Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Pneumococcus infektion af primære humane endotelceller i konstant flow

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60323
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

Summary

Denne undersøgelse beskriver den mikroskopiske monitorering af pneumokokker-tilslutningen til von Willebrand-faktor strenge, der produceres på overfladen af differentierede humane primære endotelceller under forskydnings stress i definerede strømningsforhold. Denne protokol kan udvides til detaljeret visualisering af specifikke cellestrukturer og kvantificering af bakterier ved anvendelse af differentiale immunofarvnings procedurer.

Abstract

Interaktion af Streptococcus pneumoniae med overfladen af endotelceller er medieret i blodgennemstrømning via mekanisk følsomme proteiner såsom von Willebrand Factor (VWF). Dette glykoprotein ændrer sin molekylære konstellation som reaktion på forskydnings stress og udsætter derved bindingssteder for et bredt spektrum af Host-ligand-interaktioner. Generelt er dyrkning af primære endotelceller under en defineret forskydnings strøm kendt for at fremme den specifikke cellulære differentiering og dannelsen af et stabilt og tæt forbundet endotellag, der ligner fysiologien i den indvendige foring af et blodkar . Således kræver den funktionelle analyse af interaktioner mellem bakterielle patogener og værts Vaskulaturen, der involverer mekaniske følsomme proteiner, etablering af pumpesystemer, som kan simulere de fysiologiske strømnings kræfter, som vides at påvirke overfladen af vaskulære celler.

Den mikrofluidiske anordning, der anvendes i dette studie, muliggør kontinuerlig og Pulseless recirkulation af væsker med en defineret strømningshastighed. Det computerstyrede Lufttryks pumpesystem anvender en defineret forskydningsbelastning på endotelcellernes overflader ved at generere et kontinuerligt, envejs og kontrolleret medium flow. Morfologiske ændringer af cellerne og bakteriel fastgørelse kan mikroskopisk overvåges og kvantificeres i flowet ved hjælp af specielle kanal slides, der er designet til mikroskopisk visualisering. I modsætning til statisk cellekultur infektion, som generelt kræver en prøve fiksering forud for immun mærkning og mikroskopiske analyser, de mikrofluidisk dias muliggør både fluorescens-baserede påvisning af proteiner, bakterier, og cellulære komponenter efterprøve fiksering; seriel immunofluorescens farvning; og direkte fluorescens baseret detektion i realtid. I kombination med fluorescerende bakterier og specifikke fluorescens-mærkede antistoffer, denne infektion procedure giver en effektiv flere komponent visualisering system til et stort spektrum af videnskabelige applikationer relateret til vaskulære processer.

Introduction

Patogenesen af pneumokokker infektioner er karakteriseret ved en mangesidet interaktion med en mangfoldighed af ekstracellulære matrix forbindelser og komponenter i den menneskelige hæmostase, såsom plasminogen og vWF1,2, 3,4,5,6,7,8. Multi Domain glykoprotein vWF fungerer som nøgle regulator af en balanceret hæmostase ved at mægle trombocyt rekruttering og fibrin inkorporering på stedet for vaskulær trombusdannelse9. Betydningen af funktionel, aktiv VWF til blødningskontrol og sårheling påvises ved von Willebrands sygdom, en almindelig arvelig blødningsforstyrrelse10.

Den globulære vWF cirkulerer i det menneskelige blod system i en koncentration på op til 14,0 μg/ml11,10. Som reaktion på vaskulær skade, den lokale frigivelse af vWF af endotel Weibel Palade organer (WBP) er markant forøget11,12. Tidligere undersøgelser viser, at pneumokokker overholdelse af humane endotelceller og dets produktion af pore dannende toksin pneumolysin i betydelig grad stimulerer luminale vWF sekretionen13. De hydrodynamiske kræfter i blodgennemstrømningen inducerer en strukturel åbning af mekanismens esponsive VWF domæner. Ved strømningshastigheder på 10 dyn/cm2 vWF multimerizes til lange protein strenge på op til flere hundrede mikrometer i længden, der forbliver fastgjort til subendothelium10,12.

For at forstå funktionen af multimeriserede vWF-strenge genereret under forskydnings stress i interaktionen af pneumokokker med endoteloverfladen blev der etableret en mikrofluidic-baseret cellekultur infektion tilgang. Der blev anvendt en mikrofluidic-enhed med et software kontrolleret lufttryk pumpesystem. Dette gav mulighed for en kontinuerlig, ensrettet recirkulation af cellekulturmedium med en defineret strømningshastighed. Derved anvendte systemet en defineret forskydningsbelastning på overfladen af endotelceller, som forblev fastgjort inde i specialiserede kanalrutschebaner. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at simuleringen af forskydnings kraften i blodstrømmen i det menneskelige vaskulære system, hvor VWF-strengene genereres på differentierede endotelceller under definerede konstante strømningsforhold. Til dette formål blev endotelcellerne dyrket i specifikke kanalrutschebaner (Se tabel over materialer), som blev tilpasset til mikroskopiske analyser under gennemstrømningen. Det mikrofluidisk pumpesystem leverede den meget definerede og kontrollerede forskydnings stresssituation, der kræves for dannelsen af udvidede vWF strenge på flydende endotheliale cellelag. Efter stimulering af VWF-sekretion af confluently dyrket humane navle formede vene endotelceller (HUVEC) af histamin tilskud, strengen dannelse blev induceret ved at anvende en shear stress (ԏ) af 10 dyn/cm2. Forskydnings belastningen defineres som den kraft, der handler på cellelaget. Det beregnes omtrent efter Cornish et. al.14 med ligning 1:
Equation 1

Hvor ԏ = forskydningsbelastning i dyn/cm2, η = viskositet i (dyn ∙ s)/cm2, h = halvdelen af kanal højden, w = halvdelen af kanalbredden og Φ = flow hastigheds i ml/min.

Resultatet af ligning 1 afhænger af de forskellige højder og bredder på de forskellige anvendte slides (Se tabel over materialer). I dette studie blev der anvendt et luer-kanal udtræk på 0,4 μm, som resulterede i en kammer slide faktor på 131,6 (Se formel 2).
Equation 2

Viskositeten af mediet ved 37 °C er 0,0072 dyn ∙ s/cm ², og der blev anvendt en forskydningsbelastning på 10 dyn/cm ². Dette resulterede i en strømningshastighed på 10,5 mL/min (Se formel 3).
Equation 3

Her er tilpasningen og fremskridt af en mikrofluidisk celledyrkning procedure ved hjælp af et ensrettet laminar flow system til undersøgelse og visualisering af bakterielle infektions mekanismer i værts vasculaturen beskrevet i detaljer. Generering af VWF strenge på endotellag kan også stimuleres ved hjælp af andre pumpesystemer, der er i stand til at anvende en kontinuerlig og stabil shear stress15.

Efter dyrkning af primære endotelceller til sammenløbet i flow og stimulering af VWF-streng dannelse blev pneumokokker, der udtrykker rødt fluorescens protein (RFP)16 , føjet til endotelcellelag under konstant mikroskopisk kontrol. Tilknytningen af bakterier til VWF strenge på overfladen af endotelceller blev mikroskopisk visualiseret og overvåges i op til tre timer i realtid ved hjælp af VWF-specifikke fluorescerende-mærkede antistoffer. Med denne tilgang, rolle vWF som en vedhæftning cofaktor fremme bakteriel tilknytning til den vaskulære endotelum blev bestemt8.

