Summary
本研究では、定義された流路条件におけるせん断応力下で分化したヒト一次内皮細胞の表面上で産生されるフォン・ヴィレブランド因子ストリングに対する肺炎球菌の視認性の顕微鏡的モニタリングについて述べている。このプロトコルは、微分免疫染色手順を適用することにより、特定の細胞構造の詳細な可視化および細菌の定量に拡張することができる。
Abstract
肺炎レンサ球菌と内皮細胞の表面との相互作用は、フォン・ヴィレブランド因子(VWF)などのメカノ感受性タンパク質を介して血流中に媒介される。この糖タンパク質は、せん断応力に応答して分子立体構造を変化させ、それによって宿主リガンド相互作用の広いスペクトルの結合部位を露出させる。一般に、定義されたせん断流の下で一次内皮細胞の培養は、血管の内層の生理学に似た安定で密接に連結された内皮層の形成と特異的な細胞分化を促進することが知られている.したがって、メカノ感受性タンパク質を含む細菌病原体と宿主血管系との相互作用の機能解析には、界面に影響を及ぼすことが知られている生理学的流動力をシミュレートできるポンプシステムの確立が必要である。血管細胞。
本研究で用いられるマイクロ流体デバイスは、定義された流量で流体の連続的かつパルスレスな再循環を可能にする。コンピュータ制御の空気圧ポンプシステムは、連続的、単方向、制御された媒体流れを生成することにより、内皮セル表面に定義されたせん断応力を適用します。細胞および細菌結合の形態学的変化は顕微鏡的視覚化のために設計されている特別なチャネルスライドを使用して流れの顕微鏡的に監視され、定量することができる。一般に、免疫標識と顕微鏡分析の前にサンプル固定を必要とする静的細胞培養感染とは対照的に、マイクロ流体スライドは、タンパク質、細菌、および細胞成分の蛍光ベースの検出の両方を可能にするサンプル固定後;連続免疫蛍光染色;リアルタイムで直接蛍光ベースの検出を行います。蛍光細菌および特異的蛍光標識抗体と組み合わせることで、この感染手順は、血管プロセスに関連する科学的応用の巨大なスペクトルのための効率的な多成分可視化システムを提供します。
Introduction
肺炎球菌感染症の病因は、プラスミノーゲンおよびVWF1、2などのヒト止血症の細胞外マトリックス化合物および成分の多様性との多面的相互作用によって特徴付けられます。3,4,5,6,7,8.マルチドメイン糖タンパク質VWFは、血管血栓形成9の部位における血栓細胞リクルートおよびフィブリンの組み込みを媒食することにより、バランスのとれた止血症の主要な調節体として機能する。出血制御および創傷治癒のための機能的、活性VWFの重要性は、フォン・ヴィレブランド病、一般的な遺伝性出血性疾患10によって実証される。
球状VWFは、最大14.0μg/mL11、10の濃度でヒト血液系を循環する。血管損傷に対して、内皮ワイベルパレードボディ(WBP)によるVWFの局所放出は著しく増加する11、12である。これまでの研究では、肺炎球菌がヒト内皮細胞に付着し、細孔形成毒素肺炎の産生が発光VWF分泌13を有意に刺激することが示されている。血流の流体力学的力は、メカノレスポンシブVWFドメインの構造開口部を誘導する。10 dyn/cmの流量で、VWFは、サブ子宮皮10、12に取り付けられたままの長さ数百マイクロメートルまでの長いタンパク質ストリングに多量化する。
肺炎球菌と内皮表面との相互作用においてせん断応力下で発生する多量体化VWF弦の機能を理解するために、マイクロ流体ベースの細胞培養感染アプローチが確立された。ソフトウェア制御空気圧ポンプシステムを備えたマイクロ流体装置を使用した。これにより、定義された流量を有する細胞培養培地の連続的な単方向再循環が可能にされた。それによって、システムは、特殊なチャネルスライド内に取り付けられたままの内皮細胞の表面に定義されたせん断応力を適用した。このアプローチにより、定義された一定の流れ条件下で分化した内皮細胞にVWF弦が生成される、ヒト血管系の血流中のせん断力のシミュレーションが可能となった。この目的のために、内皮細胞を特定のチャネルスライドで培養した(材料表参照)。マイクロ流体ポンプシステムは、コンフルエント内皮細胞層上の拡張VWF弦の形成に必要な高度に定義され、制御されたせん断応力状況を提供しました。ヒスタミン補充によりヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を収縮的に増殖させたヒト臍静脈内皮細胞のVWF分泌の刺激後、弦形成は10dyn/cm2のせん断応力(・△)を加えることによって誘導された。せん断応力は、細胞層に作用する力として定義されます。コーニッシュetに従って計算される。al.14方程式 1:
ここで、dyn/cm2のせん断応力、ε = 粘度(dyn∙s)/cm2、h= チャネル高さの半分、w = チャネル幅の半分、および Φ = 流量 (mL/min) です。
方程式 1 の結果は、使用するさまざまなスライドの高さと幅によって異なります (「材料表」を参照)。本研究では、0.4μmのルアーチャンネルスライドを用い、チャンバースライド係数131.6を用いた(式2参照)。
37°Cでの媒体の粘度は0.0072 dyn∙s/cm²であり、10dyn/cm²のせん断応力を使用した。その結果、流量は10.5mL/分になります(式3を参照)。
ここで、宿主血管系における細菌感染機構の調査及び可視化のための単方向層流システムを用いた微小流体細胞培養手順の適応及び進歩について詳細に説明する。内皮層上のVWF弦の生成は、連続的で安定したせん断応力15を適用することができる他のポンプシステムを使用することによって刺激することができる。
VWF弦形成の流れと刺激に合流する一次内皮細胞の培養後、赤色蛍光タンパク質(RFP)16を発現する肺炎球菌16を、一定の顕微鏡制御下で内皮細胞層に添加した。内皮細胞表面のVWF弦への細菌の付着は、VWF特異的蛍光標識抗体を用いて顕微鏡的に可視化し、最大3時間リアルタイムで監視した。このアプローチにより、血管内皮への細菌付着を促進する接着補因子としてのVWFの役割が8と判定された。
