Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Pneumococcus-infectie van primaire humane endotheliale cellen in constante stroming

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60323
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

Summary

Deze studie beschrijft de microscopische monitoring van pneumococcus hechting aan Von Willebrand factor snaren geproduceerd op het oppervlak van gedifferentieerde menselijke primaire endotheliale cellen onder shear stress in gedefinieerde stromingsomstandigheden. Dit protocol kan worden uitgebreid naar gedetailleerde visualisatie van specifieke celstructuren en kwantificering van bacteriën door differentiële immunokleurings procedures toe te passen.

Abstract

Interactie van Streptococcus pneumoniae met het oppervlak van endotheel cellen wordt gemedieerd in de bloedstroom via mechanosensitieve eiwitten zoals de Von Willebrand factor (vwf). Deze glycoproteïne verandert de moleculaire conformatie in reactie op shear stress, waardoor binding sites bloot voor een breed spectrum van gastheer-ligand interacties. In het algemeen is het kweken van primaire endotheel cellen onder een gedefinieerde schuif stroom bekend om de specifieke celdifferentiatie te bevorderen en de vorming van een stabiele en strak gekoppelde endotheellaag die lijkt op de Fysiologie van de binnenbekleding van een bloedvat . Zo vereist de functionele analyse van interacties tussen bacteriële pathogenen en de gastheer-vasculatuur met mechanogevoelige eiwitten de oprichting van pompsystemen die de fysiologische stroom krachten kunnen simuleren die bekend zijn om het oppervlak van vasculaire cellen.

Het microfluïdische apparaat dat in deze studie wordt gebruikt, maakt een continue en pulseloze recirculatie van vloeistoffen met een gedefinieerde stroomsnelheid mogelijk. Het computergestuurde luchtdruk pompsysteem past een gedefinieerde shear stress op endotheliale celoppervlakken toe door een continue, unidirectionele en gecontroleerde gemiddelde stroom te genereren. Morfologische veranderingen van de cellen en bacteriële gehechtheid kunnen microscopisch worden bewaakt en gekwantificeerd in de stroom door gebruik te maken van speciale kanaal dia's die zijn ontworpen voor microscopische visualisatie. In tegenstelling tot statische celkweek infectie, die in het algemeen een monster fixatie vereist voorafgaand aan immuun labeling en microscopische analyses, maken de microfluïdische dia's zowel de fluorescentie-gebaseerde detectie van eiwitten, bacteriën en cellulaire componenten mogelijk na monster fixatie; seriële immunofluorescentie kleuring; en directe fluorescentiedetectie in real-time. In combinatie met fluorescerende bacteriën en specifieke fluorescentie-gelabelde antilichamen, deze infectie procedure biedt een efficiënte meervoudige component visualisatie systeem voor een groot spectrum van wetenschappelijke toepassingen met betrekking tot vasculaire processen.

Introduction

De pathogenese van pneumococcus-infecties wordt gekenmerkt door een veelzijdige interactie met een diversiteit aan extracellulaire matrix verbindingen en componenten van de menselijke hemostase, zoals plasminogeen envwf1,2, 3,4,5,6,7,8. De multi Domain glycoproteïne VWF fungeert als een belangrijke regulator van een evenwichtige hemostase door middel van bemiddeling van trombocyten werving en fibrinincorporatie op de plaats van vasculaire trombus formatie9. Het belang van functionele, actieve VWF voor bloedings beheersing en wondgenezing wordt aangetoond door de ziekte van Von Willebrand, een veelvoorkomend erfelijke bloedingsstoornis10.

Bolvormige vwf circuleert in het humaan bloedsysteem bij een concentratie van maximaal 14,0 μg/ml11,10. Als reactie op vasculaire letsels is de lokale afgifte van vwf door endotheliale Weibel Palade Bodies (WBP) aanzienlijk toegenomen11,12. Eerdere studies tonen aan dat de hechting van pneumococcus aan humane endotheelcellen en de productie van de Pore vormende toxine pneumolysine de Luminale VWF secretie13aanzienlijk stimuleert. De hydrodynamische krachten van de bloedstroom induceren een structurele opening van de mechanoresponsive VWF domeinen. Bij stroomsnelheden van 10 dyn/cm2 de vwf multimerizes tot lange eiwit snaren tot enkele honderden micrometers in lengte die blijven gehecht aan het subendothelium10,12.

Om te begrijpen van de functie van multimerized VWF snaren gegenereerd onder shear stress in de interactie van pneumococcus met het endotheliale oppervlak, een microfluidic gebaseerde cel cultuur infectie aanpak werd vastgesteld. Een microfluïdisch apparaat met een software-gestuurde luchtdruk pompsysteem werd gebruikt. Hierdoor kon een continue, unidirectionele recirculatie van het celkweekmedium met een gedefinieerde stroomsnelheid worden ingeschakeld. Daardoor paste het systeem een gedefinieerde shear stress op het oppervlak van endotheliale cellen, die bleef bevestigd in gespecialiseerde kanaal dia's. Deze aanpak stelde de simulatie van de dwarskracht binnen de bloedstroom van het menselijke vasculaire systeem, waarbij VWF snaren worden gegenereerd op gedifferentieerde endotheliale cellen onder gedefinieerde constante stroom omstandigheden. Voor dit doel werden de endotheelcellen gekweekt in specifieke kanaal glaasjes (Zie tabel van materialen), die tijdens de stroming werden aangepast voor microscopische analyses. Het microfluïdische pompsysteem voorzag in de sterk gedefinieerde en gecontroleerde shear stresssituatie die nodig was voor de vorming van verlengde VWF snaren op de confluente endotheliale cellaag. Na de stimulatie van VWF-afscheiding van de door de mens geteelde humane navelstreng endotheliale cellen (HUVEC) door histamine suppletie, werd de snaar vorming geïnduceerd door het aanbrengen van een shear stress (ԏ) van 10 dyn/cm2. De shear stress wordt gedefinieerd als de kracht die op de cellaag optreedt. Het wordt ongeveer berekend volgens Cornish et. al.14 met vergelijking 1:
Equation 1

Waarbij ԏ = afschuif spanning in dyn/cm2, η = viscositeit in (DYN ∙ s)/cm2, h = helft van de kanaal hoogte, w = de helft van de kanaal breedte en Φ = debiet in ml/min.

Het resultaat van vergelijking 1 is afhankelijk van de verschillende hoogtes en breedten van de verschillende gebruikte dia's (Zie tabel met materialen). In deze studie werd een Luer-kanaal glijbaan van 0,4 μm gebruikt, resulterend in een kamer glijbaan factor van 131,6 (zie formule 2).
Equation 2

Viscositeit van het medium bij 37 °C is 0,0072 dyn ∙ s/cm ² en een shear stress van 10 dyn/cm ² werd gebruikt. Dit resulteerde in een debiet van 10,5 mL/min (Zie Formule 3).
Equation 3

Hier wordt de aanpassing en vooruitgang van een microfluïdische celculturing procedure met behulp van een unidirectioneel laminaire stroomsysteem voor het onderzoek en visualisatie van bacteriële infectiemechanismen in de gastheer-vasculatuur gedetailleerd beschreven. Het genereren van VWF-snaren op endotheliale lagen kan ook worden gestimuleerd door gebruik te maken van andere pompsystemen die in staat zijn om een continue en stabiele shear stress15toe te passen.

