Summary
מחקר זה מתאר את הניטור המיקרוסקופית של הדבקות הפנקוקוס על מחרוזות וויללרנד של פון וילבלאנד המיוצר על פני השטח של תאים אנושיים מובחנים ראשוניים תחת לחץ הטיה בתנאי זרימה מוגדרים. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב להדמיה מפורטת של מבני תאים ספציפיים וכימות חיידקים על ידי החלת הליכי חיסוני דיפרנציאלי.
Abstract
אינטראקציה של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס עם פני השטח של תאים אנדותל מתווך בזרימת הדם באמצעות חלבונים מכניביים מרכיב כגון מקדם וויללמותג פון (vwf). גליקופרוטאין זה משנה את המבנה המולקולרי שלה בתגובה למתח ההטיה, ובכך חושף אתרי כריכה לקשת רחבה של מארחים ואינטראקציות. באופן כללי, הקפדה על תאי האנדותל הראשוניים תחת זרימת הטיה מוגדרת לקדם את הבידול התאי המסוים ואת היווצרות של שכבת אנדותל יציבה ומקושרת היטב הדומה לפיזיולוגיה של הציפוי הפנימי של כלי הדם . לפיכך, ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות בין פתוגנים חיידקיים לבין הפונדקאי המארח מעורבים חלבונים מכנימים רגישים דורש הקמת מערכות משאבה שיכולות לדמות את כוחות הזרימה הפיסיולוגיים הידועים להשפיע על פני השטח של תאי כלי הדם.
המכשיר המיקרו-פלואידיג המשמש במחקר זה מאפשר הפעלה מתמשכת ורציפה של נוזלים עם קצב זרימה מוגדר. מערכת משאבת לחץ האוויר מבוקרת המחשב מחיל לחץ הטיה מוגדר על משטחי תא אנדותל על ידי יצירת זרימה רציפה, חד כיווני, בינונית ומבוקרת. שינויים מורפולוגיים של התאים והקבצים המצורפים החיידקיים יכולים להיות מנוטרים באופן מיקרוסקופי ולכמת בזרימה באמצעות שקופיות ערוץ מיוחדות המיועדות להדמיה מיקרוסקופית. בניגוד לזיהום התרבות התא סטטי, אשר באופן כללי דורש קיבעון לדוגמה לפני תיוג החיסונית ניתוחים מיקרוסקופיים, שקופיות microflu, מאפשר הן איתור מבוססי-פלואורסצנטית של חלבונים, חיידקים, ורכיבים סלולריים לאחר קיבעון דגימה; כתמים מוחיסורתיים; וגילוי מבוסס-פלואורסצנטית ישיר בזמן אמת. בשילוב עם חיידקים פלורסנט ונוגדנים ספציפיים המסומנים בקרינה פלואורסצנטית, זה הליך זיהום מספק מערכת יעילה מרובת רכיבים מרובים עבור ספקטרום עצום של יישומים מדעיים הקשורים תהליכים כלי דם.
Introduction
הפתוגנזה של זיהומים פנאומטי מאופיין באינטראקציה רבת-פנים עם מגוון של תרכובות מטריצות ורכיבים של המטאוסטזיס האנושי, כגון פלמיננוגן ו vwf1,2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה רב התחומים גליקופרוטאין VWF משמש כרגולטור מפתח של הומוסטאזיס מאוזנת על ידי גיוס thrombocyte מדיה ו התאגדות פיאין באתר של היווצרות כלי דם הטרובוס9. החשיבות של הפונקציונלי, VWF פעיל עבור שליטה דימום וריפוי הפצע הוא הפגינו על ידי המחלה של פון Willebrand, הפרעת דימום משותף הפרעה10.
כדורי vwf מסחררת במערכת הדם האנושי בריכוז של עד 14.0 μg/mL11,10. בתגובה לפציעה וסקולרית, שחרורו המקומי של vwf על ידי הגופים האלה של weibel palade (wbp) גדל במידה ניכרת11,12. מחקרים קודמים מראים כי הדבקות האנטי-קוקוס לתאי האנדותל של האדם והייצור של הנקבוביות היוצרות משאבה משמעותית מעוררת באופן משמעותי את הפרשת הלומיאל (VWF)13. הכוחות ההידרודינמיים של זרימת הדם גורמים לפתיחת מבנה של תחומים VWF מכנימים. בקצב זרימה של 10 דינמיקה/ס"מ2 vwf multimerizes למחרוזות חלבון ארוך של עד כמה מיקרומטר באורך הנותרים מחוברים subאנדותל10,12.
כדי להבין את הפונקציה של מחרוזות VWF מולטימzed שנוצר תחת לחץ הטיה באינטראקציה של אבקת הקוקוס עם משטח אנדותל, מבוססי microfluidic מבוסס תרבות התא הגישה זיהום הוקמה. התקן מיקרופלואידיג עם מערכת משאבת הלחץ על התוכנה בקרת האוויר שימש. פעולה זו איפשרה הפעלת מבנה חד-כיווני ורציף של מדיום תרבות התא עם קצב זרימה מוגדר. ובכך, המערכת החלה להדגיש הטיה מוגדרת על פני השטח של תאים אנדותל, אשר נשאר מחובר בתוך שקופיות הערוץ המקצועית. גישה זו אפשרה את הסימולציה של כוח ההטיה בתוך זרם הדם של מערכת כלי הדם של האדם, שבו מחרוזות VWF מופקים על תאים אנדותל מובחנים בתנאי זרימה קבועים מוגדרים. לצורך זה, תאי האנדותל מעובדים בשקופיות מסוימות של ערוצים (ראו טבלת חומרים), שהותאמה לניתוחים מיקרוסקופיים במהלך הזרימה. מערכת המשאבה microflu, מספק את המצב מאוד מוגדר ומבוקר לחץ להטות הנדרש עבור היווצרות של מחרוזות VWF המורחבת על שכבת התאים שוטפת של הרשת. לאחר הגירוי של VWF-הפרשה של האדם בוגר הטבור וריד בתאי הטבורי (HUVEC) על ידי תוספי היסטמין, היווצרות מחרוזת המושרה על ידי החלת מתח הטיה (ԏ) של 10 דינמיקה/cm2. לחץ ההטיה מוגדר ככוח הפועל על שכבת התא. הוא מחושב בקירוב על פי הקורנית. אל14 עם משוואה 1:
כאשר ԏ = להטות את המתח בדינמיקה/cm2, η = צמיגות ב (דינמיקה ∙ s)/cm2, h = מחצית גובה הערוץ, w = חצי רוחב הערוץ, ו Φ = שיעור flowrate-mL/min.
התוצאה של משוואה 1 תלויה בגבהים וברוחב השונים של השקופיות השונות המשמשות (ראה טבלת חומרים). במחקר זה שקופית ערוץ luer של 0.4 יקרומטר והתוצאה היא גורם שקופית קאמרית של 131.6 שימש (ראה נוסחה 2).
צמיגות של המדיום ב 37 ° c הוא 0.0072 דינמיקה ∙ s/cm ² ו להטות את הלחץ של 10 דינמיקה/cm ² שימש. זה הביא לקצב הזרימה של 10.5 mL/min (ראה פורמולה 3).
כאן, הסתגלות וקידום של הליך מיקרופלואידיג תא culturing באמצעות מערכת זרימה חד-כיוונית למינארי עבור החקירה ויזואליזציה של מנגנוני זיהום חיידקי בתוך המארח המארחים מתואר בפירוט. הדור של מחרוזות VWF על שכבות אנדותל יכול להיות גם מגורה באמצעות מערכות משאבה אחרות, כי הם מסוגלים להחיל לחץ מתמשך ויציב להטות15.
לאחר הטיפוח של תאי האנדותל הראשוניים למפגש בזרימה וגירוי של היווצרות מחרוזות VWF, הבעת הופעת חלבון פלואורסצנט אדום (RFP)16 נוספו לשכבת התא האנדותל תחת שליטה מיקרוסקופית מתמדת. ההחזקה של חיידקים כדי vwf מחרוזות על פני השטח של תאים אנדותל היה מאכל דמיין והפיקוח עד שלוש שעות בזמן אמת על ידי שימוש ב-vwf ספציפי נוגדנים מתויג-פלורסנט. עם גישה זו, התפקיד של VWF כמו קופקטור הדבקה לקידום ההחזקה החיידקית של כלי הדם אנדותל היה נחוש8.
