Summary
تصف هذه الدراسة الرصد المجهري للالتزام بالمكورات الرئوية لسلاسل عامل فون ويلبراند المنتجة علي سطح الخلايا البطانية الاساسيه البشرية المتمايزة تحت ضغط القص في ظروف التدفق المحددة. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل التصور التفصيلي للهياكل الخلوية المحددة والقياس الكمي للبكتيريا عن طريق تطبيق إجراءات المناعة التفاضلية.
Abstract
يتم التوسط في تفاعل العقديه الرئوية مع سطح الخلايا البطانية في تدفق الدم عن طريق البروتينات الميكانيكية مثل عامل فون ويلبراند (vwf). هذا البروتين السكري يغير التشكيل الجزيئي الخاص به استجابه للإجهاد القص ، التالي تعريض مواقع ملزمه لمجموعه واسعه من التفاعلات المضيف-ligand. بشكل عام ، من المعروف ان زراعه الخلايا البطانية الاوليه تحت تدفق القص محدده لتعزيز التمايز الخلوي محدده وتشكيل طبقه بطانية مستقره ومرتبطة باحكام تشبه فسيولوجيا البطانة الداخلية للاوعيه الدموية . وهكذا ، فان التحليل الوظيفي للتفاعلات بين مسببات الامراض البكتيرية والاوعيه الدموية المضيفة التي تنطوي علي البروتينات الميكانيكية يتطلب إنشاء أنظمه ضخ التي يمكن محاكاة قوي تدفق الفسيولوجية المعروف ان تؤثر علي سطح خلايا الاوعيه الدموية.
ويتيح الجهاز المجهري المستخدم في هذه الدراسة أعاده تدوير مستمرة ونبضه للسوائل بمعدل تدفق محدد. يطبق نظام مضخة ضغط الهواء الذي يتحكم فيه الكمبيوتر ضغطا محددا للقص علي أسطح الخلايا البطانية عن طريق توليد تدفق متوسط مستمر وأحادي الاتجاه ومتحكم فيه. يمكن رصد التغيرات المورفولوجية للخلايا والملحقات البكتيرية مجهريا وتحديدها كميا في التدفق باستخدام شرائح قناه خاصه مصممه لتصور مجهري. علي النقيض من العدوى الخلوية الساكنة ، والتي تتطلب بشكل عام تثبيت العينات قبل وضع العلامات المناعية والتحاليل المجهرية ، فان الشرائح الصغيرة تتيح الكشف القائم علي الفلورية للبروتينات والبكتيريا والمكونات الخلوية بعد تثبيت العينة ؛ المسلسل تلطيخ المناعي. والكشف المباشر القائم علي الفلورية في الوقت الحقيقي. في تركيبه مع البكتيريا الفلورية والأجسام المضادة المسمية الفلورية المحددة ، يوفر هذا الاجراء العدوى نظام التصور مكون متعددة فعاله لطيف ضخم من التطبيقات العلمية المتعلقة بعمليات الاوعيه الدموية.
Introduction
وتتميز الاصابه بالتهابات المكورات الرئوية بتفاعل متعدد الأوجه مع تنوع مركبات مصفوفة خارج الخلية ومكونات الأرقاء البشري ، مثل البلازمينوجين و vwf1،2، 3،4،5،6،7،8. البروتين السكري متعدد المجالات VWF بمثابه منظم الرئيسية من الأرقاء متوازنة عن طريق التوسط في التوظيف الجلطات والتاسيس الفيفيبين في موقع تشكيل خضيه الاوعيه الدموية9. ويتجلى اهميه الوظيفية ، VWF النشطة للسيطرة علي النزيف والتئام الجروح من قبل المرض فون ويلبراند ، وهو اضطراب النزيف الموروثة المشتركة10.
يدور vwf الكروي في نظام الدم البشري بتركيز يصل إلى 14.0 ميكروغرام/مل11,10. ردا علي أصابه الاوعيه الدموية ، والإفراج المحلي من vwf بواسطة الهيئات البطانية weibel palade (wbp) زيادة ملحوظة11،12. وتبين الدراسات السابقة ان التصاق بالمكورات الرئوية للخلايا البطانية البشرية وإنتاجها من السموم التي تشكل المسام بنيوموليسين بشكل كبير يحفز التلالؤ VWF إفراز13. القوي الهيدروديناميكية لتدفق الدم للحث علي فتح الهيكلية للمجالات VWF الألى المستجيبة. في معدلات التدفق من 10 داين/سم2 و vwf multimerizes إلى سلاسل البروتين طويلة تصل إلى عده مئات ميكرومتر في الطول التي لا تزال تعلق علي سوبيندوثيليوم10,12.
لفهم وظيفة السلاسل VWF multimerized المتولدة تحت الضغط القص في التفاعل من المكورات الرئوية مع سطح بطانية ، تم تاسيس نهج العدوى ثقافة الخلية القائمة علي ميكروفلويديك. تم استخدام جهاز ميكروفلويدريك مع نظام مضخة ضغط الهواء التي تسيطر عليها البرمجيات. وقد مكن ذلك من أعاده التدوير المستمرة أحاديه الاتجاه لمتوسط ثقافة الخلية بمعدل تدفق محدد. التالي ، طبق النظام إجهادا محددا للقص علي سطح الخلايا البطانية ، والذي ظل ملتصقا داخل شرائح القناات المتخصصة. وقد مكن هذا النهج من محاكاة قوه القص داخل مجري الدم لنظام الاوعيه الدموية البشرية ، الذي تولد فيه سلاسل VWF علي خلايا بطانية متباينة تحت ظروف تدفق ثابته محدده. لهذا الغرض ، تم زراعه الخلايا البطانية في شرائح قناه محدده (انظر جدول المواد) ، والتي تم تكييفها للتحليلات المجهرية اثناء التدفق. وقد وفر نظام المضخة ميكروفلويديك وضع الإجهاد القص المحدد بدرجه عاليه والمتحكم به والمطلوب لتشكيل سلاسل vwf الموسعة علي طبقه الخلايا البطانية المتموجة. بعد تحفيز VWF-إفراز خلايا الوريد الحبل السري البشري كونفلوينتلي نمت (HUVEC) بواسطة مكملات الهيستامين ، وكان المستحث تشكيل سلسله من خلال تطبيق الضغط القص (ԏ) من 10 داين/سم2. يتم تعريف الإجهاد القص كقوة تعمل علي طبقه الخلية. وتحسب تقريبا وفقا لكورنيش et. al.14 مع المعادلة 1:
حيث ԏ = القص الإجهاد في داين/سم2، η = اللزوجة في (داين ∙ s)/سم2، h = نصف ارتفاع القناة ، ث = نصف عرض القناة ، و Φ = معدل الجريان في مل/دقيقه.
تعتمد نتيجة المعادلة 1 علي الارتفاعات والعروض المختلفة للشرائح المختلفة المستخدمة (انظر جدول المواد). في هذه الدراسة تم استخدام شريحة قناه Luer من 0.4 μm الناتجة في عامل الشريحة الغرفة من 131.6 (انظر الصيغة 2).
اللزوجة من الوسط عند 37 درجه مئوية هو 0.0072 داين ∙ s/cm ² وتم استخدام الضغط القص من 10 داين/سم ². ونتج عن ذلك معدل تدفق 10.5 مل/دقيقه (انظر الصيغة 3).
هنا ، يتم وصف التكيف والتقدم من الخلية ميكروفلويدريك اجراء التنظير باستخدام نظام تدفق الصفعي أحادي الاتجاه للتحقيق والتصور من أليات العدوى البكتيرية في الاوعيه الدموية المضيف بالتفصيل. يمكن أيضا تحفيز توليد سلاسل VWF علي طبقات بطانية باستخدام أنظمه المضخات الأخرى التي هي قادره علي تطبيق الإجهاد القص مستمرة وثابته15.
بعد زراعه الخلايا البطانية الاوليه للتقاء في تدفق وتحفيز تشكيل سلسله VWF ، تمت أضافه المكورات الرئوية التي تعبر عن البروتين الأحمر الفلوري (عروض العروض)16 إلى طبقه الخلايا البطانية تحت السيطرة المجهرية المستمرة. تم مجهريا تصور ومراقبه المرفق من البكتيريا إلى سلاسل VWF علي سطح الخلايا البطانية ورصدها لمده تصل إلى ثلاث ساعات في الوقت الحقيقي باستخدام الأجسام المضادة المحددة بالنيون التي تحمل علامة الفلورسنت. مع هذا النهج ، تم تحديد دور VWF كعامل التصاق تعزيز التعلق البكتيرية لبطانة الاوعيه الدموية8.