タンパク質分泌と立体構造変化の顕微鏡的可視化に加えて、この方法は、細菌感染プロセスの単一ステップをリアルタイムで監視し、異なる時点での付着菌の量を定量化するために使用することができる感染。特定のソフトウェア制御ポンプシステムはまた、内皮細胞を定義された一定の流れ条件で数日間培養する可能性を提供し、定義されたパルス媒体フローインキュベーションを可能にする。さらに、このメソッドは、異なるセルタイプを使用して適用することができます。染色プロトコルを適応させることは、真核細胞に内部化された細菌の検出および可視化も可能にする。
この原稿では、病態生理学的プロセスの効率的かつ汎用的な特性評価のための定義された、信頼性が高く、再現可能なアプローチとして使用できるこの高度な実験プロトコルについて説明します。
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Protocol
マイクロ流体細胞培養は、市販の原発性ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)で行った。同社は、ドナーのインフォームド・コンセントで細胞を分離した。この研究は、参照番号219-04で連邦州バーデン・ヴュルテンベルク州医師会の倫理委員会によって承認されました。
注:プロトコル供給については、材料表を参照してください。
1. 原発性内皮細胞の事前培養
- 37°Cで3つの異なるドナーから1 x 105一次HUVECを含む凍結グリセロールバイアルを解凍し、25cm2細胞フラスコで前温内皮細胞増殖培地(ECGM、サプリメントで使用する準備ができている)の7mLで細胞を播種する。
注:一次内皮細胞は、5回以上の増殖サイクルの後に分化能力を失う。したがって、高いグレードの細胞分化が必要な場合は、5箇所未満の細胞のみを使用できます。 - 細胞を5%CO2雰囲気中37°Cで60分間培養し、表面付着を可能にし、ECGM細胞培養培地を交換して凍結保存から残留物を取り除きます。
- 5%CO2雰囲気中の37°Cで細胞を培養し続け、サブコンフルエント細胞層を形成します。
注:HUVECは、タイトな細胞間接触が後の流れの安定な細胞層の形成を防ぐので、コンフルエント層に成長してはならない。
2.肺炎レンサ球菌の事前培養
注意:肺炎レンサ球菌は、バイオセーフティレベル2剤であり、バイオセーフティレベル2の実験室でのみ培養することが許可されています。すべての細菌治療の安全レベル2に分類されたクリーンベンチを使用し、エアロゾル形成を厳密に避け、細菌の沈沈沈下のためのエアロゾル保護付き遠心分離機を使用してください。
- 常に-80°Cで保存されているグリセロールストックに由来する肺炎球菌臨床単離体ATCC11733を有するコロンビア血液寒天板を接種し、37°Cおよび5%CO2で一晩寒天プレートを栽培する。
- 1%酵母エキス(THY)と15mLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.4を補充したトッドヒューイット液体ブロスを40mL調製し、細菌の培養および洗浄工程を行います。
- 細菌の培養には滅菌チューブを使用し、液体培養液を細菌塊で接種します。非接種液体ブロスに対する600nmでの1mLアリコートのフォトメトリック測定により接種量を制御する。0.15の600 nm(OD600)で光学密度に達するまで、液体スープに細菌塊を充填します。
- 接種した液体スープを37°Cと5%CO2で振らずにインキュベートし、プラスチックキュベットを用いて1mLアリコートを測定して30分毎にOD600を測定します。
- 細菌培養が指数成長期に相当する0.4のOD600に達するとすぐに、細菌培養懸濁液を室温で1,000 x gで10分間遠心分離する(RT)。
注:肺炎球菌培養が1.0を超えるOD600に達することは許さないでください。 - 細菌堆積物を10mL PBSで穏やかに再懸濁し、RTで1,000 x gで10分間再び堆積物を再び取り出します。
- 洗浄した細菌堆積物を1mL PBSに穏やかに再懸濁し、1mLのPBSを基準にして10μLの細菌懸濁液のOD600を決定する。
- PBSの細菌の量を2.0のOD600に調整します。以前に決定された細菌計数によれば、2.0のOD600は2x109コロニー形成単位(CFU)に相当する。細菌の自己分析を防ぐために、直ちに感染手順を進めます。
3. 微流流体条件下におけるHUVECの内皮細胞培養
- 制御されたタンパク質分解によって細胞培養フラスコから一次内皮細胞を剥離する。クリーンベンチを使用して、滅菌環境で以下の手順を実行します。洗浄工程用に滅菌PBSの15mLの容積を準備する。
- 亜流暢に成長したHUVEC層からECGMを取り出し、血清学的ピペットを使用して10 mL PBSで細胞層を洗浄し、細胞培養培地を取り除きます。
- 37°Cの前温細胞解離溶液を37°Cの3mLで洗浄したHUVECをインキュベートし、37°Cで5分間の細胞剥離を行います。毎分顕微鏡的モニタリングによりタンパク質分解細胞剥離を観察します。
- 離れた細胞懸濁液を、2%胎児子牛血清(FCS)を補充したECGMの7mLを含むチューブにピペットし、RTで220 x gで細胞を3分間停止させた。
- 上清を取り外し、5% FCS と 1 mM MgSO4を補充した ECGM の 250 μL で HUVEC を再中断します。ノイバウアー細胞計数チャンバーを使用して細胞カウントのための細胞懸濁液の10μLを使用し、5%FCSおよび1 mM MgSO4を補完する4 x 106細胞/mL ECGMに細胞数を調整する。
注:各流れ実験のために5%FCSおよび1 mM MgSO4を添加したECGM培地の30 mLが必要となる。ここからこの培地組成物はECGMS-mediumと名付けられています。培養培地中のFCS濃度の2%から5%の増加は、チャネルスライドに播種されたHUVECの細胞結合および細胞生存率を支持する。培地は、FCSおよびMgSO4をサプリメントし、せん断応力条件下でHUVECの細胞結合を実質的に安定化させる。