Na de teelt van primaire endotheelcellen tot samenvloeiing in stroming en stimulatie van VWF-snaar vorming, werden pneumokokken die rood fluorescentie-eiwit (RFP)16 uitdrukken, toegevoegd aan de endotheelcellaag onder constante microscopische controle. Het gehechtheid van bacteriën aan VWF-snaren op het oppervlak van endotheelcellen werd microscopisch gevisualiseerd en gedurende maximaal drie uur in real-time gemonitord door gebruik te maken van VWF-specifieke antilichamen met fluorescentie-label. Met deze aanpak werd de rol van VWF als adhesie cofactor voor het bevorderen van bacteriële gehechtheid aan het vasculaire endotheel bepaald8.

Naast de microscopische visualisatie van eiwit secretie en conformationele veranderingen, deze methode kan worden gebruikt voor het bewaken van enkele stappen van bacteriële infectie processen in real time en kwantificeren van de hoeveelheid bijgevoegde bacteriën op verschillende tijdstippen van Infectie. Het specifieke software-gestuurde pompsysteem biedt ook de mogelijkheid om de endotheelcellen in gedefinieerde constante stromingsomstandigheden gedurende maximaal enkele dagen te kweken en maakt een gedefinieerde gepulseerde-medium stroom incubatie mogelijk. Bovendien kan deze methode worden toegepast met behulp van verschillende celtypen. Het aanpassen van het kleurings protocol maakt ook de detectie en visualisatie van bacteriën geïnternationaliseerd in eukaryotische cellen mogelijk.

Dit manuscript beschrijft dit geavanceerde experimentele protocol, dat kan worden gebruikt als een gedefinieerde, betrouwbare en reproduceerbaar benadering voor een efficiënte en veelzijdige karakterisering van pathofysiologische processen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De microfluïdische celkweek werd uitgevoerd met commerciële primaire humane navelstreng endotheliale cellen (HUVEC). Het bedrijf isoleerde de cellen met geïnformeerde toestemming van de donor. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de kamer van de artsen van de federale staat Baden-Wuerttemberg met het referentienummer 219-04.

Opmerking: Zie tabel met materialen voor protocol benodigdheden.

1. preultivatie van primaire endotheel cellen

  1. Ontdooi een bevroren glycerol flacon met 1 x 105 primaire huvec van drie verschillende donoren zachtjes bij 37 °c en zaai de cellen in 7 ml voorverwarmde endotheliale celgroei medium (ecgm, klaar voor gebruik met supplementen) in een 25 cm2 celkolf.
    Opmerking: De primaire endotheliale cellen verliezen differentiatie capaciteit na meer dan 5 proliferatie cycli. Daarom kunnen alleen cellen met minder dan 5 passages worden gebruikt als een hoge graad van celdifferentiatie vereist is.
  2. Cultiveer de cellen bij 37 °C in 5% CO2 -atmosfeer voor 60 min om oppervlakte bevestiging toe te staan en het ecgm-celcultuurmedium uit te wisselen om resten van cryoconservering kwijt te raken.
  3. Ga door met het kweken van de cellen bij 37 °C in 5% CO2 -atmosfeer totdat ze een subconfluente cellaag vormen.
    Opmerking: De HUVEC mag niet uitgroeien tot een confluente laag, omdat de nauwe celcelcontacten de vorming van een stabiele cellaag later in de stroming verhinderen.

2. preultivatie van Streptococcus pneumoniae

Let op: Streptococcus pneumoniae is een bioveiligheid niveau 2 agent en mag alleen worden gekweekt in bioveiligheid niveau 2 laboratoria. Gebruik een schone bank die is geclassificeerd voor veiligheidsniveau 2 voor alle bacteriële behandelingen, Vermijd strikt aërosolvorming en gebruik een centrifuge met aerosol bescherming voor sedimentatie van bacteriën.

  1. Inoculeren een Columbia Blood agar Plate met een klinisch isolaat van Streptococcus pneumoniae ATCC11733 afgeleid van een glycerol kolf die constant bij-80 °c is opgeslagen en de agar-plaat 's nachts bij 37 °c en 5% Co2cultiveren.
  2. Bereid 40 mL Todd Hewitt Liquid Bouillon aangevuld met 1% gistextract (THY) en 15 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4, voor bacteriële teelt en wasstappen.
  3. Gebruik een steriele buis voor bacteriële teelt en inoculeren van de vloeibare kweek bouillon met bacteriële massa. Controle van de hoeveelheid inoculatie door fotometrische meting van 1 mL aliquots bij 600 nm tegen niet-geënt vloeibare Bouillon als referentie. Vul de bacterie massa in de vloeibare Bouillon tot deze een optische dichtheid bereikt bij 600 nm (OD600) van 0,15.
  4. Incureren de geënt vloeibare Bouillon zonder te schudden bij 37 °C en 5% CO2 en bepalen de OD600 elke 30 minuten door het meten van 1 ml aliquots met behulp van plastic cuvettes.
  5. Zodra de bacteriecultuur een OD600 van 0,4 heeft bereikt, wat overeenkomt met de exponentiële groeifase, centrifugeer de bacteriële kweek suspensie gedurende 10 minuten bij 1.000 x g bij kamertemperatuur (RT).
    Opmerking: Sta niet toe dat een pneumococcus-cultuur een OD-600 van meer dan 1,0 bereikt, omdat een hoge pneumococcus-cultuur dichtheid bekend is om bacteriële autolyse te veroorzaken, wat de algehele bacteriële geschiktheid kan beïnvloeden.
  6. Rebreng het bacteriële sediment voorzichtig met 10 mL PBS en sediment opnieuw gedurende 10 minuten bij 1.000 x g bij RT.
  7. Rebreng het gewassen bacteriële sediment voorzichtig in 1 mL PBS en bepaal de OD600 van 10 μL van de bacteriële suspensie met 1 ml PBS als referentie.
  8. Pas de hoeveelheid bacteriën in PBS aan op een OD600 van 2,0. Volgens vroeger bepaalde bacteriële telling, een OD600 van 2,0 komt overeen met 2 x 109 kolonie vormende eenheden (CFU). Onmiddellijk doorgaan met de infectie procedure om bacteriële autolyse te voorkomen.

