Summary
이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.
Abstract
이 방법의 목적은 항원 제시 세포(APC) 및 이펙터 도우미 T 림프구(Th) 세포에 의해 형성된 세포 간 컨쥬게이션의 예로서 면역학적 시냅스(IS)를 생성하고, 상기 의 첫 번째 단계에 대응하는 이미지를 기록하는 것이다. IS 형성 및 후속 인신 매매 이벤트 (APC와 Th 셀에서 모두 발생). 이러한 사건은 결국 IS에서 양극화 된 분비로 이어질 것입니다. 본 프로토콜에서, 황색포도상구균 장독소 E(SEE)-펄스라지 세포를 세포 시냅스 모델로 서에 도전한 주캇 세포는 생물학적 현실에 대한 이러한 실험 시스템의 근접성(Th cell-APC 시냅스 접합체)에 근접하기 때문에 사용되었다. 여기에서 제시된 접근은 세포 대 세포 융합, 시간 경과 취득, 광시야 형광 현미경 검사법 (WFFM) 뒤에 심상 처리 (취득 후 deconvolution)를 관련시킵니다. 이것은 이미지의 신호 대 잡음 비 (SNR)를 향상시키고, 시간 적 해상도를 향상시키고, 신흥 시냅스 접합체에서 여러 형광크롬을 동기화 수집 할 수 있으며 형광 표백을 감소시킵니다. 또한, 프로토콜은 종점 세포 고정 프로토콜(파라포름알데히드, 아세톤 또는 메탄올)과 잘 일치하며, 이는 추가적인 면역형광 염색 및 분석을 가능하게 할 것이다. 이 프로토콜은 또한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법 (LSCM) 및 기타 최첨단 현미경 기술과 호환됩니다. 주요 주의 사항으로, Z 축을 따라 초점 평면에 오른쪽 90 ° 각도에 있던 T 셀-APC 경계 (IS 인터페이스라고 함)만 제대로 이미지화하고 분석 할 수 있습니다. Z 차원 및 다음 이미지 분석에서 이미징을 단순화하는 다른 실험 모델이 존재하지만, 이러한 접근법은 APC의 복잡하고 불규칙한 표면을 에뮬레이트하지 않으며 IS에서 비생리학적 상호 작용을 촉진할 수 있습니다. 따라서, 여기서 사용되는 실험접근법은 IS에서 발생하는 일부 생물학적 복잡성을 재현하고 직면하는 데 적합하다.
Introduction
이 방법의 주요 목표는 SEE 초항원 및 이펙터 Th 세포로 펄스된 항원 제시 세포(APC)에 의해 형성된 면역학적 시냅스(IS) 세포-세포 접합체를 생성하고, 면역학적 시냅스 형성의 첫 번째 단계에 대응하는 이미지를 등록하고 후속 인신매매 사건(APC 및 Th cell 모두에서 발생)을 생성하는 것이다. APC상에서 MHC-II에 결합된 항원으로 의한 세포 수용체(TCR)의 결합시 IS의 확립은 항원 특이적, 체액성 및 세포 면역 반응에 관여하는 매우 역동적이고 가단성 및 임계 인스턴스를 구성한다1,2. IS는 액틴 재구성 과정을 특징으로 하는 특수 한 상분자 활성화 복합체 (SMAC) 패턴의 형성에 의해 정의 된다3. APC를 가진 T 림프구에 의하여 IS 건설시, IS를 향한 분비 소포의 편광은 시냅스 간격에 편광분비에 연루된 것처럼 보입니다. 이러한 집중된 기계는 T 림프구의 중요한 분비 효과기 역할의 효능을 향상시키기 위해 면역 계통에 모호하게 공급하는 것으로 보이며, 방관자 세포의 비특이적, 사이토카인 중재 자극, 관련없는 표적 세포의 살해 및 활성화 유도 세포 사멸을 통한 세포 사멸(AICD)4를통해 세포 사멸을 감소시킨다.
IS의 결과는 T 림프구와 APC 모두의 특성에 따라 다릅니다. MHC-II에 연관된 항원을 표시하는 APC와 Th 세포(전형적으로 CD4+ 세포)의 시냅스 접촉은 T 세포(사이토카인 분비, 증식 등)의 활성화를 생성하고, 경우에 따라 AICD4를통한 세포자멸을 생성한다. 세포독성 T 림프구(CTL)(주로 CD8+ 세포)가 MHC-I와 관련된 항원을 제시하는 APC와 상호 작용하는 경우, 결과는 항원을 가진 CTL의 사전 자극 여부에 차이가 있다. 따라서, APC상에서 항원-MHC-I 복합체를 식별하는 순진한 CTL은 표적 세포를 파괴하고 분열시키기 위해 "프라이밍"된다. 프라임형 CTL은 또한 항원 특이적 세포 박멸을 생성하는 표적 세포(즉, 바이러스 또는 종양 세포에 의해 감염된 세포)를 가진 시냅스를확립한다 5,6.
면역학적 시냅스에서 엑소좀의 편광 분비는 관련 면역 반응에 관여하는 연구의 발달적이고 도전적인영역7. 항원TCR 자극시 IS8,9 (비디오 1)를향한 편광 수송을 경험하는 다발성 소포(IlV)를 운반하는 다기관체(MVB)가 입증되었다. 시냅스 막에서 이들 MVB의 융합은 시냅스 갈라진 부분8,10에엑소좀으로서 그들의 탈과립 및 ILV의 방출을 유도한다. 이것은 APC11,TCR 자극 CD4+ 림프체 및 프라이밍 Ctl로 작용하는 SEE 초항원 코팅 라지 세포에 도전한 Th 형 Jurkat 세포에 의해 형성된 IS에서 발생합니다. 따라서, Jurkat 세포에 의해 만들어진 시냅스는 엑소좀의 편광 분비 트래픽을 연구하는 귀중한 모델을 구성한다. 추가, 조사의 수십 년은 TCR 신호에 많은 근본적인 통찰력이 형질전환된 T 세포주를 가진 연구 결과에서 온 것을 보여주었습니다, 실제로 이 모형 시스템의 가장 잘 알려진 것은 Jurkat 백혈병 T 세포주12입니다.