- チャネルスライドでHUVECを種子し、栽培する。きれいなベンチを使用して無菌環境で働く。細胞はせん断ストレス下で2日間培養され、続いて細菌への感染と顕微鏡モニタリングがさらに2時間続く。
- チャンネルスライド、直径1.6mm、長さ50cmの灌流セット、ECGMS-培地のアリコート、高さ0.4μmのルアーチャンネルスライドを、37°Cで5%CO2雰囲気のインキュベーターで24時間、気泡の数を減らします。
注:この手順は、プラスチック装置を脱気し、媒体、灌流管、および貯蔵所を前温することをお勧めします。材料や液体がRTまたは冷蔵庫に保存されている場合、実験中にインキュベーターで加熱すると、プラスチックや液体に溶解したガスが放出されます。その後、ガスバブルが表示されます。実験の前にすべてのプラスチック部品を脱気すると、この効果が排除されます。システムがインキュベーターから取り出されるたびに、ガス吸収のプロセスが再び開始されます。したがって、RTで迅速に動作し、より長い期間、インキュベーターの外に流体ユニットを残すことはありません。 - ピペットを使用して、2%滅菌濾過したブタゼラチン溶液の100°LをPBS溶液に、温度平衡化されたチャネルスライドの1つの貯蔵所に注入します。ゼラチン溶液を37°Cで1時間インキュベートし、1 mLルアーシリンジを用いて滅菌条件下でスライドのチャネルを1mL PBSでリンスする。
- ゼラチンコーティングされたチャネルスライドを薄いポリスチレンまたは発泡スチロールプレートの上に置き、スライド温度の低下を防ぎます。スライドに1 mLルアーシリンジを使用して、4 x 106/mL HUVECサスペンションの100°Lを追加します。
注:クリーンベンチの冷たい金属表面にチャネルスライドを配置すると、スライド底部の温度が低下し、それによって内皮細胞に冷たい応力を発生させる可能性がある。セルピペット中は、気泡が上昇し、スライドの内側から消えるように、スライドを少し上に保持します。 - 37°Cと5%CO2で60分間HUVECでチャンネルスライドをインキュベートし、チャンネルスライドの両端にある培地貯留層をそれぞれ60μL ECGMS-mediumで埋めます。37°Cで1時間、CO2を5%でインキュベートします。
- チャンネルスライド、直径1.6mm、長さ50cmの灌流セット、ECGMS-培地のアリコート、高さ0.4μmのルアーチャンネルスライドを、37°Cで5%CO2雰囲気のインキュベーターで24時間、気泡の数を減らします。
- マイクロ流体ポンプとソフトウェア設定を調整します。
- 平衡灌流セットをポンプユニットに接続し、13.6 mLのECGMS-mediumを充填し、ポンプ制御ソフトウェアを起動します。設定した流体ユニットのメニューのスクロールダウンウィンドウを使用して、適切な灌流セットとチャンバースライドのタイプを選択します。中粘度のソフトウェアで 0.007 (dyn∙s/cm2)を選択します。(補足図 1の赤い矢印が付いた圧力ポンプ ソフトウェアの設定を参照してください)。
- インキュベーターの外側で、乾燥シリカビーズで満たされたガラス瓶を空気圧チューブに接続します(図1、差し込み3を参照)。圧力ポンプの空気は灌流貯蔵所とポンプの間を循環し、ポンプ装置に再入る前に乾燥しなければならない。ソフトウェアメニューで「フローパラメータ」を選択し、圧力を40 mbarに設定し、連続中流を開始して液体媒体でポンプチューブをフラッシュします。(これらの設定は、補足図 1の赤い矢印で示されています)。
- 流れ栽培の所望のせん断応力サイクルをプログラムします。5 dyn/cm2で始まり、バランスのとれた貯水池ポンプを制御し、ポンプシステムで気泡が循環していないことを保証します。
注:チャネル スライドの壁せん断応力は、灌流媒体の流量と粘度によって異なります。別のポンプシステムを使用する場合は、目的のせん断応力レベルを生成する流量を設定するために、序文で説明されている方程式を参照してください。説明した設定は、5.42 mL/minの流量に対応しています(圧力ポンプソフトウェアにおける適切なフローパラメータ設定を示す例示的なスクリーンショットを補足図2に示します)。 - ポンプ制御ソフトウェアの流れの循環を停止し、Luer 接続の近くにチューブをクランプして、灌流チューブ内の媒体流れを保持します。チャンネルスライドを接続し、気泡を回避し、37°Cおよび5%CO2のCO2インキュベーターに接続されたチャンネルスライドで流体ユニットを配置します。せん断応力を 5 dyn/cm2で 30 分間開始し、せん断応力レベルを加速する前に、せん断応力によって生成される力に細胞をスムーズに適応させます(補足図 3を参照)。
注:流れの中の気泡の動きは細胞剥離につながる可能性があるため、チューブシステムまたはチューブシステムに接続した後、気泡がチューブシステムまたはスライドに残らないことを注意してください。 - せん断応力を10 dyn/cm2(この流れの設定では10.86 mL/minに対応)まで加速し、37°Cと5%CO2の小さなCO2インキュベーターで48時間連続せん断応力でチャンネルスライドをインキュベートし、細胞分化を可能にします(各ソフトウェア settinng は、補足図 4に赤い矢印で示されています。
注:HUVEC細胞は、流れの培養が10 dyn/cm2で直接開始された場合、チャネル表面から剥離する傾向がある。5 dyn/cm2を最低 30 分間使用して少ないせん断応力で流れの培養を開始し、その後せん断応力を所望の 10 dyn/cm2までゆっくりと増加させた場合、細胞はチャンバー表面に付着したままになります。10 dyn/cm2のせん断応力は、VWF 弦形成に必要なこの灌流設定の最小値です。 - マイクロ流体細胞培養の24時間後、両方の中層でバランスの取れた中レベルに達したときにポンプ制御ソフトウェアで中流を停止します。流体ユニットをクリーンベンチに入れ、10 mLの血清学的ピペットを使用して、灌流貯留層の循環栽培媒体の10 mLを除去します。10 mL の ECGMS-培地を貯蔵所に追加して培地を更新し、流体ユニットを 37 °C および 5% CO2の CO2インキュベーターに戻し、ポンプ制御ソフトウェアを使用して流体栽培を再開します。
