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Chemistry

Nanopatrón de nanopatrón de nanopatrón de sustrato mediado por origami de ADN para aplicaciones de cizallamiento

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60313
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 1,4, 1,4
1Biohybrid Materials, Department of Bioproducts and Biosystems, Aalto University, 2University of Jyväskylä, Nanoscience Center, Department of Biological and Environmental Science, University of Jyväskylä, 3University of Jyväskylä, Nanoscience Center, Department of Physics, University of Jyväskylä, 4HYBER Center of Excellence, Department of Applied Physics, Aalto University

Summary

Aquí, describimos un protocolo para crear nanoestructuras inorgánicas discretas y precisas en sustratos utilizando formas de origami de ADN como plantillas guía. El método se demuestra mediante la creación de antenas plasmónicas en forma de pajarita de oro en un sustrato transparente (zafiro).

Abstract

La nanotecnología de ADN estructural proporciona una ruta viable para la construcción desde abajo hacia arriba utilizando el ADN como material de construcción. La técnica de nanofabricación de ADN más común se llama origami de ADN, y permite la síntesis de alto rendimiento de estructuras precisas y altamente versátiles con precisión a nivel de nanómetro. Aquí, se muestra cómo la información espacial del origami de ADN se puede transferir a nanoestructuras metálicas combinando el origami de ADN de abajo hacia arriba con los enfoques de litografía de arriba hacia abajo utilizados convencionalmente. Esto permite la fabricación de miles de millones de nanoestructuras diminutas en un paso sobre sustratos seleccionados. El método se demuestra utilizando origami de ADN bowtie para crear estructuras metálicas de antena en forma de pajar en sustratos de nitruro de silicio o zafiro. El método se basa en el crecimiento selectivo de una capa de óxido de silicio en la parte superior del sustrato de deposición de origami, lo que resulta en una máscara de patrón para seguir los pasos litográficos. Estas superficies equipadas con nanoestructuras se pueden utilizar como sensores moleculares (por ejemplo, espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS)) y en varias otras aplicaciones ópticas en el rango de longitud de onda visible debido a los pequeños tamaños de característica (sub-10 nm). La técnica puede extenderse a otros materiales a través de modificaciones metodológicas; por lo tanto, las superficies ópticamente activas resultantes pueden encontrar uso en el desarrollo de metamateriales y metasuperficies.

Introduction

La nanotecnología del ADN estructural ha evolucionado rápidamente durante la última década1,2, y el desarrollo más influyente en el campo ha sido sin duda la invención del origami de ADN3,4. La técnica de origami de ADN permite la fabricación de prácticamente cualquier nanoforma con características estructurales precisas3,4. Este potente método se puede utilizar en la disposición espacial (sub)nanómetro-precisa y el anclaje de otros nano-objetos, tales como nanotubos de carbono5, nanopartículas metálicas6,7,8, 9, enzimas/proteínas10,11,12,13 y materiales terapéuticos14,15,16,17 . Es importante destacar que estas estructuras no son meramente estáticas, sino que también se pueden programar para actuar de forma dinámica18,19. Las innumerables aplicaciones del origami de ADN van desde la administración de fármacos20,21,22 a la electrónica molecular / plasmónica5,23,24, 25 y desde la ciencia de los materiales26,27 a las técnicas de imagen y calibración novedosas28.

Además de las aplicaciones mencionadas anteriormente, la resolución espacial extrema de las formas de origami de ADN podría aprovecharse en nanopatrones y delicada litografía a nanoescala29,30. Este protocolo describe un método de litografía para crear nanoestructuras inorgánicas discretas y precisas en sustratos utilizando plantillas de origami de ADN. Estas plantillas se pueden producir eficientemente en varias formas y en grandes cantidades31,y depositarse sin esfuerzo en sustratos elegidos a grandes escalas32. Estas propiedades permiten una fabricación altamente paralela de miles de millones de nanoestructuras en un solo paso en comparación con la litografía de haz de electrones comúnmente utilizada, sino más bien lenta u otras técnicas de nanofabricación basadas en escaneo.

En este documento, el proceso de fabricación se demuestra mediante la creación de estructuras en forma de pajarita de oro en sustratos de nitruro de silicio y zafiro; en otras palabras, la información espacial del origami de ADN se transfiere a nanoestructuras totalmente metálicas. Como se explica aquí, la técnica no se limita a la estructura de origami de ADN de paja seleccionada, ya que el método permite el uso de prácticamente cualquier forma de origami de ADN. Además, con modificaciones metódicas, la técnica se puede extender a diferentes metales y sustratos allanando el camino hacia la fabricación de metasuperficies33.

Las superficies modeladas con la fabricación mediada por origami de ADN pueden servir como sensores versátiles; por ejemplo, se pueden utilizar en espectroscopia Raman (SERS) mejorada en superficie. Como resultado de las pequeñas dimensiones de las nanoformas individuales, las superficies creadas pueden encontrar usos en aplicaciones ópticas y plasmónicas en el rango de longitud de onda visible.