완전히 개발된 IS의 형성은 항문 또는 AICD5를제외하고, Th 세포의 활성화, 순진한 CTL의 활성화 또는 프라이밍 된 CTL에 의한 표적 세포 살해를 포함한 몇 가지 중요한 생물학적 결과를 생성합니다. 따라서, T 림프구에 의해 확립된 분비IS의 두 가지 주요 유형이 매우 다양하지만, 유사하게 중요한 면역 이펙터 기능1,6,13이있다. 한편, 프라이밍 세포 독성 T 림프구 (CTL)에서 IS는 IS를 향해 ("분비 리소좀"이라고 함)의 급속한 편광 (초에서 몇 분까지)을 유도합니다. 용액 과립의 탈과립은 시냅스 갈라진부분 (14)에분비 된 천체 및 그란자임(pro-apoptotic 분자)을 유도한다. 분비된 퍼포린 및 그란자임은 이후에 표적 세포의 살해를유도한다(15,16). CTL은 표적 세포가 살해되는 대로 단 몇 분 동안 지속되는 임시 시냅스를 개발합니다3,17. 이는 아마도 최적의 CTL 태스크가 수많은 표적세포에가능한 한 많은 치명적인 타격을 분배하기 위해 신속하고 일시적인 접촉을 필요로 하는 상황 으로 인한 것 일 것이다3,17. 대조적으로, Jurkat 세포와 같은 Th 림프구는 안정적이고 오래 지속되는 IS (10-30 분에서 최대 시간까지)를 생성하며, 이는 자극 사이토카인3,17의방향및 끊임없는 분비 모두에 필요한 것으로 보인다. 사이토카인은 또한 분비 소포로 둘러싸여 있으며 그 중 일부는 (즉, IL-2, IFN-γ) IS17 및 분비에 대한 편광 수송을 경험한다. IS의 한 가지 필수적인 특징은 T 세포와 APC 사이의 탐색적, 약하고 일시적인 접촉의 형성이며(비디오1)이는 더 강한 상호작용과 성숙한 IS의 확립을 생성할 수 있으며, TCR이 조산 항원-MHC 복합체를 식별하고 적절한 공동 자극 연결이 확립된다는 것을 제공하는5. 초기 연락처의 시작과 성숙하고 완전히 생산적인 IS의 설립은 본질적으로 스토컨스, 빠르고 비동기 프로세스5,18입니다. 더욱이, 세포 대 세포 접합체19의생성에 있는 희소한 주파수가 있습니다, 이는 화상 진찰 기술에 대한 도전을 구성할 수 있습니다 (결과 및 토론 단을 참조하십시오 참조하십시오).
T 림프구에 있는 microtubule 조직 센터 (MTOC) 및 분비 과립의 편광을 검토하는 또 다른 주요 도전은 전체 프로세스가 빠른 것입니다 (초에서 몇 분), 특히 Ctl에서. 이러한 사실을 고려하여, 대부분의 초기 접근법은 APC/표적 세포및 T 림프구가 공동으로 혼합되고 저속 원심분리에 의해 수렴되는 종점 전략에 직면하여, 세포 간 컨쥬게이트 생성을 선호하고, 몇 분 동안 배양하고, 고정및 이후에 평가하였다. IS20을향한 MTOC 및/또는 분비 소포의 재배치. 이 접근 방식은 두 가지 중요한 제한이 있습니다 : 활발한 인신 매매 데이터가 달성되지 않았고 높은 수준의 배경 MTOC / 분비 과립 편광이 얻어졌는데, 아마도 IS 설립18의스토커특성 때문일 것입니다. 더욱이, TCR 자극, 초기 신호 이벤트(즉, 세포내 칼슘 상승, 액틴 재구성) 및 분비 소포 편성 사이의 상관관계는 조사하는 데 문제가 있다. 따라서, 살아있는 세포에서 IS의 적절한 이미징을 위한 필수 조항은 세포 간 접합체 물질화를 향상시키고, IS의 생성을 동기화하고, 가능한 경우 정의된 현미경 XY 필드 및 Z 위치에서 세포 접합체의 확립을 보장하기 위해 결합한다. 이러한 모든 문제를 피하기 위해 몇 가지 전략이 개발되었습니다. 이러한 방법, 장점 및 약점을 설명하는 것은 이 백서의 범위를 벗어납니다. 이러한 중요한 점1,4,5,21을다루는 이전에 게시 된 리뷰를 참조하십시오.
Th 림프구에 의해 만들어진 사실은 수명이 길고, Th 림프구에서 MTOC, 림프공 함유 분비 과립 및 MVB가 IS22로 이동하고 도킹하는 데 몇 분에서 몇 분까지 걸리는 상황은 Th-APC가 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 이미징에 이상적인 후보입니다.
Protocol
1. 라지 세포를 부착하는 슬라이드 준비
- 150 μL의 피브로넥틴(100 μg/mL)을 8 마이크로웰 챔버 슬라이드(플라스틱 바닥 챔버 슬라이드)에 넣고 37°C에서 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 이러한 접착 기질은 라지 세포의 결합을 웰 하부(Step 2)로 허용하고, Jurkat 세포(4단계)를 가진 살아있는 접합체의 형성, 및 시간 경과 현미경 캡처(단계 6)를 허용하며, 또한 선택적 파라포름알데히드(PFA) 고정(Step 7)과도 호환된다.
참고: 아세톤 고정의 경우, 아세톤이 플라스틱을 용해하기 때문에 섬유넥틴 대신 유리 바닥 챔버 슬라이드와 폴리 L-리신(20 μg/mL)을 사용하십시오. 8 마이크로웰 챔버 슬라이드(1cm2 웰, 300 μL 최대 부피) 또는 이에 상응하는 것은 유연하고 적절한 형식이다. - 200 μL 자동 파이펫을 사용하여 피브로넥틴을 흡인하고 부드러운 흔들림으로 2분 동안 200 μL의 PBS로 각각 잘 세척한다. 이 세척을 한 번 더 반복하십시오. 챔버 슬라이드는 4°C에서 1-2주 동안 PBS와 함께 이 단계에서 보관될 수 있다.
2. 챔버 슬라이드에 라지 세포의 접착 및 7-아미노-4-클로로메틸코마린 (CMAC) 라벨링
- 라지 세포의 사전 배양물인 10 mL의 컨플렉스(1-2 x 106 세포/mL)를 15 mL, V-bottom 튜브로 옮김을 전달한다. 잘 혼합하고 10 μL을 사용하여 Neubauer 챔버 또는 이에 상응하는 세포를 계산합니다.
- 실온에서 5 분 동안 300 x g에서 나머지 세포를 원심 분리합니다. 상급자 인해 및 폐기.
- 따뜻한 완전한 배양 배지(RPMI 1640+10% FCS, 2 mM 글루타민, 10 mM HEPES, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토미신)에서 10 6세포/mL의 농도로 세포 펠릿을 부드럽게 다시 중단시키십시오. 아래 방정식을 사용하십시오.
[]초기 x V초기 = [최종 x V최종),여기서 [초기 는 초기 세포 농도를 나타내고, V초기 = 세포 현탁액의 초기 부피, []최종 = 최종 셀 농도, V최종 = 세포 현탁액의 최종 부피.
참고: 시작 배양의 세포 농도에 따라, 필요 이상으로 더 많은 세포를 수집할 수 있지만 잠재적인 문제를 방지하기 위해 실험이 끝날 때까지 배양(37°C)에서 남은 세포를 유지하는 것이 중요하다(단계 2.6 참조). - 라지 세포를 라벨로 시냅스 컨쥬게이트 형성 동안 이들의 식별을 허용한다. 본 실험에서, 7-아미노-4-클로로메틸쿠마린(CMAC) 라벨링은 단계 2.4.2에서 수행된다.