注:圧力ポンプの機能は、大きな遠心分離機などの実験機によって突然破壊され、強い磁場障害を引き起こす可能性があります。この突然の中断は、セルの剥離につながる可能性があります。このような機械は、実験中に圧力ポンプの近くでアクティブでないことを注意してください。 - 蛍光顕微鏡の段階を覆う温度インキュベーションチャンバの前温を37°Cに開始し、顕微鏡可視化の前に温度平衡24時間を図示する。顕微鏡を前もって温めた後、顕微鏡ソフトウェア制御を開始し、適切なフィルタ設定(RFP発現細菌の検出用540 nm/590 nm)を選択することにより、蛍光顕微鏡モニタリングの主な設定を調整し、FITC共役VWF特異的抗体のフルオレセイン放出を検出するための470 nm/515 nm)。37°で流体ユニットのインキュベーションのための追加の加熱室を前温する。
注:感染解析およびマイクロスコピックモニタリング中にチャネルスライドおよび循環媒体の温度は、細胞に冷たいストレスを発生させるので、実質的に減少してはならない。一般に、顕微鏡段階を覆う温度室の大きさは、流体ユニット全体をカバーするのに十分ではない。したがって、37°Cに前温された追加の加熱室の使用をお勧めします。 - 顕微鏡的可視化のために、流体ユニットを37°予備加熱室に入れ、37°予備顕微鏡のステージにチャネルスライドを配置します。
注:顕微鏡的可視化のために、流体ユニットとチャネルスライドは、灌流チューブの長さが限られているため、CO2インキュベーターから除去する必要がありました。pH緩衝のために5%CO2雰囲気外で感染時間と顕微鏡モニタリングが必要な場合は、マイクロ流体培養にpH緩衝培地を使用する必要があります。 - ヒスタミンと細菌を流れの循環に注入する前、および顕微鏡の明視野モードを使用して流れ実験を終了した後、細胞形態およびHUVEC層の完全性を制御する。
4. VWF放出の誘導とマルチメル化VWF弦の可視化
- VWFのマルチマー化を最大200MDaの長い弦にトリガするには、10 dyn/cm2のせん断応力が必要なため、フロー設定を維持します。注射ポートを用いて灌流浴中の循環するECGMS培地に100mMヒスタミン原液の136μLを注入することにより、内皮WPBからのVWFの放出を誘導する。流れ媒体中のヒスタミンの最終濃度は1mMとなる。注入ポートが利用できない場合は、ポンプ貯蔵所の媒体にピペットを入れてヒスタミンを追加することができます。
- 多層VWF弦の免疫蛍光検出では、貯水池内のバランスの取れた媒体レベルに達したときに流れを止め、VWF特異的FITC共役抗体の20μgを200μL PBS(pH 7.4)の体積で循環13.6mLに注入する。注入ポートを使用したECGMS-培地。注入ポートが利用できない場合は、ポンプ貯蔵所の媒体にピペットをすることで抗体を追加することができます。これにより、最終的な抗体濃度は1.3μg/mLになります。
- 短時間で複数の視野の顕微鏡的走査を行う場合は、キセノン蛍光装置を30%パワーで顕微鏡の蛍光単位とエピ蛍光カメラで使用します。明視野モードでHUVEC層の形状と形態を監視し、VWFストリングの可視化に適した代表的な細胞を選択します。
- 緑色蛍光VWF弦の可視化には、顕微鏡ソフトウェア(LasX)の蛍光ユニットメニューで63x/1.40オイル目的と470nm検出フィルタを選択します。少なくとも 50 個の代表的なフィールド ビューの Z スタックのスナップショットを作成し、それぞれに約 10 個の形態学的に無傷の HUVEC を含みます。異なる時点で緑色蛍光 VWF 弦を定量化するには、複数の視野をスキャンします。
5. リアルタイムフローにおけるVWFストリングへの細菌結合の顕微鏡的評価
-
免疫蛍光検出を介してHUVEC細胞表面上で生成されるVWFストリングへの肺炎球菌結合を定量化する。
- フローを保持し、注入ポートを使用して、最大容積 1 mL の 1 mL で 1.35 x 108 CFU/mL RFP 発現肺炎球菌を注入します。あるいは、ポンプ貯蔵所内の培地に細菌をピペットする。10 dyn/cm2でせん断応力を再始動し、細菌がポンプシステム内を循環するようにします。
- 顕微鏡の倍率に関する63倍のオイル浸漬目標を選択し、RFP発現肺炎球菌を検出するために、顕微鏡ソフトウェアの蛍光フィルタ設定をRFPチャネル(540 nm検出フィルタ)に調整します。
- VWF文字列への細菌結合を定量化するには、フローを停止し、少なくとも30の代表的なフィールドビューのZスタックのスナップショットを作成し、それぞれに約10の形態学的に無傷のHUVECを含み、肺炎球菌の量をカウントします。
- ANOVA一階平均統計アルゴリズムを使用してデータを評価し、続いて詳細な統計比較のためにポストホックの両側の対になっていないサンプル検定を使用します。<0.05 の P 値は統計的に有意と見なされました。
6. サンプル固定後のVWFストリングへの細菌結合の顕微鏡的評価
- 免疫蛍光染色の前に固定をサンプルします。
- 流れを止め、ポンプ貯蔵所から10mLのECGMS培地を取り出し、5%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加して10mLのPBSを加えます。PFA溶液を10 dyn/cm2のせん断応力で10分間循環させます。
- チャンネルスライドをポンプユニットから取り外します。
- 細胞表面上の非特異的結合部位をブロックし、VWF弦および付着細菌の免疫検出を行う。
- 100 mM Na2CO3(pH 9.2)を含む洗浄液を4mL調製し、すべての洗浄工程に4%スクロースを補充します。100 mM Na2CO3(pH 9.2)を含むブロッキング溶液を1mL調製し、非特異的結合部位のブロッキングのために4%スクロースと2%ウシ血清アルブミン(BSA)を補充した。
- 1 mLルアーシリンジを使用してPFAインキュベートチャンネルスライド3xを洗浄し、洗浄液の200°Lを注入し、200μLブロッキング溶液を用いてRTで120分間スライドをインキュベートします。
- 抗体の希釈のために4%スクロースと0.5%BSAを補充した100 mM Na2CO3を含む別のブロッキング溶液の4mLを調製する。このブロッキング溶液の200°Lを使用して、肺炎球菌特異的ウサギ抗血清1:100を希釈します。このブロッキング溶液の200 μLを使用して、VWF特異的マウス抗体を1:50希釈し、VWF特異的抗体濃度を4μg/mLにします。2mg/mLのストック溶液1:100から2mg/mLの二次抗体を200μL(pH 7.4)で希釈し、最終濃度20μg/mLを生成します。
注:前述の免疫蛍光設定において、抗体を上記アルカリ炭酸塩緩衝液で希釈した場合に最適な結果を得た抗体検出が得られた。以前の結果に基づいて、推奨されるブロッキング溶液および抗体の量は多くの適用に適している。しかしながら、異なる実験は、抗体の組み合わせ、抗体濃度、インキュベーション時間、およびブロッキングバッファーの構成の個々の最適化を必要とし得る。代替として、中性pH範囲を有するリン酸緩衝系は、インキュベーション緩衝液として適しているか、あるいは好ましいかもしれない。蛍光シグナルが弱い場合は、二次抗体の濃度を高める必要があります。あまりにも多くの非特異的蛍光バックグラウンドノイズが検出された場合は、ブロッキング物質の量を増やす必要があります。 - VWF免疫蛍光染色の場合、洗浄液3xの200°Lを注入して1mLルアーシリンジを使用してチャネルスライドを洗浄し、RTで1:50希釈VWF特異的抗体を1:50でスライドにインキュベートし、その後、200で3倍に再びチャンネルスライドを洗浄します。洗浄液のμLを1:100希釈したAlexaFluor488-共役マウス特異的抗体をRTで30分間インキュベートした。最後に、200°Lの洗浄液でチャンネルスライドを3倍に再び洗浄します。
注:アレクサフルオフルオロフォアは漂白に敏感です。したがって、スライドは、フルオロフォア共役抗体とのインキュベーションステップ中に暗いチャンバーに保持することによって保護されるべきである。 - 肺炎球菌の免疫検出のために、RTで1:100希釈した肺炎球菌特異的ウサギ抗体でスライドを30分間インキュベートし、その後、200°Lの洗浄液でチャネルスライド3xを洗浄し、1:100希釈してスライドをインキュベートするAlexaFluor568-共役ウサギ特異的抗体をRTで30分間洗浄し、200μLの洗浄液でチャンネルスライドを再度3倍洗浄します。
- 蛍光ファロイジンで細胞アクチン細胞骨格を染色するには、RTで120°LのトリトンX-100を5分間インキュベートしてHUVECを透過し、200μLの洗浄液でチャンネルスライド3xを洗浄し、120°Lでスライドをインキュベートします。アレクサフルオル350共役ファロイジン。このインキュベーションステップは、重合アクチン細胞骨格を可視化し、細胞形状およびストレス誘発形態変化のモニタリングを可能にする。
- 200°Lの洗浄液でチャンネルスライド3xを洗浄します。最後に、スライド4xを200μLddH2Oで洗浄し、蛍光顕微鏡上の適切なフィルター設定を用いて緑色蛍光VWF弦、赤色蛍光細菌、青色蛍光アクチン細胞骨格を可視化します。
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Representative Results
一定の単方向流路で一次HUVECを培養すると、メカノ感受性VWF13、14で満たされた細胞WBの生成を促進するコンフルエントで密集した細胞層の形成をもたらす。このプロトコルは、人間の血流におけるせん断応力状況を模倣する必要がある感染解析のための空気圧ポンプベースのパルスレス再循環システムの使用を記述する。
このシステムは、フロー条件の定義済みのソフトウェア制御設定を可能にします。図1のフロースキームは、主なワークフローを示し、一次内皮細胞の事前培養(図1、インセット1)および肺炎球菌の事前培養(図1、インセット2)を示す。適用されたマイクロ流体システム(図1、インセット3)は、2つの媒体貯蔵所を有する灌流浴にルアーアダプタを介して接続される特別なチャネルスライドで構成される。灌流浴セットは、スタンドとして機能し、バルブシステムとして灌流管を採用する流体ユニット上に配置されます。流れ培養の場合、培地充填灌流セットと接続チャネルスライドを有する流体ユニットをCO2インキュベーターに配置する(図1、差し込み3)。流体ユニットは、エアチューブを介して空気圧ポンプに接続されています。チューブ内の空気は、空気がポンプシステムに再ポンプで再ポンプされる前に、灌流貯蔵所から水分を除去するためにシリカビーズを含む乾燥ボトルを通過する必要があります(図1、差し込み3)。空気圧ポンプは、チャンネルスライドの直径、灌流管セットの長さと直径、および粘度に応じて、連続的で定義された流量の設定を可能にするコンピュータソフトウェア(PumpControl v1.5.0)によって制御されます。使用中の媒体(図1、差し込み3)。コンフルエント成長HUVECのWPBエキソサイトーシスによるVWFの分泌は、注射ポートを用いて灌流管内の培地循環に適用されるヒスタミン刺激8によって誘導される(図1、インセット4)。10 dyn/cm2の最小せん断応力で、放出されたVWFタンパク質は多量化され、100μmを超える長さに達する長いタンパク質ストリングを形成する(図1、インセット4,5,6および図2A)。これらのタンパク質ストリングは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)共役VWF特異的抗体を培地に注入した後に顕微鏡的に検出され、可視化される。循環抗体は、細胞表面結合VWF弦の免疫蛍光検出をリアルタイムで可能にする(図1、インセット5)8。
原発性内皮細胞を用いた確立されたマイクロ流体ベースの細胞培養感染アプローチは、レンサ球菌などの細菌性病巣による血液循環の浸潤時の局所炎症性血管系の状況を模倣する肺炎.マイクロ流体内皮細胞培養を用いたせん断ストレス下での分化血管細胞との細菌相互作用の可視化および定量分析の例を示す(図1、インセット5,6)。RFP発現肺炎球菌を流れに注入し、30分の循環後、ヒスタミン刺激HUVECのVWF弦への細菌結合の最初の徴候を顕微鏡的に検出した(図1、インセット5,6および図2A、B白い矢印)8.したがって、RFP発現肺炎球菌を使用することで、細菌抗体検出を必要とせずに内皮細胞上のVWFストリングへの細菌結合の定量を可能にした。
蛍光強度のヒストグラムオーバーレイプロットは、ライカ(すなわち、LasX)が提供する評価ソフトウェアを用いて生成し、緑色蛍光抗体で検出されたVWF弦を用いてRFP発現肺炎球菌の共振を可視化した。これにより、蛍光画像内の目的の特定の領域(ROI)におけるコローカリゼーション確率の定量分析が可能になりました。VWFの蛍光シグナルと組み合わせて細菌シグナルのヒストグラムオーバーレイを使用して、両方の蛍光ピークを重ね合わせることで、VWFストリングへの肺炎球菌の取り付けを確認することができました。細菌の付着は、25分間の連続的に加えられるせん断応力に対して、最低25分間抵抗する(図2B)8。
要するに、一次HUVECの連続的な流れの培養は、VWF分泌および循環細菌8の接着部位として機能する長いVWFタンパク質ストリングの生成を可能にした。
図1:マイクロ流体内皮細胞培養を用いたVWF文字列への細菌結合の解析のワークフロー細胞培養フラスコにおける一次内皮細胞の事前培養から始まる主要な実験工程のワークフロー。流れの中で細胞を培養する前に、細胞はゼラチン被覆チャネルスライド(インセット1)に播種される。細菌は寒天プレート上で増殖し、その後、複雑な液体培地から中丸期(インセット2)で培養される。マイクロ流体細胞培養の場合、内皮細胞を有するチャネルスライドは、ポンプシステムの流体ユニットの灌流管に接続され、細胞分化のための一定の流れに供される(差込み3)。VWFストリング(緑色の矢印)の生成は、10dyn/cm2のせん断応力でヒスタミン注射によって誘導され、FITC標識VWF特異的抗体を用いた免疫蛍光検出によって顕微鏡的にモニタリングされた(Inset4)。循環培地にRFP発現菌を注入した後、VWF弦への肺炎球菌付着(赤色矢印)を450nm(インセット5)での蛍光発光によりリアルタイムに顕微鏡的に可視化した。PFAを用いた細胞の固定後、微分免疫蛍光染色は、特定の感染時点における細菌付着の可視化を提供する(Inset 6)。ステップ1、3で説明したポンプシステムおよびHUVEC細胞層の画像と、注入ポートの画像(インセット4)が含まれる。インセット4および5に示す免疫蛍光画像は、Jagau etal. 8からの許可を得て改変され、使用されている。スケール バーの長さは右下に示されます。
図2:ヒスタミン刺激HUVECの表面の連続流れで生成されたVWF弦に結合する肺炎球菌の代表的な免疫蛍光画像。(A)VWF弦の生成は、10dyn/cm2のマイクロ流体ポンプシステムを用いて収縮的に成長したHUVECをせん断応力にさらした後に顕微鏡的に定量した。FITC共役VWF特異的抗体はVWFストリングを検出した。白い矢印は、長いVWF弦に赤い蛍光を取り付けたRFP発現肺炎球菌を指します。(B)緑色蛍光VWF弦への細菌結合を一定の流れ(白矢印)で最大2時間顕微鏡的に観察し、定義されたROIの蛍光強度のソフトウェアベース評価により確認した。リアルタイム画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡(SP8、ライカ)の蛍光装置で撮影した。スケール バー = 10 μm。この図は、Jagau et al.8の許可を得て変更および使用されています。
補足図 1.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
VWFのようなメカノ感受性宿主タンパク質との細菌相互作用のシミュレーションは、定義された、単方向、および液体の連続的な流れの生成を可能にする含水性細胞培養システムを必要とし、それによって信頼できるせん断応力を発生させる.いくつかのマイクロ流体ポンプシステムがすでに説明されている。Bergmannらからの包括的なレビューは、異なる2次元および三次元細胞培養モデル17の主要な側面をまとめた。
マイクロ流体技術は、マイクロメートルおよびナノメートルスケール18でも制御可能で再現性、および浸透性のマイクロ環境の開発と1990年代初頭に始まった非常に若い技術です。提示されたマイクロ流体アプローチは、細菌接着機構および関与タンパク質の広い範囲を研究するためにも適用することができる。これは、一般的に標準的な細胞培養技術を使用して接近できないVWFなどのメカノレスレス反応接着成分を含む任意の相互作用に最適です。例えば、いくつかの細胞外マトリックスタンパク質の立体構造は、その位置によって異なることは知られている。血液系内では、フィブロネクチンのような糖タンパク質は球状立体構造で循環し、一方、細胞外マトリックスではタンパク質が多結合性二重および多層化足場19、20として現れる。さらに、マイクロ流体機器のいくつかのディストリビューターは、異なるタイプのコラーゲン(例えば、下皮コラーゲンまたは他の血漿由来タンパク質)で事前にコーティングされた標準化されたチャネルスライドを提供する。これらのチャネルスライドは、異なる流れ状況における特定の細胞外マトリックスタンパク質に対する細菌接着の可視化および定量的分析に適しています。
マイクロデバイスの製造に使用される異なる材料に基づいて、異なるマイクロ流体システムを分類できます。この点で、ガラス/シリコーンベースのプラットフォームは、ポリマーベースおよび紙ベースのプラットフォーム21とは異なる。ポリマーベースのチャネルスライドは、弾性支持表面(ESS)で製造され、一般に、流れ実験中に細胞付着のための表面コーティングを必要とする。コラーゲンなどの接着性支持成分を有するコーティングの代替として、市販のチャネルスライドの表面が物理的に改変され、ほとんどの細胞タイプに適した親水性および接着面を作成する。さらに、一部のチャネルスライドは、酸素透過性であり、流体ポンプシステム22におけるマイクロチャネルの内面上の血管細胞の培養を可能にするポリジメチルシロキサン(PDMS)のような基板を用いて生成される。23.
