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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60323
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

Summary

Diese Studie beschreibt die mikroskopische Überwachung der Pneumokokken-Bindung an von Willebrand-Faktor-Strings, die auf der Oberfläche differenzierter menschlicher Primärendothelzellen unter Scherspannung unter definierten Strömungsbedingungen hergestellt werden. Dieses Protokoll kann auf eine detaillierte Visualisierung spezifischer Zellstrukturen und die Quantifizierung von Bakterien durch die Anwendung von Differential-Immunostaining-Verfahren erweitert werden.

Abstract

Die Wechselwirkung von Streptococcus pneumoniae mit der Oberfläche von Endothelzellen wird im Blutfluss über mechanosensitive Proteine wie den Von Willebrand Factor (VWF) vermittelt. Dieses Glykoprotein verändert seine molekulare Konformation als Reaktion auf Scherspannung und setzt so Bindungsstellen für ein breites Spektrum von Wirts-Ligand-Wechselwirkungen frei. Im Allgemeinen ist die Kultivierung von primären Endothelzellen unter einem definierten Scherfluss dafür bekannt, die spezifische zelluläre Differenzierung und die Bildung einer stabilen und eng verbundenen Endothelschicht zu fördern, die der Physiologie der inneren Auskleidung eines Blutgefäßes ähnelt. . Daher erfordert die funktionelle Analyse von Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Krankheitserregern und der Wirtsvaskulatur mit mechanosensitiven Proteinen die Etablierung von Pumpensystemen, die die physiologischen Strömungskräfte simulieren können, von denen bekannt ist, dass sie die Oberfläche Gefäßzellen.

Das in dieser Studie verwendete mikrofluidische Gerät ermöglicht eine kontinuierliche und pulslose Rückführung von Flüssigkeiten mit einer definierten Durchflussrate. Das computergesteuerte Luftdruckpumpensystem wendet eine definierte Scherspannung auf endotheliale Zelloberflächen an, indem es einen kontinuierlichen, unidirektionalen und kontrollierten mittleren Durchfluss erzeugt. Morphologische Veränderungen der Zellen und bakterielle Anhaftung können im Fluss mikroskopisch überwacht und quantifiziert werden, indem spezielle Kanalschlitten verwendet werden, die für die mikroskopische Visualisierung entwickelt wurden. Im Gegensatz zur statischen Zellkulturinfektion, die im Allgemeinen eine Probenfixierung vor der Immunkennzeichnung und mikroskopischen Analysen erfordert, ermöglichen die mikrofluidischen Dias sowohl den fluoreszenzbasierten Nachweis von Proteinen, Bakterien und zellulären Komponenten. nach der Probenfixierung; serielle Immunfluoreszenzfärbung; und direkte fluoreszenzbasierte Detektion in Echtzeit. In Kombination mit fluoreszierenden Bakterien und spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern bietet dieses Infektionsverfahren ein effizientes Mehrkomponenten-Visualisierungssystem für ein riesiges Spektrum wissenschaftlicher Anwendungen im Zusammenhang mit gefäßbedingten Prozessen.

Introduction

Die Pathogenese von Pneumokokken-Infektionen ist durch eine facettenreiche Wechselwirkung mit einer Vielzahl von extrazellulären Matrixverbindungen und Komponenten der menschlichen Hämostase, wie Plasminogen und VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. Das Multidomain-Glykoprotein VWF dient als Hauptregulator einer ausgewogenen Hämostase durch Vermittlung von Thrombozytenrekrutierung und Fibrin-Inkorporation am Standort der vaskulären Thrombusbildung9. Wie wichtig funktionelles, aktives VWF für die Blutungskontrolle und Wundheilung ist, zeigt die von Willebrand-Krankheit, eine häufige erbliche Blutungsstörung10.

Globular VWF zirkuliert im menschlichen Blutsystem in einer Konzentration von bis zu 14,0 g/ml11,10. Als Reaktion auf Gefäßverletzungen ist die lokale Freisetzung von VWF durch endotheliale Weibel Palade Bodies (WBP) deutlich erhöht11,12. Frühere Studien zeigen, dass die Pneumokokken-Bindung an menschliche Endothelzellen und seine Produktion des porenbildenden Toxins Pneumolysin die luminale VWF-Sekretion signifikant stimuliert13. Die hydrodynamischen Kräfte des Blutflusses induzieren eine strukturelle Öffnung der mechanoreagierenden VWF-Domänen. Bei Durchflussraten von 10 Dyn/cm2 vermehrt sich der VWF zu langen Proteinsaiten von bis zu mehreren hundert Mikrometern Länge, die am Subendothel10,12befestigt bleiben.

Um die Funktion von multimerisierten VWF-Strings zu verstehen, die unter Scherspannung im Zusammenspiel von Pneumokokken mit der endotheliaalen Oberfläche erzeugt werden, wurde ein mikrofluidischer Zellkulturinfektionsansatz etabliert. Es wurde ein mikrofluidisches Gerät mit einem softwaregesteuerten Luftdruckpumpensystem eingesetzt. Dies ermöglichte eine kontinuierliche, unidirektionale Rezirkulation des Zellkulturmediums mit einer definierten Durchflussrate. Dabei wendete das System eine definierte Scherspannung auf die Oberfläche von Endothelzellen an, die in speziellen Kanalschlitten befestigt blieben. Dieser Ansatz ermöglichte die Simulation der Scherkraft innerhalb des Blutstroms des menschlichen Gefäßsystems, bei der VWF-Strings auf differenzierten Endothelzellen unter definierten konstanten Strömungsbedingungen erzeugt werden. Zu diesem Zweck wurden die Endothelzellen in spezifischen Kanalgleitern (siehe Materialtabelle) kultiviert, die für mikroskopische Analysen während des Durchflusses angepasst wurden. Das mikrofluidische Pumpensystem lieferte die hochdefinierte und kontrollierte Scherspannungssituation, die für die Bildung von verlängerten VWF-Strings auf der konfluenten Endothelzellschicht erforderlich ist. Nach der Stimulation der VWF-Sekretion von konfluent gewachsenen menschlichen Nabelvenenenen-Endothelzellen (HUVEC) durch Histamin-Supplementierung wurde die Saitenbildung durch Anwendung einer Scherspannung von 10 Dyn/cm2induziert. Die Scherspannung ist definiert als die Kraft, die auf die Zellschicht einwirkt. Es wird ungefähr nach Cornish et berechnet. 14 mit Gleichung 1:
Equation 1

Wobei die Scherspannung in Dyn/cm2, b = Viskosität in (dyn)/cm2, h = die Hälfte der Kanalhöhe, w = die Hälfte der Kanalbreite und die Durchflussrate in mL/min.

Das Ergebnis von Gleichung 1 hängt von den verschiedenen Höhen und Breiten der verschiedenen verwendeten Folien ab (siehe Materialtabelle). In dieser Studie wurde ein Luer-Kanalschlitten von 0,4 m verwendet, was zu einem Kammerschieberfaktor von 131,6 führte (siehe Formel 2).
Equation 2

Viskosität des Mediums bei 37 °C beträgt 0,0072 Dyn/cm2 und es wurde eine Scherspannung von 10 Dyn/cm2 verwendet. Dies führte zu einem Durchfluss von 10,5 ml/min (siehe Formel 3).
Equation 3

Hier wird die Anpassung und Weiterentwicklung eines mikrofluidischen Zellkultivierungsverfahrens mit einem unidirektionalen laminaren Strömungssystem zur Untersuchung und Visualisierung bakterieller Infektionsmechanismen in der Wirtsvaskulatur ausführlich beschrieben. Die Erzeugung von VWF-Strings auf Endothelschichten kann auch durch andere Pumpensysteme angeregt werden, die eine kontinuierliche und stetige Scherspannung15auftragen können.

Nach der Kultivierung von primären Endothelzellen zur Zusammenflussung und Stimulation der VWF-Stringbildung wurden pneumokokken, die rotes Fluoreszenzprotein (RFP)16 exezieren, der Endothelzellschicht unter konstanter mikroskopischer Kontrolle zugesetzt. Die Befestigung von Bakterien an VWF-Saiten an der Oberfläche von Endothelzellen wurde mikroskopisch visualisiert und mit VWF-spezifischen fluoreszierenden Antikörpern bis zu drei Stunden in Echtzeit überwacht. Mit diesem Ansatz wurde die Rolle von VWF als Adhäsionskofaktor zur Förderung der bakteriellen Bindung an das vaskuläre Endothel bestimmt8.