Protocol

1. Diseño de origami de ADN

NOTA: En este protocolo, se describe un proceso de nanopatrón utilizando una estructura de origami de ADN de paja de arco bidimensional (2D) (Figura 1)34. Para diseñar una nueva forma de origami de ADN, siga las pautas a continuación:

  1. Diseñar la forma deseada y las secuencias de hebras de grapas requeridas del origami de ADN utilizando caDNAno35. Para producir un origami plano de una sola capa, utilice la opción de celosía cuadrada de caDNAno y ajuste manualmente el espaciado cruzado omitiendo algunas bases en el diseño (consulte la figura 1 y el archivo caDNAno suplementario) para eliminar el giro estructural resultante de la celosía cuadrada embalaje36,37.
  2. Extender los extremos de cada hélice de ADN con hebras que contienen voladizos poli-T (8 nt); esto evitará la multimerización de los objetos a través de interacciones de apilamiento base de extremo contundente(Figura 1 y archivo caDNAno suplementario).
  3. Ejecute un análisis computacional del diseño. CanDo38,39 se puede utilizar para predecir la forma tridimensional (3D) y la rigidez estructural del origami de ADN. CanDo también es una herramienta útil para iterar el número de saltos base necesarios para la corrección de torsión y para ajustar el diseño en consecuencia.
  4. En caDNAno, elija la longitud de andamio preferida y genere las hebras de grapas necesarias para plegar la estructura. Para la estructura bowtie, se utilizan el andamio 7249 nt largo M13mp18 y 205 hebras de grapas únicas (ver el archivo cDNAno suplementario).
    NOTA: También hay otras herramientas computacionales disponibles para diseñar estructuras de origami de ADN40,41,42,43. Dependiendo de la herramienta/software elegido, otras herramientas de simulación también se pueden utilizar43,44.

2. Montaje de origami de ADN

  1. Hacer el stock de hilos de grapas mezclando cantidades iguales de todos los oligonucleótidos necesarios para la estructura de la pajarita (en total 205 grapas)34. Todos los oligonucleótidos deben tener la misma concentración inicial (p. ej., 100 m en agua libre de RNase).
  2. Preparar la mezcla de reacción plegable de origami de ADN en cantidades de 100 ml en un tubo de PCR de 0,2 ml mezclando 20 ml de hebra de andamios M13mp18 (tipo p7249, a 100 nM), 40 l de solución de grapas, donde cada hebra es de 500 nM (que produce un exceso de grapas de 10x hasta el andamio) y 40 l de tampón plegable de 2,5x (FOB). FOB contiene Tris - ácido acético - tampón de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) (TAE) complementado con MgCl2. Consulte la Tabla 1 para las concentraciones de componentes FOB.
  3. Recocido la mezcla de reacción en un termociclador de 90 oC a 27 oC. Utilice la rampa de plegado térmico que se presenta en la Tabla 2.

3. Purificación del origami de ADN

NOTA: La cantidad excesiva de hebras de grapas se puede eliminar de la solución de origami de ADN utilizando un método de purificación de poli(etilenglicol) no destructivo (PEG). El protocolo está adaptado de Stahl et al.45.

  1. Diluir 200 l de estructuras de origami de ADN ensambladas con 600 ml de 1x FOB (ver Tabla 1) para obtener un volumen inicial de 800 l.
  2. Mezclar la solución de origami de ADN diluido 1:1 con 800 l de tampón de precipitación PEG (15% PEG 8000 (p/v), 1x TAE, 505 mM NaCl) y mezclar bien pipeteando hacia adelante y hacia atrás.
  3. Centrifugar la mezcla durante 30 min a 14.000 x g y a temperatura ambiente.
  4. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
  5. Añadir 200 s de 1x FOB y mezclar suavemente mediante pipeteo. También se puede añadir una cantidad diferente de 1x FOB para obtener la concentración de origami de ADN deseada.
  6. Para redisolver las estructuras de origami de ADN (pequeño pellet transparente en la parte inferior del tubo), incubar las estructuras de origami de ADN purificado PEG durante la noche a temperatura ambiente.
  7. Estimar la concentración de origami de ADN después de la purificación de PEG midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm utilizando un espectrofotómetro UV/Vis. Utilice la ley Beer-Lambert y un coeficiente de extinción de 1,1 x 108 M-1 cm-1 para el cálculo6. La concentración típica de origami de ADN después de la purificación de PEG es de 15-20 nM.
  8. Almacene las estructuras de origami de ADN purificado PEG a 4 oC. Las estructuras de origami de ADN son generalmente estables durante meses por lo que grandes cantidades de stock se pueden preparar para su uso posterior.
    NOTA: La cantidad excesiva de hebras de grapas también se puede eliminar utilizando otras técnicas de purificación46,como la filtración de espín47,la centrifugación zonal de velocidad48 y la extracción de gel de agarosa49. Las estructuras de origami de ADN son estables en una variedad de soluciones tampón50,y si es necesario, el medio de almacenamiento se puede cambiar después de la purificación de PEG a través de la filtración de espín51.