בנוסף להדמיה המיקרוסקופית של הפרשת החלבון והשינויים השונים, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לפקח על צעדים בודדים של תהליכי זיהום חיידקי בזמן אמת, כדי לכמת את כמות החיידקים המצורפים בנקודות זמן שונות של זיהום. מערכת ספציפית מבוקרת תוכנה מספקת גם את האפשרות לתרבות התאים האנדותל בתנאי זרימה קבועה מוגדר למשך עד מספר ימים ומאפשר הדגירה פעמו זרימה בינונית. כמו-כן, ניתן להחיל שיטה זו באמצעות סוגי תאים שונים. התאמת פרוטוקול הצביעת גם מאפשרת איתור והדמיה של חיידקים הפנימו לתוך תאים איקריוטית.
כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הניסיוני המתקדם שניתן להשתמש בו כגישה מוגדרת, אמינה וניתנת ליישום לאפיון יעיל ותכליתי של תהליכים פתופסלוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הטיפוח-תרגול של התאים המיקרופלואידיג התבצע עם תאי הטבור העיקריים של העורק האנושי הראשי (HUVEC). החברה מבודדת את התאים עם הסכמה מושכלת של התורם. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של הלשכה הרופאים של המדינה הפדרלית באדן-Wuerttemberg עם מספר הסימוכין 219-04.
הערה: ראה טבלת חומרים לאספקת פרוטוקולים.
1. טיפוח-תרגול של תאי האנדותל הראשוניים
- הפשרת בקבוקון גליצרול קפוא המכיל 1 x 105 HUVEC הראשי מתוך שלושה תורמים שונים בעדינות ב 37 ° צ' ו הזרע את התאים 7 מ ל של הצמיחה של תא אנדותל בינונית (ecgm, מוכן לשימוש עם תוספי) ב 25 ס מ2 תא בקבוקון.
הערה: התאים האנדותל העיקריים מאבדים את יכולת הבידול לאחר יותר מ -5 מחזורי הפצה. לכן, רק תאים עם פחות מ 5 מעברים ניתן להשתמש אם ציונים גבוהים של בידול התא נדרשים. - לטפח את התאים ב 37 ° c ב 5% CO2 אווירה עבור 60 דקות כדי לאפשר מצורף משטח ולהחליף את המדיום תרבות תא ecgm כדי להיפטר שאריות מהקפאה.
- המשך לשלב את התאים בשעה 37 ° cבאווירה של 5% שכונתיות עד שהם יוצרים שכבת תא תת-שוטפת.
הערה: ה-HUVEC אינו צריך לצמוח לשכבה שוטפת מאז שאנשי הקשר הצמודים לתאי התא מונעים היווצרות שכבת תא יציבה בהמשך הזרימה.
2. טיפוח-תרגול של סטרפטוקוקוס
אזהרה: דלקת ריאות סטרפטוקוקוס היא ברמת בטיחות 2 סוכן והוא מותר רק להיות תרבותי ב אבטחה טיחות רמת 2 מעבדות. השתמש ספסל נקי מסווג עבור רמת בטיחות 2 עבור כל הטיפולים חיידקי, להימנע בקפדנות היווצרות תרסיס, ולהשתמש צנטריפוגה עם הגנה תרסיס לשקעי חיידקים.
- אינוחסן דם קולומביה צלחת אגר עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס בידוד ATCC11733 נגזר מתוך מניות גליצרול מאוחסן כל הזמן ב-80 ° c ולטפח את הצלחת אגר לילה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- הכינו 40 מ ל של מרק נוזלי של טוד יואיט בתוספת תמצית שמרים 1% (שלך) ו 15 מ ל של מלוחים סטרילי באגירה פוספט (PBS) pH 7.4, לטיפוח בקטריאלי ושטיפת שלבים.
- השתמשו בצינור סטרילי לטיפוח חיידקי ומשתמשים בציר התרבות הנוזלי עם מסה חיידקית. שלוט על כמות החיסונים במדידה של 1 מ ל ב600 ננומטר נגד מרק נוזלי שאינו מחוסן כהפניה. מילוי מסה חיידקית לתוך המרק הנוזלי עד שהוא מגיע לדחיסות אופטית ב 600 ננומטר (OD600) של 0.15.
- משחיז את המרק הנוזלי מחוסן מבלי לרעוד ב 37 ° צ' ו 5% CO2 ולקבוע את OD600 כל 30 דקות על ידי מדידת 1 mL הalits באמצעות כימיקלים פלסטיק.
- ברגע התרבות החיידקית הגיע OD600 של 0.4, אשר מתאים לשלב הגידול האקספוננציאלי, צנטריפוגה את השעיית התרבות החיידקית עבור 10 דקות ב 1,000 x g בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: אל תאפשר התרבות הפנאומטי כדי להגיע OD600 של יותר מ 1.0, כי צפיפות התרבות הגבוהה והפנאומטי הגבוה ידוע להפעיל את הקישור החיידקי בקטריאלי, אשר עשוי להשפיע על הכושר הכולל חיידקי. - להשעות משקע חיידקי בעדינות עם 10 מ"ל PBS ו משקע שוב עבור 10 דקות ב 1,000 x g ב RT.
- מחדש את המשקעים בקטריאלי שטף בעדינות ב 1 מ ל PBS ולקבוע את OD600 של 10 μl של ההשעיה חיידקי באמצעות 1 ML של PBS כהפניה.
- להתאים את כמות החיידקים ב-PBS ל-OD600 של 2.0. לדברי לשעבר ספירת חיידקים נקבע, OD600 של 2.0 מתאים 2 x 109 המושבה היוצרים יחידות (cfu). מיד להמשיך עם ההליך זיהום כדי למנוע אוטומטית בקטריאלי.
3. טיפוח תאי האנדותל של HUVEC בתנאים מיקרו-פלואידידים
- נתק את תאי האנדותל העיקריים מהבקבוקון של תרבות התא על ידי פרוטפוליזיס נשלט. בצע את השלבים הבאים בסביבה סטרילית באמצעות ספסל נקי. הכינו נפח של 15 מ ל של PBS סטרילי עבור שלבי הכביסה.
- הסר את ה-ECGM משכבת-HUVEC הגדלה באופן שוטף ושטוף את שכבת התאים עם 10 מ ל PBS באמצעות פיפטה סרוולוגית כדי להיפטר ממדיום תרבות התא.
- המלון משלב את שטיפת HUVEC עם 3 מ ל של 37 מעלות צלזיוס של פתרון הדיסוציאציה לניתוק תאים עבור 5 דקות ב 37 ° c. שימו לב לניתוק התא של הפרוטחרדה על ידי ניטור מיקרוסקופי בכל דקה.
- פיפטה תא מנותק הבולם לתוך צינור המכיל 7 מ ל של ECGM בתוספת 2% סרום עגל עוברי (FCS) עבור עצירת הפרוטפוליזיס משקע את התאים עבור 3 דקות ב 220 x g ב RT.
- הסר את supernatant ולהשעות מחדש את HUVEC ב 250 μL של ECGM שיושלם עם 5% FCS ו 1 מ"מ MgSO4. השתמש 10 μL של השעיית התא עבור ספירת תאים באמצעות תא Neubauer אואר לספור ולהתאים את ספירת התא כדי 4 x 106 תאים/ML ecgm בתוספת 5% fcs ו 1 מ"מ MgSO4.
הערה: עבור כל ניסוי זרימה 30 מ ל של ECGM בינונית שיושלם עם 5% FCS עם 1 mM MgSO4 יידרש. מכאן על הרכב בינוני זה נקרא ECGMS-בינונית. הגידול של ריכוז FCS במדיום התרבות מ 2% כדי 5% תומך תא מצורף והכדאיות התא של HUVEC שופרה בשקופית הערוץ. תוספי מדיום FCS ו MgSO4 לייצב באופן משמעותי את התא המצורף של HUVEC תחת תנאי לחץ הטיה.
- הזרע ולטפח את HUVEC בשקופית הערוץ. לעבוד בסביבה סטרילית באמצעות ספסל נקי. התאים יהיו מעובדים תחת לחץ הטיה עבור 2 ימים ואחריו זיהום עם חיידקים ניטור מיקרוסקופיים עבור אחר 2 h.
- שקופית ערוץ, מערכת זלוף 1.6 מ"מ קוטר ו 50 ס"מ אורך, סדרת מחלקים של ecgms-medium, ו luer ערוץ שקופית 0.4 יקרומטר בגובה, עבור 24 h בחממה עם 5% CO2 אווירה ב 37 ° צ' כדי להקטין את מספר בועות האוויר.