- 배양 배지에서 필요한 수의 라지 세포를 2 mL 튜브로 이송한다. 8 마이크로웰 챔버 슬라이드의 경우, 총 1.6 mL의 셀 서스펜션이 필요합니다(웰당 200 μL).
- CMAC가 빛에 민감하기 때문에 최종 농도10 μM에 CMAC를 추가하십시오. 200 μL 2 x 105 Raji 세포는 1 cm2 당 잘 필요하다. 따라서 8개의 웰을 준비해야 하는 경우 1.6 x 106 Raji 셀이 필요합니다.
참고: 세포 추적기 파란색으로 라지 세포에 라벨을 붙이면 시냅스 접합체가 형성될 때 Th 세포와 구별됩니다. 이 염료는 PFA 및 아세톤 고정제와 호환되며 추가 면역 형광 절차를 허용합니다. 가벼운 박람회를 피하십시오. CMAC를 가진 풀에서 라지 세포의 표지는 섬유넥틴 코팅된 챔버 슬라이드에 라지 세포의 부착 전에 재서스펜션이어서 다른 웰 들 사이에서 CMAC를 가진 라지 세포의 균일한 라벨링을 보장한다.
- CMAC 염색 된 세포를 재중단하고, 단계 1.2.에서 챔버 슬라이드에서 PBS의 포부 후, 단계 1.1-1.2에서 제조 된 섬유넥틴 코팅 챔버 슬라이드의 각각의 웰에 세포 현탁액의 200 μL을 전송한다. 챔버 슬라이드를 37°C, 5%CO2에서 30 분-1 시간 동안 배양합니다.
참고: 이 단계에서 접착력과 CMAC 라벨링이 동시에 발생하며 시간이 절약됩니다. 라지 세포는 신속하게 침전을 할 것이고, 파종 하기 전에 세포 현탁액에서 균일 한 농도를 유지 하기 위해 주의 해야 합니다. CMAC 세척이 2.7 단계에서 더 쉽게 수행되기 때문에 원심 분리에 의해이 단계에서 CMAC를 씻을 필요가 없습니다 (표지 된 라지 세포가 이미 챔버 슬라이드에 부착된 경우). CMAC는 과도한 세포 현탁액에 존재하기 때문에, 청색 형광 배경이 너무 높아서 청색 염색 된 세포를 구별할 수 없습니다. CMAC 세척 후 2.7단계에서 세포 CMAC 형광을 확인합니다. - 라지 세포가 현미경에 챔버 슬라이드의 부드러운 흔들림에 의해 우물의 바닥에 부착되어 있는지 확인합니다. 셀이 서로 사이의 간격을 표시하고 서로 결합되지 않았는지 확인합니다(그림1,가운데 패널). 세포 합류의 50-60%가 적절하다.
- 대부분의 세포가 챔버 슬라이드에 효율적으로 부착되고 세포 간격이 관찰되지 않으면 따뜻한 완전한 배지로 각 세포를 잘 씻고 200 μL 자동 파이프로 배지를 재중단하여 셀 과잉을 분리하십시오. 각 재서스펜션 단계 후에 합류를 확인합니다.
- 세포가 부착되지 않으면 접착 단계를 다시 반복하고 접착 시간 및 /또는 셀 수를 늘립니다.
참고: 여기서 멈추고 챔버 슬라이드를 37°C, 5%CO2 하룻밤(O/N)에서 배양하고 다음날 프로토콜을 계속 할 수 있습니다. 라지 세포가 형광 현미경 검사법을 사용하여 부착 및 CMAC 표지 남아 있는지 다음 날 확인하시기 바랍니다.
- 여분의 CMAC를 제거하고 형광 현미경으로 청색 방출을 확인하기 위해 따뜻한 보충 RPMI로 다시 조심스럽게 다시 잘 씻어(그림 1).
참고: 침지 오일(끈적거리고 점성) 및 높은 수치 조리개 오일 목표의 사용을 피하기 위해, 초장거리(즉, 20x 또는 40x) 목표를 사용하여 형광 현미경을 사용하여 CMAC 라벨링을 신속하게 확인할 수 있습니다.
3. CMAC의 펄스 — 황색포도상구균 장독소 E를 가진 표지된 라지 세포
- 황색포도상구균 장독소 E (참조, 1 μg / mL)를 각 우물에 추가하십시오. SEE는 SEE 냉동 스톡(PBS에서 1 mg/mL)으로부터 세포 배양 배지(100 μg/mL의 작업 용액)에서 편리하게 희석될 수 있습니다. 200 μL 마이크로웰당 100x 작동 용액의 2 μL을 사용하십시오.
주의 사항: 이 단계에 장갑을 사용하고 사용된 팁을 생물학적 위험 상자에 폐기하십시오. - 챔버 슬라이드를 37°C, 5%CO2에서 30분 이상 배양한다. SEE 효과는 적어도 3-4시간 동안 지속됩니다.
참고: SEE는 별개의 타임랩스 설정이 계획된 경우(5단계) 및/또는 종점 실험의 시작 시점(6단계)에 따라 필요한 경우 상이한 시점의 웰에 추가할 수 있다.
4. 주캇 세포의 준비
- 이 실험을 위해 이전에 성장한 Jurkat 세포(1-2 x 106 세포/mL)를 사용하십시오. 앞서 설명한바와같이 표준 배양 플라스크 또는 표준 전기화 프로토콜에 따른 이전 형질감염으로부터 세포를 사용한다. Jurkat 세포의 형질감염은 살아있는 세포에서 분비 과립의 트래픽의 시간 경과 시각화를 허용할 것입니다. 예를 들어, GFP-CD63(MVB의 마커)이 표현되면 GFP-CD63-장식된 소포의 움직임을 기록할 수있다(비디오 1).
- 상 대비 현미경의 밑에 세포를 관찰하십시오. 죽은 세포의 과잉 (>20-30%) 관찰, 표준 프로토콜(24)을사용하여 Ficoll 밀도 구배 원심 분리를 수행, 죽은 세포의 과잉을 제거하기 위해 (죽은 세포는 살아있는 세포보다 높은 밀도를 나타낸다) 사용하기 전에 (토론 참조).
- 세포를 15 mL 튜브, V-bottom 튜브로 옮기고 혈세포계를 사용하여 계수하기 위해 10 μL을 사용합니다.
- 2.2단계에서 기재된 바와 같이 나머지 세포를 원심분리기. 상급체를 버리고 신선하고 따뜻한 배양 배지를 사용하여 라지 세포 (1 x 106/mL)와 동일한 농도로 세포를 다시 중단하십시오. 2.2-2.3 단계를 따릅니다.
- 4단계를 기다리는 동안 배양체(37°C, 5%CO2)에서Jurkat 세포를 유지한다.