Neben der mikroskopischen Visualisierung von Proteinsekretion und Konformationsveränderungen könnte diese Methode eingesetzt werden, um einzelne Schritte bakterieller Infektionsprozesse in Echtzeit zu überwachen und die Menge der angeschlossenen Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten von ansteckung. Das spezifische softwaregesteuerte Pumpensystem bietet zudem die Möglichkeit, die Endothelzellen in definierten konstanten Strömungsbedingungen bis zu mehreren Tagen zu kultitoren und ermöglicht eine definierte gepulste mittlere Strömungsinkubation. Darüber hinaus kann diese Methode mit verschiedenen Zelltypen angewendet werden. Die Anpassung des Färbeprotokolls ermöglicht auch die Detektion und Visualisierung von Bakterien, die in eukaryotische Zellen verinnerlicht sind.

Dieses Manuskript beschreibt dieses fortschrittliche experimentelle Protokoll, das als definierter, zuverlässiger und reproduzierbarer Ansatz für eine effiziente und vielseitige Charakterisierung pathophysiologischer Prozesse verwendet werden kann.

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Protocol

Die mikrofluidische Zellkultivierung wurde mit kommerziellen primären menschlichen Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVEC) durchgeführt. Das Unternehmen isolierte die Zellen mit informierter Zustimmung des Spenders. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Ärztekammer des Landes Baden-Württemberg mit der Referenznummer 219-04 genehmigt.

HINWEIS: Siehe Tabelle der Materialien für Protokolllieferungen.

1. Präkultivierung der primären Endothelzellen

  1. Eine gefrorene Glyzerin-Durchstechflasche mit 1 x 105 primärer HUVEC von drei verschiedenen Spendern vorsichtig bei 37 °C auftauen und die Zellen in 7 ml vorgewärmten Endothelzellwachstumsmedium (ECGM, gebrauchsfertig mit Nahrungsergänzungsmitteln) in einem 25 cm2-Zellkolben aussäen.
    HINWEIS: Die primären Endothelzellen verlieren nach mehr als 5 Proliferationszyklen ihre Differenzierungsfähigkeit. Daher können nur Zellen mit weniger als 5 Passagen verwendet werden, wenn hohe Zelldifferenzierungsgrade erforderlich sind.
  2. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2-Atmosphäre für 60 min, um die Oberflächenbefestigung zu ermöglichen und das ECGM-Zellkulturmedium auszutauschen, um Rückstände aus der Kryokonservierung loszuwerden.
  3. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2-Atmosphäre, bis sie eine subkonfluente Zellschicht bilden.
    HINWEIS: Der HUVEC darf nicht zu einer konfluenten Schicht heranwachsen, da die engen Zell-Zell-Kontakte die Bildung einer stabilen Zellschicht später im Fluss verhindern.

2. Präkultivierung von Streptococcus pneumoniae

VORSICHT: Streptococcus pneumoniae ist ein Biosicherheitsmittel der Stufe 2 und darf nur in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 kultiviert werden. Verwenden Sie eine saubere Bank für Sicherheitsstufe 2 für alle bakteriellen Behandlungen klassifiziert, streng vermeiden Aerosolbildung, und verwenden Sie eine Zentrifuge mit Aerosolschutz für die Sedimentation von Bakterien.

  1. Impfen Sie eine columbiaische Blut-Agar-Platte mit Streptococcus pneumoniae klinischem Isolat ATCC11733, das aus einem Glyzerinbestand gewonnen wird, der ständig bei -80 °C gelagert wird, und kultivieren Sie die Agarplatte über Nacht bei 37 °C und 5%CO2.
  2. Bereiten Sie 40 ml Todd Hewitt flüssige Brühe mit 1% Hefeextrakt (THY) und 15 ml steriler Phosphat-gepufferter Kochchen (PBS) pH 7.4 für die bakterielle Kultivierung und Waschschritte vor.
  3. Verwenden Sie eine sterile Röhre für die bakterielle Kultivierung und impfen Sie die flüssige Kulturbrühe mit Bakterienmasse. Kontrollieren Sie die Impfmenge durch photometrische Messung von 1 ml Aliquots bei 600 nm gegen nicht geimpfte flüssige Brühe als Referenz. Füllen Sie die bakterielle Masse in die flüssige Brühe ein, bis sie eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,15 erreicht.
  4. Inkubieren Sie die geimpfte flüssige Brühe ohne Schütteln bei 37 °C und 5%CO2 und bestimmen Sie die OD600 alle 30 min, indem Sie 1 ml Aliquots mit Kunststoffküvetten messen.
  5. Sobald die Bakterienkultur eine OD600 von 0,4 erreicht hat, was der exponentiellen Wachstumsphase entspricht, zentrifugiert die bakterielle Kultursuspension für 10 min bei 1.000 x g bei Raumtemperatur (RT).
    HINWEIS: Erlauben Sie nicht, dass eine Pneumokokkenkultur eine OD600 von mehr als 1,0 erreicht, da eine hohe Pneumokokken-Kulturdichte bekanntermaßen eine bakterielle Autolyse auslöst, die die allgemeine bakterielle Fitness beeinträchtigen könnte.
  6. Das bakterielle Sediment vorsichtig mit 10 ml PBS und Sediment wieder für 10 min bei 1.000 x g bei RT aussetzen.
  7. Setzen Sie das gewaschene bakterielle Sediment vorsichtig in 1 ml PBS wieder auf und bestimmen Sie die OD600 von 10 l der bakteriellen Suspension mit 1 ml PBS als Referenz.
  8. Stellen Sie die Bakterienmenge in PBS auf eine OD600 von 2,0 ein. Nach zuvor ermittelter bakterieller Zählung entspricht eine OD600 von 2,0 2 x 109 koloniebildenden Einheiten (CFU). Gehen Sie sofort mit dem Infektionsverfahren fort, um eine bakterielle Autolyse zu verhindern.