Ud over den mikroskopiske visualisering af protein sekretion og konformationsmæssige ændringer, denne metode kan bruges til at overvåge enkelte trin af bakteriel infektion processer i realtid og at kvantificere mængden af vedhæftede bakterier på forskellige tidspunkter af Infektion. Det specifikke softwarestyrede pumpesystem giver også mulighed for at kultur de endotelceller i definerede konstante strømningsforhold i op til flere dage og muliggør en defineret pulseret medium flow inkubation. Desuden kan denne metode anvendes ved hjælp af forskellige celletyper. Tilpasning af farvnings protokollen giver også mulighed for påvisning og visualisering af bakterier internaliseret i eukaryote celler.

Dette manuskript beskriver denne avancerede eksperimentelle protokol, der kan bruges som en defineret, pålidelig og reproducerbar tilgang til en effektiv og alsidig karakterisering af patofysiologiske processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den mikrofluidiske celledyrkning blev udført med kommercielle primære humane navle vene endotheliale celler (HUVEC). Virksomheden isolerede cellerne med informeret samtykke fra donor. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for læger kammer i forbundsstaten Baden-Wuerttemberg med referencenummer 219-04.

Bemærk: Se tabel over materialer til protokol forsyninger.

1. fordyrkning af primære endotelceller

  1. Der tø et frossen glycerol hætteglas indeholdende 1 x 105 primær HUVEC fra tre forskellige donorer forsigtigt ved 37 °c og frø cellerne i 7 ml forvarmede endotel cellevækst medium (ecgm, klar til brug med kosttilskud) i en 25 cm2 celle kolbe.
    Bemærk: De primære endotelceller mister differentierings kapacitet efter mere end 5 sprednings cyklusser. Derfor kan kun celler med mindre end 5 passager bruges, hvis der kræves høje kvaliteter af Celledifferentiering.
  2. Dyrke cellerne ved 37 °C i 5% CO2 atmosfære for 60 min at tillade overflade fastgørelse og udveksle ecgm cellekulturmedium for at slippe af rester fra kryobevaring.
  3. Fortsæt dyrkning af cellerne ved 37 °C i 5% CO2 -atmosfære, indtil de danner et subconfluent cellelag.
    Bemærk: HUVEC må ikke vokse til et flydende-lag, da de tætte celle celle kontakter forhindrer dannelse af et stabilt cellelag senere i flow.

2. prædyrkning af Streptococcus pneumoniae

Forsigtig: Streptococcus pneumoniae er en biosikkerhedsniveau 2-agent og må kun dyrkes i laboratorier med biosikkerhedsniveau 2. Brug en ren bænk klassificeret for sikkerhedsniveau 2 for alle bakterie behandlinger, strengt undgå aerosoldannelse, og brug en centrifuge med aerosol beskyttelse til sedimentering af bakterier.

  1. Inokulere en Columbia-blod agar med Streptococcus pneumoniae klinisk ISOLAT ATCC11733 afledt af en glycerol bestand, der konstant opbevares ved-80 °c og dyrker agarpladen natten over ved 37 °c og 5% Co2.
  2. Forbered 40 mL af Todd Hewitt Liquid bouillon suppleret med 1% gærekstrakt (THY) og 15 mL steril fosfat-bufferet saltvand (PBS) pH 7,4, til bakterie dyrkning og vaske trin.
  3. Brug et sterilt rør til bakterie dyrkning og inokulere den flydende kultur bouillon med bakteriel masse. Kontrol af mængden af inokulering ved fotometrisk måling af 1 mL aliquoter ved 600 nm mod ikke-inokuleret flydende bouillon som reference. Fyld bakterie massen i den flydende bouillon, indtil den når en optisk densitet ved 600 nm (OD600) af 0,15.
  4. Den inokulerede væske bouillon inkubateres uden omrystning ved 37 °C og 5% CO2 og bestem OD600 hver 30 min ved at måle 1 ml aliquoter ved hjælp af plastik kuvetter.
  5. Så snart bakterie kulturen har nået en OD600 af 0,4, hvilket svarer til den eksponentielle vækstfase, centrifugeres bakteriekultur suspensionen i 10 min ved 1.000 x g ved stuetemperatur (RT).
    Bemærk: Lad ikke en pneumokokker kultur nå en OD600 på mere end 1,0, fordi en høj pneumokokker kultur tæthed er kendt for at udløse bakteriel autolyse, som kan påvirke den samlede bakterielle egnethed.
  6. Den bakterielle sediment resuspenderes forsigtigt med 10 mL PBS og sediment igen i 10 minutter ved 1.000 x g ved rt.
  7. Det vaskede, bakterielle sediment opslæmmes forsigtigt i 1 mL PBS, og OD600 på 10 μl af den bakterielle suspension bestemmes med 1 ml PBS som reference.
  8. Mængden af bakterier i PBS justeres til en OD600 af 2,0. Ifølge tidligere fastsatte bakterie tælling svarer en OD600 af 2,0 til 2 x 109 KOLONIDANNENDE enheder (CFU). Straks gå videre med infektionen procedure for at forhindre bakteriel autolyse.