بالاضافه إلى التصور المجهري لإفراز البروتين وتغييرات المطابقة ، يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبه الخطوات الفردية لعمليات العدوى البكتيرية في الوقت الحقيقي ولقياس كميه البكتيريا المرفقة في نقاط زمنيه مختلفه من العدوي. كما يوفر نظام المضخات الذي يتم التحكم فيه بواسطة البرامج امكانيه لاستزراع الخلايا البطانية في ظروف التدفق الثابتة المحددة لمده تصل إلى عده أيام وتمكين الحاضنة المتوسطة التدفق المحددة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة باستخدام أنواع مختلفه من الخلايا. تكييف بروتوكول تلطيخ أيضا تمكن من الكشف والتصور من البكتيريا التي تم استيعابها في الخلايا النواة.
تصف هذه المخطوطة هذا البروتوكول التجريبي المتقدم الذي يمكن استخدامه كنهج محدد وموثوق به وقابل للتكرار لتوصيف العمليات الفسيولوجية المرضية بطريقه تتسم بالكفاءة والتنوع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت زراعه الخلايا المجهرية مع خلايا بطانة الوريد السري البشري الرئيسية التجارية (HUVEC). وقد عزلت الشركة الزنزانات بموافقه مستنيرة من الجهة المانحة. تمت الموافقة علي هذه الدراسة من قبل لجنه الأخلاق من غرفه الأطباء في الدولة الاتحادية بادن-فيرتمبرج مع الرقم المرجعي 219-04.
ملاحظه: انظر جدول المواد للوازم المراسم.
1. بريكولتيفيشن الخلايا البطانية الاوليه
- ذوبان قارورة الجلسرين المجمدة التي تحتوي علي 1 × 105 HUVEC الابتدائية من ثلاثه مانحين مختلفين برفق في 37 درجه مئوية والبذور الخلايا في 7 مل من متوسط نمو الخلايا البطانية المعتدلة (ecgm ، وعلي استعداد للاستخدام مع المكملات الغذائية) في 25 سم2 خليه قارورة.
ملاحظه: تفقد الخلايا البطانية الاساسيه القدرة علي التمايز بعد أكثر من 5 دورات الانتشار. ولذلك ، يمكن استخدام الخلايا التي تحتوي علي اقل من 5 مقاطع فقط إذا كانت الدرجات العالية من تمايز الخلايا مطلوبه. - زراعه الخلايا في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2 جو لمده 60 دقيقه للسماح المرفقات السطحية وتبادل المتوسطة الخلية ecgm الثقافة للتخلص من بقايا من الحفظ.
- مواصله زراعه الخلايا في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2 الغلاف الجوي حتى انها تشكل طبقه خليه سوبكونفلوينت.
ملاحظه: يجب ان لا ينمو HUVEC إلى طبقه متموج منذ الاتصالات خليه خليه ضيقه منع تشكيل طبقه خليه مستقره في وقت لاحق في التدفق.
2. بريكولتيفيشن العقديه الرئوية
تحذير: العقديه الرئوية هي عامل مستوي السلامة البيولوجية 2 ويسمح فقط ليتم استزراعها في مختبرات مستوي السلامة الاحيائيه 2. استخدام مقعد نظيفه تصنف لمستوي السلامة 2 لجميع العلاجات البكتيرية ، وتجنب بدقه تشكيل الهباء الكتروني ، واستخدام جهاز الطرد المركزي مع حماية الهباء الكتروني لترسب البكتيريا.
- تطعيم لوحه أجار الدم كولومبيا مع العقديه الرئوية العزلة السريرية ATCC11733 المستمدة من الأسهم الجلسرين تخزينها باستمرار في-80 درجه مئوية وزراعه لوحه أجار بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
- اعداد 40 مل من المرق السائل تود هيويت تستكمل مع 1 ٪ استخراج الخميرة (THY) و 15 مل من الفوسفات معقمه-مخزنه المالحة (تلفزيوني) pH 7.4 ، للزراعة البكتيرية وخطوات الغسيل.
- استخدام أنبوب معقم للزراعة البكتيرية وتطعيم مرق الثقافة السائلة مع كتله البكتيريا. السيطرة علي كميه من التلقيح عن طريق قياس فوتومتري من 1 مل قسامات في 600 نانومتر ضد مرق السائل غير تطعيم كمرجع. أملا الكتلة البكتيرية في المرق السائل حتى يصل إلى كثافة بصريه عند 600 نانومتر (OD600) 0.15.
- احتضان مرق السائل تطعيم دون اهتزاز في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 وتحديد OD600 كل 30 دقيقه عن طريق قياس 1 مل قسامات باستخدام cuvettes البلاستيك.
- بمجرد ان الثقافة البكتيرية قد وصلت إلى600 OD من 0.4 ، والذي يتوافق مع مرحله النمو الاسي ، الطرد المركزي تعليق الثقافة البكتيرية لمده 10 دقيقه في 1,000 x g في درجه حرارة الغرفة (RT).
ملاحظه: لا تسمح للثقافة المكورات الرئوية للوصول إلى600 OD من أكثر من 1.0 ، لان كثافة ثقافة المكورات الرئوية العالية ومن المعروف ان تؤدي إلى التحلل التلقائي البكتيري ، والتي قد تؤثر علي اللياقة البدنية البكتيرية الشاملة. - أعاده تعليق الرواسب البكتيرية برفق مع 10 مل تلفزيوني والرواسب مره أخرى لمده 10 دقيقه في 1,000 x g في RT.
- أعاده تعليق الرواسب البكتيرية المغسولة برفق في 1 مل تلفزيوني وتحديد OD600 من 10 μl من تعليق البكتيرية باستخدام 1 مل من تلفزيوني كمرجع.
- ضبط كميه البكتيريا في الاذاعه التلفزيونية إلى600 OD من 2.0. وفقا لجرد البكتيرية المحددة سابقا ،600 OD من 2.0 يقابل 2 × 109 مستعمره تشكيل وحدات (كفو). علي الفور المضي قدما في اجراء العدوى لمنع انحلال الذاتي البكتيرية.
3. زراعه الخلايا البطانية من HUVEC تحت شروط ميكروفلويدريك
- افصل الخلايا البطانية الاساسيه من قارورة ثقافة الخلية بواسطة التحلل البروتيني المتحكم به. قم بتنفيذ الخطوات التالية في بيئة معقمه باستخدام مقعد نظيف. اعداد حجم 15 مل من التعقيم التلفزيوني لخطوات الغسيل.
- أزاله ECGM من طبقه HUVEC سوبكونفلوينتلي نمت وغسل طبقه الخلية مع 10 مل تلفزيوني باستخدام ماصه المصلية للتخلص من الخلية ثقافة المتوسطة.
- احتضان HUVEC غسلها مع 3 مل من 37 درجه مئوية محلول التفكك الخلية المسخن لمفرزه الخلية لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية. مراقبه انفصال الخلايا البروتينية عن طريق الرصد المجهري في كل دقيقه.
- ماصه التعليق خليه منفصلة في أنبوب يحتوي علي 7 مل من ECGM تستكمل مع 2 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) لوقف التحلل البروتيني والرواسب الخلايا لمده 3 دقائق في 220 x g في RT.
- أزاله ماده طافي وأعاده تعليق huvec في 250 μl من ecgm تستكمل مع 5 ٪ FCS و 1 ملم mgso4. استخدام 10 μL من تعليق الخلية لعد الخلايا باستخدام خليه نويباور غرفه العد وضبط عدد الخلايا إلى 4 × 106 خلايا/مل ecgm تستكمل مع 5 ٪ FCS و 1 ملم mgso4.
ملاحظه: لكل تجربه تدفق 30 مل من متوسط ECGM تستكمل مع 5 ٪ FCS ومع 1 ملم MgSO4 سيكون مطلوبا. من هنا علي هذا التكوين المتوسط يسمي ECGMS المتوسطة. زيادة تركيز FCS في الوسط الثقافي من 2 ٪ إلى 5 ٪ يدعم مرفق الخلية وبقاء الخلية من HUVEC المصنفة في شريحة القناة. المتوسطة ملاحق FCS و MgSO4 استقرار إلى حد كبير المرفق الخلية من HUVEC تحت ظروف الإجهاد القص.
- البذور وزراعه HUVEC في شريحة قناه. العمل في بيئة معقمه باستخدام مقعد نظيف. وسوف تزرع الخلايا تحت ضغط القص لمده 2 أيام تليها العدوى مع البكتيريا والرصد المجهري لمده 2 ساعة أخرى.
- تتوازن شريحة قناه ، مجموعه ترويه 1.6 mm في القطر و 50 سم في الطول ، وهو قسامه من المتوسطة ecgms ، وشريحة قناه luer 0.4 μm في الارتفاع ، ل 24 ح في حاضنه مع 5 ٪ CO2 الغلاف الجوي في 37 درجه مئوية للحد من عدد من فقاعات الهواء.