4. Electroforesis de gel de agarosa

NOTA: La calidad del plegado y la eliminación del exceso de hebras de grapas se pueden verificar mediante electroforesis de gel de agarosa.

  1. Preparar un gel de agarosa del 2 % (p/v) añadiendo 1 g de agarosa y 45 ml de 1tAE a un matraz Erlenmeyer. Caliente la mezcla en un microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo y se produzca una solución transparente.
  2. Enfríe la solución bajo el agua corriente hasta que el matraz sea cómodo de tocar (50-60 oC).
  3. Añadir 5 ml de 110 mM MgCl2 y 40 l de solución de bromuro de etidio (0,58 mg mL-1) a la solución y agitar suavemente la mezcla.
    ADVERTENCIA: El bromuro de etidio es un carcinógeno potencial y debe manipularse con cuidado.
  4. Configure la bandeja de fundición de gel y vierta la agarosa líquida en la bandeja de fundición. Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente durante al menos 30 min.
  5. Retire el gel de la bandeja de fundición y colóquelo en una cámara de electroforesis de gel. Llene la cámara con tampón de funcionamiento (1tAE con 11 mM MgCl2).
  6. Añadir 1 l de 6 x tinte de carga de gel por cada 5 l de solución de muestra y mezclar bien. Cargue las muestras pipeteando cuidadosamente la cantidad deseada de las soluciones de muestra en bolsas de gel separadas.
  7. Ejecute el gel de agarosa a una tensión constante de 95 V durante 45 min. Mantenga la cámara de electroforesis de gel en un baño de hielo para que corra para evitar daños por calor en el gel.
  8. Visualice el gel bajo luz ultravioleta utilizando un sistema de imágenes de gel(Figura 2A).

5. Preparación del sustrato(Figura 3A)

NOTA: Todos los pasos siguientes se realizan dentro de una sala limpia, excepto el crecimiento de SiO2 (Paso 9). Los pasos de limpieza también se pueden sustituir por una limpieza estándar basada en la solución de pirañasi si este proceso no es suficiente para eliminar todos los residuos del sustrato.

  1. Corte las virutas de 7 mm x 7 mm de una oblea para ser utilizada como sustrato. Para SiN, utilice una sierra de silicio, una pluma de cortador de diamantes o un implemento similar. El zafiro de corte (Al2O3) requerirá una herramienta especializada o una hoja de sierra. El tamaño del chip no tiene que ser exacto.
  2. Limpieza de las fichas.
    1. Sumerja las virutas cortadas en un vaso con acetona caliente (acetona calentada a 52 oC) y manténgalas calentadas durante al menos 15 minutos.
    2. Mientras todavía están en el baño de acetona caliente, frote suavemente las virutas con un hisopo de algodón para eliminar mecánicamente cualquier película de residuos.
    3. Con pinzas, levante las virutas de la acetona caliente y use una botella de lavado para enjuagarlas con acetona a temperatura ambiente.
    4. Sumerja las virutas en un vaso con isopropanol y ultrasonicar durante 2 min.
    5. Levante las virutas del isopropanol con pinzas y séquelas inmediatamente y a fondo usando un flujo de nitrógeno. Sólo toque y sostenga los lados y bordes de las virutas, ya que las áreas cubiertas por las pinzas no se secarán correctamente, dejando potencialmente residuos y otra contaminación en las áreas de contacto. Para obtener los mejores resultados, utilice el flujo lo más alto posible y mantenga las superficies de la viruta paralelas a la dirección del flujo.
  3. Guarde las virutas en un recipiente cubierto dentro de la sala limpia para su uso posterior.

6. Deposición de vapor químico mejorada por plasma (PECVD) de la capa de silicio amorfo (a-Si)(Figura 3B)

  1. Coloque las virutas en el equipo PECVD.
  2. Configure los parámetros de deposición para que crezcan aproximadamente 50 nm de silicio amorfo (a-Si). Los ajustes exactos varían según el modelo del equipo y la calibración. Consulte la Tabla 3 para ver los parámetros utilizados aquí. Ejecute el programa de deposición a-Si para hacer crecer la capa.
  3. Después del procesamiento, guarde las virutas en un recipiente cubierto en condiciones estándar de sala limpia.

7. Tratamiento plasmático de oxígeno de la capa a-Si(Figura 3B)

NOTA: Este paso hará que la superficie del sustrato esté ligeramente cargada negativamente e hidrófila, de modo que las estructuras de origami de ADN se puedan absorber más tarde eficazmente a la superficie con la ayuda de iones de magnesio adicionales.

  1. Coloque las virutas en el equipo de grabado de iones reactivos (RIE).
  2. Configure los parámetros de grabado para generar plasma de oxígeno. Una vez más, los ajustes exactos varían según el modelo del equipo y la calibración. Consulte la Tabla 3 para ver los parámetros utilizados aquí. Ejecute el programa de tratamiento de plasma de oxígeno.
  3. Continúe con el siguiente paso inmediatamente, ya que los efectos del tratamiento se deteriorarán rápidamente. Típicamente, los sustratos deben utilizarse dentro de los próximos 30 minutos después del tratamiento plasmático.