3. endotheliale celkweek van HUVEC onder Microfluïdische condities

  1. Maak de primaire endotheel cellen los van de celkweek kolf door gecontroleerde proteolyse. Voer de volgende stappen uit in een steriele omgeving met een schone Bank. Bereid een volume van 15 mL steriele PBS voor de wasstappen.
    1. Verwijder de ECGM uit een subconfluently geteelde HUVEC-laag en was de cellaag met 10 mL PBS met behulp van een serologische pipet om van het celkweekmedium af te komen.
    2. Inbroed de gewassen HUVEC met 3 mL 37 °C voorverwarmde celdissociatie oplossing voor celloslating gedurende 5 min bij 37 °C. Observeer de Proteolytische celloslating door microscopisch toezicht per minuut.
    3. Pipetteer de losgekoppelde celsuspensie in een buisje met 7 mL ECGM aangevuld met 2% foetaal kalf serum (FCS) voor het stoppen van de proteolyse en sediment de cellen gedurende 3 minuten bij 220 x g bij RT.
    4. Verwijder de supernatant en rebreng de HUVEC in 250 μL ECGM aangevuld met 5% FCS en 1 mM MgSO4. Gebruik 10 μL celsuspensie voor het tellen van cellen met behulp van de celtelkamer van Neubauer en stel het aantal cellen in op 4 x 106 celwaarden/ml ecgm aangevuld met 5% FCS en 1 mm MgSO4.
      Opmerking: Voor elk flow experiment is 30 mL ECGM medium aangevuld met 5% FCS en met 1 mM MgSO4 vereist. Vanaf hier op deze medium samenstelling heet ECGMS-medium. De toename van de FCS-concentratie in het kweekmedium van 2% tot 5% ondersteunt de celhechting en de levensvatbaarheid van de cellen van HUVEC in de kanaal glijbaan. De medium supplementen FCS en MgSO4 stabiliseren de celgehechtheid van huvec onder afschuif spanning aanzienlijk.
  2. Zaai en cultiveer de HUVEC in een kanaal glijbaan. Werk in een steriele omgeving met een schone Bank. De cellen zullen worden gekweekt onder shear stress voor 2 dagen gevolgd door infectie met bacteriën en microscopische monitoring voor nog eens 2 h.
    1. Een kanaal glijbaan, een perfusie-set van 1,6 mm in diameter en 50 cm in lengte, een aliquot van het ECGMS-medium en een Luer-kanaal van 0,4 μm in hoogte, voor 24 uur in een incubator met 5% CO2 -atmosfeer bij 37 °c om het aantal luchtbellen te verminderen.
      Opmerking: Deze procedure wordt aanbevolen om de plastic apparatuur te degassen en om het medium, de perfusie buizen en de reservoirs vooraf te verwarmen. Als er materialen of vloeistoffen bij RT of in de koelkast zijn opgeslagen, worden de gassen die in de kunststof zijn opgelost en vloeistoffen tijdens het experiment opgewarmd in de incubator vrijgegeven. Er zullen dan gasbellen verschijnen. Het ontgassen van alle kunststof componenten vóór het experiment zal dit effect elimineren. Telkens wanneer het systeem uit de incubator wordt gehaald, begint het proces van gasabsorptie opnieuw. Werk daarom snel bij RT en laat de fluidic unit nooit langer buiten de incubator achter.
    2. Gebruik een pipet om 100 μL van een met 2% steriele gefilterde varkens gelatine oplossing in PBS-oplossing te injecteren in een van de reservoirs van een kanaal glijbaan met temperatuur evenwicht. Inbroed de gelatine-oplossing gedurende 1 uur bij 37 °C en spoel het kanaal van de glijbaan met 1 mL PBS onder steriele omstandigheden af met een 1 mL Luer spuit.
    3. Plaats de Gelatin-gecoate kanaal glijbaan op een dun polystyreen of piepschuim plaat om te voorkomen dat een druppel in de schuif temperatuur. Voeg 100 μL van de 4 x 106/ml huvec suspensie toe met een 1 ml Luer spuit in de glijbaan.
      Opmerking: Het plaatsen van de kanaal glijbaan op het koude metalen oppervlak van de schone Bank kan de temperatuur van de schuif bodem verminderen, waardoor koude stress ontstaat voor de endotheelcellen. Tijdens het pipetteren houdt u de dia een beetje omhoog om luchtbellen te laten stijgen en uit de dia te verdwijnen.
    4. Inbroed de kanaal glijbaan met de HUVEC voor 60 min bij 37 °C en 5% CO2 en vul de middelgrote reservoirs aan beide uiteinden van de kanaal glijbaan met 60 ΜL ecgms-medium per stuk. Incuberen gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
  3. Pas de microfluïdische pomp en de software-instellingen aan.
    1. Sluit de geëquilibreerd perfusie-set aan op de pompeenheid, vul met 13,6 ml ecgms-medium en start de pomp controle software. Selecteer de geschikte perfusie set en type kamer Slide met behulp van de scroll down Windows in het menu van de fluidic Unit ingesteld. Kies 0,007 (DYN ∙ s/cm2) in de software voor gemiddelde viscositeit. (Zie de druk pomp software-instellingen gemarkeerd met rode pijlen in aanvullende figuur 1).
    2. Sluit buiten de incubator een glazen fles aan die gevuld is met het drogen van silica kralen aan de luchtdruk slang (Zie Figuur 1, inset 3). De lucht van de druk pomp circuleert tussen de perfusie reservoirs en de pomp en moet droog zijn voordat het pomp apparaat opnieuw wordt ingevoerd. Selecteer stroom parameters in het menu software, stel de druk in op 40 mbar en spoel de pomp buizen met het vloeistof medium door de continue gemiddelde stroom te starten. (Deze instellingen worden ook aangeduid met rode pijlen in aanvullende figuur 1).
    3. Program meer de gewenste shear stress cycli van flow teelt. Begin met 5 dyn/cm2, controle gebalanceerde reservoir pumpinng en verzeker dat er geen luchtbellen circuleren in het pompsysteem.
      Opmerking: De wand afschuif spanning in een kanaal glijbaan is afhankelijk van de stromingssnelheid en de viscositeit van het perfusie medium. Als u een ander pompsysteem gebruikt, raadpleeg dan de in de inleiding beschreven vergelijkingen om een debiet in te stellen dat het gewenste shear stressniveau genereert. De beschreven instellingen komen overeen met een debiet van 5,42 mL/min. (een voorbeeldscherm opname met de adequate stromings parameterinstellingen in de druk pomp software wordt weergegeven in aanvullende figuur 2).
    4. Stop de stromings circulatie in de pomp besturingssoftware en houd de gemiddelde stroom in de perfusie slang vast door de buizen in de buurt van de Luer-aansluitingen te klemmen. Verbind de kanaal glijbaan, Vermijd luchtbellen en plaats de wervelende eenheid met de aangesloten kanaal glijbaan in een CO2 -incubator bij 37 °c en 5% Co2. Start de shear stress bij 5 dyn/cm2 gedurende 30 min om de cellen soepel aan te passen aan de krachten die door de shear stress worden gegenereerd voordat het afschuif stressniveau wordt versneld (Zie aanvullende figuur 3).
      Opmerking: Zorg dat er geen luchtbellen achterblijven in het buis systeem of in de glijbaan na connectinng naar het buis systeem omdat de beweging van luchtbellen in de stroom kan leiden tot celloslating.
    5. Versnel de shear stress tot 10 dyn/cm2 (die overeenkomen met 10,86 ml/min in deze stroominstelling) en incueren de kanaal Slide in continue shear stress voor 48 h in een kleine co2 -incubator bij 37 °C en 5% Co2 om celdifferentiatie mogelijk te maken ( de respectievelijke software settinngs zijn aangegeven met rode pijlen in aanvullende figuur 4).
      Opmerking: HUVEC-cellen hebben de neiging om te ontkoppelen van het kanaal oppervlak als de stroom teelt direct wordt gestart bij 10 dyn/cm2. De cellen blijven bevestigd aan het oppervlak van de kamer als de stroom teelt wordt gestart met minder shear stress met behulp van 5 dyn/cm2 voor een minimum van 30 min gevolgd door het verhogen van de shear stress langzaam tot de gewenste 10 dyn/cm2. Een shear stress van 10 dyn/cm2 is de minimale waarde in deze perfusie-instelling die vereist is voor vwf-snaar vorming.
    6. Na 24 h van microfluïdische celteelt, stop de gemiddelde stroom met de pomp besturingssoftware precies wanneer een uitgebalanceerd medium niveau wordt bereikt in beide middelgrote reservoirs. Plaats de wervelende eenheid in een schone Bank en verwijder 10 mL van het gecirculeerde kweekmedium van de perfusie reservoirs met een serologische Pipet van 10 mL. Voeg 10 mL ECGMS-medium toe aan de reservoirs om het medium te vernieuwen, plaats de wervelende eenheid weer in de CO2 -incubator bij 37 °c en 5% Co2, en herstart de fluïdische teelt met behulp van de pomp controle software.
      Opmerking: De functie van de druk pomp kan plotseling worden verstoord door laboratorium machines zoals grote centrifuges, wat een sterke magnetische veld verstoring kan veroorzaken. Deze plotselinge verstoring kan leiden tot celloslating. Zorg dat dergelijke machines niet actief zijn in de buurt van de druk pomp tijdens het experiment.
    7. Begin met het voorverwarmen van de temperatuur incubatie kamer die de fase van de fluorescentiemicroscoop bedekt tot 37 °C voor een Evenwichts temperatuur van 24 uur vóór de microscopische visualisatie. Nadat de Microscoop is voorverwarmd, start u de Microscoop software besturing en past u de belangrijkste instellingen voor de fluorescentie microscopische controle aan door de juiste filterinstellingen te selecteren (540 nm/590 nm voor detectie van de RFP-expressie van bacteriën en 470 nm/515 nm voor de detectie van de emissie van fluoresceïne van de FITC-geconjugeerde vwf-specifieke antilichamen). Verwarm een extra verwarmingskamer voor incubatie van de fluïdische eenheid bij 37 °C.
      Opmerking: Tijdens de infectie analyses en microscopisch toezicht moet de temperatuur van de kanaal glijbaan en het circulerende medium niet substantieel afnemen, omdat dit koude stress op de cellen zou genereren. In het algemeen is de grootte van de temperatuur kamers die betrekking hebben op de Microscoop fase niet genoeg om de hele fluidic eenheid te bedekken. Daarom wordt het gebruik van een extra verwarmingskamer voorverwarmd tot 37 °C aanbevolen.
    8. Plaats voor microscopische visualisatie de fluidic-eenheid in de voorverwarmde verwarmingskamer van 37 °C en plaats de kanaal glijbaan op een fase van de voorverwarmde Microscoop 37 °C.
      Opmerking: Voor microscopische visualisatie moesten de fluïdische eenheid en de kanaal glijbaan uit de CO2 -incubator worden verwijderd vanwege de beperkte lengte van de perfusie slang. Als infectie tijden en microscopische bewaking langer dan 180 minuten nodig zijn buiten de 5% CO2 -atmosfeer voor pH-buffering, moet een pH-gebufferd medium worden gebruikt voor de microfluïdische teelt.
    9. Bedien de celmorfologie en de integriteit van de HUVEC-laag voorafgaand aan de injectie van histamine en bacteriën aan de stroom circulatie gedurende de tijd van het flow-experiment en na het voltooien van het flow-experiment met behulp van de heldere veld modus van de Microscoop.