ملاحظه: ينصح بهذا الاجراء لأزاله الغاز من المعدات البلاستيكية وتسخين الوسط والأنابيب المنصهرة والخزانات. إذا تم تخزين المواد أو السوائل في RT أو في الثلاجة ، سيتم الإفراج عن الغازات المذابة في البلاستيك والسوائل عندما يسخن في الحاضنة اثناء التجربة. ثم ستظهر فقاعات الغاز. التخلص من جميع المكونات البلاستيكية قبل التجربة سيزيل هذا التاثير. في كل مره يتم فيها إخراج النظام من الحاضنة ، تبدا عمليه امتصاص الغاز مره أخرى. ولذلك ، والعمل بسرعة في RT وأبدا ترك وحده فلويديك خارج الحاضنة لفترات زمنيه أطول. - استخدم ماصه لحقن 100 μL من محلول الجيلاتين العقيم المصفي بنسبه 2% في محلول البث التلفزيوني في أحد خزانات شريحة القناة المعايرتهاه بدرجه الحرارة. احتضان الحل الجيلاتين ل 1 ح في 37 درجه مئوية وشطف قناه الشريحة مع 1 مل تلفزيوني تحت ظروف معقمه باستخدام حقنه Luer 1 مل.
- ضع شريحة القناة المغلفة بالجيلاتين علي طبقه البوليسترين الرقيقة أو لوحه الستايروفوم لمنع حدوث انخفاض في درجه حرارة الشريحة. أضافه 100 μL من 4 × 106/مل تعليق HUVEC مع حقنه luer 1 مل في الشريحة.
ملاحظه: وضع شريحة القناة علي سطح المعدن البارد من مقاعد البدلاء نظيفه يمكن ان تقلل من درجه حرارة أسفل الشريحة ، التالي توليد الإجهاد البارد إلى الخلايا البطانية. اثناء وضع الأنابيب الخلية عقد الشريحة قليلا صعودا للسماح فقاعات الهواء ترتفع وتختفي من داخل الشريحة. - احتضان الشريحة قناه مع HUVEC ل 60 دقيقه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 وتملا الخزانات المتوسطة في كلا طرفي الشريحة القناة مع 60 ΜL ecgms-متوسطه لكل منهما. احتضان ل 1 ح في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
- تتوازن شريحة قناه ، مجموعه ترويه 1.6 mm في القطر و 50 سم في الطول ، وهو قسامه من المتوسطة ecgms ، وشريحة قناه luer 0.4 μm في الارتفاع ، ل 24 ح في حاضنه مع 5 ٪ CO2 الغلاف الجوي في 37 درجه مئوية للحد من عدد من فقاعات الهواء.
- ضبط مضخة ميكروفلويديك وإعدادات البرنامج.
- توصيل مجموعه معايرتها ترويه إلى وحده مضخة ، وملء مع 13.6 mL من ecgms-المتوسطة ، وبدء تشغيل البرنامج مضخة التحكم. حدد مجموعه ترويه كافيه ونوع من الشريحة الغرفة باستخدام التمرير لأسفل النوافذ في القائمة من وحده فلويديك اعداد. اختر 0.007 (داين ∙ s/cm2) في البرنامج للزوجة المتوسطة. (راجع إعدادات برامج ضخ الضغط التي تم وضع علامة عليها بالأسهم الحمراء في الشكل التكميلي 1).
- خارج الحاضنة ، قم بتوصيل زجاجه مملوءة بحبات السيليكا المجففة إلى أنابيب ضغط الهواء (راجع الشكل 1، أقحم 3). الهواء من مضخة الضغط يدور بين الخزانات ترويه والمضخة ويجب ان تكون جافه قبل أعاده إدخال جهاز المضخة. حدد تدفق المعلمات في القائمة البرمجيات ، وتعيين الضغط علي 40 mbar ، ومسح أنابيب مضخة مع المتوسطة السائلة من خلال بدء تدفق متوسطه مستمرة. (ويشار إلى هذه الإعدادات أيضا بواسطة الأسهم الحمراء في الشكل التكميلي 1).
- برنامج دورات الإجهاد القص المطلوبة للزراعة تدفق. تبدا مع 5 داين/سم2، والسيطرة بومبينج الخزان متوازنة وأؤكد انه لا يتم تعميم فقاعات الهواء في نظام المضخة.
ملاحظه: يعتمد الضغط القص الجدار في شريحة قناه علي معدل التدفق واللزوجة من الوسط ترويه. إذا كنت تستخدم نظام ضخ آخر ، يرجى الرجوع إلى المعادلات الموصوفة في مقدمه لتعيين معدل تدفق توليد مستوي الإجهاد القص المطلوب. تتوافق الإعدادات الموصوفة مع معدل تدفق 5.42 مل/دقيقه. (تظهر لقطه شاشه مثاليه تظهر إعدادات معلمه التدفق الكافية في برنامج ضخ الضغط في الشكل التكميلي 2). - وقف تدفق الدورة الدموية في البرنامج التحكم مضخة وعقد تدفق المتوسطة في أنابيب ترويه عن طريق لقط الأنابيب بالقرب من اتصالات luer. توصيل شريحة القناة ، التالي تجنب فقاعات الهواء ، ووضع وحده فلويديك مع شريحة قناه متصلة في حاضنه co2 في 37 درجه مئوية و 5 ٪ co2. بدء الإجهاد القص في 5 داين/سم2 لمده 30 دقيقه للتكيف بسلاسة الخلايا إلى القوات المتولدة عن الإجهاد القص قبل تسريع مستوي الإجهاد القص (انظر الشكل التكميلي 3).
ملاحظه: الحرص علي ان لا تبقي فقاعات الهواء في نظام أنبوب أو في الشريحة بعد connectinng إلى نظام أنبوب لان حركه فقاعات الهواء في تدفق قد يؤدي إلى مفرزه الخلية. - تسريع الضغط القص إلى 10 داين/سم2 (التي تتوافق مع 10.86 mL/min في هذا الاعداد تدفق) واحتضان شريحة القناة في الإجهاد القص المستمر ل 48 h في حاضنه صغيره co2 في 37 درجه مئوية و 5 ٪ co2 للسماح التمايز الخلية ( ويشار إلى البرنامج المعني بالأسهم الحمراء في الشكل التكميلي 4).
ملاحظه: خلايا HUVEC تميل إلى فصل من سطح القناة إذا بدات زراعه تدفق مباشره في 10 داين/سم2. تبقي الخلايا تعلق علي سطح الغرفة إذا بدات زراعه التدفق مع اقل القص الإجهاد باستخدام 5 داين/سم2 لمده لا تقل عن 30 دقيقه تليها زيادة الإجهاد القص ببطء حتى المطلوب 10 داين/سم2. الضغط القص من 10 داين/سم2 هو الحد الأدنى للقيمة في هذا الاعداد ترويه المطلوبة لتشكيل سلسله vwf. - بعد 24 ساعة من زراعه الخلايا المجهرية ، توقف التدفق المتوسط مع برنامج التحكم في المضخة بالبالضبط عندما يتم الوصول إلى مستوي متوسط متوازن في كل من الخزانات المتوسطة. ضع وحده فلويديك في مقعد نظيفه وأزاله 10 مل من المتوسطة زراعه الموزعة من الخزانات ترويه باستخدام ماصه المصلية 10 مل. أضافه 10 مل من ecgms-متوسطه في الخزانات لتجديد المتوسطة ، ووضع وحده فلويديك مره أخرى في الحاضنة2 co في 37 درجه مئوية و 5 ٪ co2، وأعاده تشغيل زراعه فلويدريك باستخدام مضخة التحكم البرمجيات.
ملاحظه: وظيفة مضخة الضغط يمكن ان تتعطل فجاه من قبل آلات المختبرات مثل أجهزه الطرد المركزي الكبيرة ، والتي قد تخلق اضطرابات المجال المغناطيسي قويه. قد يؤدي هذا الاضطراب المفاجئ إلى انفصال الخلايا. انتبه ان هذه آلات ليست نشطه بالقرب من مضخة الضغط اثناء التجربة. - بدء الاحترار من غرفه الحضانة درجه الحرارة التي تغطي مرحله المجهر مضان إلى 37 درجه مئوية لدرجه الحرارة تاخيرمن 24 ساعة قبل التصور المجهري. بعد ان يتم تسخين المجهر ، بدء التحكم في البرامج المجهر وضبط الإعدادات الرئيسية للرصد المجهرية مضان عن طريق تحديد إعدادات مرشح المناسبة (540 nm/590 نانومتر للكشف عن البكتيريا والتعبير عن عروض العروض 470 nm/515 نانومتر للكشف عن الانبعاثات الفلوريسئينه من الأجسام المضادة الخاصة المترافقة مع FITC). يسخن غرفه تسخين اضافيه لاحتضان وحده فلويدريك عند 37 درجه مئوية.