8. Deposición de origami de ADN(Figura 3C)

  1. Preparar una mezcla de origami de ADN para su deposición mezclando 5 ml de solución de origami de ADN plegado/purificado (20 nM) con 4 ml de 1x FOB y 1 l de 1 M MgCl2. La solución resultante contiene origami de ADN de 10 nM y aproximadamente 100 mM de Mg2+.
  2. Depositar 10 l de la mezcla de origami de ADN en un chip tratado con plasma de oxígeno e incubar cubierto durante 5 minutos a temperatura ambiente. La cubierta evita el secado involuntario y ayuda a eliminar las estructuras extrañas de sal y origami de ADN más adelante.
  3. Después de la incubación, lave la superficie pipeteando por primera vez 100 l de agua destilada (por ejemplo, MilliQ) en la viruta. Enjuague el agua de un lado a otro unas cuantas veces con la pipeta, evitando tocar el centro del chip. Retire la mayor parte del agua de la superficie con la pipeta. Esto hace que solo el origami correctamente adsorbido permanezca en la superficie.
  4. Repita este ciclo de lavado (pasos 8.3) 3 a 4 veces.
  5. Después del lavado, seque la muestra inmediatamente con un flujo de nitrógeno. Haga esto de la misma manera que el secado en la preparación del sustrato (paso 5). Es importante secar la muestra lo más a fondo posible.
    NOTA: La densidad de las estructuras depositadas y, por lo tanto, la densidad de las nanoestructuras metálicas se pueden modificar ajustando la concentración de origami de ADN y Mg2+ en la solución de deposición. Mayor concentración de Mg2+ mejora la adhesión del origami de ADN y por lo tanto aumenta la densidad, pero finalmente también causará aglomeración de las estructuras de origami ADN. Por lo tanto, principalmente la concentración de origami de ADN debe ajustarse primero.

9. Crecimiento de la máscara SiO2 (Figura 3D)

NOTA: Este paso se puede realizar fuera de la sala limpia. La siguiente versión producirá un patrón de tono negativo, pero es posible modificar el proceso para producir un patrón de tono positivo en su lugar. El proceso de crecimiento de SiO2 está adaptado de Surwade et al.52,desarrollado aún más por los autores53,y finalmente optimizado para este protocolo.

  1. Tome un desecador sellado (1,5 L), una placa Petri que cabe dentro del desecador (opcional) y una placa perforada que puede funcionar como una plataforma dentro del desecador.
  2. Tomar 100 g de gel de sílice y mezclarlo con 30 g de agua destilada en el plato Petri o directamente en el desecador. Realice este paso preferiblemente con al menos 24 h de antelación para permitir que el gel de sílice se estabilice.
    NOTA: Esto se utiliza para controlar la humedad dentro del desecador y, por lo tanto, también la tasa de crecimiento y la morfología de la película SiO2. Una mayor humedad da como resultado una mayor tasa y una estructura más gruesa. Alternativamente, el gel de sílice se puede curar en una cámara de prueba climática.
  3. Coloque el gel de sílice en el desecador y sepárelo con la placa perforada.
  4. Coloque los chips con origami de ADN adsorbido, así como un vial abierto de (fresco) 10 ml de ortosilicato de tetraetilo (TEOS) y otro vial de 10 ml de hidróxido de amonio al 25% (NH4OH) en el desecador, en la plataforma perforada. Ajuste los viales cerca y en lados opuestos de las muestras. Preferiblemente utilice un corcho de matraz o un pedestal plano similar para elevar ligeramente las virutas de la plataforma.
    ADVERTENCIA: Tanto NH4OH como TEOS son dañinos en caso de contacto con la piel y sus vapores pueden causar irritación tanto en los ojos como en los órganos respiratorios. Usar en un área bien ventilada y usar guantes de protección, protección para los ojos y ropa protectora.
  5. Selle la cámara e incubar durante 20 horas a temperatura ambiente. Esto crecerá una película de SiO2 en las áreas donde no se encuentran las estructuras de origami de ADN, creando una máscara de 10-20 nm con patrón con agujeros en forma de origami de ADN(Figura 4).
  6. Retire las muestras de la cámara después de la incubación. Conservar en un recipiente cubierto. El procesamiento se puede pausar aquí. Deseche los TEOS y NH4OH usados. El lote de gel de sílice se puede utilizar 2-3 veces si se mantiene sellado dentro del desecador entre usos y se utiliza dentro de 2-3 semanas.