4. inductie van VWF-release en visualisatie van Multimerized VWF-snaren

  1. Onderhouden van de stroominstelling, omdat een shear stress van 10 dyn/cm2 is vereist voor het activeren van de multimerization van vwf tot lange tekenreeksen tot 200 MDA. Induceren van de afgifte van VWF van endotheliale WPB door het injecteren van 136 μL van een 100 mM histamine voorraadoplossing in het ECGMS-medium dat in de perfusie slang circuleert met behulp van een injectie poort. De uiteindelijke concentratie van histamine in het stroom medium is 1 mM. Als er geen injectie poort beschikbaar is, kan de histamine ook worden toegevoegd door Pipetteer in het medium van de pomp reservoirs.
  2. Voor immunofluorescentie detectie van multimerized VWF-snaren, stop de stroom wanneer een uitgebalanceerd medium niveau in de reservoirs wordt bereikt, en Injecteer 20 μg VWF-specifiek FITC-geconjugeerd antilichaam in een volume van 200 μL PBS (pH 7,4) in de circulerende 13,6 mL ECGMS-medium met behulp van een injectie poort. Als er geen injectie poort beschikbaar is, kan het antilichaam ook worden toegevoegd door Pipetteer in het medium van de pomp reservoirs. Dit resulteert in een uiteindelijke antilichaam concentratie van 1,3 μg/mL.
  3. Voor microscopisch scannen van verschillende kijk velden in korte tijd, gebruikt u de fluorescentie-eenheid van de microscoop met een Xenon fluorescentie-apparaat met een vermogen van 30% en een epifluorescentie camera. Bewaak de vorm en morfologie van de HUVEC-laag met de heldere veld modus om representatieve cellen te selecteren die geschikt zijn voor de visualisatie van VWF-strings.
  4. Voor visualisatie van groene fluorescerende VWF-snaren, selecteert u een 63x/1.40-olie doelstelling en een 470 nm-detectie filter in het fluorescentie-eenheids menu van de Microscoop software (LasX). Maak snapshots van Z-stacks van ten minste 50 representatieve veld weergaven, elk met ongeveer 10 morfologisch intacte HUVEC. Voor de kwantificering van de groene fluorescerende VWF-snaren op verschillende tijdstippen scant u verschillende kijk velden.

5. microscopische evaluatie van bacteriële gehechtheid aan VWF-strings in flow in real time

  1. Kwantificeer de pneumokokken bevestiging aan de VWF-snaren die op HUVEC-celoppervlakken worden gegenereerd via immunofluorescentie detectie.
    1. Houd de stroom vast en Injecteer 1,35 x 108 CFU/ml RFP-uitdrukken pneumokokken in een maximaal volume van 1 ml in het ecgms-medium met behulp van de injectie poort. U ook de bacteriën in het medium in het pompreservoir Pipetteer. Herstart de shear stress op 10 dyn/cm2 om de bacteriën in het pompsysteem te laten circuleren.
    2. Selecteer een 63x-olie-immersie doelstelling voor de vergroting van de Microscoop en pas de fluorescentie filterinstellingen in de Microscoop software aan op het RFP-kanaal (540 nm-detectie filter) voor detectie van pneumokokken met RFP-expressie.
    3. Voor het kwantificeren van bacteriële gehechtheid aan de VWF-snaren, stop de stroom en maak snapshots van Z-stacks van ten minste 30 representatieve veld weergaven, elk met ongeveer 10 morfologisch intacte HUVEC, en Tel de hoeveelheid pneumokokken.
    4. Gebruik het ANOVA One-factoriële statistiek algoritme om de gegevens te evalueren, gevolgd door een post hoc tweezijdige ongepaarde Sample test voor gedetailleerde statistische vergelijking. De P-waarden van < 0,05 werden statistisch significant geacht.

6. microscopische evaluatie van bacteriële gehechtheid aan VWF-snaren na monster fixatie