3. Endotheliale Zellkultivierung von HUVEC unter mikrofluidischen Bedingungen

  1. Lösen Sie die primären Endothelzellen durch kontrollierte Proteolyse vom Zellkulturkolben. Führen Sie die folgenden Schritte in einer sterilen Umgebung mit einer sauberen Bank aus. Bereiten Sie ein Volumen von 15 ml sterilem PBS für die Waschschritte vor.
    1. Entfernen Sie die ECGM aus einer subkonfluent gewachsenen HUVEC-Schicht und waschen Sie die Zellschicht mit 10 ml PBS mit einer serologischen Pipette, um das Zellkulturmedium loszuwerden.
    2. Inkubieren Sie den gewaschenen HUVEC mit 3 ml 37 °C vorgewärmten Zelldissoziationslösung zur Zellablösung für 5 min bei 37 °C. Beobachten Sie die proteolytische Zellablösung durch mikroskopische Überwachung jede Minute.
    3. Pipette die abgelöste Zellsuspension in ein Rohr mit 7 ml ECGM ergänzt mit 2% fetalem Kalbsserum (FCS) zum Stoppen der Proteolyse und Sediment der Zellen für 3 min bei 220 x g bei RT.
    4. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie den HUVEC in 250 l ECGM, ergänzt mit 5% FCS und 1 mM MgSO4,wieder aus. Verwenden Sie 10 l der Zellsuspension für die Zellzählung mit einer Neubauer-Zellzählkammer und passen Sie die Zellzahl auf 4 x 106 Zellen/ml ECGM an, ergänzt durch 5% FCS und 1 mM MgSO4.
      HINWEIS: Für jedes Strömungsexperiment werden 30 ml ECGM-Medium mit 5% FCS und 1 mM MgSO4 benötigt. Von nun an heißt diese mittlere Zusammensetzung ECGMS-medium. Die Erhöhung der FCS-Konzentration im Kulturmedium von 2% auf 5% unterstützt die Zellanhaftung und Zelllebensfähigkeit von HUVEC, das im Kanalschlitten gesät wird. Das Medium ergänzt FCS und MgSO4 stabilisiert die Zellanhaftung von HUVEC unter Scherspannungsbedingungen wesentlich.
  2. Säen und kultivieren Sie den HUVEC in einer Kanalrutsche. Arbeiten Sie in einer sterilen Umgebung mit einer sauberen Bank. Die Zellen werden unter Scherstress für 2 Tage kultiviert werden, gefolgt von einer Infektion mit Bakterien und mikroskopische Überwachung für weitere 2 h.
    1. Ausgleich eines Kanalschlittens, eines Perfusionssatzes von 1,6 mm Durchmesser und 50 cm Länge, eines Aliquots des ECGMS-Mediums und eines Luer-Kanalschlittens 0,4 m in der Höhe, für 24 h in einem Inkubator mit 5 %CO2-Atmosphäre bei 37 °C, um die Anzahl der Luftblasen zu reduzieren.
      HINWEIS: Dieses Verfahren wird empfohlen, um die Kunststoffausrüstung zu entgasen und das Medium, die Perfusionsrohre und die Reservoirs vorzuwärmen. Wenn Materialien oder Flüssigkeiten bei RT oder im Kühlschrank gelagert wurden, werden im Kunststoff gelöste Gase und Flüssigkeiten freigesetzt, wenn sie während des Experiments im Inkubator erhitzt werden. Dann werden Gasblasen auftreten. Die Entgasung aller Kunststoffkomponenten vor dem Experiment wird diesen Effekt eliminieren. Jedes Mal, wenn das System aus dem Inkubator genommen wird, beginnt der Prozess der Gasaufnahme wieder. Arbeiten Sie daher schnell bei RT und lassen Sie die Fluideinheit nie für längere Zeiträume außerhalb des Inkubators.
    2. Verwenden Sie eine Pipette, um 100 l einer 2% sterilgefilterten Schweinegelatinelösung in PBS-Lösung in eines der Reservoirs eines temperaturgleich geausgleichten Kanalschlittens zu injizieren. Inkubieren Sie die Gelatinelösung für 1 h bei 37 °C und spülen Sie den Kanal des Dias mit 1 ml PBS unter sterilen Bedingungen mit einer 1 ml Luer Spritze ab.
    3. Legen Sie den gelatinebeschichteten Kanalschlitten auf eine dünne Polystyrol- oder Styroporplatte, um einen Rückgang der Gleittemperatur zu verhindern. Fügen Sie 100 l der 4 x 106/ml HUVEC Suspension mit einer 1 ml Luer Spritze in das Dia ein.
      HINWEIS: Das Platzieren des Kanalschlittens auf der kalten Metalloberfläche der sauberen Bank könnte die Temperatur des Gleitbodens verringern und dadurch kalte Belastung der Endothelzellen erzeugen. Halten Sie während der Zellpipettierung die Folie ein wenig nach oben, um Luftblasen aufsteigen zu lassen und aus dem Inneren des Dias verschwinden zu lassen.
    4. Inkubieren Sie den Kanalschlitten mit dem HUVEC für 60 min bei 37 °C und 5%CO2 und füllen Sie die mittleren Reservoirs an beiden Enden des Kanalschlittens mit je 60 l ECGMS-Medium. 1 h bei 37 °C und 5%CO2inkubieren.
  3. Passen Sie die mikrofluidische Pumpe und die Softwareeinstellungen an.
    1. Schließen Sie den ausgeglichenen Perfusionssatz an die Pumpeneinheit an, füllen Sie ihn mit 13,6 ml ECGMS-Medium aus, und starten Sie die Pumpensteuerungssoftware. Wählen Sie den geeigneten Perfusionssatz und die Art der Kammerrutsche mithilfe der Scroll-Down-Fenster im Menü der eingerichteten Fluideinheit aus. Wählen Sie 0.007 (dyn/cm2) in der Software für mittlere Viskosität. (Siehe die Druckpumpen-Softwareeinstellungen, die in Der Zusätzlichen Abbildung 1mit roten Pfeilen markiert sind).
    2. Schließen Sie außerhalb des Inkubators eine mit trocknenden Kieselsäureperlen gefüllte Glasflasche an die Luftdruckschläuche an (siehe Abbildung 1, Inset 3). Die Luft der Druckpumpe zirkuliert zwischen den Perfusionsbehältern und der Pumpe und muss vor dem Wiedereintritt in das Pumpengerät trocken sein. Wählen Sie Im Softwaremenü Strömungsparameter aus, stellen Sie den Druck auf 40 mbar ein, und spülen Sie die Pumpenrohre mit dem flüssigen Medium, indem Sie den kontinuierlichen mittleren Durchfluss starten. (Diese Einstellungen werden auch durch rote Pfeile in Der Zusatzabbildung 1angezeigt).
    3. Programmieren Sie die gewünschten Scherspannungszyklen der Strömungskultivierung. Beginnen Sie mit 5dyn/cm2 , steuern Sie symmetrische Reservoir pumpinng und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Pumpensystem zirkulieren.
      HINWEIS: Die Wandscherspannung in einem Kanalschlitten hängt von der Durchflussrate und der Viskosität des Perfusionsmediums ab. Wenn Sie ein anderes Pumpensystem verwenden, lesen Sie bitte die in der Einleitung beschriebenen Gleichungen, um einen Durchfluss festzulegen, der den gewünschten Scherspannungspegel erzeugt. Die beschriebenen Einstellungen entsprechen einer Durchflussrate von 5,42 ml/min. (Ein beispielhafter Screenshot, der die entsprechenden Durchflussparametereinstellungen in der Druckpumpensoftware zeigt, ist in Der Zusatzabbildung 2dargestellt).
    4. Stoppen Sie die Durchflusszirkulation in der Pumpensteuerungssoftware und halten Sie den mittleren Durchfluss im Perfusionsschlauch, indem Sie die Rohre in der Nähe der Luer-Verbindungen spannen. Schließen Sie den Kanalschlitten an, wodurch Luftblasen vermieden werden, und legen Sie die Fluideinheit mit dem angeschlossenen Kanalschlitten in einenCO2-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2. Beginnen Sie die Scherspannung bei 5 Dyn/cm2 für 30 min, um die Zellen reibungslos an die durch die Scherspannung erzeugten Kräfte anzupassen, bevor Sie den Scherspannungspegel beschleunigen (siehe Ergänzende Abbildung 3).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen im Rohrsystem oder im Schlitten nach dem Anschluss an das Rohrsystem verbleiben, da die Bewegung von Luftblasen im Durchfluss zu einer Zellablösung führen kann.
    5. Beschleunigen Sie die Scherspannung auf 10 Dyn/cm2 (die in dieser Strömungseinstellung 10,86 ml/min entsprechen) und inkubieren Sie den Kanalschlitten in kontinuierlicher Scherspannung für 48 h in einem kleinenCO2-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2, um eine Zelldifferenzierung zu ermöglichen ( Die jeweiligen Software-Settinngs sind in Der Ergänzungsabbildung 4mit roten Pfeilen gekennzeichnet.
      HINWEIS: HUVEC-Zellen neigen dazu, sich von der Kanaloberfläche zu lösen, wenn die Strömungskultivierung direkt bei 10 dyn/cm2gestartet wird. Die Zellen bleiben an der Kammeroberfläche befestigt, wenn die Strömungskultivierung mit weniger Scherspannung mit 5 Dyn/cm2 für mindestens 30 min begonnen wird, gefolgt von einer langsamen Erhöhung der Scherspannung auf die gewünschten 10 dyn/cm2. Eine Scherspannung von 10 Dyn/cm2 ist der Mindestwert in dieser Perfusionseinstellung, der für die VWF-Stringbildung erforderlich ist.
    6. Stoppen Sie nach 24 h mikrofluidischer Zellkultivierung den mittleren Durchfluss mit der Pumpensteuerungssoftware genau dann, wenn in beiden mittleren Reservoirs ein ausgeglichener mittlerer Pegel erreicht wird. Legen Sie die Fluideinheit in eine saubere Bank und entfernen Sie 10 ml des zirkulierenden Anbaumediums der Perfusionsreservoirs mit einer 10 ml serologischen Pipette. Fügen Sie 10 ml ECGMS-Medium in die Reservoirs, um das Medium zu erneuern, legen Sie die Fluideinheit wieder in denCO2-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2, und starten Sie den flüssigen Anbau mit der Pumpensteuerungssoftware neu.
      HINWEIS: Die Funktion der Druckpumpe kann plötzlich durch Labormaschinen wie große Zentrifugen gestört werden, was zu einer starken Magnetfeldstörung führen kann. Diese plötzliche Störung kann zu einer Zellablösung führen. Achten Sie darauf, dass solche Maschinen während des Experiments nicht in der Nähe der Druckpumpe aktiv sind.
    7. Beginnen Sie die Vorwärmung der Temperaturinkubationskammer, die das Stadium des Fluoreszenzmikroskops auf 37 °C für temperaturausgleich 24 h abdeckt, bevor die mikroskopische Visualisierung. Nachdem das Mikroskop vorgewärmt ist, starten Sie die Steuerung der Mikroskopsoftware und passen Sie die Haupteinstellungen für die fluoreszenzmikroskopische Überwachung an, indem Sie die entsprechenden Filtereinstellungen (540 nm/590 nm für die Detektion der RFP-exemitten Bakterien und 470 nm/515 nm zum Nachweis der Fluorescein-Emission der FITC-konjugierten VWF-spezifischen Antikörper). Vorwärme neine zusätzliche Heizkammer zur Inkubation der Fluideinheit bei 37 °C.
      HINWEIS: Während der Infektionsanalysen und der mikroskopischen Überwachung sollte die Temperatur des Kanalschlittens und des zirkulierenden Mediums nicht wesentlich abnehmen, da dies kalte Belastung der Zellen erzeugen würde. Im Allgemeinen reicht die Größe der Temperaturkammern, die die Mikroskopstufe abdecken, nicht aus, um die gesamte Fluideinheit abzudecken. Daher wird die Verwendung einer zusätzlichen Heizkammer empfohlen, die auf 37 °C vorgewärmt ist.
    8. Zur mikroskopischen Visualisierung legen Sie die Fluideinheit in die 37 °C vorgewärmte Heizkammer und stellen Sie den Kanalschlitten auf eine Stufe des 37 °C vorgewärmten Mikroskops.
      HINWEIS: Für die mikroskopische Visualisierung mussten die Fluideinheit und der Kanalschlitten aufgrund der begrenzten Länge der Perfusionsschläuche aus dem CO2-Inkubator entfernt werden. Wenn Infektionszeiten und mikroskopische Überwachung enußerhalb der 5%CO2-Atmosphäre für die pH-Pufferung erforderlich sind, sollte ein pH-gepuffertes Medium für den mikrofluidischen Anbau verwendet werden.
    9. Kontrollieren Sie die Zellmorphologie und die Integrität der HUVEC-Schicht vor der Injektion von Histamin und Bakterien in die Durchflusszirkulation während der gesamten Zeit des Strömungsexperiments und nach Abschluss des Strömungsexperiments mit dem Hellenfeldmodus des Mikroskops.