הערה: הליך זה מומלץ לדגה את הציוד הפלסטי ולחמם את המדיום, את צינורות ההיתוך ואת המאגרים. אם החומרים או הנוזלים אוחסנו ב-RT או במקרר, הגזים המומסים בפלסטיק ובנוזלים ישוחררו כאשר הם ייתחממו בחממה במהלך הניסוי. בועות הגז יופיעו לאחר מכן. מנטרל את כל רכיבי הפלסטיק לפני הניסוי יבטל את האפקט הזה. בכל פעם שהמערכת נלקחת מהאינקובטור, תהליך קליטת הגז מתחיל שוב. לכן, לעבוד במהירות ב-RT ולעולם לא להשאיר את יחידת פלואידים מחוץ לחממה לפרקי זמן ארוכים יותר. - השתמש בפיפטה כדי להזריק 100 μL של 2% בתמיסה סטרילית מסוננת של הג בפתרון PBS לתוך אחד המאגרים של שקופית ערוץ טמפרטורה. מודיית את הג-פתרון עבור 1 h ב 37 ° צ' ולשטוף את הערוץ של השקופית עם 1 mL PBS בתנאים סטרילי באמצעות 1 mL מזרק Luer.
- הצב את שקופית הערוץ המצופה בג בקלקר דק או בצלחת קלקר כדי למנוע ירידה בטמפרטורת השקופית. הוסף 100 μL של 4 x 106/Mlההשעיה HUVEC עם מזרק 1 ML luer לתוך השקופית.
הערה: הצבת שקופית הערוץ על משטח המתכת הקר של הספסל הנקי עלולה להקטין את הטמפרטורה של תחתית השקופית, ובכך ליצור לחץ קר לתאי האנדותל. במהלך ליטוף התא ללטף את השקופית קצת למעלה כדי לתת בועות אוויר לעלות ולהיעלם מתוך השקופית. - דגירה שקופית הערוץ עם HUVEC עבור 60 דקות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 ולמלא את המאגרים בינוניים בשני הקצוות של שקופית הערוץ עם 60 ΜL ecgms-בינוני כל. מודטה עבור 1 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- שקופית ערוץ, מערכת זלוף 1.6 מ"מ קוטר ו 50 ס"מ אורך, סדרת מחלקים של ecgms-medium, ו luer ערוץ שקופית 0.4 יקרומטר בגובה, עבור 24 h בחממה עם 5% CO2 אווירה ב 37 ° צ' כדי להקטין את מספר בועות האוויר.
- כוונן את המשאבה המיקרופלואידיג ואת הגדרות התוכנה.
- חבר את הפרפיוז הבינוני שנקבע ליחידת המשאבה, מילוי עם 13.6 mL של ECGMS-medium, והפעל את תוכנת בקרת המשאבה. בחר את ערכת המיזוג הנאותה ואת סוג השקופית הקאמרית באמצעות הגלילה למטה החלונות בתפריט של יחידת פלואידים להגדיר. בחר 0.007 (דינמיקה ∙ s/cm2) בתוכנה עבור צמיגות בינונית. (עיין בהגדרות התוכנה של משאבת הלחץ המסומנות בחיצים אדומים באיור המשלים 1).
- מחוץ לחממה, לחבר בקבוק זכוכית מלא עם מחרוזת סיליקה לייבש צינורות לחץ אוויר (להתייחס לאיור 1, שיבוץ 3). האוויר של משאבת הלחץ מסתובב בין המאגרים זלוף ואת המשאבה צריך להיות יבש לפני הכניסה מחדש למכשיר המשאבה. בחר פרמטרי זרימה בתפריט תוכנה, להגדיר את הלחץ 40 mbar, ולשטוף את צינורות המשאבה עם המדיום הנוזלי על ידי הפעלת זרימה בינונית רציפה. (הגדרות אלה מסומנות גם על ידי חיצים אדומים באיור המשלים 1).
- התוכנית הרצויה להטות את הלחץ מחזורים של טיפוח הזרימה. התחל עם 5 דינמיקה/cm2, בקרת מאגר מאוזנת דלעת ולהבטיח כי אין בועות אוויר במחזור במערכת המשאבה.
הערה: הקיר להטות את המתח בשקופית הערוץ תלוי בקצב הזרימה ואת צמיגות של המדיום זלוף. אם השימוש במערכת משאבה אחרת, עיין במשוואות המתוארות במבוא לקביעת קצב זרימה היוצר את רמת הסטרס הרצויה של ההטיה. ההגדרות המתוארות מתאימות לקצב הזרימה של 5.42 mL/min. (צילום מסך למופת המציג את הגדרות הפרמטרים של הזרימה הנאותה בתוכנת משאבת הלחץ מופיעה באיור המשלים 2). - להפסיק את זרימת הזרימה בתוכנת בקרת המשאבה ולהחזיק את הזרימה הבינונית בצינורות זלוף על ידי לולאה את הצינורות ליד חיבורי luer. חבר את שקופית הערוץ, ובכך למנוע בועות אוויר, ולמקם את יחידת flu, עם שקופית הערוץ המחובר ב-CO2 חממה ב 37 ° c ו 5% CO2. הפעל את לחץ ההטיה ב-5 דינמיקה/cm2 עבור 30 דקות כדי להתאים בצורה חלקה את התאים לכוחות שנוצרו על-ידי לחץ ההטיה לפני האצת רמת הלחץ ההטיה (ראה איור 3).
הערה: לדאוג כי לא יישארו בועות אוויר במערכת הצינורית או בשקופית לאחר התחברות למערכת הצינורית, מכיוון שהתנועה של בועות אוויר בזרם עלולה להוביל לניתוק תאים. - להאיץ את המתח להטות ל 10 דינמיקה/cm2 (אשר מתאים 10.86 mL/min בהגדרה זו של זרימה) ו מודקת שקופית הערוץ במתח הטיה רציפה עבור 48 h ב חממה קטנה CO2 ב 37 ° צ' ו 5% co2 כדי לאפשר בידול התא ( settinngs תוכנה בהתאמה מצוינים עם חיצים אדומים באיור המשלים 4).
הערה: תאים HUVEC נוטים להתנתק ממשטח הערוץ אם טיפוח הזרימה החלה ישירות ב 10 דינמיקה/cm2. התאים נשארים מחוברים למשטח החדר אם טיפוח הזרימה מתחיל עם פחות מתח הטיה באמצעות 5 דינמיקה/cm2 עבור מינימום של 30 דקות ואחריו על ידי הגדלת הלחץ הטיה לאט עד הרצוי 10 דינמיקה/cm2. מתח הטיה של 10 דינמיקה/cm2 הוא הערך המינימלי בהגדרת הפרזיה הנדרשת עבור היווצרות מחרוזת vwf. - לאחר 24 שעות של טיפוח תא microflu, לעצור את הזרימה בינונית עם תוכנת בקרת המשאבה בדיוק כאשר רמת בינונית מאוזנת מתמלאת בשני מאגרים בינוניים. הניחו את יחידת הפלואידיג בספסל נקי והסירו 10 מ ל של מדיום הטיפוח-תרגול של מאגרי הפרזיה בעזרת מצפטה בגודל 10 מ ל. הוסף 10 מ ל של ECGMS-בינוני לתוך המאגרים כדי לחדש את המדיום, למקם את יחידת פלואידיג חזרה לתוך החממה CO2 ב 37 ° צ' ו 5% CO2, והפעל מחדש את הטיפוח flu, באמצעות תוכנת בקרת המשאבה.
הערה: הפונקציה של משאבת הלחץ יכול לפתע להיות מופרת על ידי מכונות מעבדה כגון צנטריפוגות גדולות, אשר עשוי ליצור הפרעה שדה חזק מגנטי. ההפרעה הפתאומית הזאת. עלולה להוביל לניתוק תאים לדאוג כי מכונות כאלה אינם פעילים ליד משאבת הלחץ במהלך הניסוי. - התחילו את ההתחממות המוקדמת של תא הדגירה של הטמפרטורה המכסה את השלב של המיקרוסקופ הפלואורסצנטית ל 37 ° c עבור טמפרטורה לרמה 24 שעות לפני ההדמיה המיקרוסקופית. לאחר המיקרוסקופ הוא מראש, להתחיל את השליטה בתוכנה מיקרוסקופ ולהתאים את ההגדרות העיקריות עבור ניטור מיקרוסקופיים פלואורסצנטית על ידי בחירת הגדרות מסנן המתאים (540 nm/590 nm לאיתור של חיידקים RFP הביע 470 nm/515 ננומטר לאיתור פליטת fluorescein של נוגדנים בעלי FITC-מצופיסגור-ספציפי. לחמם תא חימום נוסף לדגירה של יחידת הפלואידיג ב 37 ° c.