  1. Proef de fixatie voorafgaand aan immunofluorescentie kleuring.
    1. Stop de stroom, verwijder 10 mL ECGMS-medium uit de pomp reservoirs en voeg 10 mL PBS toe, aangevuld met 5% Paraformaldehyde (PFA). Laat de PFA-oplossing 10 minuten circuleren bij een shear stress van 10 dyn/cm2.
    2. Koppel de kanaal glijbaan los van de pompeenheid.
  2. Blokkeer niet-specifieke binding sites op het celoppervlak en voer immunodetectie van VWF-snaren en aangesloten bacteriën uit.
    1. Bereid 4 mL van een wasoplossing met 100 mM na2co3 (pH 9,2) aangevuld met 4% sucrose voor alle wasstappen. Bereid 1 mL van een blokkerende oplossing met 100 mM na2co3 (pH 9,2) aangevuld met 4% sucrose en 2% boviene serumalbumine (BSA) voor het blokkeren van niet-specifieke bindingsplaatsen.
    2. Was de PFA-incubated Channel Slide 3x met een 1 mL Luer spuit om 200 μL van de wasoplossing te injecteren en de glijbaan voor 120 min bij RT met 200 μL blokkerende oplossing te inbrotsen.
    3. Bereid 4 mL van een andere blokkerende oplossing met 100 mM na2co3, (pH 9,2) aangevuld met 4% SUCROSE en 0,5% BSA voor de verdunning van de antilichamen. Gebruik 200 μL van deze blokkerende oplossing om het pneumococcus-specifieke konijn antiserum 1:100 te verdunnen. Gebruik 200 μL van deze blokkerende oplossing om het VWF-specifieke muis antilichaam 1:50 te verdunnen om een VWF-specifieke antilichaam concentratie van 4 μg/mL te maken. Verdun het AlexaFluor488 geconjugeerde secundaire antilichaam van een 2 mg/mL stamoplossing 1:100 in 200 μL PBS (pH 7,4) om een eindconcentratie van 20 μg/mL te genereren.
      Opmerking: In de beschreven immunofluorescentie-instellingen leverde de detectie van antilichamen optimale resultaten op toen de antilichamen in de bovengenoemde alkalische carbonaat buffer werden verdund. Op basis van eerdere resultaten zijn de aanbevolen blokkerende oplossingen en de hoeveelheid antilichamen geschikt voor vele toepassingen. Verschillende experimenten kunnen echter individuele optimalisatie van de antilichaam combinatie, antilichaam concentratie, incubatietijd en de constitutie van de blokkerende buffer vereisen. Als alternatief kan een fosfaat-gebufferd systeem met een neutraal pH-bereik geschikt zijn of zelfs de voorkeur krijgen als incubatie buffer. In geval van zwakke fluorescentie signalen moet de concentratie van secundair antilichaam worden verhoogd. Als er te veel onbepaald fluorescentie achtergrondgeluid wordt gedetecteerd, moet de hoeveelheid blokkerende stoffen worden verhoogd.
    4. Voor VWF-immunofluorescentie kleuring, was de kanaal glijbaan met een 1 mL Luer injectiespuit door het injecteren van 200 μL van de wasoplossing 3x en inbroed de glijbaan met de 1:50 verdunde VWF-specifieke antilichamen gedurende 30 minuten bij RT. spoel daarna de kanaal Slide 3x met 200 μL van de wasoplossing en inbroed de glijbaan met de 1:100 verdunde AlexaFluor488-geconjugeerde muis-specifieke antilichamen gedurende 30 minuten bij RT. Was tenslotte de kanaal Slide 3x met 200 μL van de wasoplossing.
      Opmerking: De AlexaFluor-fluorohores zijn gevoelig voor bleken. Daarom moet de glijbaan worden beschermd door deze in een donkere kamer te houden tijdens de incubatie stappen met fluorophore-geconjugeerde antilichamen.
    5. Voor immunodetectie van de pneumokokken, inbroed de glijbaan met een 1:100 verdunde pneumococcus-specifieke konijn antilichaam gedurende 30 min bij RT. Daarna was de kanaal Slide 3x met 200 μL van de wasoplossing en inbroed de glijbaan met 1:100 verdund AlexaFluor568-geconjugeerd konijn-specifiek antilichaam gedurende 30 min bij RT. was de kanaal slede opnieuw 3x met 200 μL van de wasoplossing.
    6. Om de cellulaire actine cytoskelet met fluorescerende phalloidine vlekken, permeabilize de HUVEC door incubatie met 120 μL 0,1% Triton X-100 gedurende 5 min bij RT. was de kanaal glijbaan 3x met 200 μL van de wasoplossing en inbroed de glijbaan met 120 μL 1:1000 verdund AlexaFluor350-geconjugeerde phalloidine. Deze incubatie stap visualiseert het gepolymeriseerde actine cytoskelet en laat toe de celvorm en mogelijke door stress veroorzaakte morfologische veranderingen te bewaken.
    7. Was de kanaal glijbaan 3x met 200 μL van de wasoplossing. Was ten slotte de Slide 4x met 200 μL ddH2O en visualiseer de groene FLUORESCERENDE vwf-snaren, de rode fluorescerende bacteriën en het blauwe fluorescerende actine cytoskelet met behulp van de juiste filterinstellingen op de fluorescentiemicroscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het kweken van primaire huvec in een constante unidirectionele stroom resulteert in de vorming van een confluente en strak verpakte cellaag die de generatie van cellulaire wpbs bevordert, gevuld met de mechanosensitive vwf13,14. Dit protocol beschrijft het gebruik van een luchtdruk pomp-gebaseerd, pulseless recirculatiesysteem voor infectie analyse die vereist nabootsen van de shear stresssituatie in de menselijke bloedstroom.

Dit systeem maakt een gedefinieerde, softwaregestuurde instelling van stromings condities mogelijk. Het stroomschema in Figuur 1 illustreert de belangrijkste workflow, beginnend met de precultivatie van primaire endotheliale cellen (Figuur 1, inzet 1) en de precultivatie van pneumokokken (Figuur 1, inset 2). Het toegepaste microfluïdische systeem (Figuur 1, inzet 3) bestaat uit een speciale kanaal glijbaan die via een Luer-adapter is aangesloten op perfusie slangen met twee middelgrote reservoirs. De perfusie slangenset wordt geplaatst op een wervelende eenheid die als een standaard fungeert en de perfusie buizen als een ventiel systeem gebruikt. Voor de stroming teelt wordt de wervelende eenheid met de middelgevulde perfusie-set en de aangesloten kanaal glijbaan in een CO2 -incubator geplaatst (Figuur 1, inzet 3). De fluidic unit is aangesloten op een luchtdruk pomp via luchtslang. De lucht in de slang moet door een droog fles met silica kralen gaan voor het verwijderen van vocht uit de perfusie reservoirs voordat de lucht in het pompsysteem wordt opgepompt (Figuur 1, inzet 3). De luchtdruk pomp wordt bestuurd door computer software (PumpControl v 1.5.0) die de instelling van een continue, gedefinieerde stroomsnelheid mogelijk maakt, afhankelijk van de diameter van de kanaal glijbaan, de lengte en diameter van de perfusie slang set, en de viscositeit van de gebruikte medium (Figuur 1, inzet 3). De uitscheiding van VWF door WPB exocytose van een met de hand gegroeide HUVEC wordt geïnduceerd door histamine-stimulatie8 die wordt toegepast in de medium circulatie in de perfusie slang met behulp van een injectie poort (Figuur 1, inset 4). Bij een minimale shear stress van 10 dyn/cm2, de vrijgegeven vwf eiwitten multimerize en vormen lange eiwit snaren bereiken lengtes van meer dan 100 μm (Figuur 1, inzet 4, 5, 6 en Figuur 2a). Deze eiwit snaren worden microscopisch gedetecteerd en gevisualiseerd na de injectie van fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerde VWF-specifieke antilichamen in het medium. De circulerende antilichamen maken de immunofluorescentie detectie van de celoppervlakgebonden VWF-snaren in real-time mogelijk (Figuur 1, inzet 5)8.

De gevestigde microfluidic-gebaseerde cel cultuur infectie benadering met behulp van primaire endotheel cellen bootst de situatie van een lokaal ontstoken vasculatuur na infiltratie van de bloedsomloop door bacteriële pathobionten zoals Streptococcus pneumoniae. Voorbeelden van de visualisatie en kwantitatieve analyse van bacteriële interactie met gedifferentieerde vasculaire cellen onder shear stress met behulp van microfluïdische endotheliale celkweek worden getoond (Figuur 1, insets 5, 6). RFP-uitdrukken van pneumokokken werd geïnjecteerd in de stroom en na 30 minuten circulatie werden de eerste tekenen van bacteriële gehechtheid aan VWF-snaren van histamine-gestimuleerde HUVEC microscopisch gedetecteerd (Figuur 1, insets 5, 6 en Figuur 2a, B witte pijlen)8. Zo heeft het gebruik van RFP-uitdrukken van pneumokokken de kwantificering van bacteriële gehechtheid aan de VWF-snaren op de endotheelcellen mogelijk gemaakt zonder de eis van detectie van bacteriële antilichamen.