4. Induktion von VWF-Release und Visualisierung von Multimerized VWF Strings

  1. Halten Sie die Strömungseinstellung aufrecht, da eine Scherspannung von 10 dyn/cm2 erforderlich ist, um die Multimerisierung von VWF auf lange Saiten von bis zu 200 MDa auszulösen. Induzieren Sie die Freisetzung von VWF aus endothelialem WPB, indem Sie 136 l einer 100 mM Histamin-Stammlösung in das ECGMS-Medium in jizieren, das in den Perfusionsschläuchen über einen Injektionsanschluss zirkuliert. Die endgültige Konzentration von Histamin im Strömungsmedium wird 1 mM betragen. Wenn kein Injektionsanschluss verfügbar ist, kann das Histamin alternativ durch Pipettieren in das Medium der Pumpenbehälter hinzugefügt werden.
  2. Zur Immunfluoreszenzdetektion von mehrfach verkörnten VWF-Strings den Fluss stoppen, wenn ein ausgeglichener mittlerer Pegel in den Reservoirs erreicht wird, und 20 g eines VWF-spezifischen FITC-konjugierten Antikörpers in einem Volumen von 200 l PBS (pH 7,4) in die zirkulierenden 13,6 ml ECGMS-Medium mit einem Injektionsanschluss. Wenn kein Injektionsanschluss verfügbar ist, kann der Antikörper alternativ durch Pipettieren in das Medium der Pumpenbehälter hinzugefügt werden. Daraus ergibt sich eine endende Antikörperkonzentration von 1,3 g/ml.
  3. Verwenden Sie für das mikroskopische Scannen mehrerer Sichtfelder in kurzer Zeit die Fluoreszenzeinheit des Mikroskops mit einem Xenon-Fluoreszenzgerät mit 30 % Leistung und einer Epifluoreszenzkamera. Überwachen Sie die Form und Morphologie der HUVEC-Schicht mit dem hellen Feldmodus, um repräsentative Zellen auszuwählen, die für die Visualisierung von VWF-Strings geeignet sind.
  4. Zur Visualisierung von grünen fluoreszierenden VWF-Strings wählen Sie im Fluoreszenzeinheitsmenü der Mikroskopsoftware (LasX) ein 63x/1,40 Ölobjektiv und einen 470 nm Detektionsfilter aus. Erstellen Sie Snapshots von Z-Stacks mit mindestens 50 repräsentativen Feldansichten, die jeweils etwa 10 morphologisch intakte HUVEC enthalten. Zur Quantifizierung der grünen fluoreszierenden VWF-Strings zu verschiedenen Zeitpunkten scannen Sie mehrere Sichtfelder.

5. Mikroskopische Bewertung der bakteriellen Befestigung an VWF-Saiten in Flow in Echtzeit

  1. Quantifizieren Sie die pneumokokkende Befestigung an den AUF HUVEC-Zelloberflächen erzeugten VWF-Strings durch Immunfluoreszenznachweis.
    1. Halten Sie den Durchfluss und injizieren Sie 1,35 x 108 KKR/mL RFP-exezierende Pneumokokken in einem maximalen Volumen von 1 ml in das ECGMS-Medium mit dem Injektionsanschluss. Alternativ pipette die Bakterien in das Medium im Pumpenreservoir. Starten Sie die Scherspannung bei 10 Dyn/cm2 neu, um die Bakterien im Pumpensystem zirkulieren zu lassen.
    2. Wählen Sie ein 63-faches Öl-Immersion-Objektiv für die Mikroskopvergrößerung und passen Sie die Fluoreszenzfiltereinstellungen in der Mikroskopsoftware an den RFP-Kanal (540 nm Detektionsfilter) zur Detektion von RFP-exezierenden Pneumokokken an.
    3. Zur Quantifizierung der bakteriellen Befestigung an den VWF-Strings stoppen Sie den Fluss und erstellen Sie Momentaufnahmen von Z-Stacks von mindestens 30 repräsentativen Feldansichten, die jeweils etwa 10 morphologisch intakte HUVEC enthalten, und zählen die Menge an Pneumokokken.
    4. Verwenden Sie den einfaktoriellen Statistikalgorithmus ANOVA, um die Daten auszuwerten, gefolgt von einem post hoc zweischwanzigen, nicht gepaarten Stichprobentest für einen detaillierten statistischen Vergleich. P-Werte von <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

6. Mikroskopische Bewertung der bakteriellen Befestigung an VWF-Saiten nach Probenfixierung

  1. Probe der Fixierung vor der Immunfluoreszenzfärbung.
    1. Stoppen Sie den Durchfluss, entfernen Sie 10 ml ECGMS-Medium aus den Pumpenbehältern und fügen Sie 10 ml PBS hinzu, ergänzt durch 5% Paraformaldehyd (PFA). Lassen Sie die PFA-Lösung 10 min bei einer Scherspannung von 10 Dyn/cm2zirkulieren.
    2. Trennen Sie den Kanalschlitten von der Pumpeneinheit.
  2. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen auf der Zelloberfläche und führen Sie die Immundetektion von VWF-Strings und angehängten Bakterien durch.
    1. Bereiten Sie 4 ml einer Waschlösung mit 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) vor, ergänzt mit 4% Saccharose für alle Waschschritte. Bereiten Sie 1 ml einer Blockierlösung vor, die 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) enthält, ergänzt durch 4% Saccharose und 2% Rinderserumalbumin (BSA) zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen.
    2. Waschen Sie den PFA-inkubierten Kanalschlitten 3x mit einer 1 ml Luer-Spritze, um 200 l der Waschlösung zu injizieren und den Schlitten 120 min bei RT mit 200-L-Blockierlösung zu inkubieren.
    3. Bereiten Sie 4 ml einer anderen Blockierlösung vor, die 100 mM Na2CO3enthält (pH 9.2), ergänzt durch 4% Saccharose und 0,5% BSA zur Verdünnung der Antikörper. Verwenden Sie 200 l dieser Blockierlösung, um das Pneumokokken-spezifische Kaninchenantiserum 1:100 zu verdünnen. Verdünnen Sie den VWF-spezifischen Mausantikörper 1:50 mit 200 l dieser Blockierlösung, um eine VWF-spezifische Antikörperkonzentration von 4 g/ml zu erzielen. Verdünnen Sie den AlexaFluor488-konjugierten Sekundärantikörper aus einer 2 mg/ml-Stammlösung 1:100 in 200 l PBS (pH 7,4), um eine Endkonzentration von 20 g/ml zu erzeugen.
      HINWEIS: In den beschriebenen Immunfluoreszenzeinstellungen lieferte der Antikörpernachweis optimale Ergebnisse, wenn die Antikörper im oben genannten alkalischen Karbonatpuffer verdünnt wurden. Basierend auf den bisherigen Ergebnissen sind die empfohlenen Blockierlösungen und die Menge an Antikörpern für viele Anwendungen geeignet. Verschiedene Experimente erfordern jedoch möglicherweise eine individuelle Optimierung der Antikörperkombination, der Antikörperkonzentration, der Inkubationszeit und der Konstitution des Blockierpuffers. Alternativ könnte ein phosphatgepuffertes System mit neutralem pH-Bereich als Inkubationspuffer geeignet oder sogar bevorzugt sein. Bei schwachen Fluoreszenzsignalen sollte die Konzentration von Sekundärantikörpern erhöht werden. Wenn zu viel unspezifischefluoreszenz-Hintergrundgeräusche festgestellt werden, sollte die Menge der blockierenden Substanzen erhöht werden.
    4. Für die VWF-Immunfluoreszenzfärbung den Kanalschlitten mit einer 1 ml Luer-Spritze durch Injektion von 200 l der Waschlösung 3x waschen und den Schlitten mit dem 1:50 verdünnten VWF-spezifischen Antikörper 30 min bei RT inkubieren. Danach den Kanalschlitten wieder 3x mit 200 waschen L der Waschlösung und inkubieren Sie die Rutsche mit dem 1:100 verdünnten AlexaFluor488-konjugierten mausspezifischen Antikörper für 30 min bei RT. Waschen Sie schließlich die Kanalrutsche 3x mit 200 l der Waschlösung erneut.
      HINWEIS: Die AlexaFluor-Fluorophore sind empfindlich gegenüber Bleichen. Daher sollte die Rutsche geschützt werden, indem sie während der Inkubationsschritte mit den fluorophorkonjugierten Antikörpern in einer dunklen Kammer gehalten wird.
    5. Zur Immundetektion der Pneumokokken die Rutsche mit einem 1:100 verdünnten Pneumokokken-spezifischen Kaninchenantikörper 30 min bei RT inkubieren. Anschließend die Kanalrutsche 3x mit 200 l der Waschlösung waschen und die Rutsche mit 1:100 verdünnt inkubieren. AlexaFluor568-konjugierter kaninchenspezifischer Antikörper für 30 min bei RT. Waschen Sie den Kanalschlitten wieder 3x mit 200 l der Waschlösung.
    6. Um das zelluläre Aktin-Zytoskelett mit fluoreszierendem Phalloidin zu färben, durchpermeabilisieren Sie den HUVEC durch Inkubation mit 120 l von 0,1% Triton X-100 für 5 min bei RT. Waschen Sie den Kanalschlitten 3x mit 200 l der Waschlösung und inkubieren Sie die Rutsche mit 120 l von 1:1.000 verdünnt AlexaFluor350-konjugiertes Phalloidin. Dieser Inkubationsschritt wird das polymerisierte Aktin-Zytoskelett visualisieren und die Überwachung der Zellform und möglicher stressinduzierter morphologischer Veränderungen ermöglichen.
    7. Waschen Sie den Kanalschlitten 3x mit 200 l der Waschlösung. Waschen Sie schließlich den Schlitten 4x mit 200 l ddH2O und visualisieren Sie die grünen fluoreszierenden VWF-Strings, die roten fluoreszierenden Bakterien und das blaue fluoreszierende Aktin-Zytoskelett mit den entsprechenden Filtereinstellungen am Fluoreszenzmikroskop.