10. Grabado de iones reactivos (RIE) de SiO2 y a-Si(Figura 3E)

  1. Coloque las virutas en el equipo de grabado de iones reactivos (RIE).
  2. Configure los parámetros de grabado para grabar sólo 2-5 nm de SiO2 con el fin de revelar la capa a-Si debajo de los agujeros en la máscara de SiO2. Los ajustes exactos deben determinarse experimentalmente para el equipo individual. Los parámetros utilizados aquí se presentan en el Cuadro 3. Ejecute el programa de grabado de plasma Anisotrópico SiO2.
  3. Configure los parámetros de grabado para perforar a través de la capa a-Si de 50 nm. Los parámetros utilizados aquí se presentan de nuevo en el Cuadro 3. Ejecute el programa de grabado de plasma isotrópico a-Si.
  4. Retire las muestras del equipo RIE y guárdelas cubiertas. El procesamiento se puede suspender de nuevo aquí.

11. Deposición física de vapor (PVD) de metales(Figura 3F)

  1. Cargue las virutas en la cámara de evaporación del instrumento PVD.
  2. Elija un metal de destino. En primer lugar, elija un metal adhesivo. Aquí, se utilizan 2 nm de cromo (Cr).
  3. Configure el programa de control de espesor para el material y el espesor de destino. El método de control depende del instrumento. Aquí, se utiliza un microbalance de cristal de cuarzo (QCM). El espesor medido se ajusta por densidad de material objetivo y factor Z y debe corregirse mediante un factor de herramienta determinado experimentalmente que sea específico para el dispositivo y cada material de destino.
  4. Encienda el haz de electrones, alinee el haz con el objetivo y aumente la corriente del haz hasta alcanzar una velocidad de deposición de 0,05 nm/s. Evaporar hasta alcanzar un espesor final de 2 nm.
  5. Elija un segundo metal objetivo (por ejemplo, oro) sin ventilar la cámara ni interrumpir el proceso. Las interrupciones o ventilación permitirán que el metal adhesivo comience a oxidarse y disminuirá su facilidad de uso como adhesivo.
  6. Repita los pasos 11.3 a 11.4. Evaporar hasta alcanzar 20 nm. Esto creará una estructura metálica en forma de origami de ADN a través de los orificios de máscara SiO2 con una altura total de 22 nm.
  7. Ventile la cámara y retire las muestras.
  8. El procesamiento se puede pausar aquí si las muestras se almacenan cubiertas.

12. Despegue con ácido fluorhídrico (HF)(Figura 3G)

  1. Vierta 50% la solución etchant a base de HF en un recipiente de plástico adecuado. No se debe utilizar HCl para la mezcla, ya que HCl grabaría el Cr en la muestra.
    ADVERTENCIA: La IC es extremadamente corrosiva, causa irritación grave y quemaduras y puede ser mortal al contacto con la piel o si se inhala. Utilice HF solo en una capucha de humo dedicada o en un banco húmedo ventilado con un delantal protector, guantes resistentes a productos químicos y visera facial, o protección química completa.
  2. Sumerja las muestras en el etchant a base de HF y revuelva suavemente con pinzas de plástico.
  3. Espere a que la capa SiO2 se conste completamente y que la capa metálica se desprenda. El tiempo variará notablemente dependiendo de la densidad de los agujeros de la máscara. Un mayor número de agujeros se traducirá en un grabado más rápido. Si la capa de metal es difícil de pelar, se puede utilizar una breve ultrasonicación de 5 a 10 s.
  4. Una vez que la película metálica se separa, enjuague las muestras con agua destilada doble e isopropanol.
  5. Después de enjuiciar, seque las muestras con un flujo de nitrógeno de la misma manera que las instrucciones para la preparación del sustrato (paso 5). Evite el contacto de las pinzas con el centro de la viruta, ya que eso puede destruir las nanoestructuras formadas.
    NOTA: Las muestras se pueden almacenar y procesar suspendidas aquí.

13. RIE de a-Si restante(Figura 3H)

  1. Coloque las virutas en el equipo de grabado de iones reactivos (RIE).
  2. Configure los parámetros de grabado para la eliminación a fondo de todos los 50 nm de a-Si. Los parámetros pueden ser los mismos que en el paso 10, pero un tiempo de grabado ligeramente más largo (40 s) se puede utilizar para asegurar la eliminación de todos los a-Si. Consulte la Tabla 3 para ver los parámetros utilizados aquí.  Ejecute el programa de grabado de plasma isotrópico a-Si para eliminar el a-Si restante.
  3. Retire las muestras del equipo RIE y guárdelas cubiertas. Esto concluirá el procesamiento de la muestra.

14. Microscopía de fuerza atómica (AFM)

NOTA: La microscopía de fuerza atómica y la microscopía electrónica de barrido se pueden utilizar para monitorear el éxito del crecimiento y el patrón de la película, así como para imágenes de estructuras de origami de ADN plegado(Figura 2B,C). El siguiente paso de preparación de muestra se puede omitir si se crean imágenes las muestras procesadas de los pasos 5 a 13.