참고: 두 번째 옵션 (형질 감염)에서, 살아있는 세포의 수는 첫 번째 보다 훨씬 낮을 것입니다. 따라서, 실험을 위한 충분한 세포를 갖기 위하여 더 높은 시작 세포 배양 량을 사용하는 것을 고려한다. 10 x 106 Jurkat 세포에서 전기 개화 큐벳 및 형질 감염 당, 만 2-4 x 106 Jurkat 세포는 48 시간 의 형질 전환 후 생존하고 이러한 세포 중 일부는 Ficoll 단계 동안 손실됩니다. 따라서, 하나의 전기 천공 큐벳은 일반적으로 8 마이크로 웰 (1.6 x 106 형질 감염된 Jurkat 세포)에서 부착 된 SEE 펄스 라지 세포에 도전하기에 충분하다.
5. 라지와 주캇 세포의 공동 파종
- 3.2단계에서 인큐베이터로부터 CMAC 표지된, SEE-펄스, 부착된 라지 세포를 함유하는 챔버 슬라이드를 취한다. 이전에 2.7 단계에서 수행되었기 때문에 이 단계에서 CMAC를 세척할 필요가 없습니다.
- 각 웰의 배양 배지를 하나씩 하나씩 흡인하여, 자동 200 μL 파이펫을 사용하여 웰의 한 구석에서 흡인한다. 잘 된 매체를 완전히 건조시키지 마십시오.
- 4.5단계에서 제조된 세포 배양 배지(1 x 10 6/mL)에서 재중단된 Jurkat 세포의 200 μL로 배지를 즉시 교체한다. 시간 경과 화상 진찰이 수행되는 경우에, Jurkat 세포가 퇴적하고 시냅스 접합체를 아주 빨리 형성하는 경향이 있기 때문에, 이 단계 직후6단계로 이동하십시오. 편의를 위해, 이 단계에서 Jurkat 세포로 시드를 받지 않는 SEE-펄스, 부착된 라지 세포를 함유하는 마이크로웰은 Jurkat 세포에 대한 후속 도전까지 세포 배양 배지로 유지되어야 한다. 이를 통해 Jurkat 세포에 대한 후속 도전을 유연하게 허용하여 추가 시간 경과 또는 역역학, 종점 실험 접근법을 사용할 수 있습니다.
- 시간 경과가 수행될 경우 신속하게 6단계로 진행합니다. 이는 시냅스 컨쥬게이트 형성 및 동시 이미지 획득을 허용하도록 37°C, 5%CO2에서 현미경 단계 인큐베이터 또는 이에 상응하는 1-2 시간 동안의 공동 배양을 포함한다. 종점 분석이 없는 경우, 세포를 고정하기 전에 현미경(도 1)을이용하여 공동 배양 기간 후 의 회부 결합체 형성을 예견한다(단계 7).
6. 신흥 시냅스 접합관의 시간 경과 이미징
- 이미징 전에 현미경과 배양챔버를 준비합니다. 비디오 1에 표시된 예제의 경우 자세한 현미경 설정은 그림 2에표시됩니다.
참고: 시간 경과 실험이 계획되는 경우, 모든 현미경 설정 및 보체(주변 세포 배양 챔버 등)는 부착된 라지 세포를 가진 챔버 슬라이드에 Jurkat 현탁액을 첨가하기 전에 제조되어야 한다. 다음 단계는 상업적현미경(물자 표)에대해 설명된다. 그러나, 세포 배양 인큐베이터를 구비한 임의의 반전형광 현미경이 사용될 수 있다.- 편광 트래픽을 이미징할 때 60배 오일 침지, 높은 수치 조리개가 있는 현미경을 사용하십시오.
- 자동 초점 시스템이 켜져 있는지 확인하고 오프셋을 조정하여 하단 표면에 바인딩된 Raji 셀에 초점을 맞춥니다. 그림 1, 비디오 1 및 비디오 2를참조하십시오.
- 5.3단계에서 부착된 라지 세포를 함유하는 각 웰을 각각 유량첨가한 후, 예열된(1-2시간) 현미경 스테이지 인큐베이터(즉, OKOlab)에서 마이크로웰 챔버 슬라이드를 신속하게 찾아내고 현미경으로 일부 XY 위치를 선택하고, 그 분야는 현미경 초점으로 떨어지는 Jurkat 형질감염세포에 의해 만들어진 신흥 IS 대형을 기록할 가능성이 높습니다.
- 온도 안정화 단계가 안정적인 X, Y, Z 위치를 유지하는 것이 관찰되었기 때문에 예열된 현미경 단계 인큐베이터를 사용한다. 편리한 XY 필드에 대한 기준은 다음과 같습니다 : 잘 집중되고 비 결합 된 라지 세포 (즉, 세포 간 간격을 표시) 및 형질 감염 Jurkat 세포의 존재 (이것은 투과 및 UV 또는 GFP 채널을 결합하여 확인할 수 있습니다). Jurkat 세포는 챔버 슬라이드에 매우 빠르게 (몇 분) 침전하고, 신흥 시냅스를 이미지 할 수있는 기회는 시간이 지남에 따라 감소할 것이다(그림 1). 정의된 시간 경과 후 실험을 완료하거나 7단계로 진행하여 후속 면역형광 및 분석을 위해 접합체를 고칠 수 있다.
참고: 적절한 시간 해상도(프레임당 1-2분)로 동시, 다중 웰 타임랩스 수집을 위해 최대 4개의 서로 다른 마이크로웰에서 최대 16개의 서로 다른 현미경 필드를 선택할 수 있습니다. 제한은 이미지화될 다양한 형광화의 수와 강도(카메라 박람회에 영향을 미치는)에 의존합니다(CMAC를 제외한 발현형 단백질의 수에 따라 다름). 프레임 속도를 높이는 한 가지 방법은 GFP에 대한 각 "n" 시간 프레임 중 하나만으로 CMAC 채널에 대해 기록하는 것입니다(즉, n=8, 도 2에도시된 바와 같이), 라지 셀이 잘 바닥에 부착되고 Jurkat 세포로서 쉽게 이동하지 않기 때문에. 또한, 이것은 빈번한 UV 광 노출이 세포를 손상시킬 수 있기 때문에, 세포 생존을 유익합니다. MVB의 편광을 완료하는 데 몇 분에서 몇 분 정도 걸리기 때문에 시간 프레임 속도를 1분 이하(즉, 비디오 1, 도 2의프레임당 20초)로 조정해 보십시오. 전동 에피 형광 포탑과 적절한 밴드 패스 형광 필터 또는 등가물을 갖춘 현미경은 이 다중 채널 캡처를 수행하는 데 필요합니다.
7. 시냅틱 접합선 및 고정의 종점 형성
- 엔드포인트 실험만 이 계획된 경우(시냅스 접합체 형성이 적절하다는 것을 허용하기 위해 1-2시간 배양), 챔버 슬라이드를 37°C에서 배양하고, 1-2h에 대해 5%CO2를 배양하고, 배양 기간 후 컨쥬게이트 형성을 확인(도 1에서와같이) 이어서, 아세톤 또는 PFA로 접합체를 고정(후속 면역에 사용되는 항원 및 항출체에 의존한다). 이 경우 인큐베이션은 현미경 단계 인큐베이터를 필요로 하지 않는다. 예를 들어 비디오 3을 참조하십시오.