3. Endothelial celledyrkning af HUVEC under mikrofluidiske forhold

  1. De primære endotelceller fra celle dyrknings kolben afmonteres ved kontrolleret proteolyse. Udfør følgende trin i et sterilt miljø ved hjælp af en ren bænk. Forbered en volumen på 15 mL steril PBS til vaske trinene.
    1. Fjern ECGM fra et subconfluently-dyrket HUVEC-lag, og vask cellelaget med 10 mL PBS ved hjælp af en serologisk pipette for at slippe af med cellekultur mediet.
    2. Den vaskede HUVEC inkuberes med 3 ml 37 °c forvarmede-celle dissociations opløsning til løsrivelse af celler i 5 min ved 37 °c. Overhold den proteolytiske celle løsrivelse ved mikroskopisk overvågning hvert minut.
    3. Den udskilte cellesuspension afpipetteres i et rør, der indeholder 7 mL ECGM suppleret med 2% føtal kalv serum (FCS) til standsning af proteolyse og sediment cellerne i 3 min ved 220 x g ved rt.
    4. Supernatanten fjernes, og HUVEC resuspenderes i 250 μL ECGM suppleret med 5% FCS og 1 mM MgSO4. Brug 10 μL af cellesuspensionen til celletælling ved hjælp af et Neubauer-celle optællings kammer, og Juster celletal til 4 x 106 celler/ml ecgm suppleret med 5% FCS og 1 mm mgso4.
      Bemærk: For hvert flow eksperiment vil 30 mL ECGM-medium suppleret med 5% FCS og med 1 mM MgSO4 være påkrævet. Herfra på denne medium sammensætning er hedder ECGMS-medium. Stigningen i FCS koncentration i dyrkningsmediet fra 2% til 5% understøtter celle fastgørelse og cellens levedygtighed af HUVEC seedede i kanalen slide. Medium kosttilskud FCS og MgSO4 væsentligt stabilisere celle fastgørelse af HUVEC under shear stress betingelser.
  2. Frø og dyrke HUVEC i en kanal slide. Arbejd i et sterilt miljø ved hjælp af en ren bænk. Cellerne vil blive dyrket under forskydnings stress i 2 dage efterfulgt af infektion med bakterier og mikroskopisk overvågning for en anden 2 h.
    1. Ækvibrere en kanal slide, en perfusion sæt 1,6 mm i diameter og 50 cm i længden, en alikvot af ECGMS-medium, og en luer kanal slide 0,4 μm i højden, for 24 h i en inkubator med 5% CO2 atmosfære ved 37 °c at reducere antallet af luftbobler.
      Bemærk: Denne fremgangsmåde anbefales at Degas plastik udstyret og at forvarme mediet, perfusions rørene og reservoirer. Hvis materialer eller væsker er blevet opbevaret ved RT eller i køleskabet, frigives gasser opløst i plastik og væsker, når de opvarmes i inkubator under forsøget. Gasbobler vil derefter dukke op. Afgasning af alle Plastkomponenter, før eksperimentet vil eliminere denne effekt. Hver gang systemet tages ud af inkubator, begynder processen med gasabsorption igen. Arbejd derfor hurtigt på RT, og Efterlad aldrig Fluidic-enheden uden for inkubator i længere perioder.
    2. Brug en pipette til at injicere 100 μL af en 2% sterilfiltreret Porcin gelatineopløsning i PBS-opløsning til et af reservoirerne i et temperatur-ækvibreret kanal skred. Der inkubates gelatine opløsningen i 1 time ved 37 °C, og slids kanalen skylles med 1 mL PBS under sterile forhold ved hjælp af en 1 mL luer-sprøjte.
    3. Anbring den gelatine belagte kanal slide på en tynd polystyren eller Styrofoam plade for at forhindre et fald i glide temperaturen. Der tilsættes 100 μL af 4 x 106/ml HUVEC-suspensionen med en 1 ml luer-sprøjte i sliden.
      Bemærk: Placering af kanalen slide på den kolde metal overflade af den rene bænk kunne sænke temperaturen af glide bunden, og derved generere kold stress til endotelcellerne. Under celle pipettering hold diaset lidt opad for at lade luftbobler stige og forsvinde indefra diaset.
    4. Inkuber kanal diaset med HUVEC i 60 min ved 37 °C og 5% CO2 og fyld de mellemstore reservoirer i begge ender af kanal diaset med 60 ΜL ECGMS-medium hver. Inkuber i 1 time ved 37 °C og 5% CO2.
  3. Justér mikrofluidisk-pumpen og softwareindstillingerne.
    1. Tilslut det ækvibrerede perfusions sæt til pumpeenheden, fyld med 13,6 mL ECGMS-medium, og start pumpe styringssoftwaren. Vælg det passende perfusions sæt og typen af kammer slide ved hjælp af rulle vinduerne i menuen for den Fluidic-enhed, der er oprettet. Vælg 0,007 (dyn ∙ s/cm2) i softwaren til medium viskositet. (Se indstillinger for trykpumpe software markeret med røde pile i supplerende figur 1).
    2. Uden for inkubator, Tilslut en glas flaske fyldt med tørring silica perler til lufttryk slangen (Se figur 1, inset 3). Tryk pumpens luft cirkulerer mellem perfusions reservoirer og pumpen og skal være tørre, inden pumpe anordningen genindføres. Vælg flow parametre i menuen software, Indstil trykket til 40 mbar, og skyl pumpe rørene med det flydende medium ved at starte det kontinuerlige medium flow. (Disse indstillinger angives også med røde pile i supplerende figur 1).
    3. Program de ønskede shear stress cyklusser af flow dyrkning. Start med 5 dyn/cm2, kontrol afbalanceret reservoir pumpinng og forsikre, at ingen luftbobler cirkulerer i pumpesystemet.
      Bemærk: Vægforskydnings belastningen i et kanal dias afhænger af strømningshastigheden og viskositeten af perfusions mediet. Hvis du bruger et andet pumpesystem, henvises til de ligninger, der er beskrevet i indledningen for at indstille en strømningshastighed, der genererer det ønskede forskydnings niveau. De beskrevne indstillinger svarer til en strømningshastighed på 5,42 mL/min. (et eksemplarisk skærmbillede, der viser de passende flow parameterindstillinger i trykpumpe softwaren, vises i supplerende figur 2).
    4. Stop flow cirkulationen i pumpe styringssoftwaren, og hold medium strømmen i perfusions slangen ved at fastspænde rørene i nærheden af luer-tilslutningerne. Forbind kanal sliden og undgå luftbobler, og Placer Fluidic-enheden med det tilsluttede kanalrutschebane i en CO2 -inkubator ved 37 °c og 5% Co2. Start forskydnings belastningen ved 5 dyn/cm2 i 30 minutter for at tilpasse cellerne jævnt til de kræfter, der genereres af forskydnings belastningen, før du accelererer forskydnings stressniveauet (Se supplerende figur 3).
      Bemærk: Pas på, at der ikke er luftbobler tilbage i rørsystemet eller i diaset efter tilslutning til rørsystemet, fordi bevægelsen af luftbobler i flowet kan føre til, at cellen løsrives.
    5. Accelerere forskydnings belastningen til 10 dyn/cm2 (som svarer til 10,86 ml/min i denne strømnings indstilling) og Inkubér kanal sliden i kontinuerlig forskydningsbelastning for 48 h i en lille Co2 -inkubator ved 37 °C og 5% Co2 for at tillade Celledifferentiering ( de respektive software settinngs er indikeret med røde pile i supplerende figur 4).
      Bemærk: HUVEC-celler har tendens til at løsne sig fra kanalens overflade, hvis flow dyrkningen påbegyndes direkte ved 10 dyn/cm2. Cellerne forbliver fastgjort til kammerets overflade, hvis flow dyrkning startes med mindre forskydningsbelastning ved hjælp af 5 dyn/cm2 i mindst 30 min efterfulgt af at øge forskydnings belastningen langsomt op til den ønskede 10 dyn/cm2. En forskydningsbelastning på 10 dyn/cm2 er den mindste værdi i denne perfusions indstilling, der kræves til vWF-streng dannelse.
    6. Efter 24 timer af mikrofluidisk celledyrkning, stop medium flow med pumpen kontrol software præcis, når en afbalanceret medium niveau er nået i begge mellemstore reservoirer. Den fluidiske enhed placeres i en ren bænk, og der udtages 10 mL af det cirkulerede dyrkningsmedium for perfusions reservoirer ved hjælp af en 10 mL serologisk pipette. Tilsæt 10 mL ECGMS-medium i reservoirer for at forny mediet, Placer Fluidic-enheden tilbage i CO2 -inkubator ved 37 °c og 5% Co2, og genstart den fluidiske dyrkning ved hjælp af pumpe styringssoftwaren.
      Bemærk: Tryk pumpens funktion kan pludselig afbrydes af laboratorie maskiner såsom store centrifuger, som kan skabe en stærk magnetisk felt forstyrrelse. Denne pludselige afbrydelse kan føre til celle løsrivelse. Pas på, at sådanne maskiner ikke er aktive i nærheden af tryk pumpen under forsøget.
    7. Start foropvarmningen af temperatur inkubations kammeret, der dækker fase af fluorescens mikroskop, til 37 °C for temperaturligevægt 24 timer før den mikroskopiske visualisering. Når mikroskopet er forvarmet, kan du starte mikroskop-softwarens kontrol og justere de vigtigste indstillinger for fluorescens mikroskopiske overvågning ved at vælge de relevante filterindstillinger (540 nm/590 nm til påvisning af de RFP-udtrykte bakterier og 470 nm/515 nm til påvisning af fluorescei emission af de FITC-konjugeret VWF-specifikke antistoffer). Forvarm et ekstra opvarmnings kammer til inkubation af Fluidic-enheden ved 37 °C.
      Bemærk: Under infektionen analyser og mikroskopisk overvågning temperaturen af kanalen slide og det cirkulerende medium bør ikke falde væsentligt, fordi dette ville generere kold stress på cellerne. Generelt er størrelsen af temperatur kamrene, der dækker mikroskop stadiet, ikke nok til at dække hele Fluidic-enheden. Derfor anbefales det at anvende et ekstra opvarmnings kammer, der er forvarmet til 37 °C.
    8. For mikroskopisk visualisering placeres Fluidic-enheden i 37 °C forvarmet varme kammer og Placer kanal diaset på en fase af 37 °C forvarmet mikroskop.
      Bemærk: For mikroskopisk visualisering skulle Fluidic-enheden og kanal sliden fjernes fra CO2 -inkubator på grund af perfusions slangens begrænsede længde. Hvis infektions tider og mikroskopisk monitorering længere end 180 min er påkrævet uden for 5% CO2 -atmosfæren til pH-buffering, bør der anvendes et pH-bufferet medium til mikrofluidisk dyrkning.
    9. Kontroller cellernes morfologi og integriteten af HUVEC-laget før injektion af histamin og bakterier til flow cirkulationen i hele flow eksperimentet og efter endt flow eksperimentet ved hjælp af mikroskopets lyse felt tilstand.