Histogram overlay plots van de fluorescentie intensiteiten werden gegenereerd met behulp van de evaluatiesoftware van Leica (d.w.z. LasX) om de colokalisatie van de RFP-uitdrukken van pneumokokken te visualiseren met de VWF-snaren gedetecteerd met groene fluorescerende antilichamen. Hierdoor werd een kwantitatieve analyse mogelijk gemaakt van de waarschijnlijkheid van de colokalisatie in specifieke interessegebieden (ROI) binnen het fluorescentie beeld. Met behulp van histogram overlays van bacteriële signalen in combinatie met de fluorescentie signalen van de VWF, overlappende fluorescentie pieken voor beide kunnen worden gevisualiseerd en daarmee bevestigde pneumococcus gehechtheid aan de VWF snaren. De bacteriële bevestiging is bestand tegen de continu toegepaste shear stress voor een minimum van 25 min (Figuur 2b)8.

Kortom, de continue stroming teelt van primaire HUVEC ingeschakeld VWF secretie en de generatie van lange VWF eiwit snaren die dienen als adhesie plaatsen voor circulerende bacteriën8.

Figure 1
Figuur 1: workflow voor analyses van bacteriële gehechtheid aan VWF-snaren met behulp van microfluïdische endotheliale celteelt. Workflow van de belangrijkste experimentele stappen beginnend met de precultivatie van primaire endotheliale cellen tot subconfluency in celkweek kolven. Voorafgaand aan de celteelt in de stroom worden cellen in een Gelatin-gecoate kanaal glijbaan (inzet 1) gesekt. Bacteriën worden geteeld op agar-platen, gevolgd door de teelt in een complexe vloeibare middelgrote tot mid-log fase (inzet 2). Voor de microfluïdische celcultuur wordt een kanaal glijbaan met endotheel cellen verbonden met de perfusie buizen van een wervelende eenheid van het pompsysteem en onderworpen aan een constante stroom voor celdifferentiatie (inzet 3). De generatie van de VWF-snaren (groene pijl) werd geïnduceerd door histamine injectie bij een shear stress van 10 dyn/cm2 en microscopisch gecontroleerd door immunofluorescentie detectie met behulp van FITC-GELABELDE vwf-specifieke antilichamen (inset 4). Na injectie van de RFP-expressie van bacteriën op het Circulerend medium werd de pneumococcus-bijlage (rode pijl) aan de VWF-snaren in real-time microscopisch gevisualiseerd door fluorescentie-emissie bij 450 nm (inzet 5). Na fixatie van de cellen met behulp van PFA, biedt differentiële immunofluorescentie kleuring de visualisatie van bacteriële hechting op specifieke infectie tijdpunten (inzet 6). De beelden van het pompsysteem en de HUVEC-cellaag zoals beschreven in stap 1, 3 en het beeld van de injectie poort (inzet 4) zijn inbegrepen. De immunofluorescentie beelden die in de insets 4 en 5 worden getoond, zijn aangepast en gebruikt met toestemming van jagau et al.8. De lengtes van de schaal staven worden rechtsonder aangegeven.

Figure 2
Figuur 2: representatieve immunofluorescentie beelden van pneumococcus binding aan de VWF snaren gegenereerd in continue stroming op het oppervlak van histamine-gestimuleerd HUVEC. (A) de generatie van de vwf-snaren werd microscopisch gekwantificeerd na het blootstellen van WERVELENDE huvec om de spanning te afschuiven met behulp van een microfluïdisch pompsysteem bij 10 dyn/cm2. FITC-geconjugeerde VWF-specifieke antilichamen hebben de VWF-snaren gedetecteerd. Witte pijlen wijzen op RFP-uitdrukken van pneumokokken met rode fluorescentie bevestigd aan lange VWF-snaren. B) bacteriële bevestiging aan de groene FLUORESCERENDE vwf-snaren werd microscopisch waargenomen gedurende maximaal 2 uur in constante stroom (witte pijlen) en werd bevestigd door software-gebaseerde evaluatie van fluorescentie intensiteiten van een gedefinieerde ROI. Real-time beelden werden genomen met de fluorescentie apparatuur van een confocale laser scanning microscoop (SP8, Leica). Schaal staven = 10 μm. Dit cijfer is aangepast en gebruikt met toestemming van Jagau et al.8.

Aanvullend figuur 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend figuur 3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De simulatie van bacteriële interactie met mechanosensitieve gastheer eiwitten zoals VWF vereist een perfbruikbare celcultuursysteem dat het genereren van een gedefinieerde, unidirectionele en continue stroom van vloeistoffen mogelijk maakt, waardoor betrouwbaar shear stress wordt gegenereerd . Verschillende microfluïdische pompsystemen zijn al beschreven. Een uitgebreid overzicht van Bergmann et al. vat de belangrijkste aspecten van verschillende twee-en driedimensionale celcultuurmodellen17samen.

De microfluïdische technologie is een zeer jonge techniek gestart in de vroege jaren 1990 met de ontwikkeling van beheersbare, reproduceerbare en perfbruikbare micro-omgevingen in een micrometer en zelfs in een nanometer schaal18. De gepresenteerde microfluïdische benadering kan ook worden toegepast om het brede scala van bacteriële adhesie mechanismen en betrokken eiwitten te bestuderen. Het is het meest geschikt voor elke interactie waarbij mechanoresponsieve adhesie componenten zoals VWF worden gebruikt, die in het algemeen niet benaderbaar zijn met behulp van standaard celkweek technieken. Bijvoorbeeld, het is bekend dat de conformatie van verschillende extracellulaire matrix eiwitten verschilt afhankelijk van hun locatie. Binnen het bloedsysteem circuleren glycoproteïnen zoals fibronectine in een bolvormige conformatie, terwijl in de extracellulaire matrix de eiwitten verschijnen als multiconnected di-en multimerized steiger19,20. Bovendien bieden verschillende distributeurs van microfluïdische apparatuur gestandaardiseerde kanaal glaasjes met verschillende soorten collageen (bijv. subendotheliale collageen of andere eiwitten die uit plasma afkomstig zijn). Deze kanaal dia's zijn geschikt voor visualisatie en kwantitatieve analyses van bacteriële hechting op specifieke extracellulaire matrix eiwitten in verschillende stromings situaties.

Verschillende microfluïdische systemen kunnen worden gecategoriseerd op basis van de verschillende materialen die worden gebruikt voor de productie van micro apparaten. In dit opzicht verschillen de op glas/siliconen gebaseerde platformen van de op polymeer gebaseerde en de op papier gebaseerde platformen21. Op polymeer gebaseerde kanaal dia's worden geproduceerd met een elastisch ondersteund oppervlak (ESS), vereisen over het algemeen een oppervlaktecoating voor celbevestiging tijdens flow-experimenten. Als alternatief voor een coating met wrijvings ondersteunende componenten zoals collageen, wordt het oppervlak van sommige in de handel verkrijgbare kanaal dia's fysiek gewijzigd, wat een hydrofiel en hecht oppervlak creëert dat geschikt is voor de meeste celtypen. Bovendien worden sommige kanaal dia's gegenereerd met behulp van substraten zoals Polydimethylsiloxaan (PDM'S), die zuurstof-permeabel is en ook de cultuur van bloedvat cellen op het binnenoppervlak van microkanalen in fluïdische pompsystemen22mogelijk maakt, 23.