ملاحظه: خلال تحليلات العدوى والرصد المجهري درجه حرارة الشريحة القناة والمتوسطة المتداولة لا ينبغي ان تنخفض إلى حد كبير ، لان هذا من شانه ان يولد الإجهاد البارد علي الخلايا. بشكل عام ، وحجم غرف درجه الحرارة التي تغطي مرحله المجهر ليست كافيه لتغطيه وحده فلويديك كله. ولذلك ، ينصح باستخدام غرفه تسخين اضافيه إلى 37 درجه مئوية. - بالنسبة للتصور المجهري ، ضع وحده فلويدريك في 37 درجه مئوية التسخين المسبق للغرفة ووضع شريحة القناة علي مرحله من 37 درجه مئوية المجهر الذي تم تسخينه مسبقا.
ملاحظه: بالنسبة للتصورات المجهرية ، تحتاج وحده فلويدريك وشريحة القناة إلى ازالتها من حاضنه CO2 بسبب الطول المحدود لأنابيب التروية. إذا العدوى مرات ورصد المجهرية أطول من 180 دقيقه مطلوبه خارج 5% CO2 جو للتخزين المؤقت لدرجه الحموضة ، وينبغي استخدام متوسط الحموضة المخزنة للزراعة ميكروفلويديك. - السيطرة علي الشكل الخلية وسلامه طبقه HUVEC قبل حقن الهستامين والبكتيريا إلى تدفق الدورة الدموية طوال الوقت من التجربة تدفق وبعد الانتهاء من تجربه تدفق باستخدام وضع حقل مشرق من المجهر.
4. التعريفي من VWF-الإفراج والتصور من سلاسل VWF Multimerized
- الحفاظ علي تدفق الاعداد ، وذلك لان الضغط القص من 10 داين/سم2 مطلوب لتحريك multimerization من vwf لسلاسل طويلة تصل إلى 200 MDa. حمل الإفراج عن vwf من البطانية wpb عن طريق حقن 136 μl من 100 mM الحل الأسهم الهيستامين في ecgms-متوسطه تعميمها في أنابيب ترويه باستخدام منفذ الحقن. سيكون التركيز النهائي من الهستامين في المتوسطة تدفق 1 مم. إذا لم يتوفر منفذ حقن ، يمكن أضافه الهستامين بدلا من ذلك عن طريق الأنابيب في وسط خزانات المضخة.
- للكشف عن المناعي لسلاسل VWF multimerized ، ووقف تدفق عندما يتم التوصل إلى مستوي متوسط متوازن في الخزانات ، وحقن 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة الخاصة FITC-مترافق في حجم 200 μL تلفزيوني (pH 7.4) في تعميم 13.6 مل من ECGMS-متوسطه باستخدام منفذ حقن. إذا لم يتوفر منفذ حقن ، يمكن أضافه الجسم المضاد بدلا من ذلك عن طريق النفخ في وسط خزانات المضخة. وهذا يؤدي إلى تركيز الأجسام المضادة النهائية من 1.3 ميكروغرام/مل.
- للمسح المجهري لعده مجالات من الرؤية في وقت قصير ، استخدم وحده مضان من المجهر مع جهاز الفلورية زينون في السلطة 30 ٪ وكاميرا العدسة. راقب شكل وتشكل طبقه HUVEC مع وضع الحقل الساطع لتحديد الخلايا التمثيلية المناسبة لمرئيات السلاسل VWF.
- لتصور الأخضر الفلورسنت سلاسل VWF ، حدد الهدف النفط 63x/1.40 وتصفيه الكشف عن 470 nm في القائمة الوحدة الفلورية من البرنامج المجهر (LasX). إنشاء لقطات من المكدسات Z علي الأقل 50 عرض الحقل التمثيلي ، تحتوي كل منها علي ما يقرب من 10 HUVEC سليمه شكليا. للقياس الكمي لسلاسل VWF الفلورية الخضراء في نقاط زمنيه مختلفه ، امسح عده حقول من العرض.
5. التقييم المجهري للمرفق البكتيري لسلاسل VWF في التدفق في الوقت الحقيقي
-
قياس مرفق المكورات الرئوية إلى سلاسل VWF التي تم إنشاؤها علي أسطح الخلايا HUVEC عن طريق الكشف عن المناعي.
- عقد تدفق وحقن 1.35 x 108 كفو/ml عروض العروض-التعبير عن المكورات الرئوية في حجم الحد الأقصى من 1 مل في ecgms-متوسطه باستخدام منفذ الحقن. بدلا من ذلك ، ماصه البكتيريا في الوسط في خزان المضخة. أعاده تشغيل الضغط القص في 10 داين/سم2 للسماح للبكتيريا تعميم داخل نظام المضخة.
- حدد الهدف الغمر النفط 63x للتكبير المجهر وضبط إعدادات فلتر مضان في برنامج المجهر لعروض القناات (540 nm الكشف فلتر) للكشف عن المكورات الرئوية التعبير عن عروض العطاءات.
- لتحديد الكمية من المرفقات البكتيرية لسلاسل VWF ، ووقف تدفق وإنشاء لقطات من Z-أكوام من ما لا يقل عن 30 وجات النظر الميدانية التمثيلية ، كل منها يحتوي علي ما يقرب من 10 السليمة شكليا HUVEC ، وحساب كميه المكورات الرئوية.
- استخدم خوارزميه الإحصائيات الاحاديه ANOVA لتقييم البيانات ، متبوعه باختبار عينه غير مزدوجة غير مقترنة لآخرين للمقارنة الاحصائيه المفصلة. واعتبرت قيم P البالغة < 0.05 ذات دلاله احصائيه.
6. التقييم المجهري للمرفقات البكتيرية لسلاسل VWF بعد تثبيت العينة
- عينه التثبيت قبل تلطيخ المناعي.
- وقف تدفق ، وأزاله 10 مل من ECGMS-متوسطه من خزانات المضخة ، وأضافه 10 مل من تلفزيوني تستكمل مع بارافورمالدهيد 5 ٪ (PFA). السماح للحل PFA تعميم لمده 10 دقيقه في الإجهاد القص من 10 داين/سم2.
- افصل شريحة القناة من وحده المضخة.
- قم بحظر مواقع الربط غير المحددة علي سطح الخلية ونفذ التطعيم المناعي لسلاسل VWF والبكتيريا المرفقة.
- اعداد 4 مل من محلول الغسيل التي تحتوي علي 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) تستكمل مع 4 ٪ السكروز لجميع خطوات الغسيل. اعداد 1 مل من حل منع التي تحتوي علي 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) تستكمل مع 4 ٪ السكروز و 2 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسنيين) لعرقله مواقع ملزمه غير محدده.
- اغسل الشريحة القناة المحتضنة 3x باستخدام حقنه Luer 1 مل لحقن 200 μL من محلول الغسيل واحتضان الشريحة لمده 120 دقيقه في RT مع 200 μL حجب الحل.
- اعداد 4 مل من آخر حل الحجب التي تحتوي علي 100 mM Na2CO3، (pH 9.2) تستكمل مع 4 ٪ السكروز و 0.5 ٪ بوسنيا لتخفيف الأجسام المضادة. استخدام 200 μL من هذا الحل حجب لتخفيف المكورات الرئوية الخاصة الأرنب انتيسيس# يروم 1:100. استخدام 200 μL من هذا الحل منع لتمييع الأجسام المضادة الماوس الخاصة VWF 1:50 لجعل تركيز الأجسام المضادة المحددة VWF من 4 ميكروغرام/مل. تمييع الأجسام المضادة AlexaFluor488-مترافق الثانوية من 2 mg/mL الأسهم الحل 1:100 في 200 μL من تلفزيوني (pH 7.4) لتوليد تركيز نهائي من 20 ميكروغرام/مل.