הערה: במהלך ניתוחי זיהום וניטור מיקרוסקופיים את הטמפרטורה של שקופית הערוץ ואת המדיום במחזור לא צריך להקטין באופן משמעותי, כי זה יהיה לייצר לחץ קר על התאים. באופן כללי, הגודל של תאי הטמפרטורה המכסה את המיקרוסקופ אינו מספיק כדי לכסות את כל יחידת הפלואידיג. לכן, מומלץ להשתמש בחדר חימום נוסף שחומם ל37 מעלות צלזיוס. - להדמיה מיקרוסקופית, הציבו את יחידת הפלוטואידים בחדר החימום הקדם-ממדי של 37 ° c והציבו את שקופית הערוץ בשלב של 37 ° c מיקרוסקופ מראש.
הערה: להדמיה מיקרוסקופית, יחידת הפלואידיג ושקופית הערוץ הדרושים להסרה מאינקובטור של CO2 בשל האורך המוגבל של אבובים הפרזיה. אם זמני זיהום וניטור מיקרוסקופיים יותר מ 180 דקות נדרשים מחוץ 5% CO2 האטמוספירה עבור pH אגירה, מדיום באגירה ph צריך לשמש לטיפוח מיקרופלואידיג. - לשלוט על מורפולוגיה התא ואת היושרה של שכבת HUVEC לפני הזרקה של היסטמין וחיידקים למחזור זרימת לאורך זמן ניסוי הזרימה ולאחר סיום ניסוי הזרימה באמצעות מצב שדה בהיר של המיקרוסקופ.
4. אינדוקציה של VWF-שחרור והדמיה של מיתרים VWF מולטימאד
- לשמור על הגדרת הזרימה, כי לחץ ההטיה של 10 דינמיקה/cm2 נדרש כדי להפעיל את המולטימטיזציה של vwf למחרוזות ארוכות של עד 200 מד א. לזרז את שחרורו של vwf מ-wpb אנדותל על ידי הזרקת 136 μl של 100 mM היסטמין פתרון מניות לתוך מחזורי ecgms-בינוני בצינורות זלוף באמצעות יציאת הזרקה. הריכוז הסופי של היסטמין. במדיום הזורם יהיה 1 מ"מ אם אין יציאת הזרקה זמין, היסטמין ניתן להוסיף לחילופין על ידי ליטוף לתוך המדיום של מאגרי המשאבה.
- עבור האבחון של מחרוזות VWF החיסונית של multimerized, לעצור את הזרימה כאשר רמת בינונית מאוזנת במאגרים הוא הגיע, ולהזריק 20 μg של נוגדן מצומת VWF ספציפי בנפח של 200 μL PBS (pH 7.4) לתוך במחזור 13.6 mL של ECGMS-בינוני באמצעות יציאת הזרקה. אם אין יציאת זריקה זמינה, את הנוגדן ניתן להוסיף לחילופין על ידי ליטוף לתוך המדיום של מאגרי המשאבה. התוצאה היא ריכוז נוגדן הסופי של 1.3 μg/mL.
- עבור סריקה מיקרוסקופית של מספר שדות של תצוגה בתוך זמן קצר, השתמש ביחידת הזריחה של המיקרוסקופ עם מכשיר פלואורסצנטית קסנון ב 30% כוח מצלמה אפיפלואורסצנטית. נטר את הצורה ואת המבנה של שכבת HUVEC עם מצב שדה בהיר כדי לבחור תאים מייצגים מתאים הדמיה VWF-מיתרים.
- עבור ויזואליזציה של מחרוזות VWF פלורסנט ירוק, בחר מטרת שמן 63 x/1.40 ומסנן זיהוי nm 470 ננומטר בתפריט היחידה הפלואורסצנטית של תוכנת המיקרוסקופ (LasX). צור תמונות של Z-ערימות של לפחות 50 התצוגות של שדה הנציג, כל אחד המכיל כ 10 HUVEC ללא שינוי מורפולוגית. לקוונפיקציה של מחרוזות VWF פלורסנט ירוק בנקודות זמן שונות, לסרוק כמה שדות של תצוגה.
5. מיקרוסקופיים הערכה של מצורף חיידקי VWF-מיתרים זורם בזמן אמת
-
לכמת את האביזר הפנאומטי ל-VWF-מיתרים שנוצרו על משטחי תא HUVEC באמצעות זיהוי immunofluorescence.
- להחזיק את הזרם ולהזריק 1.35 x 108 cfu/ML rfp-הביע פנאומטי בנפח מרבי של 1 mL לתוך ECGMS-בינונית באמצעות יציאת ההזרקה. לחילופין, פיפטה את החיידקים לתוך המדיום במאגר המשאבה. הפעל מחדש את הלחץ הטיה ב 10 דינמיקה/cm2 כדי לאפשר לחיידקים לזרום בתוך מערכת המשאבה.
- בחר 63 x מטרת הטבילה שמן להגדלה מיקרוסקופ ולהתאים את הגדרות מסנן הזריחה בתוכנת המיקרוסקופ ל-RFP-ערוץ (540 לזיהוי ננומטר מסנן) לאיתור של RFP-הביע פנאומטי.
- עבור כימות של החזקה בקטריאלי למחרוזות VWF, לעצור את הזרימה וליצור תמונות של Z-ערימות של לפחות 30 השדה הנציג תצוגות, כל אחד המכיל כ 10 מורפולוגית ללא פגע HUVEC, ולספור את כמות הפנאומטי.
- השתמש באלגוריתם הסטטיסטיקה של העצרת הראשונה של ANOVA כדי להעריך את הנתונים, ולאחר מכן בדיקת דגימה דו-זנבית בעלת שני הזנב לאחר השוואה סטטיסטית מפורטת. ערכי P של < 0.05 נחשבו משמעותיים מבחינה סטטיסטית.
6. הערכה מיקרוסקופית של בקטריאלי מצורף ל VWF-מיתרים לאחר קיבעון לדוגמה
- לדגום את הקיבעון לפני. הצביעת האימונולוורנציה
- לעצור את הזרימה, להסיר 10 מ ל של ECGMS-בינוני מתוך מאגרי המשאבה, ולהוסיף 10 מ ל של PBS שיושלם עם 5% פאראפורמלדהיד (בתחתית). תן את הפתרון הדינמיקה לזרום 10 דקות במתח הטיה של 10/cm2.
- נתק את שקופית הערוץ מיחידת המשאבה.
- חסום אתרי קשירה לא ספציפיים על משטח התא ובצע זיהוי חיסוני של מחרוזות VWF וחיידקים מצורפים.
- הכינו 4 מ ל של פתרון כביסה המכיל 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) שיושלם עם 4% סוכרוז עבור כל שלבי הכביסה. הכינו 1 מ ל של פתרון חסימה המכיל 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) שיושלם עם 4% סוכרוז ו 2% בסרום בקון אלבומין (bsa) עבור חסימת אתרי איגוד לא ספציפי.
- לשטוף את השקופית התחתית הערוץ 3x שקופית באמצעות 1 mL מזרק Luer להזריק 200 μL של פתרון כביסה ומארג השקופית עבור 120 דקות בשעה RT עם 200 μL חסימת פתרון.
- הכן 4 מ מ של פתרון חוסם אחר המכיל 100 mM Na2CO3, (pH 9.2) שיושלם עם 4% סוכרוז ו 0.5% bsa עבור דילול של נוגדנים. השתמש 200 μL של פתרון חוסם זה כדי לדלל את הנסיוב האנטי-קוקוס הספציפי לארנב 1:100. השתמש ב-200 μL של פתרון חוסם זה כדי לדלל את הנוגדן VWF-ספציפי העכבר 1:50 כדי להפוך את ריכוז הנוגדן הספציפי VWF של 4 μg/mL. לדלל את הנוגדן משני AlexaFluor488 מצותת מ 2 מ"ג/mL פתרון מניות 1:100 ב 200 μL של PBS (pH 7.4) כדי ליצור ריכוז סופי של 20 μg/mL.