- 세포를 고치려면 FCS없이 따뜻한 RPMI (37 °C) 배지로 부드럽게 흔들어서 잘 씻어 내보소소(세럼의 알부민는 아세톤 고정물로 침전될 수 있음). 흡입하고 각각의 우물에 PFA 또는 미리 냉각 된 아세톤의 200 μL을 추가합니다. 챔버 슬라이드를 실온(RT) 또는 얼음위에 각각 20분 동안 배양합니다.
참고: 아세톤 고정을 위해 아세톤을 -20°C에서 미리 식히고 챔버 슬라이드를 4°C에서 미리 식힙니다. 아세톤이 8 개의 유리 바닥 챔버 슬라이드에서 배양 된 세포를 고정하는 데 사용되는 경우 플라스틱 뚜껑을 제거하십시오. - PBS로 각 우물을 두 번 세척하고 담금질 용액 (PBS, 50 mM NH4Cl)의 200 μL을 추가합니다. 챔버 슬라이드를 4 °C에서 배양합니다.
참고: 이 단계에서 챔버 슬라이드는8에기재된 바와 같이 면역형광 프로토콜을 수행하기 전에 4°C에서 적어도 1개월 동안 머물 수 있다. 뚜껑은 증발을 방지합니다.
8. 이미지 처리
- 시간 경과 시리즈 및 / 또는 고정 된 세포의 스틸 사진의 수집 후 이미지 디톤 볼루션 (즉, Huygens deconvolution 또는 동등한, 재료의 표)를수행합니다. 적절한 소프트웨어(즉, Huygens의 "와이드 필드" 광학 옵션 사용)와 올바른 광학 파라미터를 사용하여 Deconvolute를 사용합니다. 현미경4의 측정점 확산 함수(PSF)의 이미지 처리를 위해 데선볼루션이 필요합니다.
- 또는, 현미경 파일에서 메타 데이터 중 포함 된 광학 매개 변수의 자동 로드에 의해 이상화 된 PSF를 계산하는 소프트웨어를 사용합니다. 이러한 광학 파라미터는 불소파장, 굴절률, 목표의 수치 개구부 및 이미징 기술(공초점, 광시야 등)을 포함한다. 4.
- 그 후, 이미징 소프트웨어는 PSF 및 다양한 데코볼루션 알고리즘(즉, Huygens 소프트웨어의 QMLE 및 CMLE)을 단계별 축적, 계산 프로세스에서 사용하며, 그 결과 사용자는 필요할 때 지속적으로 시각화및 중지(또는 재개)할 수 있다. 이 단계에서 사용자는 회선 및 / 또는 신호 대 잡음 비를 변경하고 deconvolution을 다시 시작할 수 있습니다. deconvolution 소프트웨어는 타임랩스 시리즈 (X, Y, T)(비디오 2)및 Z 스택 (X, Y, Z)(비디오 3)와잘 작동합니다. 세포질, 확산 형광화는4,9에의해 개선되지 않기 때문에, 디콘볼루트 채널은 이후 CMAC, 원시 채널에 병합되었다.
Representative Results
우리는 Jurkat-Raji 면역 시냅스 접합체를 생성하고 IS 형성의 초기 단계를 적절하게 이미지화하기 위해 설명된 프로토콜을 따랐습니다. 우리의 목표는 MTOC의 양극화와 IS를 향한 분비 기계를 연구하기 위해 이전에 따라20 초기 접근 방식을 개선하는 것이었습니다. 이 접근은 IS 대형 또는 초기 시냅스 사건의 화상 진찰을 허용하지 않는 종점 전략에 근거를 두었다, 이 전략에서 IS 대형 의무는 혼합의 펠릿에서 발생했기 때문에, 원심 분리된 세포, 그러나 현미경에. 우리의 프로토콜은 적절한 세포 농도의 사용에 기초한 접근법(단계 2 및 3)을 사용하여, 자체 현미경 챔버 슬라이드(8 마이크로 웰 챔버 슬라이드)에 세포 대 세포 IS 접합체의 형성을 선호하기 때문에, 예열된 현미경 단계 인큐베이터(4단계)에 장착된 이 주요 주의사항을 피하기 위해 고안되었다. 이 전략은 IS 형성을 유도, 동시에 타임 랩스 이미징 캡처(비디오 1).
도 1은 프로토콜(단계 5.2)에 따라 수득된 시냅스 주카트-라지 접합체를 나타낸다. 이미지는 대표적인 타임랩스 실험의 첫 번째 프레임을 나타냅니다. 2 x 105 라지 세포 및 2 x 105 Jurkat 세포를 1 cm2웰에 첨가하였다. 상부 패널은 투과 채널을 표시하고, 중간 패널은 CMAC(파란색) 채널(Raji 셀)으로 구성되며, 하부 패널은 투과와 CMAC 병합 채널을 모두 표시합니다. 노란색 화살표는 일부 시냅스 접합체를 참조로 표시하는 반면 녹색 화살표는 Jurkat 세포 1개 및 여러 라지 세포(복합 접합체)에 의해 만들어진 시냅스 접합체를 나타냅니다. 감소 하는 세포 농도 (105 또는 1 cm2 잘에서 세포) 복잡 한 세포 접액게이트의 형성을 우회 할 것 이다, 하지만 편광 트래픽의 후속 분석을 위한 충분 한 세포 접합체되지 않을 수 있습니다 (아래 참조), 그 차례로 또한 발견 하 고 신흥 시 냅 스 접합체를 이미지 하는 기회 감소.
도 2는 비디오 1에대응하는 대표적인 타임랩스 실험에서 적절한 소프트웨어(즉, 니콘 NIS_AR)를 이용하여 두 개의 상이한 불소화(CMAC 및 GFP-CD63)의 동시 포획에 사용되는 이미징 파라미터에 대응하는 스크린샷을 나타낸다.
비디오 1 (면역학 시냅스, 원시)은 GFP-CD63 (다기관-MVB, 녹색 소포의 마커)을 표현하는 Jurkat T 림프구를 나타내고 1 Jurkat 세포와 2 라지 세포 사이의 이중 시냅스의 형성을 파란색으로 표시합니다(그 중 하나는 침몰을 겪습니다). Jurkat 셀 내부에서 시냅스 영역을 향해 MVB의 동시 이동이 기록되었습니다(GFP-CD63의 경우 캡처 프레임 속도 = 20초마다 1프레임, 비디오 재생 속도 = s당 2프레임). 시냅스 접합체는 상술한 프로토콜(Step 6.2)에 따라 수득및 이미지화되었으며, 이는 새로운 시냅스의 이미징을 허용하였다(비디오1). GFP-CD63 및 CMAC 형광 채널의 동시 캡처는 적절한 소프트웨어(즉, NIS-AR, 재료 표)를사용하여 수행하였다. 비디오는 대표적인 타임랩스 실험의 원시 데이터를 나타냅니다. 자동 초점 시스템은 실험을 통해 안정적인 초점을 보장하기 위해 유리 바닥에 결합된 Raji 셀에 대하여 적절한 오프셋으로 정의되었다.