4. induktion af VWF-frigivelse og visualisering af Multimeriserede VWF-strenge

  1. Opretholde flow indstillingen, fordi en forskydningsbelastning på 10 dyn/cm2 er nødvendig for at udløse multi-multimeriseringen af vWF til lange strenge på op til 200 MDA. Inducerer frigivelsen af vWF fra endotel WPB ved at injicere 136 μl af en 100 mm histamin stamopløsning i det ecgms-medium, der cirkulerer i perfusions slangen ved hjælp af en injektions port. Den endelige koncentration af histamin i strømnings mediet vil være 1 mM. Hvis der ikke er nogen injektions port til rådighed, kan histamin tilsættes alternativt ved pipettering i mediet af pumpe reservoirer.
  2. For immunofluorescens detektion af multi-strengede VWF-strenge, stop flowet, når der opnås et balanceret medium niveau i reservoirer, og Injicer 20 μg et VWF-specifikt FITC-konjugeret antistof i et volumen på 200 μL PBS (pH 7,4) i den cirkulerende 13,6 mL ECGMS-medium ved hjælp af en injektions port. Hvis der ikke er nogen injektions port til rådighed, kan antistoffet tilsættes alternativt ved pipettering i mediet af pumpe reservoirer. Dette resulterer i en endelig antistofkoncentration på 1,3 μg/mL.
  3. For mikroskopisk scanning af flere synsfelter på kort tid, bruge mikroskop fluorescens enhed med en xenon fluorescens enhed ved 30% magt og et epifluorescens kamera. Overvåg HUVEC-lagets form og morfologi med den lyse felt tilstand for at vælge repræsentative celler, som egner sig til visualiseringen af VWF-strengene.
  4. For visualisering af grønne fluorescerende VWF-strenge skal du vælge en 63x/1.40-olie målsætning og et 470 nm-detekterings filter i menuen fluorescens enhed i mikroskop softwaren (LasX). Opret snapshots af Z-stakke af mindst 50 repræsentative felt visninger, der hver indeholder ca. 10 morfologisk intakt HUVEC. Til kvantificering af de grønne fluorescerende VWF-strenge på forskellige tidspunkter, Scan flere synsfelter.

5. mikroskopisk vurdering af bakteriel fastgørelse til VWF-strenge i flow i realtid

  1. Kvantificere pneumokok fastgørelse til VWF-strengene genereret på HUVEC-cellernes overflader via immunofluorescens detektering.
    1. Hold flowet og Injicer 1,35 x 108 CFU/ml RFP-ekspektionering af pneumokokker i en maksimal volumen på 1 ml i ECGMS-mediet ved hjælp af injektionsporten. Alternativt kan du pipettere bakterierne i mediet i pumpe beholderen. Genstart forskydnings belastningen ved 10 dyn/cm2 for at lade bakterierne cirkulere i pumpesystemet.
    2. Vælg en 63x olie nedsænknings målsætning for mikroskop forstørrelse, og justér indstillingerne for fluorescens filter i mikroskop softwaren til RFP-kanalen (540 nm Detection filter) til påvisning af RFP-ekspression af pneumokokker.
    3. For kvantificering af bakteriel fastgørelse til VWF strengene, stoppe strømmen og skabe snapshots af Z-stakke af mindst 30 repræsentative felt visninger, hver indeholder ca. 10 morfologisk intakt HUVEC, og tælle mængden af pneumokokker.
    4. Brug ANOVA en-faktoriel statistik algoritme til at evaluere data, efterfulgt af en post hoc to-sidet uparret prøve test for detaljeret statistisk sammenligning. P-værdier på < 0,05 blev anset for at være statistisk signifikante.

6. mikroskopisk vurdering af bakteriel fastgørelse til VWF-strenge efterprøve fiksering

  1. Prøve fiksering forud for immunofluorescens farvning.
    1. Stop flowet, Fjern 10 mL ECGMS-medium fra pumpe reservoirer, og tilsæt 10 mL PBS suppleret med 5% PARAFORMALDEHYD (PFA). Lad PFA-opløsningen cirkulere i 10 minutter ved en forskydningsbelastning på 10 dyn/cm2.
    2. Frakobl kanal sliden fra pumpeenheden.
  2. Bloker uspecifikke bindingssteder på cellens overflade, og Udfør immunodetektion af VWF-strenge og tilknyttede bakterier.
    1. Der forberedes 4 mL vaskeopløsning indeholdende 100 mM na2co3 (pH 9,2) suppleret med 4% saccharose til alle vaske trin. 1 mL af en blokerende opløsning, der indeholder 100 mM na2co3 (pH 9,2), suppleres med 4% saccharose og 2% bovint serumalbumin (BSA) til blokering af uspecifikke bindingssteder.
    2. Den PFA-inkuberet kanal slide 3x vaskes ved hjælp af en 1 mL luer-sprøjte til injektion af 200 μL af Vaskeopløsningen, og der inkubateres i 120 min ved RT med 200 μL blokerende opløsning.
    3. Der fremstilles 4 mL af en anden blokerende opløsning indeholdende 100 mM na2co3, (pH 9,2) suppleret med 4% saccharose og 0,5% BSA til fortynding af antistofferne. Brug 200 μL af denne blokerende opløsning til at fortynde den pneumococcus-specifikke kanin-antiserum 1:100. Brug 200 μL af denne blokerende opløsning til at fortynde det VWF-specifikke museantistof 1:50 for at lave en VWF-specifik antistofkoncentration på 4 μg/mL. Det AlexaFluor488-konjugeret sekundære antistof fortyndes fra en 2 mg/mL stamopløsning 1:100 i 200 μL PBS (pH 7,4) for at generere en endelig koncentration på 20 μg/mL.
      Bemærk: I de beskrevne immunofluorescens-indstillinger leverede antistof detektionsresultaterne optimale resultater, når antistofferne blev fortyndet i den ovennævnte alkaliske karbonat buffer. Baseret på tidligere resultater, de anbefalede blokerende løsninger og mængden af antistoffer er egnet til mange applikationer. Men, forskellige eksperimenter kan kræve individuel optimering af antistof kombination, antistof koncentration, inkubationstid, og forfatning af blokerende buffer. Alternativt kan et phosphatbufferet system med et neutralt pH-interval være egnet eller endda foretrukket som en inkubations buffer. I tilfælde af svage fluorescens signaler bør koncentrationen af sekundært antistof øges. Hvis der påvises for meget uspecifik fluorescens baggrundsstøj, bør mængden af blokerende stoffer øges.
    4. For VWF-immunofluorescens farvning vaskes kanal sliden ved hjælp af en 1 mL luer-sprøjte ved at injicere 200 μL af Vaskeopløsningen 3x og Inkuber diaset med det fortyndede VWF-specifikke antistof (1:50) i 30 min ved RT. bagefter vaskes kanal diaset igen 3x med 200 μL af Vaskeopløsningen og inkubere diaset med 1:100 fortyndet AlexaFluor488-konjugeret muse specifikt antistof i 30 minutter ved RT. Endelig vaskes kanalen dias igen 3x med 200 μL af Vaskeopløsningen.
      Bemærk: AlexaFluor-fluorophorerne er følsomme over for blegning. Derfor skal diaset beskyttes ved at holde det i et mørkt kammer under inkubations trinene med fluorophore-konjugeret antistoffer.
    5. Til immunodetektion af pneumokokker, inkubatér diaset med et 1:100 fortyndet pneumococcus-specifikt kanin-antistof i 30 min ved RT. bagefter vaskes kanal sliden 3x med 200 μL Vaskeopløsningen og Inkuber diaset med 1:100 fortyndet AlexaFluor568-konjugeret kanin-specifikt antistof i 30 min ved RT. vask kanal sliden igen 3x med 200 μL af Vaskeopløsningen.
    6. For at plette cellulært actin cytoskelet med fluorescerende phalloidin, permeabilize HUVEC ved inkubation med 120 μL af 0,1% Triton X-100 i 5 min ved RT. vask kanal sliden 3x med 200 μL af Vaskeopløsningen og Inkuber diaset med 120 μL 1:1000 fortyndet AlexaFluor350-konjugeret phalloidin. Dette inkubations trin vil visualisere det polymeriserede actin cytoskelet og tillade overvågning af celle formen og mulige stress-induceret morfologiske ændringer.
    7. Vask kanal sliden 3x med 200 μL af Vaskeopløsningen. Endelig vaskes diaset 4X med 200 μL ddH2O og Visualiser de grønne fluorescerende vWF-strenge, de røde fluorescerende bakterier og det blå fluorescerende actin cytoskelet ved hjælp af de relevante filterindstillinger på fluorescens mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dyrkning primær HUVEC i en konstant ensrettede flow resulterer i dannelsen af en flydende og stramt pakket cellelag, der fremmer generering af cellulære wpbs fyldt med den mekanisosensitive vWF13,14. Denne protokol beskriver brugen af et lufttryk pumpe-baseret, Pulseless recirkulation system til infektion analyse, der kræver efterligne forskydnings stresssituation i den menneskelige blodgennemstrømning.