Het microfluïdische systeem dat werd gebruikt in deze studies diende als een efficiënt en betrouwbaar systeem dat werd toegepast voor de analyse van de interactie van Staphylococcus aureus met multimerized vwf vezels na de cultuur van menselijke endotheliale cellen in de stroming 24,25. Dit microfluïdische systeem was een gesloten circulair perfusie systeem dat de analyse van infectie door pathogene bacteriën mogelijk maakte onder bioveiligheid 2-condities. Bovendien waren de kanaal glaasjes geschikt voor microscopische monitoring tijdens de stroming en zijn ze leverbaar met verschillende voor coatings (bijv. gelatine, poly-L-lysine of collageen-IV) die zorgen voor celhechting en een hoge mate van experimentele reproduceerbaarheid. Dit protocol maakt gebruik van een microfluïdisch systeem (Zie tabel met materialen) voor het instellen van een perfbruikbaar infectie model voor S. pneumoniae, waardoor de stromings situatie in het menselijk vasculaire systeem wordt nagebootsgemaakt8.

De beschreven algemene procedure van bacteriële celbevestiging in dit microfluïdische systeem kan ook worden uitgevoerd met andere typen pompsystemen die een gedefinieerde en continue stroom in een steriele omgeving genereren. Voor microfluïdische doeleinden worden voornamelijk vier soorten datatransport besturingen gebruikt: i) peristaltische pompen en recirculatie pompen, die in dit protocol worden gebruikt, II) spuit pompen, III) drukregelaars, en IV) drukregelaars met stroomschakelaar matrices. Elk soort datatransport regelsysteem heeft voor-en nadelen, afhankelijk van de specifieke microfluïdische toepassing en de mogelijkheid om in real-time microscopische visualisatie uit te voeren. In de meeste toepassingen die een continue circulatie van de monsters vereisen, worden recirculatie pompen gecombineerd met software-gebaseerde drukregelaars om een gedefinieerde stromings situatie te garanderen. Dit is ook geoptimaliseerd in het pompsysteem gedemonstreerd hier. De op de spuit gebaseerde pompsystemen kunnen worden onderverdeeld in "klassieke" spuit pompen, die stromings oscillatie en "pulseless" microfluïdische spuit pompen genereren. Deze op spuitpomp gebaseerde systemen zijn over het algemeen eenvoudig te gebruiken, maar de datatransportbesturing in dode kanalen is uitdagend met behulp van spuit pompen. Bovendien, stroom veranderingen in de chip kan enige tijd duren, en een debietmeter is nodig om te bepalen van de stroomsnelheid. Zelfs pulseless spuit pompen kunnen periodieke pulsatie genereren op de stroomsnelheid als gevolg van de stap-voor-stap motor van de spuitpomp. Een ander twee spuitpomp apparaat is in staat om een "infuse en opname"-gebaseerde fluidische beweging te genereren die gedefinieerde afschuifkrachten op celoppervlakken toepast en geschikt is voor microdialyse toepassingen, zelfs op een PC-onafhankelijke manier. Dit systeem moet worden gecombineerd met microtubing voor de aansluiting van kamers of kanaal glaasjes voor celkweek, gevolgd door microscopische analyses.

De bovengenoemde drukregelaars zijn datatransport besturingen die de tank met het monster onder druk zetten, die soepel in een micro fluïdische kamer of op een chip wordt geïnjecteerd. De drukregelaars kunnen een pulseless flow tot stand brengen en ook stroomsnelheden bieden in combinatie met stromingsmeters. Een combinatie van drukregelaars met stroomschakelaar matrices maken een snelle stroomschakelaar zonder terugstromen mogelijk. Het Recirculerende systeem gepresenteerd hier ingeschakeld de generatie van shear stress waarden meestal gerapporteerd voor het menselijk vasculaire systeem26. In vivo vasculaire wand afschuiving stress is geschat op basis van wand afschuiving tarieven als afgeleid van niet-invasief opgenomen Velocity profielen, en volledige bloed viscositeit in grote slagaders en plasma viscositeit in arteriolen26. Reneman en Hoeks opgenomen Velocity profielen in grote slagaders met behulp van een speciaal ontworpen echografie systeem en in arteriolen via optische technieken met behulp van fluorescerende stromingssnelheid tracers26. Een gemiddelde shear stress van 11-13 dyn/cm2 is bereikt in de halsslagader, in tegenstelling tot alleen 4-5 dyn/cm2 in de brachiale slagader. Piekwaarden tot 25-70 dyn/cm2 zijn gecontroleerd voor de halsslagader. De shear stress waarden van kleine en middelste aderen varieert tussen 0,1 en 0,5 dyn/cm2. In het hier beschreven microfluïdische systeem is de toepasselijke shear stress waarde afhankelijk van de geselecteerde perfusie slangdiameter, de hoogte van de kanaal glijbaan en de viscositeit van het gebruikte fluidic medium. De geselecteerde wervelende instelling was samengesteld uit een glijbaan met 0,4 cm in hoogte (volume van 100 μl) in combinatie met een perfusie-set van 50 cm in lengte en 1,6 mm in diameter en de gemiddelde viscositeit was 0,0072 [Dyn · s]/cm2. Deze instelling is geschikt voor een afschuif spanningsbereik tussen 3,5 en 31,2 dyn/cm2 bij stroomsnelheden van 3,8 − 33,9 ml/min. Bovendien kan de druk pomp software controle een gepulseerde medium stroom die een gepulseerde arteriële bloedstroom nabootsen kunnen toepassen.

Het succesvolle, betrouwbare en reproduceerbaar gebruik van deze gecombineerde microfluïdische infectie methode vereist enkele voorzorgsmaatregelen die in gedachten moeten worden gehouden. Tijdens het infectie proces onder microfluïdische omstandigheden kan de cellaag worden blootgesteld aan cytotoxische of cytolytische bacteriële verbindingen zoals pneumolysine, die de levensvatbaarheid van de eukaryote cel beïnvloeden en de celhechting op het glij oppervlak verzwakken. Daarom is het noodzakelijk om gedurende de gehele loop van het experiment een constante stroom te houden en de integriteit van de celmorfologie moet regelmatig worden gecontroleerd. Bovendien moet het flow Culture medium alle essentiële voedingsstoffen aan de endotheelcellen leveren om een strakke oppervlakte bevestiging van de cellen gedurende het infectie experiment te waarborgen. Niettemin, opgemerkt moet worden dat medium supplementen bevatten stoffen die kunnen interfereren of remmen de interactie tussen de bacteriën en specifieke gastheer eiwitten. In studies met pneumococcus-VWF-interactie bijvoorbeeld moet heparine worden uitgeput van het celkweekmedium, omdat het de binding van pneumokokken aan VWF8remt.