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Representative Results

Die Kultivierung von primärer HUVEC in einem konstanten unidirektionalen Fluss führt zur Bildung einer konfluenten und dicht gepackten Zellschicht, die die Erzeugung von zellulären WPBs fördert, die mit dem mechanosensitiven VWF13,14gefüllt sind. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines luftdruckpumpenbasierten, pulslosen Rezirkulationssystems für die Infektionsanalyse, das die Scherstresssituation im menschlichen Blutfluss nachahmt.

Dieses System ermöglicht eine definierte, softwaregesteuerte Einstellung der Durchflussbedingungen. Das Strömungsschema in Abbildung 1 veranschaulicht den Hauptworkflow, beginnend mit der Vorkultivierung der primären Endothelzellen (Abbildung 1, Inset 1) und der Vorkultivierung von Pneumokokken ( Abbildung1, Inset 2). Das aufgebrachte mikrofluidische System(Abbildung 1, Inset 3) besteht aus einem speziellen Kanalschlitten, der über einen Luer-Adapter mit Perfusionsschläuchen mit zwei mittleren Behältern verbunden ist. Das Perfusionsrohr-Set wird auf eine Fluideinheit gelegt, die als Ständer dient und die Perfusionsrohre als Ventilsystem verwendet. Für die Strömungskultivierung werden die Fluideinheit mit dem mittelgefüllten Perfusionsset und dem angeschlossenen Kanalschlitten in einenCO2-Inkubator gelegt(Abbildung 1, Inset 3). Die Fluideinheit wird über Luftschläuche mit einer Luftdruckpumpe verbunden. Die Luft in den Schläuchen muss durch eine Trocknungsflasche mit Kieselsäureperlen geleitet werden, um Feuchtigkeit aus den Perfusionsbehältern zu entfernen, bevor die Luft wieder in das Pumpensystem gepumpt wird (Abbildung 1, Inset 3). Die Luftdruckpumpe wird über eine Computersoftware (PumpControl v1.5.0) gesteuert, die die Einstellung einer kontinuierlichen, definierten Durchflussrate in Abhängigkeit vom Durchmesser des Kanalschlittens, der Länge und dem Durchmesser des Perfusionsschlauchsatzes und der Viskosität der verwendetes Medium(Abbildung 1, Inset 3). Die Sekretion von VWF durch WPB-Exozytose von konfluent angebautem HUVEC wird durch Histamin-Stimulation8 induziert, die in der mittleren Zirkulation in den Perfusionsschläuchen mit einem Injektionsanschluss aufgetragen wird (Abbildung 1, Inset 4). Bei einer minimalen Scherspannung von 10 Dyn/cm2vermehren sich die freigesetzten VWF-Proteine und bilden lange Proteinsaiten mit einer Länge von mehr als 100 m (Abbildung 1, Inset 4,5,6 und Abbildung 2A). Diese Proteinsaiten werden nach der Injektion von Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierten VWF-spezifischen Antikörpern in das Medium mikroskopisch erkannt und visualisiert. Die zirkulierenden Antikörper ermöglichen den Immunfluoreszenznachweis der zellflächengebundenen VWF-Strings in Echtzeit (Abbildung 1, Inset 5)8.

Der etablierte mikrofluidische Zellkultur-Infektionsansatz mit primären Endothelzellen imitiert die Situation einer lokal entzündeten Vaskulatur bei infiltration der Blutzirkulation durch bakterielle Pathobionts wie Streptococcus pneumoniae. Gezeigt werden Beispiele für die Visualisierung und quantitative Analyse der bakteriellen Interaktion mit differenzierten Gefäßzellen unter Scherspannung mittels mikrofluidischer Endothelzellkultikultur (Abbildung 1, Insets 5,6). RFP-exzentrisch exzessierte Pneumokokken wurden in den Durchfluss injiziert und nach 30 min Zirkulation wurden die ersten Anzeichen einer bakteriellen Anhaftung an VWF-Saiten von histaminstimulierten HUVEC mikroskopisch nachgewiesen (Abbildung 1, Insets 5,6 und Abbildung 2A, B weiße Pfeile)8. So ermöglichte die Verwendung von RFP-exemitten Pneumokokken die Quantifizierung der bakteriellen Bindung an die VWF-Saiten an den Endothelzellen ohne bakterielleantikörperde Detektion.

Histogramm-Overlay-Plots der Fluoreszenzintensitäten wurden mit der Auswertungssoftware von Leica (d.h. LasX) erzeugt, um die Kolokalisierung von RFP-exezierenden Pneumokokken mit den mit grünen fluoreszierenden Antikörpern nachgewiesenen VWF-Strings zu visualisieren. Dies ermöglichte eine quantitative Analyse der Kolokalisierungswahrscheinlichkeit in bestimmten Regionen von Interesse (ROI) innerhalb des Fluoreszenzbildes. Mit Hilfe von Histogramm-Overlays von bakteriellen Signalen in Kombination mit den Fluoreszenzsignalen des VWF konnten überlappende Fluoreszenzspitzen für beide visualisiert und damit die Pneumokokken-Befestigung an den VWF-Strings bestätigt werden. Die bakterielle Befestigung widersteht der kontinuierlich aufgetragenen Scherspannung für mindestens 25 min (Abbildung 2B)8.

Zusammenfassend ermöglicht der kontinuierliche Flow-Anbau von primärer HUVEC die VWF-Sekretion und die Erzeugung langer VWF-Proteinsaiten, die als Haftstellen für zirkulierende Bakterien dienen8.