Dette system muliggør en defineret, softwarestyret indstilling af strømningsforhold. Strømnings skemaet i figur 1 illustrerer hoved arbejdsgangen, begyndende med fordyrkning af primære endotelceller (figur 1, inset 1) og fordyrkning af pneumokokker (figur 1, inset 2). Det anvendte mikrofluidisk-system (figur 1, inset 3) består af et særligt kanal-dias, der er forbundet via en luer-adapter til perfusions slanger med to mellemstore reservoirer. Perfusions slangesættet placeres på en Fluidic-enhed, der fungerer som stativ og anvender perfusions rørene som et ventilsystem. Til strømnings dyrkning anbringes Fluidic-enheden med det mellem fyldte perfusions sæt og det tilsluttede kanalrutschebane i en CO2 -inkubator (figur 1, inset 3). Fluidic-enheden er forbundet med en lufttryk pumpe via luftslange. Luften i slangen skal passere gennem en tørre flaske, der indeholder silica perler til fjernelse af fugt fra perfusions reservoirer, før luften pumpes ind i pumpesystemet (figur 1, inset 3). Lufttryk pumpen styres af computer software (PumpControl v 1.5.0), der gør det muligt at fastsætte en kontinuerlig, defineret strømningshastighed afhængigt af diameteren af kanal diaset, længden og diameteren af perfusions slangesættet og viskositeten af anvendte medium (figur 1, inset 3). Udskillelsen af VWF ved WPB exocytose af confluently dyrket HUVEC induceres af histamin-stimulation8 , der påføres mellem cirkulationen i perfusions slangen ved hjælp af en injektions port (figur 1, inset 4). Ved et minimum forskydningsbelastning på 10 dyn/cm2, de frigivne vWF proteiner multimerize og danner lange protein strenge nå længder på mere end 100 μm (figur 1, inset 4, 5, 6 og figur 2a). Disse protein strenge er mikroskopisk detekteret og visualiseret efter injektion af fluorescein isothiocyanat (FITC)-konjugeret VWF-specifikke antistoffer i mediet. De cirkulerende antistoffer aktiverer immunofluorescens detektion af cellens overflade-bundne VWF-strenge i realtid (figur 1, inset 5)8.

Den etablerede microfluidic-baserede cellekultur infektion tilgang ved hjælp af primære endotelceller efterligner situationen for en lokalt betaget vaskulatur ved infiltration af blodcirkulationen af bakterielle patogener såsom Streptococcus pneumoniae. Eksempler på visualisering og kvantitativ analyse af bakteriel interaktion med differentierede vaskulære celler under forskydnings stress ved hjælp af mikrofluidisk endotel celledyrkning vises (figur 1, indsættene 5, 6). De RFP-udtrykte pneumokokker blev injiceret i flowet, og efter 30 minutters cirkulation blev de første tegn på bakteriel tilknytning til VWF-strenge af histamin stimulerede HUVEC mikroskopisk påvist (figur 1, indsættene 5, 6 og figur 2a, B hvide pile)8. Brugen af RFP-udtrykkelige pneumokokker gjorde det muligt at kvantificere bakteriel tilknytning til VWF-strengene på endotelcellerne uden krav om påvisning af bakterie antistof.

Histogram overlay plots af fluorescens intensiteter blev genereret ved hjælp af evalueringssoftware leveret af Leica (dvs., LasX) til at visualisere samlokaliseringen af RFP-ekspression pneumokokker med VWF strenge detekteret med grønne fluorescerende antistoffer. Dette gjorde det muligt at analysere sandsynligheden for samlokalisering i bestemte områder af interesse (ROI) inden for fluorescens billedet. Brug af histogrammet overlays af bakterielle signaler i kombination med fluorescens signaler fra vWF, overlappende fluorescens toppe for begge kunne visualiseres og dermed bekræftet pneumokokker fastgørelse til vWF strengene. Den bakterielle fastgørelse modstår den kontinuerligt anvendte forskydningsbelastning i mindst 25 min (figur 2b)8.

I alt, den kontinuerlige flow dyrkning af primær HUVEC aktiveret VWF sekretion og generation af lange VWF protein strenge, der tjener som vedhæftnings steder for cirkulerende bakterier8.

Figure 1
Figur 1: workflow for analyser af bakteriel fastgørelse til vWF strenge ved hjælp af mikrofluidisk endotel celledyrkning. Workflow af de vigtigste eksperimentelle trin begyndende med fordyrkning af primære endotelceller til subconfluency i cellekultur kolber. Før celledyrkning i flowet, er cellerne seedet i en gelatine-belagt kanal slide (inset 1). Bakterier dyrkes på agarplader efterfulgt af dyrkning i en kompleks væske medium til mid-log fase (inset 2). For mikrofluidic cellekultur er en kanal slide med endotelceller forbundet med perfusions rørene af en Fluidic enhed af pumpesystemet og udsat for konstant flow for Celledifferentiering (inset 3). Genereringen af VWF-strengene (grøn pil) blev induceret af histamin injektion ved en forskydningsbelastning på 10 dyn/cm2 og mikroskopisk overvåget ved immunofluorescens detektion ved hjælp af FITC-mærkede vWF-specifikke antistoffer (inset 4). Efter injektion af RFP-ekspression af bakterier til det cirkulerende medium blev pneumokokker fastgørelse (rød pil) til vWF-strengene mikroskopisk visualiseret i realtid ved fluorescens emission ved 450 Nm (inset 5). Efter fiksering af cellerne ved hjælp af PFA, differentialimmunofluorescens farvning giver visualisering af bakteriel fastgørelse på specifikke infektion tidspunkter (inset 6). De billeder af pumpesystemet og HUVEC-cellelag, der er beskrevet i trin 1, 3, og billedet af Indsprøjtnings porten (inset 4) er inkluderet. De immunofluorescens billeder, der er vist i insets 4 og 5 , er blevet modificeret og anvendt med tilladelse fra jagau et al.8. Længden af skala bjælkerne er indikeret nederst til højre.