הערה: ב הגדרות החיסונית המתוארת, זיהוי נוגדנים נמסר תוצאות אופטימליות כאשר הנוגדנים היו מדולל במאגר פחמתי אלקליין הנ ל. בהתבסס על תוצאות קודמות, הפתרונות החוסמים המומלצים וכמות הנוגדנים מתאימים ליישומים רבים. עם זאת, ניסויים שונים עשויים לדרוש אופטימיזציה אינדיבידואלית של שילוב הנוגדן, הנוגדן ריכוז, זמן דגירה, והחוקה של המאגר חוסם. כחלופה, מערכת פוספט באגירה עם טווח pH נייטרלי יכול להיות מתאים או אפילו מועדף כמו מאגר דגירה. במקרה של אותות זריחה חלשה, הריכוז של נוגדנים משני צריך להיות מוגבר. אם מזוהה יותר מדי רעש של רקע בלתי מוגדר, כמות חומרי החסימה צריכה להיות מוגברת. - עבור VWF-אימונוofor, כתמים לשטוף את שקופית הערוץ באמצעות 1 מ"ל Luer מזרק על ידי הזרקת 200 μL של פתרון כביסה 3x ו-מודלת את השקופית 1:50 באמצעות נוגדן VWF מדולל ספציפי עבור 30 דקות ב-RT. לאחר מכן, לשטוף את שקופית הערוץ שוב 3x עם 200 μL של הפתרון כביסה ו-מעכלת את השקופית עם 1:100 מדולל AlexaFluor488-מעלה נוגדן העכבר עבור 30 דקות ב RT. לבסוף, לשטוף את שקופית הערוץ שוב 3x עם 200 μL של פתרון כביסה.
הערה: האלכאפילואור-פלואורואופהורס רגישים ללבנה. לכן, השקופית צריכה להיות מוגנת על ידי שמירה על הבית בחדר חשוך במהלך שלבי הדגירה עם הנוגדנים מצופפור. - עבור זיהוי חיסוני של הינע הפנאומטי, מודלת את השקופית עם נוגדן הארנב הספציפי 1:100 מדולל-קוקוס עבור 30 דקות ב-RT. לאחר מכן, לשטוף את שקופית ערוץ 3x עם 200 μL של פתרון כביסה ו מודלת את השקופית עם 1:100 מדולל AlexaFluor568-מעלה נוגדן ספציפי לארנב עבור 30 דקות at RT. לשטוף את שקופית הערוץ שוב 3x עם 200 μL של פתרון כביסה.
- כדי להכתים את שלד אקטין הסלולר עם phalloidin, החדיר של huvec על ידי דגירה עם 120 μl של 0.1% טריטון X-100 עבור 5 דקות ב RT. לשטוף את שקופית ערוץ 3x עם 200 μl של פתרון כביסה ומודלת את השקופית עם 120 μl של 1:1000 מדולל . AlexaFluor350. שלב הדגירה הזאת יהיה להמחיש את שלד ציטוטין הפילמור ולאפשר ניטור של הצורה ואת הלחץ אפשרי המושרה שינויים מורפולוגיים.
- לשטוף את שקופית ערוץ 3x עם 200 μL של פתרון כביסה. לבסוף, לשטוף את השקופית 4x עם 200 μl ddh2O ו לדמיין את מחרוזות vwf ירוק פלורסנט, החיידק פלורסנט אדום, ואת השלד הכחול פלורסנט אקטין באמצעות הגדרות המסנן המתאים על המיקרוסקופ ניאון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Culturing הראשי huvec בזרימה חד כיווני מתמדת היווצרות שכבת התאים הקשורים וגדוש בחוזקה המקדם את הדור של wpbs הסלולר ממולא vwf המכונה הרגיש13,14. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת המבוססת על לחץ אוויר מבוסס על משאבה, לניתוח זיהום המחייב לחקות את המצב לחץ ההטיה בזרימת הדם האנושית.
מערכת זו מאפשרת הגדרה מוגדרת ומבוקרת תוכנה של תנאי זרימה. ערכת הזרימה באיור 1 ממחישה את זרימת העבודה העיקרית, החל בטיפוח-תרגול של תאי האנדותל הראשוניים (איור 1, שיבוץ 1) והטיפוח-תרגול של הינע הפנאומטי (איור 1, שיבוץ 2). מערכת מיקרופלואידיג שימושית (איור 1, כניסת 3) מורכבת משקופית ערוץ מיוחד המחובר באמצעות מתאם luer לצינור פרזיה עם שני מאגרים בינוניים. להגדיר את צינורות זלוף ממוקם על יחידת flu, המשמש כעמדה ומעסיקה את צינורות זלוף כמערכת שסתום. לטיפוח הזרימה, יחידת הפלואידיג עם סט הפרפיוז הבינוני ושקופית הערוץ המחובר ממוקמות בחממה של CO2 (איור 1, שיבוץ 3). יחידת הפלואידיג מקושרת למשאבת לחץ אוויר באמצעות צינורות האוויר. האוויר אבובים חייב לעבור בקבוק ייבוש המכיל חרוזי סיליקה להסרת לחות מן המאגרים זלוף לפני האוויר הוא מוניטין לתוך מערכת המשאבה (איור 1, שיבוץ 3). משאבת לחץ האוויר נשלטת על ידי תוכנת מחשב (מ1.5.0 בקרת שליטה v) המאפשרת את ההגדרה של קצב זרימה רציף, מוגדר בהתאם לקוטר של שקופית הערוץ, את האורך והקוטר של הגדר צינורות זלוף, ואת צמיגות של מדיום בשימוש (איור 1, שיבוץ 3). הפרשת vwf על ידי wpb האקסוציטוזה של convec גדל באופן שוטף הוא המושרה על ידי היסטמין-גירוי8 להחיל את זרימת בינונית צינורות זלוף באמצעות יציאת הזרקה (איור 1, שיבוץ 4). בלחץ הטיה מינימלי של 10 דינמיקה/cm2, חלבונים vwf שוחרר multimerize וטופס מחרוזות חלבון ארוך להגיע אורכי של יותר מ 100 יקרומטר (איור 1, שיבוץ 4, 5, 6 ו איור 2a). מחרוזות חלבונים אלה זוהו באופן מיקרופיקטיטי ודמיינו לאחר ההזרקה של fluorescein isothiocyanate (FITC)-מעלה מעלה נוגדנים ספציפיים למדיום. נוגדנים מחזורי לאפשר זיהוי immunofluorescence של מחרוזות VWF מאוגד משטח התא בזמן אמת (איור 1, שיבוץ 5)8.
מבוססי מיקרופלואידיג מבוסס התרבות תא הגישה זיהום באמצעות תאי האנדותל העיקרי מחקה את המצב של הנגיף הדלקתי מקומית על הסתננות של זרימת הדם על ידי הפתויונים בקטריאלי כגון סטרפטוקוקוס . דלקת ריאות דוגמאות להדמיה ולניתוח כמותי של אינטראקציה חיידקית עם תאים בעלי כלי דם מובחנים תחת לחץ הטיה באמצעות טיפוח-תרגול של תאי מיקרופלואידיג מוצגים (איור 1, insets 5, 6). Rfp-הביע פנאומטי מוזרק לתוך זרימת ואחרי 30 דקות של זרימת הדם, את הסימנים הראשונים של החזקה בקטריאלי מחרוזות vwf של היסטמין-מגורה huvec היו מאכל (איור 1, insets 5, 6 ו איור 2a, B בחצים לבנים)8. כך, השימוש של RFP-הביע פנאומטי מופעלת כימות של בקטריאלי המצורף למחרוזות VWF על התאים האנדותל ללא דרישה של זיהוי נוגדנים חיידקי.
באמצעות תוכנת ההערכה שסופקה על-ידי לייקה (לדוגמה, LasX), מחלקות היסטוגרמה של כיסוי ההיסטוגרמה הופקו באמצעות מחרוזות ה-VWF שזוהו עם נוגדנים פלואורסצנטי ירוקים. הדבר איפשר ניתוח כמותי של הסתברות הלוקליזציה של התאמה לשפות אחרות באזורים מסוימים של ריבית (ROI) בתוך התמונה הפלואורסצנטית. באמצעות שכבות היסטוגרמה של אותות חיידקיים בשילוב עם אותות פלואורסצנטית של VWF, הפסגות הפלואורסצנטית חופפים עבור שניהם יכול להיות דמיינו ובכך אישר המצורף הפנאומטי למחרוזות VWF. הקובץ המצורף החיידקי מתנגד למתח ההטיה ברציפות למינימום של 25 דקות (איור 2B)8.
בסכום, הטיפוח זרימה רציפה של HUVEC הראשי איפשר הפרשה VWF והדור של מחרוזות חלבון VWF ארוך המשמשים כאתרי הדבקה עבור במחזור חיידקים8.
איור 1: זרימת עבודה לניתוח של מצורף בקטריאלי למחרוזות VWF באמצעות טיפוח-תרגול של תאים מיקרופלואידיג. תהליך העבודה של הצעדים הניסיוניים העיקריים החל בטיפוח-תרגול של תאי האנדותל הראשוניים לשיטת המשנה בצלוחיות התרבות התאית. לפני טיפוח התאים בזרם, התאים מוזרמים לתוך שקופית ערוץ מצופה ג'לטין (כניסת 1). חיידקים גדלים על צלחות אגר ולאחר מכן טיפוח במדיום נוזלי מורכב לשלב באמצע היומן (שיבוץ 2). עבור תרבות תא microflu, שקופית ערוץ עם תאים אנדותל מחובר לצינורות פרזיה של יחידת פלואידיג של מערכת המשאבה ונתון לזרימה רציפה לבידול תאים (שיבוץ 3). הדור של vwf-מיתרים (החץ הירוק) המושרה על ידי הזרקת היסטמין בלחץ הטיה של 10 דינמיקה/cm2 ו מאכל מעקב על ידי זיהוי immunofluorescence באמצעות שימוש ב-fitc המסומנת נוגדנים ספציפיים (שיבוץ 4). לאחר הזרקה של rfp ביטוי חיידקים על בינוני במחזור, מצורף אבקת קוקוס (חץ אדום) אל vwf-מיתרים היה מאכל בזמן אמת על ידי פליטת הזריחה ב 450 ננומטר (שיבוץ 5). לאחר קיבעון של התאים באמצעות התחתית, החיסונית דיפרנציאליות דיפרנציאלית מספק את ההדמיה של החזקה בקטריאלי בנקודות זמן זיהום ספציפי (שיבוץ 6). התמונות של מערכת המשאבה ואת שכבת התאים HUVEC המתוארים בשלבים 1, 3, ואת התמונה של יציאת ההזרקה (שיבוץ 4) נכללים. התמונות האימונולואוסטים המוצגות ב- Insets 4 ו- 5 שונו והשתמשו בהן בהיתר מ-jagau et al.8. אורך פסי הסרגל מצוין בחלק הימני התחתון.
איור 2: הנציג של האיגודים האימונולואוורבינציה של מאגד פנאומטי למחרוזות VWF שנוצרו בזרימה רציפה על פני השטח של היסטמין-מגורה HUVEC. (א) הדור של מחרוזות vwf היה לכמת מיקרוסקותיים לאחר חשיפת convec גדל באופן שוטף כדי להטות את הלחץ באמצעות מערכת משאבת אכל ב 10 דינמיקה/cm2. כאשר מדובר בנוגדנים מבוססי-FITC, זוהו מחרוזות VWF. חיצים לבנים הצבע על RFP ביטוי פנאומטי עם זריחה אדומה מחוברת מחרוזות VWF ארוך. (ב) ההחזקה החיידקית של מחרוזות vwf פלורסנט ירוקה היה מאכל עד 2 h בזרימה מתמדת (חצים לבנים) ואושרה על ידי הערכה מבוססת תוכנה של עוצמות של כוונות זריחה של ROI מוגדר. תמונות בזמן אמת צולמו עם הציוד הפלואורסצנטית של מיקרוסקופ בלייזר קונפוקלית וקד (SP8, לייקה). קנה מידה של סרגלים = 10 μm. דמות זו שונתה והשתמשה בהיתר מ-Jagau et al.8.
משלים איור 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה של אינטראקציה חיידקית עם חלבונים מארחים רגישים מכונאי כגון VWF דורש מערכת התרבות התא המכונה המאפשרת את הדור של זרימה מוגדרת, חד כיווני, רציפה של נוזלים, ובכך לייצר מאמץ הטיה אמין . כמה מערכות משאבות מיקרופלואידיסי כבר תוארו. סקירה מקיפה של ברגמן ואח ' מסכמת את ההיבטים המרכזיים של מודלים שונים של תרבות התא השני והתלת-ממדיים17.
הטכנולוגיה המיקרופלואידיסי היא טכניקה מאוד צעירה שהחלה בתחילת שנות ה-90 עם התפתחות של מיקרומטר בשליטה, הניתנת לשינוי ומיקרו-סביבות במיקרו-מיקרומטר ואפילו בסולם נאנמטר18. הגישה microfluidic הציג ניתן גם להחיל על לימוד מגוון רחב של מנגנוני הדבקה חיידקיים וחלבונים מעורבים. היא מתאימה ביותר עבור כל אינטראקציה המערבת רכיבים הדבקה מכנימים כגון VWF, אשר באופן כללי אינם נגיש באמצעות טכניקות סטנדרטיות של תרבות התא. לדוגמה, ידוע כי היווצרות של מטריקס מספר חלבונים החילוץ משתנה בהתאם למיקומם. בתוך מערכת הדם, גליקורופנס כמו פיברוטין לזרום בתוך היווצרות הכדורית, ואילו במטריקס המגלותי החלבונים מופיעים כ-di-and מולטימזאד הגרדום19,20. יתר על כן, מפיצים מספר ציוד microflu, מציעים שקופיות הערוץ סטנדרטית מצופה עם סוגים שונים של קולגן (g., שיטת המשנה, או חלבונים אחרים הנגזרים פלזמה). אלה שקופיות ערוץ מתאימים הדמיה וניתוחים כמותיים של הדבקה בקטריאלי לחלבונים ספציפיים מטריקס מטריצות במצבי זרימה שונים.
ניתן לסווג מערכות מיקרו-פלואידים שונות בהתאם לחומרים השונים המשמשים לייצור מיקרו-מכשירים. בהקשר זה, מערכות הזכוכית/סיליקון מבוסס על פלטפורמות מבוססות-פולימר ואת הנייר מבוסס פלטפורמות21. שקופיות מבוססות-פולימר מיוצרות באמצעות משטח נתמך (ESS) מבוסס-על, בדרך כלל דורשים ציפוי משטח לתא במהלך ניסויים בזרימה. כחלופה לציפוי עם רכיבים תומכים הדבקה כגון קולגן, המשטח של כמה שקופיות ערוץ זמין מסחרית שונה פיזית, אשר יוצר משטח הידרופילי ודביק מתאים לרוב סוגי תאים. יתר על כן, כמה שקופיות הערוץ נוצרות באמצעות מצעים כמו polydiמתיל siloxane (PDMS), אשר חדיר חמצן ומאפשר גם את התרבות של תאים כלי הדם על פני השטח הפנימי של מיקרוערוצים במערכות משאבת פלואידיג22, . עשריםואחד
מערכת microflu, שנעשה שימוש במחקרים אלה שימש מערכת יעילה ואמינה אשר הוחל על ניתוח האינטראקציה של האורהולוקוקוס עם סיבי vwf מולטימאד לאחר התרבות של תאי האדם האנדותל בזרימה 24,25. מערכת מיקרופלואידיג זו הייתה מערכת מעגלית סגורה שאפשרה ניתוח של זיהום של חיידקים פתוגניים תחת התנאים אבטחה טיחות 2. יתר על כן, שקופיות הערוץ היו מתאימים ניטור מיקרוסקופיים במהלך הזרימה זמינים עם ציפויים שונים (למשל, ג'לטין, פולי ליזין, או קולגן-IV) המבטיחים הדבקה תא ומידה גבוהה של התוכסות ניסיוני. פרוטוקול זה משתמש במערכת מיקרופלואידיג (ראה טבלת חומרים) להקמת מודל זיהום של מיכל עבור S. דלקת ריאות, ובכך לחקות את מצב הזרימה בתוך מערכת כלי הדם האנושי8.
הנוהל הכללי המתואר של המצורף לתא חיידקי במערכת מיקרופלואידיג זה יכול להתבצע גם עם סוגים אחרים של מערכות משאבה היוצרות זרימה מוגדרת ורציפה בסביבה סטרילית. למטרות microflu, בעיקר ארבעה סוגים של מערכות בקרת זרימה משמשים: i) משאבות פריסטלטיות ומשאבות מחזור, אשר משמשות בפרוטוקול זה, ii) משאבות מזרק, iii) בקרי לחץ, ו iv) בקרי לחץ עם מטריצות בורר זרימה. לכל סוג של מערכת בקרת זרימה יש יתרונות וחסרונות בהתאם ליישום מיקרופלואידיג הספציפי ואת היכולת לבצע הדמיה מיקרוסקופית בזמן אמת. ברוב היישומים הדורשים סירקולציה רציפה של דגימות, משאבות משולבות משולבים עם בקרי לחץ מבוססי תוכנה כדי להבטיח מצב זרימה מוגדר. זה גם אופטימיזציה במערכת המשאבה הפגינו כאן. מערכות משאבת מבוסס מזרק ניתן לאחד לתוך "קלאסי" משאבות מזרק, אשר לייצר תנודות זרימה, ו "מחסור" משאבות מיקרופלוג משאבת. אלה משאבת מזרק מבוססי מערכות הן בדרך כלל קל לשימוש, אבל בקרת זרימה בערוצים מתים מאתגר באמצעות משאבות מזרק. יתר על כן, שינויי זרימה בתוך השבב עשוי להימשך זמן מה, ו מד זרימה נדרש כדי לקבוע את קצב הזרימה. אפילו משאבות לייצור מזרקים עשויים ליצור הפריה תקופתית על קצב הזרימה בשל מנוע שלב אחר שלב של משאבת המזרק. עוד שני המכשיר משאבת מזרק מסוגל ליצור "להחדיר ולמשוך" התנועה פלואידיג מבוססי המוחלת הגדרת כוחות הטיה על משטחי התא והוא מתאים ליישומים microdialysis גם באופן עצמאי PC. מערכת זו חייבת להיות משולבת עם microtubing לחיבור של התאים או שקופיות ערוץ לטיפוח התא ואחריו ניתוחים מיקרוסקופיים.
בקרי הלחץ הנ ל הם מערכות בקרת זרימה הלחץ על הטנק המכיל את המדגם, אשר מוזרק בצורה חלקה בחדר מיקרופלואידיג או על שבב. בקרי הלחץ יכולים ליצור זרימה ללא מחסור ולספק גם שיעורי זרימה בשילוב עם מטרים זורמים. שילוב של בקרי לחץ עם מטריצות מתג זרימה מאפשרים מתג זרימה מהירה ללא זרימות גב. המערכת המוצגת כאן אפשרה את הדור של ערכי מתחים הטיה המדווחים בדרך כלל עבור מערכת כלי הדם האנושיים26. ב vivo כלי דם להטות את המתח המשוער מהקיר להטות שיעורי נגזר מפרופילי מהירות מוקלט באופן בלתי פולשני, ואת צמיגות של כל דם בעורקים גדולים צמיגות פלזמה בתוך העורק26. רנמאן והיוקס הקליטו פרופילי מהירות בעורקים גדולים באמצעות מערכת אולטרסאונד מעוצבת במיוחד ובעזרת טכניקות אופטיות באמצעות שימוש בשיטות מהירות זרימת פלורסנט במהירות26. מתח ממוצע ההטיה של 11-13 דינמיקה/cm2 הוא הגיע לעורק הראש, בניגוד ל 4-5 דינמיקה/cm2 בעורק הראש. שיא הערכים של עד 25-70 דינמיקה/cm2 מנוטרים על העורק הראשי. להטות את ערכי הלחץ של ורידים קטנים ובינוניים בין 0.1 ו 0.5 דינמיקה/cm2. במערכת microflu, מתוארים כאן, ערך מתח ההטיה הישים תלוי בקוטר צינורות ההיתוך הנבחר, בגובה של שקופית הערוץ, וצמיגות של מדיום פלואידיג בשימוש. ההגדרה flu, c שנבחרו היה מורכב של שקופית עם 0.4 ס מ גובה (נפח של 100 μl) בשילוב עם ערכת זלוף של 50 ס מ אורך ו 1.6 mm קוטר ו צמיגות בינונית היה 0.0072 [דינמיקה · s]/cm2. הגדרה זו מתאימה לטווח לחץ הטיה בין 3.5 ו 31.2 דינמיקה/cm2 בקצבי זרימה של 3.8-33.9 mL/min. בנוסף, משאבת הלחץ תוכנה בקרת יכול להחיל זרימה בינונית פעמו שיכול לחקות זרימת דם העורקים פעמו.
השימוש המוצלח, האמין והניתן להידבקות בשיטת ההדבקה המשולבת הזאת, מחייב כמה אמצעי זהירות שיש לזכור. במהלך הזיהום בתנאים מיקרופלואידים, שכבת התא עשויה להיות חשופה תרכובות בקטריאלי ציטוטוקטיים או cytolytic כגון, אשר משפיעים על הכדאיות של התא איקריוטית ולהחליש את הדבקות התא למשטח השקופית. לכן, שמירה על זרימה מתמדת נדרשת במהלך כל הניסוי והשלמות של מורפולוגיה התא חייבת להיות מפוקחת לעתים קרובות. יתר על כן, בינונית תרבות הזרימה צריך לספק את כל החומרים המזינים החיוניים לתאי האנדותל כדי להבטיח משטח חזק מצורף של התאים במהלך הניסוי זיהום. עם זאת, יש לציין כי תוספי מזון בינוניים מכילים חומרים שעלולים להפריע או לעכב את האינטראקציה בין החיידקים וחלבונים מארחים ספציפיים. במחקרים של האינטראקציה האנטי-ובולקוקוס-VWF למשל, הפארין חייב להיות מרוקן ממדיום התרבות התא, כי זה מעכב את הכריכה של הינע פנאומטי כדי VWF8.
צעד קריטי נוסף בתרבות הזרימה של תאי האנדותל הוא התחזוקה של הדבקה תא הדוקה, התלויה בחיוניות התא הכוללת וברמת הבידול. הטיה עמידים בפני זרימת תאים של תאי האנדותל העיקרי הושגה רק כאשר התאים נשמרו בקפדנות בשטף לפני החשיפה כדי להטות את המתח. מצד שני, הייצור של WPB באופן ישיר תלוי בשטף של שכבת התא האנדותל לקידום תא התא-המגע החזק13. היתרון של התרבות התא microfluidic של תאי האנדותל העיקרי מכסה את התפשטות התא המושרה מאוד מוביל במהירות היווצרות של שכבת התא confluent בתנאי זרימה. התאים מחוברים היטב זה לזה, מכוונים באופן קולקטיבי לכיוון הזרימה, ומייצגים פנוטיפ מאוד הבדיל הנדרש כדי לייצר WPB הפרשה. Wpb אלה לשמש אחסון שלפוחיות עבור vwf, מפעילים בין ו ציטוקינים כי הם exלוציטוטוקטית כמו התפרצויות חלבון על גירוי היסטמין או פעילותמשאבה מתחדשת 27,13. לכן, הדור של מאוד דביק, שכבת התאים שוטפת של תאים מובחנים ראשוניים העיקרי במעברים התפשטות נמוכה הוא תנאי הכרחי לשחרור vwf יעיל והיווצרות של מחרוזות vwf על משטח התא וה ניתוחים של חיידקים-VWF-אינטראקציה בתנאי זרימה. לפיכך, יש לציין כי הבידול של תאי האנדותל לקחו 48 h של טיפוח הזרימה במינימום ונדרש זרימה רציפה ללא כל וריאציות בלחץ המשאבה. כל וריאציות עשויות להוביל לפיצוץ בינוני פתאומי, שיגרום לריקון התאים מהשקופית. יתר על כן, במהלך הדמיה מיקרוסקופית השקופית microflu, מאגרים בינוניים של מערכת המשאבה צריך להישמר בטמפרטורה של 37 ° c כמו זה מייצג את הטמפרטורה האופטימלית של התאים האנושיים.
קווי התאים האנושיים החיים מתאימים ניסויים מדעיים רבים מועסקים לעתים קרובות בלימודי התרבות התא לזיהום. קווי תאים אלה חולקים כמה יתרונות טכניים כלליים, כגון דרישות תרבות נמוכות או בינונית והתפשטות בלתי מוגבלת, המאפשרת המשך מאות פעמים ללא שינויים משמעותיים במבנה או בפרופילי הקולטן. עם זאת, קווי התאים האלה מייצגים תרבות חד-יחידית וחשופים לתנאי גדילה מלאכותיים דו-ממדיים. 28 הסביבה החסרה של רקמות המקור פיסיולוגי תוצאות שינויים משמעותיים של תאים פונקציונליים מורפולוגית ולכל מעבר של התרבות29. לפני ניסויים אחרים הדבקה בקטריאלי, הפרופיל של משטח חשוף מסוג תאים החלבונים וקולטנים של תאים בריאות האדם העיקרי של המין האנושי במעברים שונים בתרבות התא נקבע. הניתוח cyPECAM1 try הזרימה חשף ביטוי מופחת מאוד של חלבונים משטח ספציפי כגון מולקולת טסיות הדם אנדותל מולקולה 1 () בתוך שמונה סיבובים של מעבר התא. יתר על כן, המתבטאת בפרופיל הקולטן השתנה באופן משמעותי במעברים תא גבוה לטובת סוג תא-לא מוגדר אינטגרציה בתבנית הקולטן ואת סוג תא מופחת בתבנית הקולטן (ברגמאן ואח ', נתונים שלא פורסמו). תוצאות אלו רלוונטיות במיוחד לניתוחים של אינטראקציות מארחות פתוגן במחקרים של ביולוגיה מדבקת. עם המטרה של לקיים את המאפיינים תא פנומטאית ורמה גבוהה של בידול פונקציונלי במהלך תרבות התא microfluidic בזמן של זיהום חיידקי, תאים אנדותל העיקרי של תורמים מרובים נבחרו במקרה זה ובשימוש רק עד חמישה מעברים במקסימום כדי לשמור על המאפיינים הפנוטיליים הספציפיים ככל האפשר8.
ההדמיה המשולבת של חיידקים ומבני שטח תא ספציפיים במהלך הזרימה דורש פרוטוקול ממוטב לצביעת פלואורסצנטית. באמצעות צירופים שונים של חלבונים הניתנים לשימוש במישרין, חיידקים בעלי מבטא בחלבון, ונוגדנים בעלי קרינה פלואורסצנטית, הליכי מעטפת מבוססי כתמים ניתן להתאים במיוחד למטרות ההדמיה. הליכים אלה מאפשרים הדמיה מיקרוסקופית מוגדרת וברורה וגם בידול וכימות של דבקות בקטריאלי והפנמה3,13,30,31. הגילוי המבוסס על מבוססת על החיידק הפנפניל מבוסס על הצורך בשלב חדירות התאים כגון הדגירה הקצרה של טריטון X-100, שעלולה להוביל לניתוק תאים. לכן, האיתור של תהליכי הפנמה החיידקית המתרחשים בתרבות הזרימה צריך להיות מדמיין לאחר הדגירה הזורמת באמצעות דגימות מקושרות בחצי הדרך. עבור ויזואליזציה בזמן אמת של חיידקים בזרימה, השימוש בחיידקים מהונדסים גנטית המבטא חלבונים פלואורסצנטית מאפשר זיהוי מיקרוסקופי מהיר וממוקד. Rfp-הבעת זנים אבקת הקוקוס שנוצרו באמצעות בונה גנטי יעיל שתוכנן על ידי kjos ו-16, 8 שימשו במחקר ניסיוני זה. לאיתור מחרוזות VWF בזרימה, שונה VWF-ספציפי שונים נוגדנים מתויג בדיקות נבדקו יכול לשמש. כדי לקבל תגובת אות אופטימלית ברקע בלתי ספציפי ממוזער, ריכוז הנוגדן הנאותה היה מאוד בעקביות עבור כל נוגדן שהוחל.
עבור הדמיה של תאים מיקרוסקופיים לחיות, יחידת פלואידים ושקופית הערוץ מוסרים מאינקובטור CO2 ומוצבים בתא מראש עד 37 ° c במיקרוסקופ. לא ניתן לכוונן את החדר הזה. ל -5% קו2 ללא אווירה באגירה קרבונט, HUVEC מורפולוגיה והכושר החיידקי נשאר שלם עד 180 דקות, אשר מספיק לניתוח של הדבקות בקטריאלי VWF-תיווך. אם זמן זיהום ארוך יותר ניטור מיקרוסקופיים מחוץ החממה CO2 נדרשים, בינונית תרבות התא באגירה יש להשתמש כדי לפצות על המשמרות pH בשל ריכוז מספיק CO2 . לחילופין, ניתן להניח את כל המערכת בחזרה לחממה של CO2 בין השלבים של סדרת זמן של הדמיה מיקרוסקופית.
בנוסף לזיהוי הקרינה הפלואורסצנטית בזמן אמת, הזיהום החיידקי של האנדותל בתוך שקופית הערוץ יכול להיעצר ולהישמר על ידי החלפת בינונית עם פאראפורמלדהיד (בתחתית) כחומר קיבוע. לאחר קיבעון בזרם, החיסונית אופטימיזציה ממוטבת ומיטוב של משטח התא בתוך שקופית הערוץ מאפשר את הדור של הפריטים החזותיים מיקרוסקופיים בעלי ערך תמונה ומספק מבנה רב-תכליתי משולב זיהוי של תרכובות סלולריות ספציפיות המעורבות באינטראקציה בין חיידקים ותאי מחשב מארחים. היתרון המדעי של השיטה המשולבת הזאת הוא ששקופית הערוצים של הערוץ החצי-מטופל יכולה להיות מאוחסנת ומשמשת לצביעת מבנים של מבנה הריבית. הטיפול באמצעות ההלאומית מפעיל את החיידקים ובכך מעצר את הביטוי של RFP-חלבון. לכן, נסיוב האנטי-קוקוס ספציפי שנוצר ארנב לאיתור החיסונית חיידקים והדמיה בוצעה באמצעות הארנב ספציפי AlexaFluor568-מצובית נוגדן משני8. כפי שהוזכר כבר, השימוש שילובים שונים נוגדנים דורש אופטימיזציה מדויקת של כמויות נוגדנים הרכב חסימת מאגר. אחרת, אותות רקע שאינם ספציפיים ואפקטי זיהוי צולב עלולים לגרום לתוצאות של כתמים מלאכותיים. הליך מדומה של immunofluorescence ניתן להשתמש בקלות לאיתור מטרות סלולריות שונות כגון שלד ציטוטין או סמנים אנדוזומיום13,31.
הליך זה ניתן להתאים כדי ליצור סביבת רקמה מורכבת יותר המחקה את הפיזיולוגיה מנקודת מבט היסטולוגית, פיסיולוגית ופונקציונלית. ניתוח הזיהום המוצג ניתן להשתמש ביעילות כדי לענות על מספר שאלות מדעיות באותו זמן על ידי שימוש בשורה-חיבור של מספר שקופיות ערוץ לערכה אחת זלוף. זה להגדיר המורחבת היה להקל על ניתוחים של סוגי תאים שונים, confluences וציפויים שונים בתוך אותה הגדרת זרימה במקביל ולאפשר השוואה ישירה של זיהומים חיידקיים של סוגי תאים שונים. יתר על כן, הסדרתי בחיבור קו וניתוחים משולבים של מספר שקופיות ערוץ מספק גם את האפשרות של ניסויים סדרת זמן, אשר ניתן להחיל על פרופיל ביטוי גנים (למשל, ניתוח של זיהום מקדם זמן התקפה אלימה ביטוי גנים).
ניתוח הזיהום יכול להיות גם המורחבת לתנאי זרימה קבועה לאורך זמן מספר ימים או אפילו שבועות כדי לנתח את התגובה התאית בתנאים מחקה שלב ארוך לטווח זיהום כרונית. בנוסף לתרבות סוג תא בודד מוצג, מספר דוגמאות של תרבות תא הטרוטיפקס בהתקני התרבות של תאי מיקרופלואידיג כבר דווחו32,33. זה מאפשר מחקרים פרמקולוגית גבוהה התפוקה עשוי בסופו של דבר לגרום באמצעות מערכות תרבות התא microfluidic למטרות משובי כמו גם34.
לסיכום, מערכת מיקרופלואידיג בשילוב עם הליכים מכתים החיסונית שימש כמודל רב ערך לניתוח של פתוקומזמים בין חיידקים ותאים מארחים בסביבה המדמה את התנאים בתוך מערכת כלי הדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
הפרויקט מומן על ידי DFG (להיות 4570/4-1) כדי S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of >2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| Histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| Reaction tubes 1.5/2.0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| Reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| Serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
References
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
- Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
- Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
- Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
- Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
- Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
- Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
- Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).
- Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
- Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
- Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
- Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
- Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
- Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
- Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
- Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
- Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
- Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
- Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
- Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
- Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
- Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
- Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
- Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
- Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
- Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
- Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218 (1996).
- Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
- Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
- Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).