これらの研究で使用されたマイクロ流体システムは、流れのヒト内皮細胞の培養後に多量化されたVWF繊維と黄色ブドウ球菌の相互作用を解析するために適用された効率的で信頼性の高いシステムとして機能した24、25.このマイクロ流体システムは、バイオセーフティ2条件下で病原性細菌による感染の分析を可能にする閉鎖的な円形灌流システムであった。さらに、チャネルスライドは流れの間の顕微鏡的なモニタリングのために適し、細胞の付着および高度の実験的再現性を保障する異なったプレコーティング(例えば、ゼラチン、ポリL-リジン、またはコラーゲンIV)と利用できる。このプロトコルは、S.肺炎に対する含水性感染モデルの確立のためにマイクロ流体系(材料表参照)を用いて、それによってヒト血管系8内の流動態を模倣する。
このマイクロ流体系における細菌細胞付着の記載された一般的な手順は、滅菌環境で定義された連続的な流れを発生させる他のタイプのポンプシステムと共に行うことができる。マイクロ流体の目的では、主に4種類の流量制御システムが使用されます:i)このプロトコルで使用されるペリスタティックポンプと再循環ポンプ、ii)シリンジポンプ、iii)圧力コントローラ、およびiv)フロースイッチマトリックスを備えた圧力コントローラ。フロー制御システムの各種類は、特定のマイクロ流体アプリケーションとリアルタイムで顕微鏡的可視化を実行する能力に応じて、利点と欠点を有する。サンプルの連続的な循環を要求するほとんどの適用では、再循環ポンプはソフトウェアベースの圧力コントローラと結合され、定義された流れの状態を保障する。これは、ここで示すポンプシステムでも最適化されています。シリンジベースのポンプシステムは、流れ振動を発生させる「クラシック」シリンジポンプと「パルスレス」マイクロ流体シリンジポンプに細分化できます。これらのシリンジポンプベースのシステムは一般的に使いやすいですが、行き止まりチャンネルのフロー制御はシリンジポンプを使用して困難です。さらに、チップ内のフローの変更には時間がかかる場合があり、流量を決定するには流量計が必要です。パルスレスシリンジポンプでさえ、シリンジポンプのステップバイステップモータにより、流量に周期的な脈動を発生させる可能性があります。別の2つの注射器ポンプ装置は、細胞表面に定義されたせん断力を適用し、PCに依存しない方法でも微小透析用途に適した「注入および撤退」ベースの流体運動を生成することができる。このシステムは、細胞培養のためのチャンバーまたはチャネルスライドの接続のための微小管と組み合わせ、その後に顕微鏡分析を行う必要があります。
上記の圧力コントローラは、試料を含むタンクを加圧するフロー制御システムであり、マイクロ流体チャンバーまたはチップにスムーズに注入される。圧力コントローラは、パルスレスフローを確立し、流量メーターと組み合わせて流量を提供することができます。フロースイッチマトリックスを備えた圧力コントローラを組み合わせることで、バックフローのない高速フロースイッチを実現します。ここで提示される再循環システムは、ヒト血管系26について一般的に報告されるせん断応力値の生成を可能にした。生体内血管壁せん断応力は、非侵襲的に記録された速度プロファイルに由来する壁せん断速度から推定されており、動脈26における大きな動脈および血漿粘度における全血粘度。ルネマンとフークスは、特別に設計された超音波システムを使用して大動脈の速度プロファイルを記録し、蛍光流速トレーサー26を用いた光学技術を介して動脈に記録した。頸動脈では、頸動脈で11~13dyn/cm2の平均せん断応力が達し、上腕動脈の4~5dyn/cm2に達する。 最大25〜70 dyn/cm2のピーク値は頸動脈について監視されている。小静脈と中静脈のせん断応力値の範囲は 0.1 ~ 0.5 dyn/cm2です。ここで説明するマイクロ流体システムにおいて、適用可能なせん断応力値は、選択された灌流浴量、チャネルスライドの高さ、および使用される流体媒体の粘度に依存する。選択した流体設定は、長さ50cm、直径1.6mmの灌流セットと組み合わせた高さ0.4cm(体積100°L)のスライドで構成され、中粘度は0.0072[dyn·s]/cm2であった。この設定は、流量 3.8−33.9 mL/分で3.5~31.2 dyn/cm2のせん断応力範囲に適しています。さらに、圧力ポンプソフトウェア制御は脈拍動の動脈血流を模倣することができる脈拍動の媒体の流れを適用できる。
この組み合わせマイクロ流体感染法の成功し、信頼性が高く、再現可能な使用には、留意しなければならないいくつかの予防措置が必要です。微小流体状態下での感染過程では、細胞層が肺炎球菌などの細胞傷害性または細胞溶解性細菌化合物にさらされ、真核細胞の生存率に影響を与え、スライド表面への細胞付着を弱める。したがって、実験の全体を通して一定の流れを維持する必要があり、細胞形態の完全性を頻繁に監視する必要があります。さらに、フロー培養培地は、感染実験を通じて細胞の表面付着を確実にするために、内皮細胞にすべての必須栄養素を提供する必要があります。それにもかかわらず、 培地サプリメントは、細菌と特定の宿主タンパク質間の相互作用を妨げるか、または阻害する可能性のある物質が含まれていることに留意する必要があります。例えば肺炎球菌-VWF相互作用の研究では、ヘパリンは、VWF8への肺炎球菌の結合を阻害するので、細胞培養培地から枯渇しなければならない。
内皮細胞の流れ培養におけるもう一つの重要なステップは、細胞全体の活力と分化のレベルに依存するタイトな細胞接着の維持である。一次内皮細胞のせん断流抵抗性細胞接着は、せん断応力にさらされる前に細胞が厳密に亜収縮状態に保たれている場合にのみ達成された。一方、WPBの産生は、タイトな細胞結合を促進する内皮細胞層の合流性に直接依存する。原発性内皮細胞のマイクロ流体細胞培養の利点は、流れ条件下でのコンフルエント細胞層の形成に迅速につながる強誘起細胞増殖をカバーする。細胞は互いにしっかりと結合され、流れの方向に集合的に配向され、分泌性WPBを産生するために必要とされる高度に分化した表現型を表す。これらのWPBは、ヒスタミン刺激または肺炎溶解活性27、13時にタンパク質バーストとしてエキソサイト化されるVWF、血管拡張活性化剤、およびサイトカインの貯蔵小胞として機能する。従って、高い接着剤の生成には、低増殖通路における分化した一次内皮細胞のコンフルエントセル層は、効率的なVWF放出および細胞表面上のVWF弦の形成および流れ条件における細菌-VWF相互作用の分析したがって、内皮細胞の分化は、最低で48時間の流れ培養を要し、ポンプ圧力にばらつきのない一定のせん断流を必要とすることに留意しなければならない。バリエーションがあると、突然の中程度の爆発が発生し、セルがスライドからフラッシュされる可能性があります。さらに、顕微鏡的可視化の間、マイクロ流体スライドおよびポンプシステムの媒体貯留部は、ヒト細胞の温度最適性を表すので、37°Cの温度に保たれる必要があった。
不死化ヒト細胞株は多くの科学実験に適しており、細胞培養感染研究でしばしば用いられる。これらの細胞株は、形態や受容体プロファイルに大きな変化なしに数百回の通過を可能にする、低または中程度の培養要件や無制限の増殖など、いくつかの一般的な技術的利点を共有します。しかし、これらの細胞株は孤独な単一培養を表し、人工二次元増殖条件を受ける。28欠損された生理的源組織環境は、培養29のすべての通路に伴う機能的および形態学的細胞表現型の実質的な変化をもたらす。他の細菌接着実験に先立ち、異なる細胞培養通路におけるヒト原発性肺内皮細胞の表面露出細胞型特異的マーカータンパク質および受容体のプロファイルが決定された。フローサイトメトリー分析は、血小板内皮細胞接着分子1(PECAM1)などの特定の表面タンパク質の発現を8ラウンドの細胞通過の範囲内で強く減少させたことを明らかにした。さらに、発現されたインテグリン受容体プロファイルは、細胞型非特異的インテグリン受容体パターンおよび還元細胞型特異的インテグリン受容体パターンを支持して高等細胞通路において有意に変化した(Bergmann et al., 未公開データ)。これらの結果は、感染生物学研究における病原体と宿主相互作用の解析に特に関連している。細菌感染時の微小流体細胞培養時のフェノールト細胞特性と高い機能分化を維持することを目的として、この場合は複数のドナーからの一次内皮細胞が選択され、使用されるだけ表現型特性を可能な限り具体的に保つために、最大5つの通路を8.
流れの間に細菌および特定の細胞表面構造の結合された視覚化は、最適化された蛍光染色プロトコルを必要とする。直接標識されたタンパク質、蛍光タンパク質発現細菌、および蛍光共役抗体の異なる組み合わせを使用して、免疫蛍光染色手順を可視化ターゲットに特異的に適合させることができる。これらの手順は、定義された明確な顕微鏡的可視化を可能にし、また細菌の付着および内在化の分化および定量を可能にする。内在化細菌の免疫蛍光ベースの検出には、短いTriton X-100インキュベーションなどの細胞透過ステップが必要であり、細胞剥離につながる可能性があります。したがって、フロー培養で発生する細菌内在化プロセスの検出は、PFA架橋サンプルを用いてフローインキュベーション後に可視化されるべきである。流れの細菌をリアルタイムで可視化するために、蛍光タンパク質を発現する遺伝子組み換え細菌を使用することで、迅速かつ標的化された顕微鏡的検出が可能になります。この実験研究では、KjosおよびVeening16,8によって設計された効率的な遺伝的構造を用いて生成されたRFP発現肺炎球菌株が使用された。流れの中のVWFストリングの検出のために、異なるVWF特異的フルオレセイン標識抗体を試験し、使用することができる。最小化された非特異的背景で最適なシグナル応答を得るために、適切な抗体濃度を、適用された抗体ごとに一貫して滴定した。
顕微鏡的な生細胞イメージングの場合、流体ユニットとチャネルスライドをCO2インキュベーターから取り出し、顕微鏡で37°Cに前温したチャンバーに入れます。このチャンバーは5%CO2に調整できませんでした。炭酸水素緩衝雰囲気がなければ、HUVEC形態および細菌適性は最大180分間そのまま残り、VWF媒介細菌の付着の分析に十分である。CO2インキュベーターの外でより長い感染時間と顕微鏡的モニタリングが必要な場合は、CO2濃度が不十分なためのpHシフトを補うために緩衝細胞培養培地を使用する必要があります。あるいは、システム全体を、顕微鏡可視化の時系列のステップの間にCO2インキュベーターに戻すことができる。
リアルタイムでの蛍光検出に加えて、チャネルスライド内の内皮の細菌感染を停止し、固定物質としてパラホルムアルデヒド(PFA)との培地交換によって保存することができる。流れの固定の後、チャネルスライド内の細胞表面の最適化され、段階的な免疫蛍光染色は、貴重な顕微鏡的なスナップショットの視覚化の生成を可能にし、多目的な組み合わせ構造検出を提供する細菌と宿主細胞との相互作用に関与する特定の細胞化合物。この組み合わせ方法の科学的な利点は、PFA処理チャネルスライドを保存し、目的の構造のポストフロー免疫蛍光染色に使用することができることです。PFA治療は細菌を不活性化し、RFPタンパク質の発現を停止します。そこで、細菌免疫検出や可視化のためにウサギに肺炎球菌特異的抗血清を生成し、ウサギ特異的AlexaFluor568-共役二次抗体8を用いて行った。既に述べたように、異なる抗体の組み合わせを使用するには、抗体量およびブロッキング緩衝液組成物の正確な最適化が必要である。そうしないと、非特異的なバックグラウンド信号とクロス検出効果が人工染色結果につながる可能性があります。最適化された免疫蛍光染色手順は、アクチン細胞骨格またはエンドソームマーカー13、31などの多くの異なる細胞標的の検出に容易に使用することができる。
この手順は、組織学的、生理学的、および機能的観点から生理学を模倣するより複雑な組織環境を作成するために適応することができる。提示された感染分析は、複数のチャンネルスライドを1つの灌流セットにインライン接続することで、複数の科学的な質問に同時に答えるために効率的に使用することができます。この拡張セットアップにより、同じフロー設定内の異なるセルタイプ、セル合流、および異なるスライドコーティングの分析が並行して容易になり、異なる細胞タイプの細菌感染を直接比較できます。さらに、ライン接続のシリアルといくつかのチャンネルスライドの組み合わせ分析は、遺伝子発現プロファイリングに適用できる時系列実験の可能性も提供します(例えば、感染時間依存性毒性因子の解析遺伝子発現)。
感染分析はまた、長期慢性感染期を模倣する条件で細胞応答を分析するために、数日または数週間持続する一定の層流状態に拡張することができる。提示された単細胞型培養に加えて、マイクロ流体細胞培養装置におけるヘテロチピック細胞培養のいくつかの例は、既に32、33が報告されている。これは、高スループットの薬理学的研究を可能にし、最終的には再生目的のためにマイクロ流体細胞培養システムを使用するだけでなく、34をもたらす可能性があります。
要約すると、免疫染色手順と組み合わせたマイクロ流体システムは、血管系内の状態をシミュレートする環境における細菌と宿主細胞間の病態機構の分析のための貴重なモデルとして機能した。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
このプロジェクトはDFG(BE 4570/4-1)からS.Bに資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of >2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| Histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| Reaction tubes 1.5/2.0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| Reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| Serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
References
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