Figure 2
Figur 2: repræsentative immunofluorescens billeder af pneumokokker binding til vWF strengene genereret i kontinuerlig flow på overfladen af histamin-stimuleret HUVEC. (A) genereringen af vWF-strengene blev mikroskopisk kvantificeret efter at have udsat den konflydende dyrkede HUVEC til forskydning af stress ved hjælp af et mikrofluidisk pumpesystem ved 10 dyn/cm2. FITC-konjugeret VWF-specifikke antistoffer detekterede VWF-strengene. Hvide pile peger på RFP-udtrykker pneumokokker med rød fluorescens knyttet til lange VWF strenge. (B) bakteriel fastgørelse til den grønne fluorescerende vWF strenge blev mikroskopisk observeret for op til 2 h i konstant flow (hvide pile) og blev bekræftet af software-baseret evaluering af fluorescens intensiteter af en defineret Roi. Realtidsbilleder blev taget med fluorescens udstyr af et confokal laser scannings mikroskop (SP8, Leica). Skala stænger = 10 μm. Dette tal er blevet ændret og brugt med tilladelse fra Jagau et al.8.

Supplerende figur 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Simuleringen af bakteriel interaktion med mekanisnofølsomme værts proteiner som VWF kræver et perfbrugbart cellekultursystem, der muliggør generering af en defineret, ensrettet og kontinuerlig strøm af væsker, hvilket skaber pålidelig forskydningsbelastning . Flere mikrofluidisk pumpesystemer er allerede blevet beskrevet. En omfattende anmeldelse fra Bergmann et al. opsummerer de vigtigste aspekter af forskellige to-og tre-dimensionelle cellekultur modeller17.

Den mikrofluidisk teknologi er en meget ung teknik startede i begyndelsen af 1990 ' erne med udviklingen af kontrollerbare, reproducerbare, og perfable mikromiljøer i en mikrometer og selv i en nanometer skala18. Den præsenterede mikrofluidisk tilgang kan også anvendes til at studere den brede vifte af bakterielle vedhæftnings mekanismer og involverede proteiner. Det er bedst egnet til enhver interaktion, der involverer mekaniselleresponsive vedhæftnings komponenter såsom VWF, som generelt ikke er tilgængelig ved hjælp af standard cellekultur teknikker. For eksempel er det kendt, at konstellationen af flere ekstracellulære matrix proteiner varierer afhængigt af deres placering. I blodsystemet cirkulerer glykoproteiner som fibronektin i en kugleformet konstellation, hvorimod proteinerne i den ekstracellulære matrix fremstår som multiconnected di-og multimeriseret stilladser19,20. Desuden tilbyder flere distributører af mikrofluidisk udstyr standardiserede kanal slides forbelagt med forskellige typer kollagen (f. eks. subendotel kollagener eller andre plasmaafledte proteiner). Disse kanal slides er velegnede til visualisering og kvantitative analyser af bakteriel vedhæftning til specifikke ekstracellulære matrix proteiner i forskellige flow situationer.

Forskellige mikrofluidisk-systemer kan kategoriseres ud fra de forskellige materialer, der anvendes til mikroenheds produktion. I denne forbindelse adskiller de glas/silikone-baserede platforme sig fra de polymer baserede og de papirbaserede platforme21. Polymer-baserede kanal slides er produceret med en elastisk understøttet overflade (ESS), kræver generelt en overfladebelægning til celle fastgørelse under flow eksperimenter. Som et alternativ til en belægning med vedhæftnings bærende komponenter som kollagen, er overfladen af nogle kommercielt tilgængelige kanal slides fysisk modificeret, hvilket skaber en hydrofile og klæbende overflade, der passer til de fleste celletyper. Desuden er nogle kanal slides genereret ved hjælp af substrater som Polydimethylsiloxan (PDMS), som er ilt-permeable og også gør det muligt for kulturen i blodkar celler på den indvendige overflade af mikrokanaler i Fluidic pumpesystemer22, 23.

Det mikrofluidisk system, der blev anvendt i disse undersøgelser tjente som et effektivt og pålideligt system, der blev anvendt til analysen samspillet mellem Staphylococcus aureus med multimeriserede vWF fibre efter kultur af humane endotelceller i flow 24,25. Dette mikrofluidic system var et lukket cirkulært perfusions system, der gjorde det muligt at analysere infektion med sygdomsfremkaldende bakterier under biosikkerhed 2 betingelser. Desuden var kanalen slides egnet til mikroskopisk overvågning under flow og er tilgængelige med forskellige præbelægninger (f. eks gelatine, poly-L-lysin, eller kollagen-IV), der sikrer celle vedhæftning og en høj grad af eksperimentel reproducerbarhed. Denne protokol anvender et mikrofluidic-system (Se tabel over materialer) til etablering af en perfbrugbar infektions model for S. pneumoniae og derved efterligner strømnings situationen i det humane vaskulære system8.

Den beskrevne generelle procedure for bakteriel celle fastgørelse i dette mikrofluidisk system kan også udføres med andre typer af pumpesystemer, der genererer et defineret og kontinuerligt flow i et sterilt miljø. Til mikrofluidiske formål anvendes hovedsagelig fire typer flow kontrolsystemer: i) peristaltiske pumper og recirkulations pumper, som anvendes i denne protokol, II) sprøjtepumper, III) trykregulatorer og IV) trykregulatorer med flow switch matricer. Hver form for flow kontrolsystem har fordele og ulemper afhængigt af den specifikke mikrofluidisk applikation og evnen til at udføre mikroskopisk visualisering i realtid. I de fleste anvendelser, der kræver kontinuerlig cirkulation af prøverne, kombineres recirkulations pumper med softwarebaserede trykregulatorer for at sikre en defineret strømnings situation. Dette er også optimeret i pumpesystemet demonstreret her. De sprøjte baserede pumpesystemer kan opdeles i "klassiske" sprøjtepumper, som genererer flow svingning og "Pulseless" mikrofluidisk sprøjtepumper. Disse sprøjtepumpe baserede systemer er generelt nemme at bruge, men flow kontrol i blindgyde kanaler er udfordrende ved hjælp af sprøjtepumper. Desuden kan flow ændringer inde i chippen tage lidt tid, og en flowmåler er nødvendig for at bestemme strømningshastigheden. Selv Pulseless sprøjtepumper kan generere periodisk pulsering på strømningshastigheden på grund af sprøjte pumpens trin-for-trinmotor. En anden to sprøjtepumpe anordning er i stand til at generere en "indgyde og trække"-baseret Fluidic bevægelse, der anvender definerede forskydningskræfter på celle overflader og er egnet til mikrodialyse applikationer selv i en PC-uafhængig måde. Dette system skal kombineres med mikroslanger til tilslutning af kamre eller kanal rutsjebaner til celledyrkning efterfulgt af mikroskopiske analyser.