ملاحظه: في الإعدادات المناعية الموصوفة ، حقق اكتشاف الأجسام المضادة نتائج مثلي عندما تم تخفيف الأجسام المضادة في المخزن المؤقت للكربونات القلوية المذكورة أعلاه. استنادا إلى النتائج السابقة ، والحلول الموصي بها حجب وكميه الأجسام المضادة هي مناسبه للعديد من التطبيقات. ومع ذلك ، قد تتطلب التجارب المختلفة التحسين الفردي لتركيبه الأجسام المضادة ، وتركيز الأجسام المضادة ، ووقت الحضانة ، ودستور الحاجز المانع. وكبديل لذلك ، قد يكون النظام المخزن بالفوسفات مع نطاق الحموضة المحايد مناسبا أو حتى مفضلا كمخزن مؤقت للحضانة. في حاله الإشارات الفلورية الضعيفة ، ينبغي زيادة تركيز الأجسام المضادة الثانوية. إذا تم الكشف عن الكثير من الضوضاء غير محدده مضان الخلفية ، يجب زيادة كميه المواد المانعة. - لتلطيخ VWF-المناعي ، وغسل الشريحة قناه باستخدام 1 مل حقنه Luer عن طريق حقن 200 μL من الحل الغسيل 3x واحتضان الشريحة مع الأجسام المضادة المخففة 1:50 المحددة VWF لمده 30 دقيقه في RT. بعد ذلك ، اغسل الشريحة القناة مره أخرى 3x مع 200 μL من محلول الغسيل واحتضان الشريحة مع 1:100 المخفف الجسم المضادة للماوس AlexaFluor488-مترافق الخاصة لمده 30 دقيقه في RT. وأخيرا ، اغسل الشريحة القناة مره أخرى 3x مع 200 μL من محلول الغسيل.
ملاحظه: اليكسافلور-فلوبوهورس حساسة لتبيض. ولذلك ، يجب حماية الشريحة بالاحتفاظ بها في غرفه مظلمة اثناء خطوات الحضانة مع الأجسام المضادة المترافقة مع الفلوكوفيري. - لتطعيم المكورات الرئوية ، احتضان الشريحة مع 1:100 الجسم الهوائية المخففة الرئوية الخاصة الأرانب لمده 30 دقيقه في RT. بعد ذلك ، وغسل الشريحة قناه 3x مع 200 μL من محلول الغسيل واحتضان الشريحة مع 1:100 المخفف AlexaFluor568-الأجسام المضادة الخاصة بالأرانب لمده 30 دقيقه في RT. اغسل الشريحة القناة مره أخرى 3x مع 200 μL من محلول الغسيل.
- لوصمه الخلايا الخلوية مع فلوفيسين الفلورسنت ، يتخلل HUVEC بالحضانة مع 120 μL من 0.1 ٪ تريتون X-100 لمده 5 دقائق في RT. اغسل الشريحة القناة 3x مع 200 μL من محلول الغسيل واحتضان الشريحة مع 120 μL من 1:1000 المخفف AlexaFluor350-المترافقة phسبائك. وهذه الخطوة حضانة تصور بلمره الاكتين خلوي والسماح برصد شكل الخلية والتغييرات المورفولوجية الناجمة عن الإجهاد المحتملة.
- اغسل شريحة القناة 3x مع 200 μL من محلول الغسيل. وأخيرا ، اغسل الشريحة 4x مع 200 μl ddh2O وتصور السلاسل الفلورية الخضراء vwf ، والبكتيريا الفلورية الحمراء ، والأزرق الفلورسنت الاكتين خلوي باستخدام إعدادات التصفية المناسبة علي المجهر مضان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الزراعة الاوليه huvec في تدفق أحادي الاتجاه الثابت يؤدي في تشكيل متموج ومعباه باحكام طبقه الخلية التي تروج لتوليد الشبكات الخلوية مليئه vwf الميكانيكية13،14. يصف هذا البروتوكول استخدام مضخة ضغط الهواء ، ونظام أعاده تدوير نبض لتحليل العدوى التي تتطلب محاكاة الوضع الإجهاد القص في تدفق الدم البشري.
ويتيح هذا النظام اعدادا محددا ومتحكما بالبرامج لظروف التدفق. ويوضح مخطط التدفق في الشكل 1 سير العمل الرئيسي ، بدءا ببريكولتيفيشن الخلايا البطانية الاوليه (الشكل 1، الملحق 1) وبريكولتيفيشن المكورات الرئوية (الشكل 1، الملحق 2). ويتالف النظام الميكروفلويدريك التطبيقي ( الشكل 1، الملحق 3) من شريحة قناه خاصه متصلة عبر محول luer لأنابيب الانصهار مع خزانين متوسطين. يتم وضع مجموعه أنابيب ترويه علي وحده فلويديك التي تعمل كموقف وتوظف أنابيب ترويه كنظام صمام. لزراعه التدفق ، يتم وضع وحده فلويديك مع مجموعه ترويه المتوسطة المملوءة وشريحة القناة المتصلة في حاضنه CO2 (الشكل 1، أقحم 3). يتم توصيل وحده فلويديك إلى مضخة ضغط الهواء عن طريق أنابيب الهواء. يجب ان يمر الهواء في الأنابيب من خلال زجاجه التجفيف التي تحتوي علي حبات السيليكا لأزاله الرطوبة من الخزانات ترويه قبل ان يتم repumped الهواء في نظام المضخة (الشكل 1، أقحم 3). يتم التحكم في مضخة ضغط الهواء بواسطة برامج الكمبيوتر (بومبكونترول v 1.5.0) التي تمكن من اعداد معدل تدفق مستمر ومحدد اعتمادا علي قطر شريحة القناة ، وطول وقطر مجموعه أنابيب ترويه ، ولزوجه المتوسطة المستخدمة (الشكل 1، أقحم 3). إفراز vwf من قبل الزيادة المفرطة wpb من كونفلوينتلي نمت huvec هو المستحثة بواسطة الهيستامين-التحفيز8 تطبيقها في الدورة الدموية المتوسطة في أنابيب ترويه باستخدام منفذ حقن (الشكل 1، أقحم 4). في الحد الأدنى من الضغط القص من 10 داين/سم2، والبروتينات vwf المفرج عنهم multimerize وتشكيل سلاسل البروتين طويلة تصل إلى أطوال أكثر من 100 μm (الشكل 1، أقحم 4 ، 5 ، 6 والشكل 2a). يتم الكشف عن هذه السلاسل البروتينية ومجهرياها بعد حقن فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC)-الأجسام المضادة الخاصة المترافقة بالاتحاد في الوسط. الأجسام المضادة تعميم تمكين الكشف المناعي للخلايا الخلية السطحية المرتبطة VWF في الوقت الحقيقي (الشكل 1، أقحم 5)8.
نهج العدوى القائم علي الخلايا الخلوية القائمة علي ميكروفلويدريك باستخدام الخلايا البطانية الاوليه يحاكي حاله الاوعيه الدموية الملتهبة محليا عند تسلل الدورة الدموية بواسطة البكتيريا المرضية مثل العقديه الهوائية. وتظهر أمثله علي التصور والتحليل الكمي للتفاعل البكتيري مع الخلايا الوعائية المتمايزة تحت ضغط القص باستخدام الخلية البطانية المجهرية (الشكل 1، insets 5 ، 6). تم حقن المكورات الرئوية التعبير عن العطاءات في تدفق وبعد 30 دقيقه من الدورة الدموية ، تم الكشف عن العلامات الاولي من المرفقات البكتيرية لسلاسل VWF من الهستمين حفز HUVEC (الشكل 1، insets 5 ، 6 والشكل 2a، B السهام البيضاء)8. التالي ، فان استخدام المكورات الرئوية التعبير عن طلب العروض مكن من التحديد الكمي للمرفق البكتيري لسلاسل VWF علي الخلايا البطانية دون اشتراط الكشف عن الأجسام المضادة البكتيرية.
تم إنشاء مخططات تراكب الرسم البياني لكثافة الفلورية باستخدام برنامج التقييم الذي قدمته لأيكا (اي LasX) لتصور التنظير المعوي للتعبير عن المكورات الرئوية مع سلاسل VWF المكتشفة مع الأجسام المضادة الفلورية الخضراء. وقد مكن ذلك من اجراء تحليل كمي لاحتمال الاصابه بالقولون في مناطق معينه من الاهتمام (ROI) داخل الصورة الفلورية. باستخدام تراكبات الرسم البياني من الإشارات البكتيرية في تركيبه مع إشارات مضان من VWF ، ويمكن تصور القمم المتراكبه متداخلة لكلاهما التالي تاكيد المكورات الرئوية التعلق علي سلاسل VWF. المرفق البكتيري يقاوم الإجهاد القص المطبق باستمرار لمده لا تقل عن 25 دقيقه (الشكل 2B)8.
وباختصار ، فان التدفق المستمر للزراعة من HUVEC الابتدائي تمكين إفراز VWF وتوليد سلاسل البروتين VWF طويلة التي تعمل كمواقع التصاق لتعميم البكتيريا8.