Figure 1
Abbildung 1: Workflow für Analysen der bakteriellen Bindung an VWF-Strings mit mikrofluidischer Endothelzellkultivierung. Workflow der wichtigsten experimentellen Schritte beginnend mit der Vorkultivierung von primären Endothelzellen bis zur Subkonfluenz in Zellkulturkolben. Vor der Zellkultivierung im Fluss werden die Zellen in einen gelatinebeschichteten Kanalschlitten (Inset 1) gesät. Bakterien werden auf Agarplatten angebaut, gefolgt von der Kultivierung in einer komplexen flüssigen mittleren bis mittleren Logphase (Inset 2). Für die mikrofluidische Zellkultur ist ein Kanalschlitten mit Endothelzellen mit den Perfusionsröhren einer Fluideinheit des Pumpensystems verbunden und einem konstanten Durchfluss zur Zelldifferenzierung ausgesetzt (Inset 3). Die Erzeugung der VWF-Strings (grüner Pfeil) wurde durch Histamin-Injektion bei einer Scherspannung von 10 Dyn/cm2 induziert und mikroskopisch durch Immunfluoreszenzdetektion mit FITC-gekennzeichneten VWF-spezifischen Antikörpern (Inset 4) überwacht. Nach Injektion von RFP-exezierenden Bakterien in das zirkulierende Medium wurde die Pneumokokken-Befestigung (roter Pfeil) an den VWF-Saiten mikroskopisch in Echtzeit durch Fluoreszenzemission bei 450 nm (Inset 5) visualisiert. Nach der Fixierung der Zellen mit PFA ermöglicht die Differentialimmunfluoreszenzfärbung die Visualisierung der bakteriellen Anhaftung an bestimmten Infektionszeitpunkten (Inset 6). Die in den Schritten 1, 3 beschriebenen Bilder des Pumpensystems und der HUVEC-Zellschicht und das Bild des Einspritzanschlusses (Inset 4) sind enthalten. Die in den Sätzen 4 und 5 gezeigten Immunfluoreszenzbilder wurden mit Genehmigung von Jagau et al.8modifiziert und verwendet. Die Längen der Skalenbalken sind unten rechts angegeben.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von Pneumokokkenbindung an die VWF-Strings, die im kontinuierlichen Fluss auf der Oberfläche des histaminstimulierten HUVEC erzeugt werden. (A) Die Erzeugung der VWF-Strings wurde mikroskopisch quantifiziert, nachdem sie mit einem mikrofluidischen Pumpensystem bei 10 dyn/cm2 der zerfeinern HEbspannung gegenüber Scherspannung aussetzte. FITC-konjugierte VWF-spezifische Antikörper entdeckten die VWF-Strings. Weiße Pfeile zeigen auf RFP-exättige Pneumokokken mit roter Fluoreszenz, die an langen VWF-Strings befestigt sind. (B) Die bakterielle Befestigung an den grünen fluoreszierenden VWF-Strings wurde mikroskopisch für bis zu 2 h im konstanten Durchfluss (weiße Pfeile) beobachtet und durch softwarebasierte Auswertung der Fluoreszenzintensitäten eines definierten ROI bestätigt. Echtzeitbilder wurden mit dem Fluoreszenzgerät eines konfokalen Laserscanmikroskops (SP8, Leica) aufgenommen. Skalenbalken = 10 m. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Jagau et al.8geändert und verwendet.

Ergänzende Abbildung 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Simulation der bakteriellen Interaktion mit mechanosensitiven Wirtsproteinen wie VWF erfordert ein durchwegsnutzbares Zellkultursystem, das die Erzeugung eines definierten, unidirektionalen und kontinuierlichen Flüssigkeitsflusses ermöglicht und so eine zuverlässige Scherspannung erzeugt. . Mehrere mikrofluidische Pumpensysteme wurden bereits beschrieben. Ein ausführlicher Überblick von Bergmann et al. fasst die Wesentlichen Aspekte verschiedener zwei- und dreidimensionaler Zellkulturmodellezusammen 17.

Die mikrofluidische Technologie ist eine sehr junge Technik, die in den frühen 1990er Jahren mit der Entwicklung von kontrollierbaren, reproduzierbaren und durchfbrierbaren Mikroumgebungen in einem Mikrometer und sogar im Nanometermaßstab18begann. Der vorgestellte mikrofluidische Ansatz kann auch angewendet werden, um die breite Palette von bakteriellen Adhäsionsmechanismen und beteiligten Proteinen zu untersuchen. Es eignet sich am besten für jede Interaktion, die mechanoresponsive Haftungskomponenten wie VWF beinhaltet, die im Allgemeinen nicht mit Standard-Zellkulturtechniken ansprechbar sind. So ist beispielsweise bekannt, dass die Konformation mehrerer extrazellulärer Matrixproteine je nach Standort unterschiedlich ist. Innerhalb des Blutsystems zirkulieren Glykoproteine wie Fibronectin in einer kugelförmigen Konformation, während in der extrazellulären Matrix die Proteine als multivernetztes di- und multimerisiertes Gerüsterscheinen 19,20. Darüber hinaus bieten mehrere Distributoren von mikrofluidischen Geräten standardisierte Kanalschlitten an, die mit verschiedenen Kollagenarten vorbeschichtet sind (z. B. subendotheliale Kollagene oder andere plasmaabgeleitete Proteine). Diese Kanalgitas eignen sich zur Visualisierung und quantitativen Analyse der bakteriellen Adhäsion auf bestimmte extrazelluläre Matrixproteine in unterschiedlichen Strömungssituationen.

Verschiedene mikrofluidische Systeme können basierend auf den verschiedenen Materialien, die für die Herstellung von Mikrogeräten verwendet werden, kategorisiert werden. In dieser Hinsicht unterscheiden sich die auf Glas/Silikon basierenden Plattformen von den polymerbasierten und den papierbasierten Plattformen21. Polymerbasierte Kanalschlitten werden mit einer elastisch unterstützten Oberfläche (ESS) hergestellt und erfordern in der Regel eine Oberflächenbeschichtung zur Zellbefestigung bei Strömungsexperimenten. Als Alternative zu einer Beschichtung mit haftunterstützenden Komponenten wie Kollagen wird die Oberfläche einiger handelsüblicher Kanalschlitten physikalisch modifiziert, wodurch eine für die meisten Zelltypen geeignete hydrophile und klebende Oberfläche entsteht. Darüber hinaus werden einige Kanalschlitten mit Substraten wie Polydimethylsiloxan (PDMS) erzeugt, das sauerstoffdurchlässig ist und auch die Kultur von Blutgefäßzellen auf der Innenoberfläche von Mikrokanälen in Fluidpumpensystemen ermöglicht22, 23.

Das in diesen Studien verwendete mikrofluidische System diente als effizientes und zuverlässiges System, das für die Analyse der Wechselwirkung von Staphylococcus aureus mit multimerisierten VWF-Fasern nach der Kultur menschlicher Endothelzellen im Fluss angewendet wurde. 24,25. Dieses mikrofluidische System war ein geschlossenes kreisförmiges Perfusionssystem, das die Analyse von Infektionen durch pathogene Bakterien unter Biosicherheits-2-Bedingungen ermöglichte. Darüber hinaus eigneten sich die Kanalschlitten für die mikroskopische Überwachung während des Durchflusses und sind mit unterschiedlichen Vorbeschichtungen (z.B. Gelatine, Poly-L-Lysin oder Kollagen-IV) erhältlich, die eine Zellhaftung und eine hohe experimentelle Reproduzierbarkeit gewährleisten. Dieses Protokoll verwendet ein mikrofluidisches System (siehe Tabelle der Materialien) für die Etablierung eines perfusable Infektionsmodells für S. pneumoniae, wodurch die Strömungssituation innerhalb des menschlichen Gefäßsystems imitiertwird 8.

Das beschriebene allgemeine Verfahren der bakteriellen Zellanhaftung in diesem mikrofluidischen System kann auch mit anderen Arten von Pumpensystemen durchgeführt werden, die einen definierten und kontinuierlichen Fluss in einer sterilen Umgebung erzeugen. Für mikrofluidische Zwecke werden hauptsächlich vier Arten von Durchflussregelungssystemen eingesetzt: i) peristaltische Pumpen und Umwälzpumpen, die in diesem Protokoll verwendet werden, ii) Spritzenpumpen, iii) Druckregler und iv) Druckregler mit Durchflussschaltermatrizen. Jede Art von Durchflussregelung samt Vorteil und Nachteile, abhängig von der spezifischen mikrofluidischen Anwendung und der Fähigkeit, mikroskopische Visualisierungen in Echtzeit durchzuführen. In den meisten Anwendungen, die eine kontinuierliche Zirkulation der Proben erfordern, werden Umwälzpumpen mit softwarebasierten Druckreglern kombiniert, um eine definierte Strömungssituation zu gewährleisten. Dies wird auch im hier demonstrierten Pumpensystem optimiert. Die spritzenbasierten Pumpensysteme können in "klassische" Spritzenpumpen unterteilt werden, die Strömungsschwingungen erzeugen, und "pulslose" mikrofluidische Spritzenpumpen. Diese Spritzenpumpen-basierten Systeme sind in der Regel einfach zu bedienen, aber die Durchflussregelung in Sackgassenkanälen ist mit Spritzenpumpen eine Herausforderung. Darüber hinaus können Strömungsänderungen innerhalb des Chips einige Zeit in Anspruch nehmen, und ein Durchflussmesser ist erforderlich, um die Durchflussmenge zu bestimmen. Selbst pulslose Spritzenpumpen können durch den Schritt-für-Schritt-Motor der Spritzenpumpe eine periodische Pulsation auf den Durchfluss erzeugen. Zwei weitere Spritzenpumpengeräte sind in der Lage, eine "Infuse and withdraw"-basierte Fluidbewegung zu erzeugen, die definierte Scherkräfte auf Zelloberflächen anwendet und auch PC-unabhängig für Mikrodialyseanwendungen geeignet ist. Dieses System muss mit Mikrotubing zum Anschluss von Kammern oder Kanalschlitten für die Zellkultivierung kombiniert werden, gefolgt von mikroskopischen Analysen.