De ovennævnte trykregulatorer er strømnings kontrolsystemer, der under trykbeholderen med prøven, som injiceres jævnt i et mikrofluidisk kammer eller på en chip. Tryk regulatorerne kan etablere en Pulseless flow og også give strømningshastigheder i kombination med flowmålere. En kombination af trykregulatorer med flow switch matricer muliggør en hurtig flow switch uden tilbagestrømning. Det recirkulerende system præsenteret her aktiveret generering af shear stress værdier typisk rapporteret for det menneskelige vaskulære system26. In vivo vaskulære vægforskydnings stress er blevet anslået fra vægforskydnings hastigheder som afledt af ikke-invasivt indspillede hastigheds profiler, og fuldblod viskositet i store arterier og plasma viskositet i arterioler26. Reneman og Hoeks indspillet hastigheds profiler i store arterier ved hjælp af en specielt designet ultralyd system og i arterioler via optiske teknikker ved hjælp af fluorescerende flowhastighed røbestoffer26. En gennemsnitlig forskydningsbelastning på 11-13 dyn/cm2 nås i halspulsåren i modsætning til kun 4-5 dyn/cm2 i brachialis arterien. Spidsværdier på op til 25-70 dyn/cm2 er blevet overvåget for halspulsåren. Forskydnings stress værdier af små og midterste vener spænder mellem 0,1 og 0,5 dyn/cm2. I det mikrofluidisk-system, der er beskrevet her, afhænger den gældende forskydnings stress værdi af den valgte perfusions slange diameter, højden af kanal diaset og viskositeten af det anvendte Fluidic-medium. Den valgte Fluidic-indstilling bestod af et dias med 0,4 cm i højden (volumen på 100 μl) i kombination med et perfusions sæt på 50 cm i længden og 1,6 mm i diameter, og medium viskositet var 0,0072 [dyn · s]/cm2. Denne indstilling er velegnet til et forskydnings spændingsområde mellem 3,5 og 31,2 dyn/cm2 ved strømningshastigheder på 3,8 − 33.9 ml/min. Desuden kan tryk pumpen software kontrol anvende en pulserende medium flow, der kan efterligne en pulserende arteriel blodgennemstrømning.

Den vellykkede, pålidelige og reproducerbare brug af denne kombinerede mikrofluidisk infektion metode kræver nogle forholdsregler, der skal holdes i tankerne. Under infektionsprocessen under mikrofluidiske forhold kan cellelaget blive udsat for cytotoksiske eller cytolytiske bakterie forbindelser såsom pneumolysin, som påvirker eukaryote cellernes levedygtighed og svækker cellens overholdelse af slide overfladen. Derfor er det nødvendigt at holde en konstant strøm gennem hele eksperimentet, og celle morfologien skal kontrolleres hyppigt. Desuden bør flow kulturmediet give alle essentielle næringsstoffer til endotelcellerne for at sikre en stram overflade fastgørelse af cellerne i hele infektions forsøget. Ikke desto mindre skal det bemærkes, at medium kosttilskud indeholder stoffer, der kan forstyrre eller hæmme samspillet mellem bakterier og specifikke Host proteiner. I studier af pneumococcus-VWF interaktion for eksempel skal heparin være opbrugt fra cellekultur mediet, fordi det hæmmer binding af pneumokokker til VWF8.

Et andet kritisk skridt i flow kulturen i endotelceller er opretholdelsen af stram celle vedhæftning, som afhænger af den samlede celle vitalitet og af differentierings niveauet. Shear flow-resistent celle adhæsion af primære endotelceller blev kun opnået, når cellerne blev strengt holdt i subconfluency før eksponering for forskydnings stress. På den anden side, produktionen af WPB direkte afhænger af sammenløbet af endotelcellelag fremme stram celle-celle-kontakter13. Fordelen ved den mikrofluidiske cellekultur af primære endotelceller dækker den stærkt inducerede celle spredning, der hurtigt fører til dannelsen af et flydende cellelag under strømningsforhold. Cellerne er tæt knyttet til hinanden, er kollektivt orienteret i retning af flow, og repræsenterer en meget differentieret fænotype, der er forpligtet til at producere sekretoriske WPB. Disse WPB fungerer som opbevarings vesikler for vWF, vasodilatations aktivatorer og cytokiner, der er exocytoseret som protein brister ved histamin stimulation eller pneumolysin aktivitet27,13. Derfor er dannelsen af et meget klæbemiddel, flydende cellelag af differentierede primære endotelceller i lavsprednings passager en uundværlig forudsætning for effektiv vWF frigivelse og dannelsen af vWF strenge på cellens overflade og analyser af bakterier-VWF-interaktion i strømningsforhold. Det skal således bemærkes, at differentieringen af endotelcellerne tog 48 h af flow dyrkning på et minimum og krævede en konstant forskydnings strøm uden variationer i Pumpetrykket. Eventuelle variationer kan føre til en pludselig medium blast, som ville skylle cellerne ud af diaset. Under mikroskopisk visualisering skulle mikrofluidic-diaset og pumpesystemets medium reservoirer desuden opbevares ved en temperatur på 37 °C, da dette repræsenterer den optimale temperatur for humane celler.

Immortalized humane cellelinjer er velegnede til mange videnskabelige eksperimenter og er ofte ansat i cellekultur infektion undersøgelser. Disse cellelinjer deler nogle generelle tekniske fordele, såsom lav eller moderat kultur krav og ubegrænset spredning, som muliggør passaging flere hundrede gange uden væsentlige ændringer i morfologi eller receptor profiler. Men disse cellelinjer repræsenterer en ensom monokultur og er underkastet kunstige to-dimensionelle vækstbetingelser. 28 den manglende fysiologiske kilde vævs miljø resulterer i betydelige ændringer af funktionelle og morfologiske celle fænotype med hver passage af kulturen29. Forud for andre bakterielle vedhæftnings eksperimenter blev profilen af overflade eksponerede celletype specifikke markør proteiner og receptorer af humane primære lunge endotelceller ved forskellige cellekultur passager fastlagt. Flowcytometri-analysen afslørede et stærkt reduceret ekspression af specifikke overflade proteiner såsom trombocytendotelcellens adhæsions molekyle 1 (PECAM1) inden for otte runder af celle passaging. Desuden, den udtrykte anti receptor profil blev væsentligt ændret i højere celle passager til fordel for en celletype-uspecifik anti receptor mønster og en reduceret celletype-specifikke anti receptor mønster (Bergmann et al., ikke-offentliggjorte data). Disse resultater er særligt relevante for analyser af patogenens interaktioner i infektionsbiologi studier. Med henblik på at opretholde de fænotypiske celle karakteristika og en høj grad af funktionel differentiering under mikrofluidisk cellekultur på tidspunktet for bakteriel infektion blev primære endotelceller fra flere donorer valgt i dette tilfælde og blev kun anvendt op til fem passager på maksimum for at holde de fænotypiske egenskaber så specifikke som muligt8.

