की गई है .

ध्रुवीकृत यातायात में गतिज मतभेद विभिन्न प्रकार के आईएस के बीच मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, सीटीएल से लिटिक कणिकाओं का ध्रुवीकृत परिवहन सेकंड या बहुत कम मिनटों में होता है, जबकि कई साइटोकिन युक्त वेसिकल्स को एच लिम्फोसाइट्स से समाप्त होने में कई घंटे तक लगते हैं। इन लौकिक विसंगतियों को पहले से ध्यान में रखा जाना चाहिए, ताकि सबसे अच्छी रणनीति डिजाइन करने के लिए और सबसे उपयुक्त प्रयोगात्मक और इमेजिंग दृष्टिकोण का चयन करने के लिए, क्योंकि कुछ इमेजिंग स्ट्रैजम्स (यानी, लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (एलएससीएम)) के लिए, समय एक सीमित कारक हो सकता है क्योंकि कैप्चर समय उचित समय संकल्प (1 मिन या उससे कम)4से बहुत अधिक है। यह एक सीमा नहीं है जब व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (WFFM) के रूप में ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोग किया जाता है । चूंकि सीटीएल में, सिनेप्स की ओर एमटीओसी का ध्रुवीकरण केवल कुछ मिनटोंतक रहता है3,6,17,विविध विशिष्ट राज्य-कला माइक्रोस्कोपी यहां वर्णित करने के लिए अलग-अलग दृष्टिकोण (लेकिन उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प को शरण देना) इन सिनेप्स26,27को ठीक से छवि बनाने के लिए आवश्यक हैं, मुख्य रूप से जब कई माइक्रोस्कोप क्षेत्र (बहु-बिंदु कैप्चर) छवि वाले होते हैं। इन उच्च संकल्प, नए दृष्टिकोण भी Th lymphocytes द्वारा किए गए synapses इमेजिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है, हालांकि किफायती और/या रसद कारणों (यानी, इन इमेजिंग तकनीकों में से कुछ के लिए आवश्यक मुख्य उपकरण यहां वर्णित एक से 6-7 गुना अधिक लागत) निश्चित रूप से कला इमेजिंग तरीकों के इन राज्य के लिए एक सीमा का गठन कर सकता है4। तथ्य यह है कि वें लिम्फोसाइट्स द्वारा बनाया गया है लंबे समय से रहते थे, और परिस्थिति है कि वें लिम्फोसाइट्स MTOC में, लिम्फोकिन युक्त स्रावशील वेसिकल्स और एमवीबी को परिवहन और डॉक22में कई मिनट तक का समय लगता है, इस प्रोटोकॉल को वें-एपीसी आईएस इमेजिंग के लिए एक आदर्श, किफायती दृष्टिकोण बनाता है।

अधिग्रहण के बाद छवि deconvolution के संयोजन में WFFM एक दिलचस्प दृष्टिकोण का गठन करता है और न केवल आर्थिक कारण इस रणनीति का समर्थन करते हैं। जेड धुरी (तकनीक की सबसे महत्वपूर्ण चेतावनी) में आंतरिक गरीब संकल्प को अधिग्रहण के बाद छवि डेकोनोवोलुशन4 (वीडियो 2के साथ वीडियो 1 की तुलना) का उपयोग करके सुधारा जा सकता है। डेकोवोलुशन एक गणना-आधारित, छवि प्रसंस्करण दृष्टिकोण का उपयोग करता है जो शोर अनुपात और छवि संकल्प के लिए संकेत में सुधार कर सकता है और इसके विपरीत27 से 2 गुना तक, XY धुरी में 150-100 एनएम और जेड एक्सिस4में 500 एनएम तक नीचे।

उच्च संवेदनशीलता, उच्च readout गति और व्यापक गतिशील रेंज, नए फ्लोरेसेंस sCMOS कैमरों का उपयोग छवियों की गुणवत्ता में सुधार होगा और फ्लोरेसेंस ब्लीचिंग को कम करेगा । यहां वर्णित सेल-टू-सेल कंजुगन प्रोटोकॉल द्वारा पेश किया गया लचीलापन कला माइक्रोस्कोपी तकनीकों के कई राज्य के साथ वर्णित सेलुलर दृष्टिकोण के संयोजन की अनुमति देता है, दोनों जीवित कोशिकाओं में, लेकिन निश्चित कोशिकाओं में भी, और अपेक्षित परिणाम वास्तव में इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स के बारे में हमारे ज्ञान में सुधार होगा।

यद्यपि हमने आसान-से-हैंडल, अच्छी तरह से स्थापित सेल लाइनों का उपयोग करके प्रोटोकॉल को लागू और मान्य किया है, लेकिन संभावित दृष्टिकोण अधिक शारीरिक बातचीत के दृश्य की अनुमति दे सकता है जब प्राथमिक टी कोशिकाएं और विभिन्न प्रकार की एंटीजन-पेश कोशिकाएं (जैसे मैक्रोफेज की डेंड्रिटिक कोशिकाएं) का उपयोगकियाजाता है। इस संदर्भ में, प्राथमिक माउस टी लिम्फोब्लास्ट9को चुनौती देने के लिए एपीसी के रूप में उपयोग की जाने वाली सुपरएंटीजन (एसईबी) -स्पंदित माउस ईएल-4 सेल लाइन का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल को भी बढ़ाया और मान्य किया गया है। वास्तव में प्राथमिक टी लिम्फोसाइट्स, विशेष रूप से सीटीएल, और अधिक अल्पकालिक और गतिशील सिनैप्टिक संपर्क प्रदान किए गए(9संदर्भ में पूरक वीडियो 8 देखें) देखें-राजी और जुरकैट मॉडल के साथ देखे गए लोगों के लिए। सिनैप्टिक संपर्क मोड की परिवर्तनशीलता को दो-आयामी इन विट्रो ऊतक समकक्ष में डेंड्रिटिक कोशिकाओं या बी कोशिकाओं के साथ प्राथमिक टी-सेल इंटरैक्शन के लिए सबसे अच्छा देखा जा सकता है जिसे इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके रिकॉर्ड और विश्लेषण भी किया जा सकता है। इसके अलावा, सुपरएंटीजन के अलावा, तकनीक का उपयोग अन्य प्रकार के सिनेप्स को इमेज करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग टीसीआर ट्रांसजेनिक, एंटीजन-विशिष्ट टी सेल मॉडल में किया जा सकता है, उदाहरण के लिए ओवएल्बिन विशिष्ट मूत्र OT1/OT2 प्रणाली का उपयोग करके या एंटीजन-विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर्स के साथ टी कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन द्वारा । यह तत्काल भविष्य के लिए प्रयोगात्मक संभावनाओं के असंख्य खोलता है ।

Disclosures

लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

हम उनके उदार योगदान के लिए प्रयोगशाला के सभी अतीत और वर्तमान सदस्यों को स्वीकार करते हैं । इस काम को स्पेनिश मिनिस्टरियो डी ओनिमिया वाई प्रतिस्पर्धी (MINECO), प्लान नैसिनल डी Investigación Científica (SAF2016-77561-R से M.I., जो फेडर-ईसी फंडिंग के साथ दिए गए हिस्से में था) से अनुदान द्वारा समर्थित था। हम उनके समर्थन और वीडियो का उत्पादन करने के लिए प्रदान की जाने वाली सुविधाओं के लिए Facultad de मेडिविना (UAM) और Facultad de मेडिविज़र को स्वीकार करते हैं। हम निरंतर और शानदार तकनीकी और सैद्धांतिक समर्थन के लिए NIKON-यूरोप स्वीकार करते हैं । इस लेख के लिए मुफ्त पहुंच निकॉन द्वारा प्रायोजित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera Nikon DS-QI1MC Nikon MQA11550 Cooled Camera Head
CMAC ThermoFisher Scientific C2110 Cell tracker blue
JURKAT cells ATCC ATCC TIB-152 Effector T lymphocytes
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom IBIDI Cat.No: 80826, 80827 Cell culture and cell imaging supports
Microscope NIKON Eclipse Ti-E Nikon NIKON Eclipse Ti-E Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module OKOLAB H201-NIKON-TI-S-ER Cell culture atmosphere
Raji Cells ATCC ATCC CCL-86 APC
RPMI medium GIBCO ThermoFisher Scientific 21875034 Culture medium
Streptococcus Enterotoxin E (SEE) Toxin Technology, Inc EP404 Bacterial Toxin
Software Huygens Essential SVI Huygens Essential Image Deconvolution software
Software ImageJ NIH Image J Image software
Software Nikon NIS-AR Nikon NIS-Elements AR Image capture and analysis software

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References

  1. Fooksman, D. R., et al. Functional anatomy of T cell activation and synapse formation. Annual Review of Immunology. 28, 79-105 (2010).
  2. de la Roche, M., Asano, Y., Griffiths, G. M. Origins of the cytolytic synapse. Nature Reviews. Immunology. 16, 421-432 (2016).
  3. Griffiths, G. M., Tsun, A., Stinchcombe, J. C. The immunological synapse: a focal point for endocytosis and exocytosis. The Journal of Cell Biology. 189, 399-406 (2010).
  4. Calvo, V., Izquierdo, M. Imaging Polarized Secretory Traffic at the Immune Synapse in Living T Lymphocytes. Frontiers in Immunology. 9, 684 (2018).
  5. Friedl, P., den Boer, A. T., Gunzer, M. Tuning immune responses: diversity and adaptation of the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 5, 532-545 (2005).
  6. Xie, J., Tato, C. M., Davis, M. M. How the immune system talks to itself: the varied role of synapses. Immunological Reviews. 251, 65-79 (2013).
  7. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  8. Alonso, R., et al. Diacylglycerol kinase alpha regulates the formation and polarisation of mature multivesicular bodies involved in the secretion of Fas ligand-containing exosomes in T lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 18, 1161-1173 (2011).
  9. Mazzeo, C., Calvo, V., Alonso, R., Merida, I., Izquierdo, M. Protein kinase D1/2 is involved in the maturation of multivesicular bodies and secretion of exosomes in T and B lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 23, 99-109 (2016).
  10. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  11. Montoya, M. C., et al. Role of ICAM-3 in the initial interaction of T lymphocytes and APCs. Nature Immunology. 3, 159-168 (2002).
  12. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews. Immunology. 4, 301-308 (2004).
  13. Huse, M., Quann, E. J., Davis, M. M. Shouts, whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nature Immunology. 9, 1105-1111 (2008).
  14. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. The Journal of Experimental Medicine. 173, 1099-1109 (1991).
  15. Vignaux, F., et al. TCR/CD3 coupling to Fas-based cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 181, 781-786 (1995).
  16. de Saint Basile, G., Menasche, G., Fischer, A. Molecular mechanisms of biogenesis and exocytosis of cytotoxic granules. Nature Reviews. Immunology. 10, 568-579 (2010).
  17. Huse, M. Microtubule-organizing center polarity and the immunological synapse: protein kinase C and beyond. Frontiers in Immunology. 3, 235 (2012).
  18. Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. The Journal of Cell Biology. 202, 779-792 (2013).
  19. Jang, J. H., et al. Imaging of Cell-Cell Communication in a Vertical Orientation Reveals High-Resolution Structure of Immunological Synapse and Novel PD-1 Dynamics. Journal of Immunology. 195, 1320-1330 (2015).
  20. Kupfer, A., Singer, S. J. Cell biology of cytotoxic and helper T cell functions: immunofluorescence microscopic studies of single cells and cell couples. Annual Review of Immunology. 7, 309-337 (1989).
  21. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature Reviews. Immunology. 11, 672-684 (2011).
  22. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. Journal of Structural Biology. 168, 152-160 (2009).
  23. Jambrina, E., et al. Calcium influx through receptor-operated channel induces mitochondria-triggered paraptotic cell death. The Journal of Biological Chemistry. 278, 14134-14145 (2003).
  24. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7 1 (2009).
  25. Herranz, G., et al. Protein Kinase C delta Regulates the Depletion of Actin at the Immunological Synapse Required for Polarized Exosome Secretion by T Cells. Frontiers in Immunology. 10, 851 (2019).
  26. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42, 864-876 (2015).
  27. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence Microscopy: A Concise Guide to Current Imaging Methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, (2017).

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 154 टी लिम्फोसाइट्स एंटीजन-पेश करने वाली कोशिकाएं इम्यूनोलॉजिकल सिनैप्स माइक्रोट्यूबबुल-ऑर्गनाइजिंग-सेंटर ध्रुवीकृत यातायात मल्टीवेसिकुलर बॉडी
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Bello-Gamboa, A., Izquierdo, J. M.,… More

Bello-Gamboa, A., Izquierdo, J. M., Velasco, M., Moreno, S., Garrido, A., Meyers, L., Palomino, J. C., Calvo, V., Izquierdo, M. Imaging the Human Immunological Synapse. J. Vis. Exp. (154), e60312, doi:10.3791/60312 (2019).

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