الشكل 1: سير العمل لتحليل الملحقات البكتيرية لسلاسل VWF باستخدام زراعه الخلايا البطانية المجهرية. سير العمل من الخطوات التجريبية الرئيسية بدءا من بريكولتيفيشن الخلايا البطانية الاوليه لسوبكونفلوينسي في قوارير ثقافة الخلية. قبل زراعه الخلايا في التدفق ، يتم بذر الخلايا في شريحة قناه الجيلاتين المغلفة (أقحم 1). تزرع البكتيريا علي لوحات أجار تليها زراعه في المتوسطة السائلة المعقدة إلى منتصف سجل المرحلة (أقحم 2). النسبة لثقافة الخلايا الصغريه ، ترتبط شريحة القناة بالخلايا البطانية بالأنابيب المنصهرة للوحدة المميعة لنظام المضخة وتخضع للتدفق المستمر لتمايز الخلايا (أقحم 3). وقد تسببت في توليد السلاسل VWF (السهم الأخضر) بواسطة حقن الهستامين في الإجهاد القص من 10 داين/سم2 و مجهريا رصدها بواسطة الكشف المناعي باستخدام الأجسام المضادة المحددة fitc المسمية Vwf (أقحم 4). بعد حقن البكتيريا التعبير عن العروض لتعميم المتوسطة ، تم مجهريا تصور المرفق المكورات الرئوية (السهم الأحمر) إلى السلاسل VWF في الوقت الحقيقي عن طريق الانبعاثات مضان في 450 nm (أقحم 5). بعد تثبيت الخلايا باستخدام PFA ، تلطيخ المناعية التفاضلية يوفر التصور من المرفقات البكتيرية في نقاط محدده الوقت العدوى (أقحم 6). يتم تضمين الصور من نظام المضخة وطبقه الخلية HUVEC الموصوفة في الخطوات 1 و 3 وصوره منفذ الحقن (أقحم 4). وقد تم تعديل الصور المناعية المبينة في Insets 4 و 5 واستخدامها باذن من jagau et al.8. يتم الاشاره إلى أطوال أشرطه المقياس في أسفل اليمين.
الشكل 2: الصور المناعية التمثيلية لربط المكورات الرئوية بسلاسل VWF المتولدة في التدفق المستمر علي سطح HUVEC المحفز للهستمين. (ا) تم تحديد الكميات التي تم توليدها من سلاسل vwf مجهريا بعد تعريض كونفلوينتلي نمت HUVEC للضغط القص باستخدام نظام مضخة ميكروفلويدريك في 10 داين/سم2. الأجسام المضادة الخاصة ب VWF التي تمت الكشف عنها في FITC سلاسل VWF. الأسهم البيضاء تشير إلى عروض العروض-التعبير عن المكورات الرئوية مع فلوري احمر تعلق علي سلاسل VWF طويلة. (B) لوحظت الملحقات البكتيرية لسلاسل vwf الفلورية الخضراء مجهريا لمده تصل إلى 2 ساعة في التدفق المستمر (السهام البيضاء) وأكدت من قبل التقييم القائم علي البرمجيات من كثافة مضان من عائد الاستثمار المحدد. تم التقاط الصور في الوقت الحقيقي مع المعدات مضان من مجهر المسح بالليزر البؤري (SP8 ، لأيكا). قضبان المقياس = 10 μm. وقد تم تعديل هذا الرقم واستخدامه باذن من Jagau et al.8.
الشكل التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
محاكاة التفاعل البكتيري مع البروتينات المضيفة الميكانيكية مثل VWF يتطلب نظام ثقافة الخلية القابلة للاستخدام التي تمكن جيل من تدفق محدده ، أحاديه الاتجاه ، ومستمر من السوائل ، التالي توليد الإجهاد القص موثوق بها . وقد تم بالفعل وصف عده أنظمه ضخ ميكروفلويدريك. ويلخص استعراض شامل من Bergmann وآخرون الجوانب الرئيسية لمختلف النماذج ثقافة الخلية اثنين وثلاثي الابعاد17.
التكنولوجيا ميكروفلويديك هي تقنيه صغيره جدا بدات في 1990s في وقت مبكر مع تطوير البيئات الدقيقة القابلة للرقابة ، واستنساخها ، وقابله للاستخدام في ميكرومتر وحتى في مقياس نانومتر18. ويمكن أيضا تطبيق نهج ميكروفلويديك المقدمة لدراسة مجموعه واسعه من أليات التصاق البكتيريا والبروتينات المشاركة. ومن الأفضل ان تكون مناسبه لأي تفاعل يتضمن مكونات التصاق ميكانيكيه مثل VWF ، والتي بشكل عام ليست ودوده باستخدام تقنيات الخلية القياسية الثقافة. علي سبيل المثال ، من المعروف ان التشكيل من عده بروتينات مصفوفة خارج الخلية يختلف تبعا لموقعها. في نظام الدم ، البروتينات السكرية مثل الفيبرونكتين تعمم في التشكيل الكروي ، في حين انه في مصفوفة خارج الخلية تظهر البروتينات علي انها متعددة التوصيل دي-و multimerized سقالة19،20. وعلاوة علي ذلك ، فان العديد من الموزعين للمعدات ميكروفلويديك توفر شرائح قناه موحده بريكواتد مع أنواع مختلفه من الكولاجين (علي سبيل المثال ، كولاجين تحت البطانية أو غيرها من البروتينات المستمدة من البلازما). هذه الشرائح قناه مناسبه للتصور والتحليلات الكمية من التصاق البكتيرية إلى بروتينات مصفوفة محدده خارج الخلية في حالات تدفق مختلفه.
يمكن تصنيف أنظمه ميكروفلويديك مختلفه استنادا إلى المواد المختلفة المستخدمة لإنتاج الجهاز الصغير. وفي هذا الصدد ، تختلف المنصات القائمة علي الزجاج/السيليكون عن المنصات المستندة إلى البوليمر والمستندة إلى الورق21. يتم إنتاج شرائح القناات التي تستند إلى البوليمر مع سطح مدعوم بشكل مطاطي (ESS) ، وتتطلب عموما طلاء سطحي لمرفق الخلية اثناء تجارب التدفق. كبديل للطلاء مع مكونات التصاق الداعمة مثل الكولاجين ، يتم تعديل سطح بعض الشرائح قناه المتاحة تجاريا جسديا ، والذي يخلق سطح هيدروفيله ولاصقه مناسبه لمعظم أنواع الخلايا. وعلاوة علي ذلك ، يتم إنشاء بعض الشرائح قناه باستخدام ركائز مثل بوليديميثيلسيلاوكسان (pdms) ، الذي هو الأكسجين نفاذيه وأيضا تمكن ثقافة خلايا الاوعيه الدموية علي السطح الداخلي للقنوات الدقيقة في أنظمه مضخة فلويديك22، 23-الآن
نظام ميكروفلويدريك التي تم استخدامها في هذه الدراسات بمثابه نظام فعال وموثوق بها التي تم تطبيقها لتحليل تفاعل المكورات العنقودية الذهبية مع ألياف vwf multimerized بعد ثقافة الخلايا البطانية البشرية في تدفق 24,25. وكان هذا النظام ميكروفلويديك مغلقه نظام ترويه الدائرية التي مكنت تحليل العدوى بواسطة البكتيريا المسببة للامراض تحت السلامة الاحيائيه 2 الظروف. وعلاوة علي ذلك ، كانت الشرائح قناه مناسبه للرصد المجهري اثناء تدفق وتتوفر مع الدقة المختلفة (علي سبيل المثال ، الجيلاتين ، بولي-L-ليسين ، أو الكولاجين الرابع) التي تضمن التصاق الخلية ودرجه عاليه من الاستنساخ التجريبية. يستخدم هذا البروتوكول نظام ميكروفلويدريك (انظر جدول المواد) لإنشاء نموذج العدوى القابلة للاستخدام لل s. الرئوية ، التالي محاكاة الوضع تدفق داخل نظام الاوعيه الدموية البشرية8.
ويمكن أيضا اجراء العملية العامة الموصوفة لمرفق الخلايا البكتيرية في هذا النظام ميكروفلويديك مع أنواع أخرى من أنظمه ضخ توليد تدفق محدده ومستمرة في بيئة معقمه. لأغراض ميكروفلويديك ، وتستخدم أساسا أربعه أنواع من نظم التحكم في التدفق: ط) مضخات التمعجيه ومضخات أعاده التدوير ، والتي تستخدم في هذا البروتوكول ، ii) مضخات حقنه ، iii) وحدات تحكم الضغط ، و iv) وحدات تحكم الضغط مع مصفوفات التبديل تدفق. كل نوع من نظام التحكم في التدفق لديه مزايا وعيوب اعتمادا علي تطبيق ميكروفلويديك محدده والقدرة علي تنفيذ التصور المجهري في الوقت الحقيقي. في معظم التطبيقات التي تتطلب التداول المستمر للعينات ، يتم دمج مضخات أعاده التدوير مع وحدات تحكم الضغط المستندة إلى البرامج لضمان حاله تدفق محدده. هذا هو أيضا الأمثل في نظام مضخة أظهرت هنا. يمكن تقسيم أنظمه المضخات القائمة علي المحاقن إلى مضخات المحاقن "الكلاسيكية" ، والتي تولد تذبذب التدفق ، و "نبض" مضخات الحقنه الميكروفلويدريك. هذه الانظمه القائمة علي مضخة المحاقن سهله الاستخدام عموما ، ولكن التحكم في التدفق في القناات المسدودة يشكل تحديا باستخدام مضخات المحاقن. وعلاوة علي ذلك ، قد تستغرق تغييرات التدفق داخل الرقاقة بعض الوقت ، ويلزم وجود مقياس تدفق لتحديد معدل التدفق. حتى مضخات حقنه نبض قد تولد نبضا دوريا علي معدل التدفق بسبب المحرك خطوه بخطوه من مضخة الحقنه. آخر اثنين من جهاز ضخ حقنه قادره علي توليد "لبث وسحب" القائم علي الحركة فلويدريك التي تطبق قوي القص المحددة علي أسطح الخلايا ومناسبه لتطبيقات الغسيل الجزئي حتى في طريقه الكمبيوتر المستقلة. ويجب الجمع بين هذا النظام والأنابيب المجهرية لتوصيل الغرف أو شرائح القناات لزراعه الخلايا تليها التحاليل المجهرية.
وحدات التحكم في الضغط المذكورة أعلاه هي أنظمه مراقبه التدفق التي تضغط علي الخزان الذي يحتوي علي العينة ، والتي يتم حقنها بسلاسة في غرفه ميكروفلويدريك أو علي رقاقه. يمكن لوحدات تحكم الضغط إنشاء تدفق نبض وأيضا توفير معدلات تدفق في تركيبه مع تدفق متر. مزيج من وحدات تحكم الضغط مع مصفوفات التبديل تدفق تمكين التبديل تدفق سريع مع عدم وجود تدفقات الظهر. نظام أعاده التدوير المقدمة هنا مكنت توليد قيم الإجهاد القص المبلغ عنها عاده لنظام الاوعيه الدموية البشرية26. في الجسم المجري الاوعيه الدموية الإجهاد القص وقد قدرت من معدلات القص الجدار كما المستمدة من غير اينفاسيفيلي سجلت ملامح السرعة ، ولزوجه الدم كله في الشرايين الكبيرة واللزوجة البلازما في الشرايين26. سجلت reneman و Hoeks لمحات السرعة في الشرايين الكبيرة باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية المصممة خصيصا وفي الشرايين عن طريق التقنيات البصرية باستخدام الفلورسنت سرعه تدفق القصبات26. ويبلغ متوسط الضغط القص من 11-13 داين/سم2 في الشريان السباتي ، بدلا من فقط 4-5 داين/سم2 في الشريان العضدي. وقد تم رصد قيم الذروة تصل إلى 25-70 داين/سم2 لشريان السباتي. قيم الإجهاد القص من الاورده الصغيرة والمتوسطة يتراوح بين 0.1 و 0.5 داين/سم2. في النظام ميكروفلويديك الموصوفة هنا ، قيمه الإجهاد القص المطبقة تعتمد علي قطر الأنابيب المحددة ترويه ، وارتفاع شريحة القناة ، واللزوجة من المتوسط فلويدريك المستخدمة. وكان الاعداد فلويدريك المحدد يتالف من شريحة مع 0.4 سم في الارتفاع (حجم 100 μl) في تركيبه مع مجموعه ترويه من 50 سم في الطول و 1.6 ملم في القطر وكانت اللزوجة المتوسطة 0.0072 [داين · ق]/سم2. هذا الاعداد مناسب لنطاق الإجهاد القص بين 3.5 و 31.2 داين/سم2 بمعدلات تدفق 3.8 − 33.9 mL/min. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن للتحكم في برنامج ضخ الضغط ان يطبق تدفقا متوسطا ينبض يمكن ان يحاكي تدفق الدم الشرياني النبضي.
الاستخدام الناجح والموثوق به والقابل للتكرار لهذه الطريقة المشتركة للعدوى الصغيرة يتطلب بعض الاحتياطات التي يجب ان توضع في الاعتبار. اثناء عمليه العدوى تحت ظروف ميكروفلوريك ، قد تتعرض طبقه الخلية للمركبات البكتيرية السامة للخلايا أو الخلوية مثل بنيوموليسين ، والتي تؤثر علي قابليه الخلية النواة وتضعف التصاق بالخلية علي سطح الشريحة. ولذلك ، فان الحفاظ علي التدفق المستمر مطلوب طوال الدورة الكاملة للتجربة ويجب مراقبه سلامه شكل الخلية في كثير من الأحيان. وعلاوة علي ذلك ، ينبغي ان توفر المتوسطة ثقافة تدفق جميع المواد الغذائية الاساسيه للخلايا البطانية لضمان المرفق السطحية الضيقة من الخلايا في جميع انحاء تجربه العدوى. ومع ذلك, تجدر الاشاره إلى ان المكملات الغذائية المتوسطة تحتوي علي المواد التي قد تتداخل أو تمنع التفاعل بين البكتيريا والبروتينات المضيفة محدده. في الدراسات من التفاعل المكورات الرئوية-VWF علي سبيل المثال ، يجب ان تستنفد الهيبارين من المتوسطة ثقافة الخلية ، لأنه يمنع ربط المكورات الرئوية إلى VWF8.
خطوه حاسمه أخرى في ثقافة تدفق الخلايا البطانية هو الحفاظ علي التصاق الخلايا الضيقة ، والذي يعتمد علي حيوية الخلية الشاملة وعلي مستوي التمايز. تم تحقيق التصاق الخلايا المقاومة لتدفق القص للخلايا البطانية الاوليه فقط عندما تم الاحتفاظ بالخلايا بدقه في سوبكونفلوينسي قبل التعرض للإجهاد القص. من ناحية أخرى ، فان إنتاج WPB يعتمد مباشره علي كونفلوينسي طبقه الخلايا البطانية تعزيز الخلايا الخلوية الضيقة الاتصالات13. وتغطي فائده ثقافة الخلايا الغشائية المجهرية للخلايا البطانية الاوليه انتشار الخلايا المستحث بقوة والذي يؤدي بسرعة إلى تشكيل طبقه خلايا متموجة تحت ظروف التدفق. وترتبط الخلايا باحكام ببعضها البعض ، وتوجه مجتمعه في اتجاه التدفق ، وتمثل النمط الظاهري المتمايزة للغاية التي مطلوبه لإنتاج WPB سيكريتوري. هذه wpb بمثابه حويصلات التخزين ل vwf ، والمنشطات توسع الاوعيه ، و السايتوكينات التي يتم اكسوسيتوسيد كما رشقات ناريه البروتين علي تحفيز الهستامين أو بنيوموليسينالنشاط 27 ،13. ولذلك ، فان جيل من طبقه لاصقه للغاية ، متموج خليه من الخلايا البطانية الاوليه المتمايزة في الممرات الانتشار المنخفض هو شرط مسبق لا غني عنه للإفراج فعال VWF وتشكيل سلاسل VWF علي سطح الخلية تحليلات البكتيريا-VWF-التفاعل في ظروف التدفق. التالي ، فانه تجدر الاشاره إلى ان التفريق بين الخلايا البطانية استغرق 48 h من زراعه التدفق في الحد الأدنى ، ويتطلب تدفق القص المستمر دون اي اختلافات في ضغط المضخة. اي اختلافات قد تؤدي إلى انفجار متوسط مفاجئ ، والتي من شانها ان مسح الخلايا من الشريحة. وعلاوة علي ذلك ، خلال التصور المجهري الشريحة ميكروفلويديك والخزانات المتوسطة لنظام المضخات اللازمة للحفاظ علي درجه حرارة 37 درجه مئوية لان هذا يمثل درجه الحرارة المثلي من الخلايا البشرية.