Den kombinerede visualisering af bakterier og specifikke celleoverflade strukturer under flow kræver en optimeret fluorescens farvnings protokol. Ved hjælp af forskellige kombinationer af direkte mærkede proteiner, fluorescens protein-ekspanderende bakterier og fluorescens konjugerede antistoffer kan immunofluorescens farvnings procedurer tilpasses specifikt til visualiserings målene. Disse procedurer muliggør en defineret og klar mikroskopisk visualisering og også en differentiering og kvantificering af bakteriel overholdelse og internalisering3,13,30,31. Immunofluorescens-baseret påvisning af internaliserede bakterier kræver en celle permeabilization trin såsom en kort Triton X-100 inkubation, hvilket kan føre til celle løsrivelse. Derfor bør påvisning af bakterielle internaliserings processer, der forekommer i en flow kultur, visualiseres efter flow inkubation ved hjælp af PFA-crosslinked prøver. For realtids visualisering af bakterier i flow muliggør brugen af genetisk modificerede bakterier, der udtrykker fluorescens proteiner, en hurtig og målrettet mikroskopisk detektion. RFP-udtrykte pneumokokker stammer, der blev genereret ved hjælp af en effektiv genetisk konstruktion designet af kjos og veening16,8 blev anvendt i denne eksperimentelle undersøgelse. Til påvisning af VWF-strenge i flow blev forskellige VWF-specifikke fluorescein-mærkede antistoffer testet og kunne anvendes. For at opnå et optimalt signal respons ved en minimeret uspecifik baggrund blev den passende antistofkoncentration konsekvent titreret for hvert anvendt antistof.

For mikroskopisk Live Cell-billeddannelse fjernes Fluidic-enheden og kanal sliden fra CO2 -inkubatoren og anbringes i et kammer, der er forvarmet til 37 °c ved mikroskopet. Dette kammer kunne ikke justeres til 5% CO2. Uden en karbonat-Buffered atmosfære forblev HUVEC morfologi og bakteriel kondition intakt i op til 180 min., hvilket er nok til analyse af VWF-medieret bakteriel vedhæftning. Hvis der er behov for længere infektions tider og mikroskopisk monitorering uden for en CO2 -inkubator, bør der anvendes et celle dyrkningsmedium med buffer for at kompensere for ph-forskydninger på grund af utilstrækkelig Co2 -koncentration. Alternativt kan hele systemet placeres tilbage i CO2 inkubator i mellem trinene i en tidsserie af mikroskopisk visualisering.

Ud over fluorescens detektering i realtid kan den bakterielle infektion i endotelet i kanal sliden stoppes og bevares ved medium udveksling med PARAFORMALDEHYD (PFA) som fikserings stof. Efter fiksering i flowet muliggør den optimerede og trinvise immunofluorescens farvning af celleoverfladen i kanal diaset generering af værdifulde mikroskopiske snapshot visualiseringer og giver en alsidig kombineret struktur detektering af specifikke cellulære forbindelser involveret i samspillet mellem bakterier og værtsceller. Den videnskabelige fordel ved denne kombinerede metode er, at den PFA-behandlede kanal slide kan lagres og anvendes til en post-flow immunofluorescens farvning af de strukturer af interesse. PFA behandling inaktiverer bakterierne og dermed arresterer ekspression af RFP-protein. Derfor blev en pneumococcus-specifik antiserum genereret i kanin for bakteriel immun påvisning og visualisering blev udført ved hjælp af en kanin-specifikke AlexaFluor568-konjugeret sekundært antistof8. Som allerede nævnt kræver brugen af forskellige antistof kombinationer en nøjagtig optimering af antistofmængder og blokerende buffer sammensætning. Ellers kan uspecifikke baggrunds signaler og kryds detekterings effekter føre til kunstige farvnings resultater. En optimeret immunfluorescens farvning procedure kan nemt bruges til påvisning af mange forskellige cellulære mål såsom actin cytoskelet eller endosomale markører13,31.

Denne procedure kan tilpasses til at skabe et mere komplekst vævs miljø, der efterligner fysiologi fra en Histologisk, fysiologisk og funktionel synspunkt. De præsenterede infektion analyser kan effektivt bruges til at besvare flere videnskabelige spørgsmål på samme tid ved hjælp af en i kø-forbindelse af flere kanal slides til en perfusion sæt. Denne udvidede opsætning ville lette analyserne af forskellige celletyper, celle sammenløb og forskellige slide belægninger inden for samme flow indstilling parallelt og tillade en direkte sammenligning af bakterielle infektioner i forskellige celletyper. Desuden giver den serielle i line forbindelse og kombinerede analyser af flere kanal slides også mulighed for tidsserie eksperimenter, som kan anvendes til genekspressions profilering (f. eks. analyse af infektions tidsafhængig virulens faktor genekspression).

Infektionen analyser kan også udvides til en konstant laminar flow tilstand varig flere dage eller endda uger for at analysere cellulære respons i forhold efterligne en langsigtet kronisk infektion fase. Ud over den præsenterede enkelt celletype kultur, nogle eksempler på eller cellekultur i mikrofluidisk cellekultur enheder er allerede blevet rapporteret32,33. Dette giver mulighed for farmakologiske undersøgelser med høj gennemstrømning og kan i sidste ende resultere i anvendelse af mikrofluidiske celle dyrkningssystemer til regenerativ formål samt34.

Sammenfattende fungerede det mikrofluidisk system i kombination med immun farvning procedurer som en værdifuld model for analysen af pathomekanismer mellem bakterier og værtsceller i et miljø, der simulerer betingelserne i det vaskulære system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Projektet blev finansieret af DFG (BE 4570/4-1) til S.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-syringe Fisher Scientific 10303002 with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe Sarstedt 9077136 For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase eBioscience now thermo fisher 00-4555-56 protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin Abcam ab176751 no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody Thermo Fisher Sientific A11001 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody Thermo Fisher Scientific A-11011 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth Becton Dickinson GmbH BD 249210 complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-25G solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter TPP 90026 subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R Beckman Coulter Life Sciences 392304 spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30 Beckman Coulter Life Sciences B06314 spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK Hermle 305.00 V05 - Z 216 M spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3886.2 used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing ibidi 10821 for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator Fisher Scientific MIDI 40 incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-Incubator Sanyo MCO-18 AIC for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar plates Becton Dickinson GmbH PA-254005.06 agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer Dell Latitude 3440 Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) Leica DMi8 An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3904.1 used for PBS buffer
Drying material Merck 101969 orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix Promocell C-39215 supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMS Promocell C-22010 ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) Promocell C-22010 culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS) biochrome now Merck S 0415 supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody Abcam ab8822 stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit ibidi 10903 fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G-1890-100g for precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochloride Sigma Aldrich H-7250-10MG for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) Promocell C-12203 Lot-Nr. 396Z042 primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) Santa Cruz sc73268 stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port ibidi 10820 for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope Zeiss Axiovert 35M inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) ibidi 80176 physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) Sigma Aldrich M7506-500G For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump ibidi 10905 air pressure pump
Neubauer cell counting chamber Karl Hecht GmbH&Co KG 40442002 microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710-S for cross linking of samples
Perfusion Set ibidi 10964 Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS) the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes Sarstedt 67,741 (2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum Pineda raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 6781.1 used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) ibidi v1.5.4 Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mL Sarstedt 72.706/ 72.695.500 required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volume Sarstedt 6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci National Collection of Type Cultures, Public Health England 10,319 Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mL Sarstedt 86.1253.025/ 86.1254.025 for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) Sigma Aldrich 451614-25G for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe P030.2 used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22 Biochrom 80-2115-20 measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose Sigma Aldrich S0389-500G for preparation of blocking buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-500ML Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract oxoid LP0021 bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
  29. Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218 (1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

Tags

Immunologi og infektion Streptococcus pneumoniae microfluidic endotelceller mikroskopi fluorescens forskydnings stress overholdelse
Pneumococcus infektion af primære humane endotelceller i konstant flow
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jagau, H., Behrens, I. K., Steinert, … More

Jagau, H., Behrens, I. K., Steinert, M., Bergmann, S. Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow. J. Vis. Exp. (152), e60323, doi:10.3791/60323 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter