Summary
Denne studien beskriver mikroskopisk overvåking av pneumococcus overholdelse av von Willebrand faktor strenger produsert på overflaten av differensiert menneskelige primære endothelial celler under skjær stress i definerte strømningsforhold. Denne protokollen kan utvides til detaljert visualisering av spesifikke celle strukturer og kvantifisering av bakterier ved å bruke differensial immunostaining prosedyrer.
Abstract
Interaksjon av Streptococcus pneumoniae med overflaten av endothelial celler er mediert i blodstrøm via mechanosensitive proteiner som von Willebrand Factor (VWF). Dette glykoprotein endrer sin molekylære konformasjon som svar på skjær stress, og dermed utsette bindende områder for et bredt spekter av Host-ligand interaksjoner. Generelt, dyrking av primær endothelial celler under en definert skjær flyt er kjent for å fremme den spesifikke cellulære differensiering og dannelsen av en stabil og tett knyttet endothelial lag som likner fysiologi av indre foring av et blodkar . Dermed, funksjonell analyse av interaksjoner mellom bakterielle patogener og verten blodkar involverer mechanosensitive proteiner krever etablering av pumpesystemer som kan simulere fysiologiske strømnings krefter kjent for å påvirke overflaten av vaskulære celler.
Den mikrovæskebasert enheten som brukes i denne studien, muliggjør en kontinuerlig og pulseless resirkulering av væsker med en definert strømningshastighet. Det datastyrte Lufttrykks pumpesystemet anvender en definert skjærbelastning på endothelial celle overflater ved å generere en sammenhengende, enveis og kontrollert medium flyt. Morfologiske endringer av celler og bakteriell vedlegget kan mikroskopisk overvåkes og kvantifisert i flyten ved hjelp av spesielle kanal lysbilder som er utformet for mikroskopisk visualisering. I motsetning til statisk cellekultur infeksjon, som generelt krever en prøve fiksering før immun merking og mikroskopiske analyser, gjør de mikrovæskebasert lysbildene det mulig å både fluorescens deteksjon av proteiner, bakterier og cellulære komponenter etter prøve fiksering; seriell immunofluorescence farging; og direkte fluorescens deteksjon i sanntid. I kombinasjon med fluorescerende bakterier og spesifikke fluorescens antistoffer, gir denne infeksjonen prosedyren en effektiv flere komponent visualisering system for et stort spekter av vitenskapelige anvendelser knyttet til vaskulær prosesser.
Introduction
Den patogenesen av pneumococcus infeksjoner er preget av en mangesidig interaksjon med et mangfold av ekstracellulære matrise forbindelser og komponenter av den menneskelige hemostase, som plasminogen og VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. Den replikasjonen glykoprotein VWF fungerer som nøkkel regulator av en balansert hemostase av formidling thrombocyte rekruttering og fibrin innlemmelse på stedet av vaskulær trombe formasjon9. Viktigheten av funksjonell, aktiv VWF for blødning kontroll og sår helbredelse er demonstrert av von Willebrand ' s sykdom, en felles arvelig blødning lidelse10.
Globular VWF sirkulerer i det menneskelige blod systemet ved en konsentrasjon på opptil 14,0 μg/ml11,10. Som svar på vaskulær skade, den lokale utgivelsen av VWF av endothelial Weibel Palade organer (WBP) er markert økt11,12. Tidligere studier viser at pneumococcus tilslutning til menneskelige endothelial celler og dens produksjon av pore-forming gift pneumolysin betydelig stimulerer luminal VWF sekresjon13. De hydrodynamisk kreftene i blodstrømmen induserer en strukturell åpning av mechanoresponsive VWF-domener. Ved strømningshastigheter på 10 Dyn/cm2 VWF multimerizes til lange protein strenger på opptil flere hundre mikrometer i lengde som forblir festet til subendothelium10,12.
For å forstå funksjonen av multimerized VWF strenger generert under skjær stress i samspillet av pneumococcus med endothelial overflaten, en mikrovæskebasert-basert cellekultur infeksjon tilnærming ble etablert. En mikrovæskebasert enhet med et programvarestyrt lufttrykk pumpesystem ble brukt. Dette aktiverte en kontinuerlig, veis resirkulering av cellekultur medium med en definert strømningshastighet. Dermed brukte systemet en definert skjær stress på overflaten av endothelial celler, som forble festet inne spesialiserte kanal lysbilder. Denne tilnærmingen aktivert simulering av skjærkraft i blodet av det menneskelige vaskulære system, der VWF strenger er generert på differensiert endothelial celler under definerte konstant strømningsforhold. For dette formålet ble de endothelial cellene dyrket i bestemte kanal lysbilder (se tabell over materialer), som ble tilpasset mikroskopiske analyser under flyten. Den mikrovæskebasert pumpen systemet gitt den svært definerte og kontrollerte skjær stress situasjonen kreves for dannelsen av utvidet VWF strenger på confluent endothelial celle laget. Etter stimulering av VWF-sekresjon av confluently vokst menneskelig navle vene endothelial celler (HUVEC) av histamin kosttilskudd, ble strengen formasjonen indusert ved å bruke en skjær stress (ԏ) på 10 Dyn/cm2. Skjær stresset er definert som kraften opptrer på celle laget. Det beregnes omtrent i henhold til Cornish et. et al.14 med ligning 1:
Hvor ԏ = skjær stress i Dyn/cm2, η = viskositet i (Dyn ∙ s)/cm2, h = halvparten av kanal høyden, w = halvparten av kanalbredden, og Φ = Strømmens hastighet i ml/min.
Resultatet av ligningen 1 avhenger av de forskjellige høydene og breddene til de forskjellige lysbildene som brukes (se tabell over materialer). I denne studien en luer kanal lysbilde av 0,4 μm resulterer i et kammer lysbilde faktor på 131,6 ble brukt (se formel 2).
Viskositet av mediet ved 37 ° c er 0,0072 Dyn ∙ s/cm ² og et skjær stress på 10 Dyn/cm ² ble brukt. Dette resulterte i en strømningshastighet på 10,5 mL/min (se formel 3).
Her er tilpasning og fremme av en mikrovæskebasert celle dyrking prosedyre ved hjelp av en enveis laminær Flow system for etterforskning og visualisering av bakteriell infeksjon mekanismer i verten blodkar er beskrevet i detalj. Generering av VWF strenger på endothelial lag kan også stimuleres ved hjelp av andre pumpesystemer som er i stand til å bruke en kontinuerlig og jevn skjær stress15.
Etter dyrking av primær endothelial celler til samløpet i flyt og stimulering av VWF streng formasjon, pneumokokker uttrykke røde fluorescens protein (RFP)16 ble lagt til endothelial celle laget under konstant mikroskopisk kontroll. Vedlegget av bakterier til VWF strenger på overflaten av endothelial celler ble mikroskopisk visualisere og overvåket i opptil tre timer i sanntid ved hjelp av VWF-spesifikke fluorescerende-merket antistoffer. Med denne tilnærmingen, rollen som VWF som en vedheft kofaktor fremme bakteriell vedlegg til vaskulær endotelet ble bestemt8.
I tillegg til mikroskopisk visualisering av protein sekresjon og conformational endringer, denne metoden kan brukes til å overvåke enkelt trinn av bakteriell infeksjon prosesser i sanntid, og å kvantifisere mengden av vedlagte bakterier på ulike tidspunkt poeng av Infeksjon. Den spesifikke programvaren-kontrollerte pumpesystemet gir også muligheten til å kultur de endothelial cellene i definerte konstante strømningsforhold i opptil flere dager og muliggjør en definert pulserende medium Flow inkubasjons. Videre kan denne metoden brukes ved hjelp av forskjellige celletyper. Tilpassing av farge protokollen gjør det også mulig å oppdage og visualisere bakterier som internalisert inn i eukaryote celler.
Dette manuskriptet beskriver denne avanserte eksperimentelle protokollen som kan brukes som en definert, pålitelig og reproduserbar tilnærming for en effektiv og allsidig karakterisering av patofysiologiske prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den mikrovæskebasert celle dyrking ble utført med kommersielle primære menneskelige navle vene endothelial celler (HUVEC). Selskapet isolerte cellene med informert samtykke fra donor. Denne studien ble godkjent av etikk Committee of Doctors Chamber av Federal State Baden-Wuerttemberg med referansenummer 219-04.
Merk: Se tabell over materialer for protokoll forsyninger.
1. Precultivation av primær endothelial celler
- Tine en frossen glyserol hetteglass inneholdende 1 x 105 primær HUVEC fra tre forskjellige givere forsiktig ved 37 ° c og frø cellene i 7 ml prewarmed endothelial cellevekst medium (ECGM, klar til bruk med kosttilskudd) i en 25 cm2 celle kolbe.
Merk: De primære endothelial cellene mister differensiering etter mer enn 5 sprednings sykluser. Derfor kan bare celler med mindre enn 5 passasjer brukes hvis høye graderinger av celle differensiering er nødvendig. - Dyrke cellene ved 37 ° c i 5% CO2 atmosfære for 60 min å tillate overflate vedlegg og utveksle ECGM cellekultur medium for å kvitte seg med rester fra cryoconservation.
- Fortsett dyrking cellene ved 37 ° c i 5% CO2 atmosfære til de danner et subconfluent celle lag.
Merk: Den HUVEC må ikke vokse til et confluent lag siden stramme celle celle kontakter hindre dannelse av et stabilt celle lag senere i flyt.
2. Precultivation av Streptococcus pneumoniae
Forsiktig: Streptococcus pneumoniae er en biosafety nivå 2-agent og kan bare brukes som kulturperler i biosafety nivå 2-laboratorier. Bruk en ren benk klassifisert for sikkerhetsnivå 2 for alle bakterielle behandlinger, unngå aerosol dannelse, og bruk en sentrifuge med aerosol beskyttelse for sedimentering av bakterier.
- Vaksinere en Columbia blod agar plate med Streptococcus pneumoniae klinisk isolere ATCC11733 avledet fra en glyserol lager stadig lagret ved-80 ° c og dyrke agar plate over natten ved 37 ° c og 5% co2.
- Forbered 40 mL Todd Hewitt flytende buljong supplert med 1% gjærekstrakt (THY) og 15 mL sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) pH 7,4, for bakteriell dyrking og vasketrinn.
- Bruk et sterilt rør for bakteriell dyrking og vaksinere den flytende kulturen buljong med bakteriell masse. Kontroller mengden av inoculation ved fotometriske måling på 1 mL alikvoter ved 600 NM mot ikke-inokulert flytende buljong som referanse. Fyll inn bakteriell masse i væsken kjøttkraft til den når en optisk tetthet på 600 NM (OD600) av 0,15.
- Ruge den inokulert flytende suppen uten risting ved 37 ° c og 5% CO2 og bestem OD600 hver 30 min ved å måle 1 ml alikvoter ved hjelp av plast kyvetter.
- Så snart bakteriell kultur har nådd en OD600 på 0,4, som tilsvarer den eksplosive vekstfasen, sentrifuger bakteriell kultur suspensjon for 10 min ved 1 000 x g ved romtemperatur (RT).
Merk: Ikke la en pneumococcus kultur å nå en OD600 på mer enn 1,0, fordi en høy pneumococcus kultur tetthet er kjent for å utløse bakteriell autolyse, som kan påvirke generelle bakteriell fitness. - Resuspend bakteriell sediment forsiktig med 10 mL PBS og sediment igjen i 10 min ved 1 000 x g ved RT.
- Resuspend den vasket bakterielle sediment forsiktig i 1 mL PBS og bestemme OD600 på 10 μL av bakteriell suspensjonen ved hjelp av 1 ml PBS som referanse.
- Juster mengden av bakterier i PBS til en OD600 på 2,0. Ifølge tidligere bestemt bakteriell telling, en OD600 av 2,0 tilsvarer 2 x 109 KOLONI forming enheter (CFU). Umiddelbart fortsette med infeksjonen prosedyren for å hindre bakteriell autolyse.
3. endothelial Cell dyrking av HUVEC under Mikrovæskebasert betingelser
- Løsne den primære endothelial celler fra cellen kultur kolbe av kontrollerte proteinolyse. Utfør følgende trinn i et sterilt miljø ved hjelp av en ren benk. Klargjør et volum på 15 mL sterilt PBS for vaske trinnene.
- Fjern ECGM fra et subconfluently HUVEC-lag og vask celle laget med 10 mL PBS ved hjelp av en serologisk pipette for å kvitte seg med cellekultur mediet.
- Ruge den vasket HUVEC med 3 mL 37 ° c prewarmed celle dissosiasjon løsning for celle avløsning i 5 min ved 37 ° c. Observer proteolytiske celle avløsning ved mikroskopisk overvåking hvert minutt.
- Pipetter frittliggende celle suspensjon i et rør som inneholder 7 mL ECGM supplert med 2% fosterets kalv serum (FCS) for å stoppe proteinolyse og sediment cellene for 3 min på 220 x g ved RT.
- Fjern supernatanten og resuspend HUVEC i 250 μL av ECGM supplert med 5% FCS og 1 mM MgSO4. Bruk 10 μL av celle oppheng for celle telling ved hjelp av en Neubauer celle telling kammer og justere celle tellingen til 4 x 106 celler/ml ECGM supplert med 5% FCS og 1 mm MgSO4.
Merk: For hver Flow eksperiment 30 mL ECGM medium supplert med 5% FCS og med 1 mM MgSO4 vil være nødvendig. Herfra på denne medium sammensetning heter ECGMS-medium. Økningen av FCS konsentrasjon i kulturen medium fra 2% til 5% støtter celle vedlegg og celle levedyktighet av HUVEC seeded i kanalen lysbildet. Mediet supplerer FCS og MgSO4 betydelig stabilisere celle feste av HUVEC under skjær stress forhold.
- Seed og dyrke HUVEC i et kanal lysbilde. Arbeid i et sterilt miljø ved hjelp av en ren benk. Cellene vil bli dyrket under skjær stress for 2 dager etterfulgt av infeksjon med bakterier og mikroskopisk overvåking for ytterligere 2 h.
- Likevekt et kanal lysbilde, et medie sett 1,6 mm i diameter og 50 cm i lengde, en alikvot av ECGMS-medium, og en luer-kanals Slide 0,4 μm i høyde, 24 timer i en inkubator med 5% CO2 -atmosfære ved 37 ° c for å redusere antall luftbobler.
Merk: Denne prosedyren anbefales for å Degas av plast utstyr og for å prewarm mediet, reagens rørene og reservoarene. Hvis materialer eller væsker har blitt lagret på RT eller i kjøleskapet, vil gasser oppløst i plast og væsker frigjøres når de varmes opp i inkubator under eksperimentet. Gassbobler vil da vises. Avgassing alle plast komponenter før eksperimentet vil eliminere denne effekten. Hver gang systemet er tatt ut av inkubator, begynner prosessen med gass absorpsjon igjen. Derfor arbeide raskt på RT og aldri la fluidic enheten utenfor inkubator for lengre tidsperioder. - Bruk en pipette til å injisere 100 μL av en 2% steril-filtrert svin gelatin løsning i PBS-løsning i en av reservoarene i et temperatur equilibrated kanal lysbilde. Ruge gelatin-løsningen for 1 time ved 37 ° c og skyll kanalen på lysbildet med 1 mL PBS under sterile forhold ved hjelp av en 1 mL luer sprøyte.
- Plasser gelatin belagt kanal lysbilde på en tynn polystyren eller Styrofoam plate for å hindre en dråpe i raset temperaturen. Tilsett 100 μL av 4 x 106/ml HUVEC suspensjon med en 1 ml luer sprøyte inn i raset.
Merk: Plassering av kanalen Skyv på den kalde metalloverflaten av ren benk kan redusere temperaturen på lysbildet bunnen, og dermed generere kaldt stress til de endothelial cellene. Under celle pipettering holder du skyve litt oppover for å la luftbobler stige og forsvinne fra innsiden av lysbildet. - Ruge kanal lysbildet med HUVEC for 60 min ved 37 ° c og 5% CO2 og fyll opp de mellom store reservoarene i begge ender av kanal raset med 60 μL ECGMS-medium hver. Ruge for 1 t ved 37 ° c og 5% CO2.
- Likevekt et kanal lysbilde, et medie sett 1,6 mm i diameter og 50 cm i lengde, en alikvot av ECGMS-medium, og en luer-kanals Slide 0,4 μm i høyde, 24 timer i en inkubator med 5% CO2 -atmosfære ved 37 ° c for å redusere antall luftbobler.
- Juster mikrovæskebasert pumpen og programvareinnstillingene.
- Koble equilibrated til pumpeenheten, fyll med 13,6 mL ECGMS-medium, og start pumpe Kontrollprogramvaren. Velg tilstrekkelig mengde og type kammer lysbilde ved hjelp av rullegardin vinduene i menyen til den fluidic enheten som er satt opp. Velg 0,007 (Dyn ∙ s/cm2) i programvaren for middels viskositet. (Se programvareinnstillingene for Trykk pumpen som er merket med røde piler i supplerende figur 1).
- Utenfor inkubator, koble en glass flaske fylt med tørking silica perler til Lufttrykks slangen (se figur 1, innfelt 3). Lufttrykket pumpen sirkulerer mellom blod reservoarene og pumpen og må være tørr før reentering pumpen enheten. Velg Flow Parameters i programvare menyen, Still inn trykket til 40-mbar, og skyll pumpe rørene med det flytende mediet ved å starte den kontinuerlige medium strømningen. (Disse innstillingene indikeres også med røde piler i supplerende figur 1).
- Programmere ønsket skjær stress sykluser av flyt dyrking. Start med 5 Dyn/cm2, kontroll balansert reservoar pumpinng og sikre at ingen luftbobler sirkulerer i pumpesystemet.
Merk: Vegg skjær stresset i et kanal lysbilde avhenger av strømningshastigheten og viskositet av medie mediet. Hvis du bruker et annet pumpesystem, henvises det til ligninger beskrevet i innledningen for å sette en strømningshastighet generere ønsket skjær stressnivå. De beskrevne innstillingene tilsvarer en strømningshastighet på 5,42 mL/min. (et eksemplarisk skjermbilde som viser innstillingene for tilstrekkelig flyt parameter i trykk pumpe programvaren, vises i supplerende figur 2). - Stopp strømnings sirkulasjonen i pumpe Kontrollprogramvaren og hold medium strømningen i blod slangen ved å klemme rørene nær luer-tilkoblingene. Koble kanal lysbildet, for derved å unngå luftbobler, og plasser fluidic enheten med det tilkoblede kanal lysbildet i en CO2 inkubator ved 37 ° c og 5% co2. Start skjær stresset ved 5 Dyn/cm2 i 30 min for å jevnt tilpasse cellene til kreftene som genereres av skjær stresset før akselererende skjær stressnivå (se supplerende figur 3).
Merk: Pass på at ingen luftbobler forblir i rørsystemet eller i lysbildet etter connectinng til rørsystemet fordi bevegelsen av luftbobler i flyten kan føre til celle avløsning. - Akselerere skjær stresset til 10 Dyn/cm2 (som tilsvarer 10,86 ml/min i denne strømnings innstillingen) og ruge kanalen lysbilde i kontinuerlig skjær stress for 48 h i en liten co2 inkubator ved 37 ° c og 5% co2 for å tillate celle differensiering ( de respektive programvare settinngs er indikert med røde piler i supplerende figur 4).
Merk: HUVEC celler har en tendens til å løsne fra kanalen overflaten hvis flyten dyrking er direkte startet på 10 Dyn/cm2. Cellene forblir festet til kammeret overflaten hvis flyten dyrking startes med mindre skjær stress ved hjelp av 5 Dyn/cm2 for minimum 30 min etterfulgt av å øke skjær stresset langsomt opp til ønsket 10 Dyn/cm2. En skjærbelastning på 10 Dyn/cm2 er minimumsverdien i denne typen som kreves for VWF streng formasjon. - Etter 24 h av mikrovæskebasert celle dyrking, stopp medium Flow med pumpen kontrollprogramvare nøyaktig når et balansert medium nivå er nådd i begge medium reservoarer. Plasser fluidic heten i en ren benk og fjern 10 mL av det sirkulert dyrket mediet til de som har brukt en 10 mL serologisk pipette. Tilsett 10 mL ECGMS-medium inn i reservoarene for å fornye mediet, plasser fluidic enheten tilbake i CO2 inkubator ved 37 ° c og 5% co2, og start fluidic dyrking ved hjelp av pumpe kontrollprogramvare.
Merk: Funksjonen til trykk pumpen kan plutselig bli forstyrret av laboratorie maskiner som store sentrifuger, som kan skape en sterk magnetfelt forstyrrelse. Denne plutselige forstyrrelsen kan føre til celle avløsning. Pass på at slike maskiner ikke er aktive i nærheten av trykk pumpen under eksperimentet. - Start prewarming av temperatur inkubasjons kammeret som dekker scenen i fluorescens mikroskop til 37 ° c for temperatur likevekts 24 timer før mikroskopisk visualisering. Når mikroskopet er prewarmed, starter du Programvarekontrollen for mikroskopet og justerer de viktigste innstillingene for fluorescens mikroskopisk overvåking ved å velge de riktige filterinnstillingene (540 NM/590 NM for påvisning av RFP-uttrykker bakterier og 470 NM/515 NM for påvisning av fluorescein utslipp av FITC-bøyd VWF-spesifikke antistoffer). Prewarm et ekstra oppvarmings kammer for inkubasjons av fluidic enheten ved 37 ° c.
Merk: Under infeksjonen analyser og mikroskopisk overvåking temperaturen i kanalen lysbildet og sirkulerende medium bør ikke reduseres vesentlig, fordi dette vil generere kulde stress på cellene. Generelt er størrelsen på temperaturen kamre som dekker mikroskopet scenen ikke nok til å dekke hele fluidic enhet. Derfor anbefales bruk av et ekstra oppvarmings kammer prewarmed til 37 ° c. - For mikroskopisk visualisering, plasser fluidic enheten i 37 ° c prewarmed varme kammeret og plasser kanal dekselet på et trinn av 37 ° c prewarmed mikroskop.
Merk: For mikroskopisk visualisering måtte fluidic enheten og kanal lysbildet fjernes fra CO2 inkubator på grunn av den begrensede lengden på Hvis infeksjon ganger og mikroskopisk overvåking lengre enn 180 min kreves utenfor 5% CO2 atmosfære for pH bufring, et pH-bufret medium skal brukes for mikrovæskebasert dyrking. - Kontroller celle morfologi og integriteten til HUVEC laget før injeksjon av histamin og bakterier til flyten sirkulasjon hele tiden av flyten eksperimentet og etter endt Flow eksperimentet ved hjelp av lyse felt modus av mikroskopet.
4. induksjon av VWF-Release og visualisering av Multimerized VWF Strings
- Oppretthold flyt innstillingen, fordi det kreves en skjærbelastning på 10 Dyn/cm2 for å utløse MULTIMERIZATION av VWF til lange strenger på opptil 200 MDa. Indusere frigivelse av VWF fra endothelial WPB ved å injisere 136 μL av en 100 mM histamin lagerløsning i ECGMS-medium som sirkulerer i slange røret ved hjelp av en injeksjons port. Den endelige konsentrasjonen av histamin i strømnings mediet vil være 1 mM. Hvis ingen injeksjon port er tilgjengelig, kan histamin legges alternativt ved pipettering inn i mediet for pumpen reservoarer.
- For immunofluorescence deteksjon av multimerized VWF-strenger, stopp flyten når et balansert medium nivå i reservoarene er nådd, og Injiser 20 μg av et VWF-spesifikt FITC-bøyd antistoff i et volum på 200 μL PBS (pH 7,4) i den sirkulerende 13,6 mL ECGMS-medium ved bruk av en injeksjons port. Hvis ingen injeksjon port er tilgjengelig, kan antistoff tilsettes alternativt ved pipettering inn i mediet for pumpe reservoarene. Dette resulterer i en endelig antistoff konsentrasjon på 1,3 μg/mL.
- For mikroskopisk skanning av flere visningsfelt på kort tid, bruk den fluorescens enheten til mikroskopet med en Xenon-fluorescens enhet med 30% strøm og et epifluorescence kamera. Overvåk formen og morfologi av HUVEC laget med den lyse feltet modus for å velge representative celler egnet for VWF-Strings visualisering.
- For visualisering av grønne fluorescerende VWF-strenger velger du et 63x/1.40 olje mål og et 470 NM deteksjons filter i fluorescens enhetsmenyen til mikroskop programvaren (LasX). Lag øyeblikksbilder av Z-stabler av minst 50 representative felt visninger, som hver inneholder ca 10 morfologisk intakt HUVEC. For kvantifisering av de grønne fluorescerende VWF-strengene på forskjellige tidspunkter, skanner flere synsfelt.
5. mikroskopisk evaluering av bakteriell vedlegg til VWF-strenger i Flow i Real time
-
Kvantifisere pneumokokk vedlegg til VWF-strenger generert på HUVEC celle overflater via immunofluorescence deteksjon.
- Hold flyten og Injiser 1,35 x 108 CFU/ml RFP-uttrykk pneumokokker i et maksimalt volum på 1 ml inn i ECGMS-medium ved hjelp av injeksjons porten. Alternativt, pipette bakteriene i mediet i pumpen reservoaret. Start skjær stresset ved 10 Dyn/cm2 for å la bakteriene sirkulere i pumpesystemet.
- Velg en 63x for å forstørre mikroskop og justere fluorescens filterinnstillinger i mikroskop programvaren til RFP-kanals (540 NM Detection filter) for påvisning av RFP-uttrykker pneumokokker.
- For kvantifisering av bakteriell vedlegg til VWF strenger, stoppe flyten og lage øyeblikksbilder av Z-stabler av minst 30 representative felt visninger, som hver inneholder ca 10 morfologisk intakt HUVEC, og telle mengden pneumokokker.
- Bruk ANOVA ett-fakultet statistikk algoritme for å evaluere dataene, etterfulgt av en post hoc tosidig prøve test for detaljert statistisk sammenligning. P-verdier på < 0,05 ble betraktet som statistisk signifikante.
6. mikroskopisk evaluering av bakteriell vedlegg til VWF-strenger etter sample fiksering
- Prøve fiksering før immunofluorescence farging.
- Stopp strømmen, Fjern 10 mL ECGMS fra pumpe reservoarene, og tilsett 10 mL PBS supplert med 5% paraformaldehyde (PFA). La PFA løsningen sirkulere i 10 min ved en skjær stress på 10 Dyn/cm2.
- Koble kanal lysbildet fra pumpeenheten.
- Block løs bindende områder på cellen overflaten og utføre immunodetection av VWF strenger og vedlagte bakterier.
- Forbered 4 mL vaskeløsning som inneholder 100 mM na2co3 (pH 9,2) supplert med 4% sukrose for alle vasketrinn. Forbered 1 mL av en blokkerings løsning som inneholder 100 mM na2co3 (pH 9,2) supplert med 4% sukrose og 2% STORFE serum albumin (BSA) for blokkering av løs bindende områder.
- Vask PFA-inkubert kanal lysbilde 3x med en 1 mL luer sprøyte for å injisere 200 μL av vaskeløsningen og ruge raset for 120 min ved RT med 200 μL blokkerings løsning.
- Forbered 4 mL av en annen blokkerings løsning som inneholder 100 mM na2co3, (pH 9,2) supplert med 4% SUKROSE og 0,5% BSA for fortynning av antistoffene. Bruk 200 μL av denne blokkerings løsningen for å fortynne den pneumococcus-spesifikke kanin antiserum 1:100. Bruk 200 μL av denne blokkerings løsningen for å fortynne det VWF-spesifikke mus antistoff 1:50 for å lage en VWF-spesifikk antistoff konsentrasjon på 4 μg/mL. Fortynne det AlexaFluor488-bøyd sekundær antistoff fra en 2 mg/mL lagerløsning 1:100 i 200 μL av PBS (pH 7,4) for å generere en endelig konsentrasjon på 20 μg/mL.
Merk: I de beskrevne immunofluorescence-innstillingene leverte antistoff-gjenkjenningen optimale resultater når Antistoffene ble fortynnet i den ovennevnte alkaliske buffer bufferen. Basert på tidligere resultater er de anbefalte blokkerings løsningene og mengden antistoffer egnet for mange bruksområder. Imidlertid kan ulike eksperimenter kreve individuell optimalisering av antistoff kombinasjon, antistoff konsentrasjon, inkubasjonstid, og Grunnloven av blokkering buffer. Som et alternativ, et fosfat-bufret system med et nøytralt pH-område kan være egnet eller foretrukket som en inkubasjons buffer. I tilfelle av svake fluorescens signaler, bør konsentrasjonen av sekundær antistoff økes. Hvis for mye løs fluorescens bakgrunnsstøy oppdages, bør mengden av blokkerende stoffer økes. - For VWF-immunofluorescence farging, vask kanal lysbildet med en 1 mL luer sprøyte ved å injisere 200 μL av vaskeløsningen 3x og ruge raset med 1:50 fortynnet VWF-spesifikt antistoff i 30 minutter ved RT. etterpå, vask kanal lysbildet igjen 3x med 200 μL av vaskeløsningen og ruge raset med 1:100 fortynnet AlexaFluor488-bøyd mus-spesifikt antistoff i 30 minutter ved RT. Til slutt, vask kanal lysbildet igjen 3x med 200 μL av vaskeløsningen.
Merk: AlexaFluor-fluorophores er følsomme for bleking. Derfor bør raset beskyttes ved å holde den i et mørkt kammer under inkubasjons trinnene med fluoroforen-bøyd antistoffer. - For immunodetection av pneumokokker ruge lysbildet med et 1:100 fortynnet pneumococcus-spesifikt kanin antistoff i 30 minutter ved RT. etterpå vaskes kanal lysbildet 3x med 200 μL av vaskeløsningen og ruge lysbildet med 1:100 fortynnet AlexaFluor568-bøyd kanin-spesifikt antistoff i 30 minutter ved RT. vask kanal lysbildet igjen 3x med 200 μL av vaskeløsningen.
- For å farge det cellulære utgangen cytoskeleton med fluorescerende phalloidin, permeabilize HUVEC ved inkubasjons med 120 μL av 0,1% Triton X-100 i 5 minutter ved RT. vask kanal lysbildet 3x med 200 μL av vaskeløsningen og ruge raset med 120 μL av 1:1000 fortynnet AlexaFluor350-bøyd phalloidin. Dette inkubasjons trinnet vil visualisere polymerisert utgangen cytoskeleton og tillate overvåking av celle form og mulige stress-indusert morfologiske endringer.
- Vask kanal dekselet 3x med 200 μL av vaskeløsningen. Til slutt, vask skyve bildet 4X med 200 μL ddH2O og Visualiser de grønne fluorescerende VWF-strengene, de røde fluorescerende Bakteriene og det blå fluorescerende utgangen cytoskeleton ved hjelp av de riktige filterinnstillingene på fluorescens mikroskopet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyrking primære HUVEC i en konstant enveis flyt resulterer i dannelsen av en confluent og tett pakket celle laget som fremmer generering av cellulære WPBs fylt med mechanosensitive VWF13,14. Denne protokollen beskriver bruk av et lufttrykk pumpebasert, pulseless resirkuleringssystem for infeksjon analyse som krever etterligne skjær stress situasjonen i den menneskelige blodstrømmen.
Dette systemet muliggjør en definert, programvarestyrt innstilling av strømningsforhold. Flytskjemaet i figur 1 illustrerer den viktigste arbeidsflyten, og starter med precultivation av primære endothelial celler (figur 1, innfelt 1) og Precultivation av pneumokokker (figur 1, innfelt 2). Det anvendte mikrovæskebasert systemet (figur 1, innfelt 3) består av et spesielt kanal lysbilde som er koblet via en luer-adapter til en slange med to medium reservoarer. Settet er plassert på en fluidic enhet som fungerer som et stativ og sysselsetter reagens rørene som ventil system. For strømnings dyrking plasseres den fluidic enheten med det medium fylte settet og det tilkoblede kanal lysbildet i en CO2 inkubator (figur 1, innfelt 3). Fluidic enheten er koblet til en Lufttrykks pumpe via luftslangen. Luften i slangen må passere gjennom en tørke flaske som inneholder silika perler for fjerning av fuktighet fra før luft reservoarene er repumped inn i pumpesystemet (bilde 1, innfelt 3). Lufttrykket pumpen styres av dataprogramvare (PumpControl v 1.5.0) som gjør det mulig å sette en kontinuerlig, definert strømningshastighet avhengig av diameteren på kanal lysbildet, lengden og diameteren på slangesettet, og viskositet av medium som brukes (figur 1, innfelt 3). Utskillelsen av VWF av WPB exocytosis av confluently dyrket HUVEC er indusert av histamin-stimulering8 anvendt i medium sirkulasjon i blod slangen ved hjelp av en injeksjon port (figur 1, innfelt 4). På et minimum skjær stress på 10 Dyn/cm2, den frigitte VWF proteiner multimerize og danner lange protein strenger nådde lengder på mer enn 100 μm (figur 1, innfelt 4, 5, 6 og figur 2a). Disse protein strengene oppdages og mikroskopisk etter injeksjonen av fluorescein isothiocyanate (FITC)-bøyd VWF-spesifikke antistoffer inn i mediet. Sirkulerende antistoffer muliggjør immunofluorescence deteksjon av celle overflate bundne VWF-strenger i sanntid (figur 1, innfelt 5)8.
Den etablerte mikrovæskebasert-baserte cellekultur infeksjon tilnærming ved hjelp av primær endothelial celler etterligner situasjonen til en lokalt betent blodkar ved infiltrasjon av blodsirkulasjonen ved bakteriell pathobionts som Streptococcus pneumoniae. Eksempler på visualisering og kvantitativ analyse av bakteriell interaksjon med differensiert vaskulære celler under skjær stress ved hjelp av mikrovæskebasert endothelial celle dyrking er vist (figur 1, inn på 5, 6). RFP-uttrykker pneumokokker ble injisert i flyten og etter 30 min av sirkulasjon, de første tegn på bakteriell vedlegg til VWF strenger av histamin-stimulert HUVEC ble mikroskopisk oppdaget (figur 1, inn-5, 6 og figur 2a, B hvite piler)8. Således, bruken av RFP-uttrykker pneumokokker aktivert kvantifisering av bakteriell vedlegg til VWF strenger på endothelial celler uten kravet om bakteriell antistoff deteksjon.
Histogram overlegg plott av fluorescens intensitet ble generert ved hjelp av evalueringsprogramvaren levert av Leica (dvs. LasX) for å visualisere colocalization av RFP-uttrykker pneumokokker med VWF strenger oppdages med grønne fluorescerende antistoffer. Dette aktiverte en kvantitativ analyse av colocalization sannsynlighet i bestemte områder av interesse (ROI) i fluorescens bildet. Ved hjelp av histogram overlegg av bakterielle signaler i kombinasjon med de fluorescens signalene fra VWF, kan overlappende fluorescens topper for begge bli brukt og dermed bekreftet pneumococcus tilknytning til VWF-strengene. Bakteriell vedlegget motstår den kontinuerlig anvendt skjær stress i minst 25 min (figur 2b)8.
I sum, den kontinuerlige flyten dyrking av primære HUVEC aktivert VWF sekresjon og generering av lange VWF protein strenger som fungerer som vedheft for sirkulerende bakterier8.
Figur 1: arbeidsflyt for analyser av bakteriell vedlegg til VWF-strenger ved hjelp av mikrovæskebasert endothelial celle dyrking. Arbeidsflyt av de viktigste eksperimentelle trinnene som begynner med precultivation av primær endothelial celler til subconfluency i cellen kultur flasker. Før celle dyrking i flyten, er celler seeded til en gelatin-belagt kanal lysbilde (innfelt 1). Bakterier dyrkes på agar plater etterfulgt av dyrking i et komplekst flytende medium til midten av loggen fase (innfelt 2). For mikrovæskebasert cellekultur er et kanal lysbilde med endothelial celler koblet til reagens rørene til en fluidic enhet i pumpesystemet og utsettes for konstant strøm for celle differensiering (innfelt 3). Genereringen av VWF-Strings (grønn pil) ble indusert av histamin injeksjon ved en skjær stress på 10 Dyn/cm2 og mikroskopisk overvåkes av immunofluorescence deteksjon ved hjelp av FITC-merket VWF-spesifikke antistoffer (innfelt 4). Etter injeksjon av RFP-uttrykker bakterier til sirkulerende medium, pneumococcus vedlegg (rød pil) til VWF-strenger ble mikroskopisk visualisere i sanntid ved fluorescens utslipp ved 450 nm (innfelt 5). Etter fiksering av cellene ved hjelp av PFA, gir differensial immunofluorescence farging visualisering av bakteriell vedlegg ved spesifikke infeksjons tids punkter (innfelt 6). Bildene av pumpesystemet og HUVEC celle lag beskrevet i trinn 1, 3, og bildet av injeksjons porten (innfelt 4) er inkludert. De immunofluorescence bildene som vises i 4 og 5 har blitt modifisert og brukt med tillatelse fra Jagau et al.8. Lengden på målestokken er indikert til nederst til høyre.
Figur 2: representative immunofluorescence bilder av pneumococcus binding til VWF strenger generert i kontinuerlig flyt på overflaten av histamin-STIMULERT HUVEC. (A) GENERERING av VWF strengene var mikroskopisk kvantifisert etter utsette CONFLUENTLY vokst HUVEC å skjære stress ved hjelp av en mikrovæskebasert pumpesystem på 10 Dyn/cm2. FITC-bøyd VWF-spesifikke antistoffer oppdaget VWF-strengene. Hvite piler peker på RFP-uttrykker pneumokokker med røde fluorescens knyttet til lange VWF strenger. (B) bakteriell vedlegg til den grønne fluorescerende VWF strengene ble mikroskopisk observert for opptil 2 t i konstant flyt (hvite piler) og ble bekreftet av programvarebasert evaluering av fluorescens intensitet av en definert avkastning. Sanntidsbilder ble tatt med det fluorescens utstyret til et konfokalmikroskopi laser skanne mikroskop (SP8, Leica). Vektstenger = 10 μm. Dette tallet har blitt modifisert og brukt med tillatelse fra Jagau et al.8.
Supplerende figur 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Simulering av bakteriell interaksjon med mechanosensitive vert proteiner som VWF krever en perfusable cellekultur system som gjør det mulig generering av en definert, enveis, og kontinuerlig strøm av væsker, og dermed generere pålitelig skjær stress . Flere mikrovæskebasert pumpesystemer er allerede beskrevet. En omfattende gjennomgang fra Bergmann et al. oppsummerer de viktigste aspektene ved ulike to-og tre-dimensjonal cellekultur modeller17.
Den mikrovæskebasert teknologien er en svært ung teknikk startet tidlig på 1990-tallet med utviklingen av kontrollerbar, reproduserbar, og perfusable microenvironments i en mikrometer og selv i en nanometer skala18. Den presenterte mikrovæskebasert tilnærmingen kan også anvendes for å studere det brede spekteret av bakterielle vedheft mekanismer og involverte proteiner. Det er best egnet for enhver interaksjon som involverer mechanoresponsive vedheft komponenter som VWF, som generelt ikke er imøtekommende ved hjelp av standard cellekultur teknikker. For eksempel er det kjent at konformasjon av flere ekstracellulære matrise proteiner varierer avhengig av deres plassering. I blodet systemet, glykoproteiner som fibronektin sirkulere i en globular konformasjon, mens i ekstracellulære matrise proteinene vises som multiconnected di-og multimerized stillas19,20. Videre, flere distributører av mikrovæskebasert utstyr tilbyr standardisert kanal lysbilder precoated med ulike typer kollagen (f. eks, subendothelial kollagen eller andre plasma-avledede proteiner). Disse kanal lysbildene er egnet for visualisering og kvantitative analyser av bakteriell vedheft til spesifikke ekstracellulære matrise proteiner i ulike strømnings situasjoner.
Ulike mikrovæskebasert systemer kan kategoriseres basert på de ulike materialene som brukes for microdevice produksjon. I denne forbindelse skiller glass/silikon-baserte plattformer seg fra polymer-baserte og papir-baserte plattformer21. Polymer-baserte kanal lysbilder produseres med en elastisk støttes overflate (ESS), vanligvis krever et overflatebelegg for celle vedlegg underflyt eksperimenter. Som et alternativ til et belegg med vedheft-støtte komponenter som kollagen, overflaten av noen kommersielt tilgjengelige kanal lysbilder er fysisk endret, noe som skaper en hydrofile og selvklebende overflate som passer for de fleste celletyper. Videre er noen kanal lysbilder generert ved hjelp av underlag som Polydimethylsiloxan (PDMS), som er oksygen gjennomtrengelig og gjør det også mulig for kulturen i blodkar celler på den indre overflaten av microchannels i fluidic pumpesystemer22, 23på.
Mikrovæskebasert systemet som ble brukt i disse studiene fungerte som en effektiv og pålitelig system som ble brukt for analysen samspillet av Staphylococcus aureus med multimerized VWF fibre etter kultur av menneskelig endothelial celler i flyt 24,25. Dette mikrovæskebasert systemet var et lukket sirkulært system som gjorde det mulig å analyse av infeksjoner av sykdomsfremkallende bakterier under biosafety 2 forhold. Videre var kanalen lysbildene egnet for mikroskopisk overvåking underflyt og er tilgjengelig med ulike precoatings (f. eks, gelatin, Poly-L-lysin, eller kollagen-IV) som sikrer celle vedheft og en høy grad av eksperimentell reproduserbarhet. Denne protokollen bruker et mikrovæskebasert system (se tabell av materialer) for etablering av en perfusable infeksjon modell for S. pneumoniae, og dermed etterligne flyten situasjonen i det menneskelige vaskulære system8.
Den beskrevne generelle prosedyren for bakteriell celle vedlegg i dette mikrovæskebasert systemet kan også gjennomføres med andre typer pumpesystemer generere en definert og kontinuerlig flyt i et sterilt miljø. For mikrovæskebasert formål, hovedsakelig fire typer flytkontroll systemer brukes: i) peristaltisk pumper og resirkulering pumper, som brukes i denne protokollen, II) sprøyte pumper, III) Trykk kontrollere, og IV) Trykk kontrollere med Flow Switch matriser. Hver type flytkontroll system har fordeler og ulemper avhengig av spesifikke mikrovæskebasert programmet og evnen til å utføre mikroskopiske visualisering i sanntid. I de fleste programmer som krever kontinuerlig sirkulasjon av prøvene, kombineres resirkulerings pumper med programvarebasert trykk kontrollere for å sikre en definert strømnings situasjon. Dette er også optimalisert i pumpesystemet demonstrert her. Sprøyte BAS ert pumpesystemer kan deles inn i "klassiske" sprøyte pumper, som genererer strømnings bevegelse og "pulseless" mikrovæskebasert sprøyte pumper. Disse sprøyte pumpe-baserte systemer er generelt enkle å bruke, men flytkontroll i Dead-End kanaler er utfordrende å bruke sprøyte pumper. Videre kan strømnings endringer inne i brikken ta litt tid, og en strømningsmåler er nødvendig for å bestemme strømningshastigheten. Selv pulseless sprøyte pumper kan generere periodiske pulsering på strømningshastigheten på grunn av den trinnvise motoren i sprøyte pumpen. En annen to sprøyte pumpen enheten er i stand til å generere en "sette mot og trekke"-baserte fluidic bevegelse som gjelder definerte skjærkrefter på celle overflater og er egnet for microdialysis applikasjoner selv i en PC-uavhengig måte. Dette systemet må kombineres med microtubing for tilkobling av kamre eller kanal lysbilder for celle dyrking etterfulgt av mikroskopiske analyser.
De ovennevnte trykk kontrollerne er strømningskontrollsystemer som pressurize tanken som inneholder prøven, som er jevnt injisert i et mikrovæskebasert kammer eller på en chip. Trykk kontrollerne kan etablere en pulseless flyt og også gi strømningshastigheter i kombinasjon med Strømningsmålere. En kombinasjon av trykk kontrollere med Flow Switch matriser aktivere en rask flyt bryter uten tilbake renn. Den resirkulering systemet presenteres her aktivert generering av skjær stress verdier vanligvis rapportert for det menneskelige vaskulære systemet26. In vivo vaskulær vegg skjær stress har blitt estimert fra veggen skjær hastigheter som avledet fra ikke-invasivt registrert hastighet profiler, og hele blod viskositet i store arterier og plasma viskositet i arterioler26. Reneman og Hoeks innspilt hastighet profiler i store arterier ved hjelp av en spesialdesignet ultralydsystem og i arterioler via optiske teknikker ved hjelp av fluorescerende strømningshastighet Bevegelsesuskarphet26. En gjennomsnittlig skjær stress på 11-13 Dyn/cm2 er nådd i hals puls arterien, i motsetning til bare 4-5 Dyn/cm2 i brachialis arterien. Topp verdier på opp til 25-70 Dyn/cm2 er overvåket for hals puls arterien. Skjær stress verdier av små og mellom store årer varierer mellom 0,1 og 0,5 Dyn/cm2. I det mikrovæskebasert systemet som beskrives her, avhenger den aktuelle skjær belastnings verdien av den valgte diameter på rør slangen, høyden på kanal lysbildet og viskositet for det fluidic mediet som brukes. Den valgte fluidic innstillingen var sammensatt av et lysbilde med 0,4 cm i høyde (volum på 100 μL) i kombinasjon med et sett med 50 cm i lengde og 1,6 mm i diameter og medium viskositet var 0,0072 [Dyn · s]/cm2. Denne innstillingen passer for et skjær stress område mellom 3,5 og 31,2 Dyn/cm2 ved strømningshastigheter på 3,8 − 33.9 ml/min. I tillegg kan trykk pumpe programvarekontroll bruke en pulserende medium flyt som kan etterligne en pulserende arteriell blodstrøm.
Den vellykkede, pålitelige og reproduserbar bruk av denne kombinerte mikrovæskebasert infeksjon metoden krever noen forholdsregler som må holdes i tankene. Under infeksjons prosessen under mikrovæskebasert forhold, kan celle laget bli utsatt for cytotoksisk eller cytolytisk bakterielle forbindelser som pneumolysin, som påvirker eukaryote celle levedyktighet og svekke cellen tilslutning til raset overflaten. Derfor er det nødvendig å holde en konstant flyt gjennom hele løpet av eksperimentet, og integriteten til celle morfologi må overvåkes ofte. Videre bør flyten kultur medium gi alle essensielle næringsstoffer til endothelial cellene for å sikre en stram overflatefeste av cellene gjennom infeksjonen eksperimentet. Likevel må det bemerkes at medium kosttilskudd inneholder stoffer som kan forstyrre eller hemme samspillet mellom bakterier og spesifikke vert proteiner. I studier av pneumococcus-VWF interaksjon for eksempel, må heparin tømmes fra cellen kulturen medium, fordi det hemmer bindingen av pneumokokker til VWF8.
Et annet kritisk skritt i Flow kultur av endothelial celler er vedlikehold av stramt celle vedheft, som avhenger av den samlede cellen vitalitet og på nivået av differensiering. Skjær strømnings bestandig celle vedheft av primær endothelial celler ble bare oppnådd når cellene ble strengt holdt i subconfluency før eksponering for å skjære stress. På den annen side, produksjon av WPB direkte avhenger av confluency av endothelial celle laget fremme stramme celle-celle-kontakter13. Fordelen med den mikrovæskebasert celle kulturen til primær endothelial celler dekker den sterkt induserte celle spredningen som raskt fører til dannelsen av et confluent celle lag under strømningsforhold. Cellene er tett festet til hverandre, er kollektivt orientert i retning av flyt, og representerer en svært differensiert fenotype som er nødvendig for å produsere sekretoriske WPB. Disse WPB tjene som lagring blemmer for VWF, vasodilatasjon aktivator, og cytokiner som er exocytosed som protein sprekker på histamin stimulering eller pneumolysin aktivitet27,13. Derfor er generering av en svært lim, confluent celle lag av differensiert primære endothelial celler i lav spredning passasjer en uunnværlig forutsetning for effektiv VWF utgivelse og dannelsen av VWF strenger på celleoverflaten og analyser av bakterier-VWF-interaksjon i strømningsforhold. Dermed må det bemerkes at differensiering av endothelial celler tok 48 h av flyten dyrking på et minimum og krevde en konstant skjær flyt uten noen variasjoner i pumpetrykket. Eventuelle variasjoner kan føre til en plutselig medium blast, som ville skylle cellene ut av lysbildet. Videre, under mikroskopisk visualisering av mikrovæskebasert lysbilde og de medium reservoarer av pumpesystemet måtte holdes ved en temperatur på 37 ° c som dette representerer temperaturen optimal av den menneskelige celler.
Udødeliggjort menneskelige cellelinjer er egnet for mange vitenskapelige eksperimenter og er ofte ansatt i cellekultur infeksjon studier. Disse cellelinjer dele noen generelle tekniske fordeler, for eksempel lav eller moderat kultur krav og ubegrenset spredning, noe som gjør passaging flere hundre ganger uten vesentlige endringer i morfologi eller reseptor profiler. Men disse cellelinjer representerer en ensom monokultur og er utsatt for kunstige to-dimensjonale vekstforhold. 28 den manglende fysiologiske kilde vevet miljø resulterer i betydelige endringer av funksjonelle og morfologiske celle fenotype med hver passering av kulturen29. Før andre bakterielle vedheft eksperimenter, profilen til overflate-eksponert celle-type bestemt markør proteiner og reseptorer av menneskelig primære lunge endothelial celler på ulike cellekultur passasjer ble bestemt. Flyten flowcytometri analysen avdekket et sterkt redusert uttrykk for spesifikke overflate proteiner som blodplater endothelial celle vedheft molekyl 1 (PECAM1) innen åtte runder med celle passaging. Videre ble den uttrykte integrin reseptor profilen signifikant endret i høyere celle passasjer i favør av en celle type-løs integrin reseptor mønster og en redusert celle type-spesifikke integrin reseptor mønster (Bergmann et al., upubliserte data). Disse resultatene er spesielt relevant for analyser av patogen-vert interaksjoner i smitte biologi studier. Med sikte på å opprettholde den fenotypiske celle egenskaper og et høyt nivå av funksjonell differensiering under mikrovæskebasert cellekultur på tidspunktet for bakteriell infeksjon, ble primære endothelial celler fra flere givere valgt i dette tilfellet og brukes bare opptil fem passasjer på maksimum for å holde fenotypiske egenskaper så spesifikk som mulig8.
Den kombinerte visualisering av bakterier og spesifikke celle overflatestrukturer under flyten krever en optimalisert fluorescens fargeprotokoll. Ved hjelp av ulike kombinasjoner av direkte merkede proteiner, fluorescens protein-uttrykker bakterier, og fluorescens-bøyd antistoffer, immunofluorescence farging prosedyrer kan være spesielt tilpasset visualisering mål. Disse prosedyrene muliggjør en definert og klar mikroskopisk visualisering og også en differensiering og kvantifisering av bakteriell overholdelse og internalisering3,13,30,31. Den immunofluorescence deteksjon av internalisert bakterier krever en celle permeabilization trinn, for eksempel en kort Triton X-100 inkubasjons, som kan føre til celle avløsning. Derfor bør påvisning av bakterielle internalisering prosesser som forekommer i en strømnings kultur, vises etter flyt inkubasjons ved hjelp av PFA-krysskoblet prøver. For sanntids visualisering av bakterier i flyt, gir bruk av genmodifiserte bakterier uttrykker fluorescens proteiner en rask og målrettet mikroskopisk deteksjon. RFP-uttrykker pneumococcus stammer som ble generert ved hjelp av en effektiv genetisk konstruere designet av Kjosog Veening ble brukt i denne eksperimentelle studien. For påvisning av VWF-strenger i flyt, ble forskjellige VWF-spesifikke fluorescein-merkede antistoffer testet og kan brukes. For å oppnå en optimal signal respons ved en minimert løs bakgrunn, var tilstrekkelig antistoff konsentrasjon gjennomgående titrert for hvert anvendt antistoff.
For mikroskopisk Live celle avbildning fjernes fluidic heten og kanal lysbildet fra CO2 inkubator og plasseres i et kammer prewarmed til 37 ° c ved mikroskopet. Dette kammeret kunne ikke justeres til 5% CO2. Uten en fysisk bufret atmosfære, forble HUVEC morfologi og bakteriell fitness intakt i opptil 180 min, noe som er nok for analyse av VWF-mediert bakteriell overholdelse. Hvis lengre infeksjons tider og mikroskopisk overvåkning utenfor en CO2 inkubator kreves, bør en bufret cellekultur medium brukes for å kompensere for pH-Skift på grunn av utilstrekkelig co2 -konsentrasjon. Alternativt kan hele systemet bli plassert tilbake i CO2 inkubator i mellom trinnene i en tidsserie av mikroskopisk visualisering.
I tillegg til fluorescens deteksjon i sanntid, kan bakteriell infeksjon av endotelet innenfor kanalen lysbildet bli stoppet og bevart ved middels utveksling med paraformaldehyde (PFA) som en fiksering substans. Etter fiksering i flyten, den optimaliserte og trinnvis immunofluorescence farging av celleoverflaten innenfor kanal raset muliggjør generering av verdifulle mikroskopiske øyeblikksbilder visualiseringer og gir en allsidig kombinert struktur deteksjon av spesifikke cellulære forbindelser involvert i samspillet mellom bakterier og verts celler. Det naturvitenskapelig fordel av denne kombinert metoden er det alt det PFA-behandlet kanalen skyve kan lagret og anvendt for en stolpe-flyte immunofluorescence flekk av det strukturer av begrave. Den PFA behandling inaktiverer bakteriene og dermed arrestasjoner uttrykk for RFP-protein. Derfor ble en pneumococcus-spesifikk antiserum generert i kanin for bakteriell immun deteksjon og visualisering ble utført ved hjelp av en kanin-spesifikk AlexaFluor568-bøyd sekundært antistoff8. Som allerede nevnt, krever bruk av ulike antistoff kombinasjoner en eksakt optimalisering av antistoff beløp og blokkering buffer sammensetning. Ellers kan løs bakgrunns signaler og kryss gjenkjennings effekter føre til kunstige fargeresultater. En optimert immunofluorescence farging fremgangsmåte kanne lett bli brukt for oppdagelsen av mange annerledes Cellular mål som det utgangen cytoskeleton eller endosomal markører13,31.
Denne prosedyren kan tilpasses for å skape et mer komplekst vev miljø som etterligner fysiologi fra en histologic, fysiologisk og funksjonell synspunkt. De presenterte infeksjons analysene kan effektivt brukes til å besvare flere vitenskapelige spørsmål samtidig ved å bruke en i linje-tilkobling av flere kanal lysbilder til ett sett. Denne utvidede satt opp ville lette analysene av ulike celletyper, celle Confluences, og forskjellige Slide-belegg innenfor samme flyt innstillingen parallelt og tillate en direkte sammenligning av bakterielle infeksjoner av ulike celletyper. Videre, fortsettelsene inne line forbindelse og kombinert analyserer av adskillige kanalen lysbilder likeledes skaffer muligheten av tid serien eksperimenter, hvilke kan anvendt for gen gjengivelsen profilering (e.g., analysen av infeksjon tid-avhengig virulens faktoren genuttrykk).
Infeksjonen analysene kan også utvides til en konstant laminær Flow tilstand som varer flere dager eller uker for å analysere cellulære respons i forhold etterligne en langsiktig kronisk infeksjon fase. I tillegg til den presenterte enkelt celletypen kultur, har noen eksempler på heterotypic cellekultur i mikrovæskebasert cellekultur enheter allerede blitt rapportert32,33. Dette gjør det mulig for høy gjennomstrømning farmakologiske studier og kan til slutt føre til bruk av mikrovæskebasert cellekultur systemer for regenererende formål så vel34.
Oppsummert var det mikrovæskebasert systemet i kombinasjon med immun farging prosedyrer som en verdifull modell for analyse av pathomechanisms mellom bakterier og vert celler i et miljø som simulerer forholdene i det vaskulære systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Prosjektet ble finansiert av DFG (BE 4570/4-1) til S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of >2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| Histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| Reaction tubes 1.5/2.0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| Reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| Serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
References
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
- Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
- Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
- Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
- Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
- Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
- Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
- Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).
- Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
- Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
- Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
- Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
- Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
- Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
- Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
- Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
- Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
- Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
- Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
- Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
- Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
- Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
- Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
- Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
- Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
- Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
- Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218 (1996).
- Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
- Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
- Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).