비디오 2(면역 시냅스, 디콘볼루션 후)는 비디오 1에해당하지만, GFP-CD63 형광 채널 이미지의 감소는 적절한 데콘볼루션 소프트웨어(즉, Huygens)를 사용하여 수행되었고, "넓은 필드" 광학 옵션 및 적절한 광학 파라미터(8단계)를 사용하였다. 이 디콘볼루트 채널은 이후에 CMAC, 원시 채널에 병합되었습니다. 신호 대 잡음 비율과 이미지의 선명도가 모두 개선된 것이 분명합니다. 상기 디톤볼루션은 전술한 바와 같이 사후 획득을 수행했다. 데선볼루션 소프트웨어에 대한 자세한 내용은4.
비디오 3(면역시냅스, 고정 및 면역형광 염색 후)은 프로토콜(acetone fixation)의 6단계 후 고정IS 컨쥬게이트의 Z-스택(z-스텝 크기 = 0.8 μm, 5 프레임)을 나타낸다. 고정 후, 면역형광은 F-액틴(green), 안티-CD63을 가시화하여 MVB(마젠타), 안티γ-튜불린을 가시화하여 MTOC(적색)를 시각화함으로써 표준프로토콜(25)을 수행하였다. CMAC(파란색)는 라지 셀에 레이블을 지정합니다. 이어서 컨쥬게이트는 "와이드 필드" 광학 옵션 및 적절한 광학 파라미터(단계 7)를 사용하여 에피플루노시스 및 여러 채널을 디콘볼루트화하여 이미지화하였다. 데콘볼루트 채널은 상이한 패널(CMAC 플러스 투과-TRANS, CMAC 플러스 파로딘, CMAC 플러스 안티 CD63 및 CMAC 플러스 안티-γ-tubulin)에 각각 지시된 바와 같이 CMAC, 원시 채널에 각각 병합되었다. 흰색 화살표는 시냅스레이블을 지정하는 반면 녹색 화살표는 MVB에 레이블을 지정하고 노란색 화살표는 MTOC레이블을 지정합니다. MVB 및 MTOC 편광의 상세한 정량화는다른 곳에서 설명되었다 25.
여기에서 제시된 접근은 세포 대 세포 접합체의 대형을 관련시키고, 동시에, 광시야 형광 현미경 검사법 (WFFM)에 의하여 시간 경과 취득및 화상 처리 (사후 취득 deconvolution)에 선행합니다. 이러한 전술은 이미지의 신호 대 잡음 비(SNR)를 개선하고, 시간적 분해능을 향상시키고, 신흥 시냅스 접합체4에서여러 형광화의 동기화된 획득을 허용했다. 또한, 프로토콜은 후속 종점 세포 고정 방법(파라포름알데히드, 아세톤 또는 메탄올)과 잘 일치하며, 이는 추가적인 면역형광 염색 및 분석25(비디오 3)를허용할 것이다. 이 프로토콜은 또한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법 및 기타 최첨단 현미경 기술과도 호환됩니다.
그림 1: 시냅스 접합체의 대표적인 이중 크기 현미경 검사법 분야. 이미지는 프로토콜 에 이어 대표적인 타임랩스 실험으로부터의 첫 번째 프레임을 나타낸다. 상부 패널은 투과 채널, 중간 패널 CMAC 채널(Raji 셀) 및 하부 패널 모두 병합된 채널을 나타낸다. 노란색 화살표는 참조로 일부 시냅스 접합문에 레이블을 지정합니다. 녹색 화살표는 복잡한 시냅스 접합체를 나타냅니다 (즉, 하나 이상의 라지 세포와 시냅스를 확립 한 Jurkat 세포). 40x EWD(0.6 NA) 목표로 캡처. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시간 경과 현미경 설정. 상기 영상은 비디오 1에대응하는 대표적인 타임랩스 실험에서 적절한 소프트웨어(즉, 니콘 NIS_AR)를 사용하여 두 개의 상이한 형광화(CMAC 및 GFP-CD63)의 동시 포획에 사용되는 이미징 파라미터에 대응하는 여러 스크린샷에 해당한다. GFP-CD63 채널의 각 프레임은 20s마다 캡처되었습니다. 실험을 진행하면서 세포 생존가능성을 유지하기 위해 GFP 채널의 8개 프레임 중 UV 채널에 대한 하나의 프레임만 캡처되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: GFP-CD63을 발현하는 Jurkat 세포에 의해 만들어진 면역학적 시냅스, 원시 데이터. 세포 트래커 블루(CMAC, blue)로 표지된 라지 B 세포를 SEE로 30분 동안 펄스하고 GFP-CD638을 발현하는 Jurkat 세포와 시냅스를 형성하였다. GFP-CD63 및 CMAC 채널에 대응하는 시간 경과가 캡처(프레임당 20s, 비디오 재생 속도 = s당 2프레임)와 대표적인 예가 도시된다. 60x 계획 APO(1.4 NA) 목표로 캡처되었습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
비디오 2: GFP-CD63을 발현하는 Jurkat 세포에 의해 만들어진 면역학적 시냅스, 데선볼루션 후. 비디오 1과동일하지만 이미지는 데선 볼루션 소프트웨어를 사용하여 디톤 볼루션되었습니다. 초점 형광에서 오염 물질을 제거하기 때문에 향상된 신호 대 잡음 비와 향상된 선명도가 분명합니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
비디오 3: 고정 및 면역 염색 면역 시냅스. 이미지는 프로토콜 및 후속 면역형광의 7단계 후 대표적인 고정 시냅스 접합체를 나타낸다. CMAC(파랑) 라벨라지 라지 세포, 투과율(TRANS)은 각각 시냅스 컨쥬게이트(흰색 화살표), 파할로이드 라벨 F-액틴(녹색), 안티-CD63 라벨 MVB(마젠타, 녹색 화살표) 및 안티γ-튜불린 라벨 MTOC(적색, 노란색 화살표)를 각각 보여준다. 이러한 채널은 에피오레시즘에 의해 이미지화되었고, 지시된 대로 붕괴되고 병합되었습니다. 비디오는 Z-스택(z-스텝 크기 = 0.8 μm, 5 프레임)을 포함한다. 흰색 화살표는 시냅스 접촉 영역에 레이블을 지정하는 반면 녹색 화살표는 MVB에 레이블을 지정하고 노란색 화살표는 MTOC에 레이블을 지정합니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
Discussion
이 프로토콜의 한계는 모든 시냅스가 광축에 수직으로 이상적으로 배향되지 않는다는 것입니다. 이 기술을 사용하여, 면역 시냅스 화상 진찰을 위한 이상적인 방향을 예측하고/또는 영향을 미칠 수 있는 방법은 없습니다. 이 문제를 해결하기 위해 최종적으로 이상적인 기준을 충족하지 못하는 임의로 캡처된 모든 시냅스를 후속 분석에서 제외합니다. 이 시냅스는, 기회적으로 충분히, 아주 빈번하지 않습니다. 그러나, 여러 실험 접근법을 사용하여 이러한 제한을 우회할 수 있다4.