خطوط الخلايا البشرية الخلد هي مناسبه للعديد من التجارب العلمية ، وغالبا ما تستخدم في دراسات العدوى ثقافة الخلية. هذه الخطوط الخلوية تتشارك بعض المزايا التقنية العامة ، مثل متطلبات الثقافة المنخفضة أو المعتدلة والانتشار غير المحدود ، والتي تمكن من المرور عده مئات من المرات دون تغييرات كبيره في التشكيل أو لمحات مستقبلات. ومع ذلك ، فان هذه الخطوط الخلوية تمثل الاحاديه الفردية وتخضع لظروف النمو الاصطناعي ثنائي الابعاد. 28 ينتج المفقودة [فسولوجكل] مصدر نسيج بيئة في تغيرات جوهريه من وظيفية ومورفولوجية خليه نمط ظاهري مع كل ممر من الثقافة29. قبل التجارب التصاق البكتيرية الأخرى ، تم تحديد الملف الشخصي من نوع الخلية المكشوفة البروتينات علامة محدده ومستقبلات الخلايا البشرية الاساسيه الرئة البطانية في مختلف المقاطع ثقافة الخلية. كشف تحليل تدفق الخلوي التعبير انخفاضا قويا من البروتينات السطحية المحددة مثل جزيء التصاق الخلايا البطانية الصفائح الدموية 1 (PECAM1) في غضون ثماني جولات من المرور الخلية. وعلاوة علي ذلك ، فان التكامل المعرب عنه للمستقبلات تغير بشكل كبير في الممرات الخلوية العليا لصالح نمط مستقبلات الخلية غير المحددة ونمط مستقبلات التكامل الخاص بنوع الخلية المنخفضة (Bergmann et al. ، البيانات غير المنشورة). هذه النتائج هي ذات الصلة بشكل خاص لتحليلات التفاعلات الممرض والمضيف في دراسات البيولوجيا العدوى. وبهدف الحفاظ علي خصائص الخلية الظاهرية ومستوي عال من التمايز الوظيفي اثناء استزراع الخلايا المجهرية في وقت العدوى البكتيرية ، تم اختيار الخلايا البطانية الاوليه من مانحين متعددين في هذه الحالة واستخدمت فقط ما يصل إلى خمسه مقاطع في الحد الأقصى من أجل الحفاظ علي الخصائص الظاهرية محدده قدر الإمكان8.
التصور المشترك للبكتيريا وهياكل سطح الخلية المحددة اثناء التدفق يتطلب بروتوكول تلطيخ الأمثل. باستخدام تركيبات مختلفه من البروتينات الموسومة مباشره ، والبكتيريا التي تعبر عن البروتين ، والأجسام المضادة المترافقة مع الفلورية ، يمكن تكييف إجراءات تلطيخ المناعة علي وجه التحديد مع أهداف التصور. وتمكن هذه الإجراءات التصور المجهري المحدد والواضح وكذلك التمايز والتقدير الكمي للالتزام البكتيري والاستيعاب العملي3،13،30،31. الكشف المناعي القائم علي البكتيريا المستوعبة يتطلب خطوه تتخلل الخلية مثل الحضانة تريتون X-100 قصيرة ، والتي قد تؤدي إلى انفصال الخلايا. ولذلك ، ينبغي تصور الكشف عن عمليات الاستيعاب البكتيرية التي تحدث في ثقافة تدفق بعد احتضان التدفق باستخدام العينات المتقاطعة PFA. لتصور الوقت الحقيقي للبكتيريا في التدفق ، فان استخدام البكتيريا المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية يمكن من الكشف المجهري السريع والمستهدف. استخدمت في هذه الدراسة التجريبية سلالات المكورات الرئوية التي تم إنشاؤها باستخدام بنيه وراثيه فعاله صممها kjos و16,8 . للكشف عن سلاسل VWF في التدفق ، تم اختبار الأجسام المضادة الخاصة بالفلوريسئين المحددة والتي يمكن استخدامها في VWF. للحصول علي استجابه الاشاره المثلي في خلفيه غير محدده مصغره ، تم معايره تركيز الأجسام المضادة الكافية باستمرار لكل الأجسام المضادة التطبيقية.
للتصوير المجهري للخلايا الحية ، تتم أزاله وحده فلويدريك وشريحة القناة من حاضنه CO2 وتوضع في الغرفة التي تم تسخينها إلى 37 درجه مئوية عند المجهر. لا يمكن تعديل هذه الغرفة إلى 5 ٪ CO2. دون الغلاف الجوي كربونات-المخزنة ، ظلت المورفولوجية HUVEC واللياقة البكتيرية سليمه لمده تصل إلى 180 دقيقه ، وهو ما يكفي لتحليل الانضمام البكتيرية بوساطة VWF. إذا كانت هناك حاجه لفترات أطول من العدوى والرصد المجهري خارج حاضنه CO2 ، يجب استخدام وسيطه الخلية المخزنة مؤقتا من أجل التعويض عن نوبات الحموضة بسبب عدم كفاية تركيز co2 . وبدلا من ذلك ، يمكن وضع النظام بأكمله مره أخرى في حاضنه CO2 بين خطوات سلسله زمنيه من التصور المجهري.
بالاضافه إلى الكشف عن الفلورية في الوقت الحقيقي ، يمكن إيقاف العدوى البكتيرية لبطانة داخل شريحة القناة والحفاظ عليها عن طريق التبادل المتوسط مع بارافورمالدهيد (PFA) كماده تثبيت. بعد التثبيت في التدفق ، فان تلطيخ المناعي الأمثل والمتدرج لسطح الخلية داخل شريحة القناة يتيح توليد مرئيات اللقطات المجهرية القيمة ويوفر الكشف المركب متعدد الاستعمالات مركبات خلوية محدده تشارك في التفاعل بين البكتيريا والخلايا المضيفة. والفائدة العلمية لهذه الطريقة المجمعة هي ان شريحة القناات المعالجة بأسلوب PFA يمكن تخزينها واستخدامها لتلطيخ المناعة بعد التدفق لهياكل الفائدة. العلاج PFA ينشط البكتيريا التالي القبض علي التعبير عن عروض البروتين. لذلك ، تم إنشاء مصل مضاد للمكورات الرئوية في الأرنب للكشف عن المناعة البكتيرية وتم تنفيذ التصور باستخدام الأجسام المضادة الثانوية AlexaFluor568-مترافق الأرنب8. كما سبق ذكره ، فان استخدام تركيبات الأجسام المضادة المختلفة يتطلب التحسين الدقيق لكميات الأجسام المضادة وتركيب العازل المانع. والا فان إشارات الخلفية غير المحددة وتاثيرات الكشف المتقاطع قد تؤدي إلى نتائج تلطيخ اصطناعية. ويمكن بسهوله استخدام اجراء تلطيخ المناعي الأمثل للكشف عن العديد من الأهداف الخلوية المختلفة مثل الاكتين خلوي أو علامات التنظير الداخلي13,31.
ويمكن تكييف هذا الاجراء لخلق بيئة انسجه أكثر تعقيدا التي تحاكي فسيولوجيا من وجهه نظر النسيجية والفسيولوجية والوظيفية. ويمكن استخدام تحليلات العدوى المقدمة بكفاءة للاجابه علي العديد من الاسئله العلمية في نفس الوقت باستخدام خط توصيل لعده شرائح من القناات إلى مجموعه واحده. ومن شان هذه المجموعة الموسعة ان تسهل تحليل أنواع الخلايا المختلفة ، وكونفلوينسيس الخلايا ، ومختلف الطلاءات المنزلقة داخل نفس اعداد التدفق بالتوازي وتسمح باجراء مقارنه مباشره للعدوى البكتيرية لأنواع مختلفه من الخلايا. وعلاوة علي ذلك ، فان التسلسل في اتصال الخط والتحليلات المجمعة للعديد من شرائح القناات يوفر أيضا امكانيه اجراء تجارب السلاسل الزمنيه ، والتي يمكن تطبيقها لتنميط التعبير الجيني (علي سبيل المثال ، تحليل عامل الاصابه المرتبط بالوقت بالعدوى التعبير الجيني).
ويمكن أيضا ان تمتد تحليلات العدوى إلى حاله تدفق الصفع مستمرة تدوم عده أيام أو حتى أسابيع من أجل تحليل استجابه الخلوية في ظروف محاكاة مرحله العدوى المزمنة علي المدى الطويل. الاضافه إلى ثقافة نوع الخلية الواحدة المقدمة ، تم بالفعل الإبلاغ عن بعض الامثله علي ثقافة الخلايا المتغايرة في أجهزه استزراع الخلايا الخلوية المجهرية32،33. وهذا يسمح للدراسات الدوائية عاليه الانتاجيه ، وقد يؤدي في نهاية المطاف إلى استخدام نظم الخلايا ميكروفلويدريك الثقافة لأغراض التجدد وكذلك34.
وباختصار ، فان نظام ميكروفلويدريك بالاشتراك مع إجراءات تلطيخ المناعة خدم كنموذج قيمه لتحليل الميكانيكا بين البكتيريا والخلايا المضيفة في بيئة تحاكي الظروف داخل نظام الاوعيه الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل المشروع من قبل DFG (BE 4570/4-1) إلى نشره سورينام
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of >2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| Histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| Reaction tubes 1.5/2.0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| Reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| Serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
References
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
- Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
- Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
- Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
- Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
- Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
- Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
- Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).
- Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
- Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
- Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
- Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
- Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
- Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
- Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
- Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
- Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
- Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
- Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
- Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
- Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
- Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
- Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
- Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
- Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
- Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
- Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218 (1996).
- Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
- Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
- Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).