  1. Preparación de muestras para AFM
    1. Para tomar una imagen del origami de ADN plegado, tome un chip de sustrato de mica.
    2. Fije el chip de mica a una diapositiva de microscopio de vidrio con un adhesivo.
    3. Preparar 10 l de solución de origami de ADN diluyendo el stock de origami de ADN de 20 nM 50 veces en 1x FOB a una concentración de aproximadamente 0,4 nM. La dilución se lleva a cabo con el fin de evitar el hacinamiento del sustrato.
    4. Pelar la capa superior de la hoja de mica con cinta débil para obtener una superficie recién cortada y cargada.
    5. Depositar la solución de origami de ADN diluido en la mica recién lacada e incubar la muestra cubierta durante 1 min a temperatura ambiente.
    6. Después de la incubación, lave la superficie 3-4 veces con 100 ml de agua destilada utilizando una pipeta. Esto hace que solo el origami correctamente adsorbido permanezca en la superficie.
    7. Depositar 100 l de agua destilada en la superficie de la mica.
    8. Incline y toque bruscamente la diapositiva del microscopio sobre la mesa para separar la mayor parte del agua.
    9. Repita este ciclo de lavado 3-4 veces.
    10. Seque bien la muestra con un flujo de nitrógeno inmediatamente después del lavado. La muestra está lista para la toma de imágenes AFM.
  2. Coloque las muestras de origami de ADN o los chips procesados en un AFM y realice exploraciones. Un tamaño de escaneo de 1-10 m es adecuado para resolver correctamente las estructuras.

15. Microscopía electrónica de barrido (SEM)

  1. Coloque las muestras en un SEM. Los chips procesados se pueden utilizar tal como son (no se necesita preparación adicional de la muestra).
  2. Elija la tensión de aceleración. Utilice voltajes bajos (5-10 kV) para reducir los efectos de carga ya que el sustrato de la muestra (Al2O3 o SiN) es un aislante.
  3. Escanee cualquier área de interés. Minimice los tiempos de escaneado para reducir la carga y evitar la deposición de contaminación.

Representative Results

Una figura esquemática del diseño del origami de ADN bowtie y sus detalles estructurales se muestran en la Figura 1. La electroforesis de gel de agarosa y el AFM se utilizan para analizar el plegado del origami de ADN y la calidad de la purificación de PEG(Figura 2). El flujo de proceso de los pasos de nanolitografía se muestra en la Figura 3. Las imágenes AFM representativas después del crecimiento de la máscara de SiO2 se muestran en la Figura 4 (este paso se muestra en la Figura 3D),mientras que las imágenes SEM de las nanoestructuras metálicas finales se pueden ver en la Figura 5 (este paso se representa en Figura 3H). La Figura 6 demuestra la funcionalidad óptica de las nanoestructuras metálicas plantilladas por el origami de ADN bowtie.

Concentraciones de componentes de búfer plegable (FOB) [mM]
Tris Acido acético Edta Cloruro de magnesio Ph
2.5x FOB 100 47.5 2.5 31.25 8,3 euros
1x FOB 40 19 1 12.5 8,3 euros

Tabla 1: Composición del tampón plegable (FOB).

Rango de temperatura [oC] Tasa de enfriamiento
90-70 -0,2 oC / 8 s
70-60 -0,1 oC / 8 s
60-27 -0,1 oC / 2 s
12 Mantenga pulsado hasta que se detenga

Tabla 2: Rampa térmica para el pliegue de pajarita origami. Después del recocido, el origami se almacenará a 12 oC hasta que el programa se detenga manualmente.

Parámetros PECVD y RIE
Gas Flujo de gas [sccm] Presión de cámara [mTorr] Potencia RF [W] Temperatura [oC] Duración [s]
PECVD de a-Si 5% SiH4 en N2 500 1000 15 250 90
Tratamiento plasmático O2 O2 50 40 200 30 1200
RIE de SiO2 CHF3 25
Ar 25 30 100 25 10-22
RIE de a-Si O2 8
SF6 100 90 50 30 35
RIE de permanecer a-Si O2 8
SF6 100 90 50 30 35-40

Tabla 3: Parámetros del proceso para la deposición de vapor químico mejorada por plasma (PECVD) y el grabado de iones reactivos (RIE). Los parámetros de proceso para estos dispositivos son específicos de instrumentos individuales y es posible que deban adaptarse cuando se utilizan.

Figure 1
Figura 1: Diseño del origami de ADN bowtie. (A) Representación esquemática del diseño de origami bowtie en el que la estructura del núcleo se muestra como hélices dobles y los voladizos de poliT se representan como líneas onduladas. (B) Captura de pantalla de una parte del diseño de bowtie origami en el software caDNAno. Las cruces rojas denotan que el par base se salta para la corrección de torsión, y los voladizos T8se agregan para evitar el apilamiento de base de extremo romo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Caracterización de la estructura del origami de ADN de pajarita. (A) Electroforesis de gel de agarosa de la estructura de la pajarita antes y después de la purificación de poli(etilenglicol) (PEG). El andamio largo 7249 nucleótidos se utiliza como referencia. (B) Imagen de microscopía de fuerza atómica (AFM) de las estructuras bowtie antes de la purificación. (C) Imagen AFM de las estructuras bowtie después de la purificación PEG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Esquema del flujo del proceso de fabricación (las dimensiones no están en escala). (A) Dados y limpie el sustrato. (B) Depositar una capa a-Si por deposición de vapor químico mejorada por plasma (PECVD). *Es posible emplear una capa de sacrificio adicional debajo del a-Si para permitir el despegue con etchant distinto de HF. (C) Tratar la superficie de la muestra con plasma O2 y depositar el origami de ADN en ella. (D) Haga crecer la máscara SiO2 en el desecador. (E) Etch una fina capa de SiO2 y a través del a-Si debajo de ella por grabado de iones reactivos (RIE). (F) Depositar metal a través de la máscara por deposición física de vapor (PVD). (G) Despegue con HF. (H) eliminar el a-Si restante por RIE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4

Figura 4: Imágenes Representativas de AFM de la película DeO2 con el patrón en forma de origami de ADN. (A) 10 ám x 10 m área de escaneo demuestra el alto rendimiento de la formación del patrón. (B) Una exploración más cercana de 3 m x 3 m muestra los patrones individuales precisos en la película de SiO2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes representativas de microscopía electrónica de barrido(SEM) de nanoestructuras metálicas plantilladas con origami de ADN estructuralmente diferente. (A) Origami de ADN en forma de cruz, es decir, el llamado origami de azulejos Seeman54. (B) Antenas Bowtie. (C) Estructuras quirales de doble L (CDL). Los inserciones muestran estructuras individuales con tamaños de caja de 150 nm x 150 nm. El rendimiento de fabricación de las estructuras exactas es de hasta 76% para el pajarita de origami y del 50% para las otras estructuras que se muestran aquí34. Esta figura ha sido adaptada y modificada de Shen et al.34. La figura se reproduce con permiso de los autores y publicada por the American Association for the Advancement of Science, 2018. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Propiedades ópticas/funcionales representativas de las nanoestructuras resultantes. (A) Mediciones de resonancia de plasmón superficial localizada (LSPR) de una estructura de pajarita de oro individual con diferente polarización (color codificado como naranja y azul). Las líneas sólidas se miden espectros y las líneas discontinuas son resultados de simulación. Los recuadros muestran la imagen SEM de la partícula medida (izquierda) y el modelo utilizado para la simulación (derecha). (B) Espectroscopia Raman mejorada de superficie (SERS) de rodamina 6G y 2,2-bipiridina medida en una superficie cubierta con nanoestructuras bowtie. La línea de base de cada muestra el nivel de señal cuando las nanoestructuras estaban ausentes. Esta figura ha sido adaptada y modificada de Shen et al.34. La figura se reproduce con permiso de los autores y publicada por the American Association for the Advancement of Science, 2018. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo proporciona una gran libertad y precisión en la forma de nanoestructuras producidas. Al cambiar el diseño del origami de ADN, se puede controlar la forma de las nanoestructuras metálicas. La forma final y exacta de las estructuras metálicas está determinada adicionalmente por el paso de crecimiento de la máscara (Paso 9) y en menor grado por el grabado de la máscara (Paso 10) en caso de que no sea anisotrópico. Si el tiempo de crecimiento de la máscara se extiende lo suficiente, los agujeros en la máscara comenzarán a crecer cerrado. Esto se puede utilizar para omitir las características más delgadas de algunas estructuras y tamaños de brecha de control, como se muestra en Shen et al.34 con triángulos separados de la pajarita origami (Figuras 5B). Por el contrario, las formas más delgadas se pueden conservar mejor al acortar el tiempo de crecimiento del óxido. Esto significa que es posible ajustar las propiedades ópticas mostradas en la Figura 6,no sólo cambiando el diseño de origami utilizado, sino también ajustando el crecimiento de la película SiO2.

Si el grosor de la máscara se cambia significativamente, ese cambio también debe reflejarse en el paso SiO2 RIE. Sólo una capa muy delgada de SiO2 debe ser grabada (2-5 nm) para apenas perforar a través de los agujeros de la máscara. Esta es la parte más sensible y crucial de todo el proceso. Dado que el tiempo de grabado es extremadamente corto, sólo 10-20 s, los ajustes exactos deben determinarse experimentalmente cuando se intenta por primera vez con equipos nuevos. Esto también es cierto para el paso 10.4 ya que algunos SiO2 también se graban durante el grabado a-Si. La extensión del SiO2 grabado viene determinado por la selectividad de los parámetros de etch a-Si utilizados, equipos e incluso calibraciones individuales de equipos. Se debe tener cuidado de no grabar toda la capa de SiO2 durante estos dos procesos.