Die oben genannten Druckregler sind Durchflussregelsysteme, die den Tank mit der Probe unter Druck setzen, der problemlos in eine mikrofluidische Kammer oder auf einen Chip eingespritzt wird. Die Druckregler können einen pulslosen Durchfluss herstellen und auch Durchflussraten in Kombination mit Durchflussmessern bereitstellen. Eine Kombination von Druckreglern mit Durchflussschaltermatrizen ermöglicht einen schnellen Durchflussschalter ohne Rückflüsse. Das hier vorgestellte Umwälzsystem ermöglichte die Erzeugung von Scherspannungswerten, die typischerweise für das menschliche Gefäßsystem gemeldet werden26. In vivo Vasorenwandscherspannung wurde anhand von Wandscherraten geschätzt, die aus nicht-invasiven Geschwindigkeitsprofilen abgeleitet sind, und der Vollblutviskosität in großen Arterien und der Plasmaviskosität in Arteriolen26. Reneman und Hoeks zeichneten Geschwindigkeitsprofile in großen Arterien mit einem speziell entwickelten Ultraschallsystem und in Arteriolen mittels optischer Techniken mit fluoreszierenden Strömungsgeschwindigkeitsspuren26auf. Eine durchschnittliche Scherspannung von 11-13 dyn/cm2 wird in der Halsschlagader erreicht, im Gegensatz zu nur 4-5 dyn/cm2 in der Brachialarterie. Für die Halsschlagader wurden Spitzenwerte von bis zu 25-70 Dyn/cm2 überwacht. Die Scherspannungswerte kleiner und mittlerer Venen liegen zwischen 0,1 und 0,5 Dyn/cm2. Im hier beschriebenen mikrofluidischen System hängt der anwendbare Scherspannungswert vom gewählten Perfusionsschlauchdurchmesser, der Höhe des Kanalschlittens und der Viskosität des verwendeten Fluidmediums ab. Die gewählte Fluideinstellung bestand aus einem Dia mit einer Höhe von 0,4 cm (Volumen 100 l) in Kombination mit einem Perfusionssatz von 50 cm Länge und 1,6 mm Durchmesser und der mittleren Viskosität betrug 0,0072 [dyn's]/cm2. Diese Einstellung eignet sich für einen Scherspannungsbereich zwischen 3,5 und 31,2 Dyn/cm2 bei Durchflussraten von 3,8 bis 33,9 mL/min. Darüber hinaus kann die Druckpumpen-Softwaresteuerung einen gepulsten mittleren Durchfluss anwenden, der einen gepulsten arteriellen Blutfluss imitieren könnte.

Die erfolgreiche, zuverlässige und reproduzierbare Anwendung dieser kombinierten mikrofluidischen Infektionsmethode erfordert einige Vorsichtsmaßnahmen, die im Auge behalten werden müssen. Während des Infektionsprozesses unter mikrofluidischen Bedingungen kann die Zellschicht zytotoxischen oder zytolytischen bakteriellen Verbindungen wie Pneumolysin ausgesetzt werden, die die Lebensfähigkeit der eukaryotischen Zelle beeinflussen und die Zellhaftung an der Gleitoberfläche schwächen. Daher ist es während des gesamten Versuchs erforderlich, einen konstanten Fluss zu halten, und die Integrität der Zellmorphologie muss häufig überwacht werden. Darüber hinaus sollte das Strömungskulturmedium den Endothelzellen alle essentiellen Nährstoffe zur Verfügung stellen, um eine enge Oberflächenhaftung der Zellen während des Infektionsexperiments zu gewährleisten. Dennoch ist zu beachten, dass mittlere Nahrungsergänzungsmittel Substanzen enthalten, die die Interaktion zwischen den Bakterien und bestimmten Wirtsproteinen stören oder hemmen könnten. In Studien zur Pneumokokken-VWF-Wechselwirkung beispielsweise muss Heparin vom Zellkulturmedium ausgedünnt werden, da es die Bindung von Pneumokokken an VWF8hemmt.

Ein weiterer kritischer Schritt in der Strömungskultur von Endothelzellen ist die Aufrechterhaltung einer engen Zellhaftung, die von der allgemeinen Zellvitalität und der Differenzierungsebene abhängt. Die durchlaufresistente Zellhaftung primärer Endothelzellen wurde nur erreicht, wenn Die Zellen vor der Exposition gegenüber Scherspannung streng in Subkonfluenz gehalten wurden. Andererseits hängt die Produktion von WPB direkt von der Konfluenz der Endothelzellschicht ab, die enge Zell-Zell-Kontakte fördert13. Der Nutzen der mikrofluidischen Zellkultur primärer Endothelzellen deckt die stark induzierte Zellproliferation ab, die schnell zur Bildung einer konfluenten Zellschicht unter Strömungsbedingungen führt. Die Zellen sind eng miteinander verbunden, sind kollektiv in Strömungsrichtung ausgerichtet und stellen einen sehr differenzierten Phänotyp dar, der zur Herstellung von sekretorischem WPB erforderlich ist. Diese WPB dienen als Speichervesikel für VWF, Vasodilatationsaktivatoren und Zytokine, die als Proteinausbrüche bei Histaminstimulation oder Pneumolysinaktivität27,13exozytiert werden. Daher ist die Erzeugung einer hochklebenden, konfluenten Zellschicht differenzierter Primärendothelzellen in durchdiestproliferationsarmen Passagen eine unabdingbare Voraussetzung für eine effiziente VWF-Freisetzung und die Bildung von VWF-Strings auf der Zelloberfläche und Analysen der Bakterien-VWF-Wechselwirkung bei Strömungsbedingungen. So ist zu beachten, dass die Differenzierung der Endothelzellen mindestens 48 h Durchflusskultivierung erforderte und einen konstanten Scherstrom ohne Variationen des Pumpendrucks erforderte. Jede Variation kann zu einer plötzlichen mittleren Explosion führen, die die Zellen aus dem Dia spülen würde. Darüber hinaus mussten bei der mikroskopischen Visualisierung der mikrofluidische Schlitten und die mittleren Behälter des Pumpensystems bei einer Temperatur von 37 °C gehalten werden, da dies das Temperaturoptimum der menschlichen Zellen darstellt.

Verewigte menschliche Zelllinien eignen sich für viele wissenschaftliche Experimente und werden oft in Zellkulturinfektionsstudien eingesetzt. Diese Zelllinien haben einige allgemeine technische Vorteile, wie niedrige oder moderate Kulturanforderungen und unbegrenzte Proliferation, die Passaging mehrere hundert Mal ohne signifikante Änderungen in der Morphologie oder Rezeptorprofile ermöglicht. Diese Zelllinien stellen jedoch eine einsame Monokultur dar und sind künstlichen zweidimensionalen Wachstumsbedingungen ausgesetzt. 28 Die fehlende physiologische Quellgewebeumgebung führt zu wesentlichen Veränderungen des funktionellen und morphologischen Zellphäpnotyps bei jedem Durchgang der Kultur29. Vor anderen bakteriellen Adhäsionsexperimenten wurde das Profil von oberflächenexponierten zellspezifischen Markerproteinen und Rezeptoren menschlicher primärer Lungenendothelzellen in verschiedenen Zellkulturpassagen bestimmt. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab eine stark reduzierte Expression spezifischer Oberflächenproteine wie des Thrombozyten-Endothelzelladhäsionsmoleküls 1 (PECAM1) innerhalb von acht Runden Zellpassaging. Darüber hinaus wurde das exprimierte Integrin-Rezeptor-Profil in höheren Zellpassagen zugunsten eines zelltypunspezifischen Integrin-Rezeptormusters und eines reduzierten zelltypspezifischen Integrin-Rezeptormusters (Bergmann et al., unveröffentlichte Daten) signifikant verändert. Diese Ergebnisse sind besonders relevant für die Analyse von Pathogen-Wirt-Wechselwirkungen in Infektionsbiologiestudien. Mit dem Ziel, die phänotypischen Zelleigenschaften und ein hohes Maß an funktioneller Differenzierung während der mikrofluidischen Zellkultur zum Zeitpunkt der bakteriellen Infektion aufrechtzuerhalten, wurden in diesem Fall primäre Endothelzellen von mehreren Spendern ausgewählt und nur bis zu fünf Passagen maximal, um die phänotypischen Eigenschaften so spezifisch wie möglich zu halten8.