편광된 CD63 방출(degranulation)은 앞서도시된바와 같이 살아있는 세포에서 CD63(CD63 세포 표면에 재국화)의 세포 표면 염색(CD63 재국화)과 같은 다른 상보적인 기술에 의해 정량화될 수 있다(고투및 투과되지 않음), 6단계 후, 후속 세척 및 고정. 또한, CD63 방출은 나노입자 추적분석9,25에 의한 엑소좀8,9 및 엑소좀 정량화를 수행할 수 있다. 이 접근은 살아있는 세포의 세포 표면 면역 형광 후에 수행되는 고정이 제공된 우리의 프로토콜과 확실히 호환됩니다.
우리는 세포의 이상적인 수를 발견했다 (에 대한 1 cm2 잘 8 웰 챔버 슬라이드) 이다 4 x 105 세포 (2 x 105 라지 세포 와 2 x 105 Jurkat 세포) 그들은 우물의 바닥에 효율적으로 부착하기 때문에. 플라스틱(fibronectin 사용) 또는 유리 바닥(폴리-L-리신 사용)에 대한 결합 효율은 일반적으로 문제가 되지 않는다. 높은 세포 수는 부착 된 세포 와, 이어서, 복잡한 시냅스 접합체 사이에 간격을 생성하지 않을 수 있습니다(그림 1); 두 상황 모두 단일 세포 대 세포 접합체가 예를 들어 MTOC 또는 분비 과립 편광 실험에서 이미지화되어야 할 때 바람직하지 않습니다. 세포의 더 적은 수는 접합을 찾아내는 기회를 감소시킬 수 있습니다, 특히 형질 감염된 Jurkat 세포는 시냅스를 생성하기 위하여 APC로 도전할 때. 우리는 프로토콜의 발병 전에 현미경 X / Y 단계에 장소에 온도 안정화 단계 인큐베이터를 관찰 한 것을 유의하시기 바랍니다 (즉, 단계 / 현미경 설정을 안정화하기 위해 사전에 1-2 시간) 안정적인 X를 유지, Y, Z 매개 변수는 적절한 이미징에 중요하다. 자동 초점 시스템은 결국 작은 Z 변형을 보상합니다.
전기 천공과 같은 특정 유전자 형질 전환 기술이 Jurkat 클론에서 형광 키메라 단백질 (즉, GFP-CD63)을 발현하는 데 사용되는 경우(비디오 1),세포의 상당한 분율이 전기 천공 후 사망 할 수 있습니다. 이것은 죽은 세포가 시냅스를 형성하지 않더라도, 살아있는, 형질감염된 세포를 초과할 때, 살아있는 Th 세포에 의해 만들어진 접합체의 대형을 방해할 수 있기 때문에 문제가 될 수 있습니다. 우리는 컨쥬게이트 형성 단계 의 앞에 표준 프로토콜을 따르는 밀도 구배 매체를 사용하여 형질전환 배양물에서 죽은 세포의 주의깊은 제거가 실제로 제대로 상세하게 접합체에 기회를 증가시킬 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 또한, 낮은 형질 감염 효율 (&20%) 이 때문에 중요 한 주의 될 수 있습니다., 적당 한 접합체 형성 효율과 결합 (약 60%)25,형질 감염 된 세포에 의해 만들어진 접합체를 찾을 확률을 감소 시킬 것 이다. 이것은 비 형질 감염 된 세포가 종점 실험 및 후속 고정에서 접합을 얻기 위해 사용되는 경우 문제가되지 않습니다. 8 마이크로웰 챔버 슬라이드는 기존의 면역형광 프로토콜과 호환됩니다. 이렇게 하면 다른 용도로 위의 프로토콜의 유연성이 향상됩니다. 아세톤고정은 플라스틱 바닥 웰이 있는 챔버 슬라이드를 사용할 때 고려해야 할 문제가 될 수 있습니다. 그러나 아세톤 고정과 호환되는 유리 바닥을 포함하는 8 개의 마이크로 웰 현미경 챔버 슬라이드가 시판되고 있습니다. 아세톤이 8 마이크로웰 유리 바닥 챔버 슬라이드에서 배양 된 세포를 고정하는 데 사용되는 경우 플라스틱 뚜껑을 제거하십시오.
현미경에는 전동 XY 단계, 전동 에피 형광 포탑 및 자동 초점 시스템 (예 : 완벽한 초점 시스템) 또는 이에 상응하는 보충제가 장착되어 있는 것이 좋습니다. 멀티 웰 획득이 필요한경우 25,자동 초점 시스템은 모든 실험을 통해 안정적인 초점을 보장합니다. 이전의 경험은 라지 세포에 적절한 초점 오프셋을 확립함으로써, T 세포의움직임(비디오 1)과XY 다중 점 실험에서 현미경 단계/챔버 슬라이드 움직임 모두를 보상할 수 있음을 나타낸다. 이것은 멀티웰 타임랩스 캡처에 매우 편리합니다.
흑백, 팬크로매틱 및 냉각 충전 된 결합 장치 (CDD) 카메라가 사용되었지만 고감도, 형광 과학 보완 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 카메라가 바람직합니다.이 카메라는 카메라 노출 시간을 줄이고 시간 해상도를 향상시킵니다. 우리가 사용한 짧은 카메라 노출 시간(순위 양식 100ms ~ 500ms)과 자동 형광 셔터가 결합되어 세포 생존가능성이 현저한 형광 표백 및/또는 손실 없이 적절한 시간 해상도(분당 1프레임 이하, 최대 16XY 위치)로 장시간 경과 캡처(최대 24시간)를 가능합니다. 동력 단계는 멀티 포인트 (XY) 캡처를 허용하고 이상적인 방향으로 신흥 및 개발 시냅스를 발견하고 이미지 화 할 수있는 기회를 증가하지만, 또한 다른 Jurkat 클론이 동시에25를컨쥬게이션 해야 할 때 멀티 웰 챔버 슬라이드에서 이미지 수집을 허용한다. 비과립과립의 트래픽을 분석할 때 최상의 결과를 얻기 위해서는 목표의 높은 수치 개구부(즉, 60x, 1.4)가 필요하다.
RAJI-SEE-Jurkat은 원래11을기술한 이래로 무수한 연구자들이 사용해 온 잘 확립된 면역학적 시냅스 모델을 구성합니다. 우리는 IS 형성의 초기 단계를 적절하게 이미지화하기 위해 이 모델에 프로토콜을 적용했습니다. 우리의 목표는 MTOC의 양극화와 IS를 향한 분비 기계를 연구하기 위해 이전에 따라20 초기 접근 방식을 개선하는 것이었습니다. 이 프로토콜로 이루어진 접합체가 시냅스에서 F-액틴 재구성을 생성하고, 표준 SMAC를 구성하고, MVB 편광트래픽(25)에수반되는 것은 주목할 만하다. 이러한 중요한 사건은 또한 공초점 현미경 검사법25에의해 분석되고 검증되었습니다.
편광 된 트래픽의 운동 차이는 IS의 다른 유형 사이에 존재한다. 예를 들면, CTL에서 lytic 과립의 편광한 수송은 Th 림프톨에서 몇몇 cytokine 를 포함하는 소포가 완료하기 위하여 분에서 몇 시간까지 걸리는 반면, 초 또는 아주 몇 분에서 일어난다. 이러한 시간적 유사성은 최적의 전략을 설계하고 가장 적합한 실험 및 이미징 접근법을 선택하기 위해 사전에 고려되어야 하며, 일부 이미징 계층(즉, 레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSCM))의 경우, 캡처 시간이 적절한 시간 해상도(1분 이하)보다 훨씬 높기 때문에 시간이 제한 요인이 될 수 있습니다(1분이하)4. 이는 상기 프로토콜에 기재된 바와 같이 광시야형 현미경 검사법(WFFM)이 사용될 때 제한이 없다. CTL에서, 시냅스를 향한 MTOC의 편광은 단지 몇 분 지속3,6,17,여기에 설명된 것과 다른 다양한 특정 한 수준의 미세 현미경 접근법 (그러나 더 높은 공간 및 시간적 해상도를 수용)은 이러한 시냅스를 적절하게 이미지화하기 위해 필요하다26,27,주로 여러 현미경 필드 (다중 점 캡처)가 이미지화될 때. 이러한 고해상도, 새로운 접근법은 또한 Th 림프구에 의해 만들어진 시냅스를 이미징하는 데 활용될 수 있지만, 경제적 및/또는 물류적 이유(즉, 이러한 이미징 기술 중 일부에 필요한 핵심 장비는 여기에 설명된 것보다 6-7배 더 많은 비용이 들음) 이러한 최첨단 이미징 방법에 대한 제한을 확실히 구성할 수 있다4. Th 림프구에 의해 만들어진 사실은 수명이 길고, Th 림프구에서 MTOC, 림프공 함유 분비 소포 및 MVB가 IS22로수송하고 도킹하는 데 몇 분에서 몇 분까지 걸리는 상황은이 프로토콜을 Th-APC IS를 이미징하기위한 이상적인 저렴한 접근 방식으로 만듭니다.
WFFM은 인수 후 이미지 디톤볼루션과 결합하여 흥미로운 접근 방식을 구성하며 경제적 이유뿐만 아니라 이 전략을 지원합니다. Z축의 본질적인 불량 해상도(기술의 가장 중요한 주의 사항)는 획득 후 이미지 디톤볼루션4(비디오 1과 비디오 2비교)를 사용하여 개선할 수 있습니다. Deconvolution은 XY 축에서 150-100 nm, Z 축4에서500 nm까지 신호 대 잡음 비 및 이미지 해상도 및 대비27을 최대 2배 까지 향상시킬 수 있는 계산 기반 의 이미지 처리 방식을 사용합니다.
고감도, 높은 판독 속도 및 넓은 다이나믹 레인지의 사용, 새로운 형광 sCMOS 카메라는 이미지의 품질을 향상시키고 형광 표백을 줄일 것입니다. 여기에 설명된 세포 대 세포 접합 프로토콜에 의해 제공되는 유연성은 살아있는 세포뿐만 아니라 고정 된 세포에서 뿐만 아니라 여러 가지 최첨단 현미경 기술과 설명된 세포 접근법의 조합을 허용하고 예상 결과를 허용합니다. 실제로 면역 시냅스의 우리의 지식을 향상시킬 것입니다.
우리는 다루기 쉬운, 잘 확립된 세포주를 사용하여 프로토콜을 구현하고 검증했지만, 잠재적접근법은 1차 T 세포및 다양한 유형의 항원 제시 세포(예: 대식세포의 수지상세포)가 사용될 때 보다 생리적 상호작용의 시각화를 허용할 수 있다5. 이러한 맥락에서, 이 프로토콜은 또한 APC로 사용되는 초항원(SEB)-펄스 마우스 EL-4 세포주,1차 마우스 T 림프체9에도전함으로써 확장 및 검증되었다. 실제로 1 차 적인 T 림프구, 특히 Ctl, SEE-Raji 및 Jurkat 모델로 본 사람들에 게 더 단명 하 고 동적 시 냅 스 접촉을 렌더링 (참조9에서보충 비디오 8 참조) 렌더링. 시냅스 접촉 모드의 가변성은 이 프로토콜을 사용하여 기록및 분석할 수 있는 2차원 체외 조직 상에서 수지상 세포 또는 B 세포와의 1차 T 세포 상호작용에 대해 가장 잘 알 수 있다. 또한, 초항원 외에도, 이 기술은 다른 유형의 시냅스를 이미지화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, TCR 트랜스제닉, 항원 특이적 T 세포 모델, 예를 들어 ov알부민 특이적 뮤린 OT1/OT2 시스템을 사용하거나 항원 특이적 T 세포 수용체를 가진 T 세포의 형질전환에 의해 사용될 수 있다. 이것은 즉각적인 미래에 대한 실험적 가능성의 무수한 열립니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그들의 관대 한 기여에 대한 실험실의 모든 과거와 현재의 구성원을 인정합니다. 이 작품은 스페인 장관 데 Economía y Competitividad (MINECO), 계획 Nacional 드 Investigación Científica (SAF2016-77561-R M.I.에, 부분적으로 FEDER-EC 자금으로 부여된)의 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 지원과 비디오를 제작하기 위해 제공 된 시설에 대한 학부 드 메디치나 (UAM) 및 디데타멘토 드 시청각을 인정합니다. 우리는 지속적으로 뛰어난 기술및 이론적 지원을 위해 니콘 -유럽을 인정합니다. 이 문서에 대한 무료 액세스는 니콘이 후원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera Nikon DS-QI1MC | Nikon | MQA11550 | Cooled Camera Head |
| CMAC | ThermoFisher Scientific | C2110 | Cell tracker blue |
| JURKAT cells | ATCC | ATCC TIB-152 | Effector T lymphocytes |
| μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom | IBIDI | Cat.No: 80826, 80827 | Cell culture and cell imaging supports |
| Microscope NIKON Eclipse Ti-E | Nikon | NIKON Eclipse Ti-E | Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option |
| Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | Cell culture atmosphere |
| Raji Cells | ATCC | ATCC CCL-86 | APC |
| RPMI medium GIBCO | ThermoFisher Scientific | 21875034 | Culture medium |
| Streptococcus Enterotoxin E (SEE) | Toxin Technology, Inc | EP404 | Bacterial Toxin |
| Software Huygens Essential | SVI | Huygens Essential | Image Deconvolution software |
| Software ImageJ | NIH | Image J | Image software |
| Software Nikon NIS-AR | Nikon | NIS-Elements AR | Image capture and analysis software |
References
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