Otro paso sensible es el crecimiento de SiO2. El proceso de crecimiento depende tanto de la humedad de la cámara como de la actividad actual del TEOS utilizado. TEOS se degrada a medida que absorbe el agua del aire, haciendo que se vuelva menos eficaz con la edad. Esto puede manifestarse como una tasa de crecimiento significativamente más lenta y menos controlable en cuestión de meses, incluso con el almacenamiento adecuado del producto químico. 34 Si la capa siO2 resultante es más delgada de lo previsto, esto puede indicar un problema con TEOS en lugar de humedad de la cámara. Mientras que una humedad más baja también puede resultar en una menor tasa de crecimiento y una película más delgada, la película resultante también debe ser más suave de lo normal. Mientras tanto, una capa gruesa granulada y áspera indicaría por el contrario un problema con la alta humedad.

También es posible realizar este protocolo en cualquier otro sustrato libremente elegido con dos requisitos: Debe tolerar tanto el grabado HF (Paso 12) como las temperaturas de 200-300 oC de PECVD (Paso 6). La temperatura se puede bajar de forma segura a 100 oC para el PECVD de a-Si si se utiliza un sustrato más sensible, pero la IC no se puede evitar si el protocolo se sigue exactamente como se describe. Para eludir hf, se requeriría la aplicación de una capa de sacrificio adicional. Si se elimina el requisito del grabado HF, este protocolo se volvería compatible con una selección más amplia de materiales de sustrato y metales.

Como este protocolo consiste en procesos de micro y nanofabricación de uso común y robustos, podría combinarse con cualquier número de otros protocolos de microfabricación donde se desean pequeños tamaños de características y formas metálicas complejas. En un futuro próximo, especialmente con la llegada de la producción en masa de origami de ADN de bajo costo31, existe la posibilidad de que este método facilite el uso general y el nanopatrón de alto rendimiento para nanofotónica sin interfaz y plasmónica55 .

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Academia de Finlandia (proyectos 286845, 308578, 303804, 267497), la Fundación Jane y Aatos Erkko y la Fundación Sigrid Jusélius. Este trabajo se llevó a cabo en el marco del Programa de Centros de Excelencia de la Academia de Finlandia (2014-2019). Reconocemos la provisión de instalaciones y apoyo técnico por parte de Las Instalaciones de Bioeconomía de la Universidad de Aalto y OtaNano – Centro de Nanomicroscopía (Aalto-NMC) y el Centro de Nanofabricación de Micronova.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Honeywell 40289H Semiconductor grade ULSI, ≥ 99.5 %
Agarose Fisher Bioreagents 1036603 Low-EEO, multi-purpose and molecular biology grade
Ammonium hydroxide Fisher Chemical 10652251 25 % ammonia solution, Certified AR for Analysis, d = 0.91
BRANSON 5510 Branson Ultrasonic bath
Dimension Icon Bruker Atomic force microscope
Electron-beam evaporator IM-9912 Instrumentti Mattila Evaporator for PVD
Ethidium bromide Sigma Aldrich E8751 Fluorescent dye for DNA staining
Eon Microplate spectrophotometer BioTek UV/Vis spectrophotometer used for DNA origami concentration measurements
Gel Doc XR+ Documentation System BioRad Gel imaging system
Gel Loading Dye, Blue (6×) New England Biolabs B7021S Bromophenol blue-based loading dye for agarose gel electrophoresis
G-storm GS1 Thermal cycler Gene Technologies
HBR 4 IKA Heating bath
Hydrofluoric acid Honeywell 40213H Semiconductor grade, 49.5-50.5 %
Isopropanol Honeywell 40301H Semiconductor grade VLSI, ≥ 99.8 %
Magnesium chloride Sigma Aldrich M8266 Anhydrous, ≥ 98 %
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad
Plasmalab 80+ PECVD Oxford Instruments PECVD system
Plasmalab 80+ RIE Oxford Instruments RIE system
Poly(ethylene glycol) Sigma Aldrich 89510 BioUltra, 8,000
PowerPac HC High-Current Power Supply BioRad
Sapphire substrate (Al2O3) University Wafer Thickness: 430 μm, Polish: DSP, Size: 50.8 mm
Sigma VP Zeiss Scanning electron microscope
Silica gel Merck 1019691000 With indicator (orange gel), granulate ~1-3 mm
Single-stranded Scaffold DNA, type p7249 Tilibit Nanosystems At 100 nM concentration
Sodium chloride Sigma Aldrich S9888 ACS reagent, ≥ 99.0 %
Staple strands (oligonucleotides) Integrated DNA Technologies Sequences can be ordered e.g. at 100 micromolar in Rnase-free water
TAE buffer (50×) pH 8.0 VWR Chemicals 444125D Electran Electrophoresis grade
Take3 micro-volume plate BioTek Used for DNA origami concentration measurements
Tetraethyl orthosilicate Sigma Aldrich 86578 ≥ 99.0 % (GC)

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Química Número 151 nanotecnología de ADN origami de ADN nanopartículas metálicas nanolitografía patrón de sustratos óptica plasmónicos
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Piskunen, P., Shen, B., Julin, S., Ijäs, H., Toppari, J. J., Kostiainen, M. A., Linko, V. DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications. J. Vis. Exp. (151), e60313, doi:10.3791/60313 (2019).

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