Die kombinierte Visualisierung von Bakterien und spezifischen Zelloberflächenstrukturen während des Durchflusses erfordert ein optimiertes Fluoreszenz-Färbeprotokoll. Mit verschiedenen Kombinationen von direkt markierten Proteinen, fluoreszenzprotein-exzierenden Bakterien und fluoreszenzkonjugierten Antikörpern können Immunfluoreszenz-Färbungsverfahren gezielt an die Visualisierungsziele angepasst werden. Diese Verfahren ermöglichen eine definierte und klare mikroskopische Visualisierung sowie eine Differenzierung und Quantifizierung der bakteriellen Adhärenz und Internalisierung3,13,30,31. Der immunfluoreszenzbasierte Nachweis von internalisierten Bakterien erfordert einen Zellpermeabilisierungsschritt, wie z. B. eine kurze Triton X-100 Inkubation, die zu einer Zellablösung führen kann. Daher sollte der Nachweis von bakteriellen Internalisierungsprozessen, die in einer Strömungskultur auftreten, nach der Inkubation durch Flow mithilfe von PFA-vernetzten Proben visualisiert werden. Für die Echtzeit-Visualisierung von Bakterien im Fluss ermöglicht die Verwendung genetisch veränderter Bakterien, die Fluoreszenzproteine exdrücken, eine schnelle und gezielte mikroskopische Detektion. In dieser experimentellen Studiewurden RFP-extierende Pneumokokkenstämme verwendet, die mit einem effizienten genetischen Konstrukt von Kjos und Veening16entwickelt wurden. Zur Detektion von VWF-Strings im Durchfluss wurden verschiedene VWF-spezifische fluorescein-markierte Antikörper getestet und konnten verwendet werden. Um eine optimale Signalreaktion bei minimiertem unspezifischem Hintergrund zu erhalten, wurde die entsprechende Antikörperkonzentration für jeden angewendeten Antikörper konsequent titriert.

Für die mikroskopische Livezellenbildgebung werden die Fluideinheit und der Kanalschlitten aus dem CO2-Inkubator entfernt und am Mikroskop auf 37 °C vorgewärmt in eine Kammer gelegt. Diese Kammer konnte nicht auf 5%CO2eingestellt werden. Ohne karbonatgepufferte Atmosphäre blieben die HUVEC-Morphologie und die bakterielle Fitness bis zu 180 min intakt, was für die Analyse der VWF-vermittelten Bakterienhaftung ausreicht. Wenn längere Infektionszeiten und mikroskopische Überwachung außerhalb eines CO2-Inkubators erforderlich sind, sollte ein gepuffertes Zellkulturmedium verwendet werden, um pH-Verschiebungen durch unzureichendeCO2-Konzentration auszugleichen. Alternativ könnte das gesamte System zwischen den Schritten einer Zeitreihe der mikroskopischen Visualisierung wieder in den CO2-Inkubator eingebracht werden.

Zusätzlich zum Fluoreszenznachweis in Echtzeit kann die bakterielle Infektion des Endothels innerhalb des Kanalschlittens durch mittleren Austausch mit Paraformaldehyd (PFA) als Fixierungssubstanz gestoppt und konserviert werden. Nach der Fixierung im Durchfluss ermöglicht die optimierte und stufenweise Immunfluoreszenzfärbung der Zelloberfläche innerhalb des Kanalschlittens die Generierung wertvoller mikroskopischer Snapshot-Visualisierungen und ermöglicht eine vielseitige kombinierte Strukturdetektion spezifische zelluläre Verbindungen, die an der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtszellen beteiligt sind. Der wissenschaftliche Vorteil dieser kombinierten Methode besteht darin, dass der PFA-behandelte Kanalschlitten gespeichert und für eine Immunfluoreszenzfärbung der Interessenstrukturen nach dem Durchfluss verwendet werden kann. Die PFA-Behandlung inaktiviert die Bakterien und hält so die Expression von RFP-Protein. Daher wurde bei Kaninchen ein Pneumokokken-spezifisches Antiserum zur bakteriellen Immundetektion erzeugt und mit einem kaninchenspezifischen AlexaFluor568-konjugierten Sekundärantikörper8. Wie bereits erwähnt, erfordert die Verwendung verschiedener Antikörperkombinationen eine exakte Optimierung der Antikörpermengen und der Blockierpufferzusammensetzung. Andernfalls können unspezifische Hintergrundsignale und Kreuzerkennungseffekte zu künstlichen Färbeergebnissen führen. Ein optimiertes Immunfluoreszenz-Färbeverfahren kann problemlos zum Nachweis vieler verschiedener zellulärer Targets wie des Aktin-Zytoskeletts oder der endosomalen Marker13,31verwendet werden.

Dieses Verfahren kann angepasst werden, um eine komplexere Gewebeumgebung zu schaffen, die Physiologie aus histologischer, physiologischer und funktioneller Sicht imitiert. Die vorgestellten Infektionsanalysen können effizient genutzt werden, um mehrere wissenschaftliche Fragen gleichzeitig zu beantworten, indem eine In-Line-Verbindung mehrerer Kanalschlitten zu einem Perfusionssatz verwendet wird. Diese erweiterte Einrichtung würde die Analyse verschiedener Zelltypen, Zellzusammenflüsse und unterschiedlicher Gleitbeschichtungen innerhalb derselben Strömungseinstellung parallel erleichtern und einen direkten Vergleich von bakteriellen Infektionen verschiedener Zelltypen ermöglichen. Darüber hinaus bieten die serielle in Line-Verbindung und kombinierte Analysen mehrerer Kanalgitas auch die Möglichkeit von Zeitreihenexperimenten, die für die Genexpressionsprofilierung (z.B. die Analyse des infektionszeitabhängigen Virulenzfaktors) angewendet werden können. Genexpression).

Die Infektionsanalysen können auch auf einen konstanten laminaren Strömungszustand ausgedehnt werden, der mehrere Tage oder sogar Wochen dauert, um das zelluläre Ansprechen unter Bedingungen zu analysieren, die eine langfristige chronische Infektionsphase imitieren. Neben der vorgestellten einzelzelligen Typkultur wurden bereits einige Beispiele für heterotypische Zellkultur in mikrofluidischen Zellkulturgeräten32,33berichtet. Dies ermöglicht pharmakologische Untersuchungen mit hohem Durchsatz und könnte letztlich zur Verwendung mikrofluidischer Zellkultursysteme für regenerative Zwecke sowie34führen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das mikrofluidische System in Kombination mit Immunfärbungsverfahren als wertvolles Modell für die Analyse von Pathomechanismen zwischen Bakterien und Wirtszellen in einer Umgebung diente, die die Bedingungen innerhalb des Gefäßsystems simuliert.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Das Projekt wurde von der DFG (BE 4570/4-1) an S.B. gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-syringe Fisher Scientific 10303002 with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe Sarstedt 9077136 For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase eBioscience now thermo fisher 00-4555-56 protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin Abcam ab176751 no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody Thermo Fisher Sientific A11001 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody Thermo Fisher Scientific A-11011 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth Becton Dickinson GmbH BD 249210 complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-25G solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter TPP 90026 subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R Beckman Coulter Life Sciences 392304 spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30 Beckman Coulter Life Sciences B06314 spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK Hermle 305.00 V05 - Z 216 M spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3886.2 used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing ibidi 10821 for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator Fisher Scientific MIDI 40 incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-Incubator Sanyo MCO-18 AIC for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar plates Becton Dickinson GmbH PA-254005.06 agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer Dell Latitude 3440 Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) Leica DMi8 An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3904.1 used for PBS buffer
Drying material Merck 101969 orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix Promocell C-39215 supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMS Promocell C-22010 ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) Promocell C-22010 culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS) biochrome now Merck S 0415 supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody Abcam ab8822 stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit ibidi 10903 fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G-1890-100g for precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochloride Sigma Aldrich H-7250-10MG for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) Promocell C-12203 Lot-Nr. 396Z042 primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) Santa Cruz sc73268 stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port ibidi 10820 for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope Zeiss Axiovert 35M inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) ibidi 80176 physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) Sigma Aldrich M7506-500G For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump ibidi 10905 air pressure pump
Neubauer cell counting chamber Karl Hecht GmbH&Co KG 40442002 microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710-S for cross linking of samples
Perfusion Set ibidi 10964 Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS) the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes Sarstedt 67,741 (2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum Pineda raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 6781.1 used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) ibidi v1.5.4 Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mL Sarstedt 72.706/ 72.695.500 required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volume Sarstedt 6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci National Collection of Type Cultures, Public Health England 10,319 Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mL Sarstedt 86.1253.025/ 86.1254.025 for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) Sigma Aldrich 451614-25G for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe P030.2 used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22 Biochrom 80-2115-20 measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose Sigma Aldrich S0389-500G for preparation of blocking buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-500ML Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract oxoid LP0021 bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 152 Streptococcus pneumoniae mikrofluidische endotheliale Zellen Mikroskopie Fluoreszenz Scherspannung Haftung
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Jagau, H., Behrens, I. K., Steinert, M., Bergmann, S. Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow. J. Vis. Exp. (152), e60323, doi:10.3791/60323 (2019).

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