Een andere belangrijke stap in de stromings cultuur van endotheelcellen is het behoud van een strakke celadhesie, die afhangt van de algehele vitaliteit van de cel en van het niveau van differentiatie. Shear flow-resistente celhechting van primaire endotheel cellen werd alleen bereikt wanneer cellen strikt werden bewaard in subconfluency vóór blootstelling aan shear stress. Anderzijds hangt de productie van WPB rechtstreeks af van de confluentie van de endotheliale cellaag die de nauwe cel-cel-contactpersonen bevordert13. Het voordeel van de microfluïdische celcultuur van primaire endotheel cellen dekt de sterk geïnduceerde celproliferatie die snel leidt tot de vorming van een confluente cellaag onder stromings condities. De cellen zijn strak aan elkaar gehecht, zijn collectief georiënteerd in de richting van de stroming en vertegenwoordigen een sterk gedifferentieerd fenotype dat nodig is om secretoire WPB te produceren. Deze WPB dienen als opslag blaasjes voor vwf, vasodilatatie activators, en cytokines die exocytosed als eiwit uitbarstingen op histamine stimulatie of pneumolysine activiteit27,13. Daarom is het genereren van een zeer zelfklevende, confluente cellaag van gedifferentieerde primaire endotheel cellen in lage proliferatie passages een onontbeerlijke voorwaarde voor een efficiënte VWF-release en de vorming van VWF-snaren op het celoppervlak en de analyses van bacteriën-VWF-interactie in stromingsomstandigheden. Er moet dus worden opgemerkt dat de differentiatie van de endotheelcellen 48 h van de stromings teelt ten minste kostte en een constante schuif stroom vereist zonder enige variaties in de pomp druk. Eventuele variaties kunnen leiden tot een plotselinge gemiddelde ontploffing, die de cellen uit de glijbaan zou spoelen. Bovendien moesten tijdens de microscopische visualisatie de microfluïdische glijbaan en de middelgrote reservoirs van het pompsysteem op een temperatuur van 37 °C worden gehouden, aangezien dit de temperatuur optimum van de menselijke cellen vertegenwoordigt.

Vereeuwigd menselijke cellijnen zijn geschikt voor vele wetenschappelijke experimenten en worden vaak gebruikt in celkweek infectie studies. Deze cellijnen delen enkele algemene technische voordelen, zoals lage of gematigde cultuur vereisten en onbeperkte proliferatie, die het mogelijk maakt om enkele honderden keren te door te komen zonder significante veranderingen in de morfologie of receptor profielen. Deze cellijnen vertegenwoordigen echter een eenzame monocultuur en worden onderworpen aan kunstmatige tweedimensionale groeiomstandigheden. 28 de ontbrekende fysiologische bron weefsel omgeving resulteert in substantiële veranderingen van functionele en morfologische celfenotype met elke passage van de cultuur29. Voorafgaand aan andere bacteriële adhesie-experimenten werd bepaald dat het profiel van de oppervlakte-blootgestelde cel-type specifieke marker eiwitten en receptoren van menselijke primaire Long endotheliale cellen in verschillende celkweek passages. De analyse van de Flowcytometrie toonde een sterk verminderde expressie van specifieke oppervlakte eiwitten zoals de bloedplaatjes endotheliale celadhesie molecule 1 (PECAM1) binnen acht ronden celpassaging. Bovendien werd het uitgesproken integrine receptor profiel significant veranderd in hogere celpassages ten gunste van een celtype-niet-specifieke integrine receptor patroon en een gereduceerde cel typespecifieke integrine receptor patroon (Bergmann et al., ongepubliceerde gegevens). Deze resultaten zijn met name relevant voor analyses van pathogenen-host interacties in infectie biologie studies. Met als doel de fenotypische celkenmerken en een hoog niveau van functionele differentiatie tijdens de microfluïdische celcultuur ten tijde van een bacteriële infectie te ondersteunen, werden in dit geval primaire endotheelcellen van meerdere donoren gekozen en alleen gebruikt maximaal vijf passages om de fenotypische karakteristieken zo specifiek mogelijk te houden8.

De gecombineerde visualisatie van bacteriën en specifieke celoppervlakte structuren tijdens de stroming vereist een geoptimaliseerd fluorescentie kleurings protocol. Met behulp van verschillende combinaties van direct gelabelde eiwitten, fluorescentie eiwit-uitverkende bacteriën en fluorescentie-geconjugeerde antilichamen, kunnen immunofluorescentie kleurings procedures specifiek worden aangepast aan de visualiserings doelstellingen. Deze procedures maken een gedefinieerde en heldere microscopische visualisatie mogelijk en ook een differentiatie en kwantificering van bacteriële hechting en internalisatie3,13,30,31. De immunofluorescentie-gebaseerde detectie van geïnternationaliseerde bacteriën vereist een celpermeabilization stap zoals een korte Triton X-100 incubatie, wat kan leiden tot celloslating. Daarom moet de detectie van bacteriële internalisatie processen die zich in een stromings cultuur voordoen, worden gevisualiseerd na de stroom incubatie met behulp van PFA-crosslinked samples. Voor real-time visualisatie van bacteriën in stroming, maakt het gebruik van genetisch gemodificeerde bacteriën die fluorescentie eiwitten uitdrukken een snelle en gerichte microscopische detectie mogelijk. In deze experimentele studie werden RFP-stammen die werden gegenereerd met behulp van een efficiënte genetische constructie die werd ontworpen door Kjos en veening16,8 gebruikt. Voor de detectie van VWF-snaren in flow werden verschillende VWF-specifieke antilichamen met fluorescein-label getest en gebruikt. Om een optimale signaal respons te verkrijgen met een geminimaliseerde, niet-specifieke achtergrond, werd de adequate antilichaam concentratie consequent getitreerd voor elk toegepast antilichaam.

Voor microscopisch Live-celbeeldvorming worden de fluïdische eenheid en de kanaal glijbaan uit de CO2 -incubator verwijderd en in een kamer geplaatst die voorverwarmd is tot 37 °c bij de Microscoop. Deze kamer kon niet worden aangepast aan 5% CO2. Zonder een carbonaat-gebufferde atmosfeer bleef de morfologie en bacteriële fitheid van HUVEC intact tot 180 min, wat voldoende is voor de analyse van de VWF-gemedieerde bacteriële hechting. Als langere infectie tijden en microscopische monitoring buiten een CO2 -incubator vereist zijn, moet een gebufferd celcultuurmedium worden gebruikt om te compenseren voor pH-verschuivingen als gevolg van ontoereikende co2 -concentratie. Als alternatief kan het hele systeem weer in de CO2 -incubator worden geplaatst tussen de stappen van een tijdreeks van microscopische visualisatie.

Naast de fluorescentiedetectie in real time, kan de bacteriële infectie van het endotheel binnen de kanaal glijbaan worden gestopt en worden bewaard door middel van gemiddelde uitwisseling met Paraformaldehyde (PFA) als fixatie stof. Na fixatie in de stroom maakt de geoptimaliseerde en stapsgewijze immunofluorescentie kleuring van het celoppervlak binnen de kanaal Slide het genereren van waardevolle microscopische momentopname visualisaties mogelijk en biedt een veelzijdige gecombineerde structuur detectie van specifieke cellulaire verbindingen die betrokken zijn bij de interactie tussen bacteriën en gastheer cellen. Het wetenschappelijke voordeel van deze gecombineerde methode is dat de PFA-behandelde kanaal glijbaan kan worden opgeslagen en gebruikt voor een post-flow immunofluorescentie kleuring van de structuren van belang. De PFA-behandeling inactiveert de bacteriën en arresteert dus de uitdrukking van RFP-eiwitten. Daarom werd een pneumococcus-specifiek antiserum gegenereerd in konijn voor bacteriële immuundetectie en visualisatie werd uitgevoerd met behulp van een konijn-specifieke AlexaFluor568-geconjugeerd secundair antilichaam8. Zoals reeds vermeld, vereist het gebruik van verschillende antilichaam combinaties een exacte optimalisering van antilichaam hoeveelheden en de blokkerende buffer samenstelling. Anders kunnen niet-specifieke achtergrond signalen en kruis detectie-effecten leiden tot kunstmatige kleuringsresultaten. Een geoptimaliseerde immunofluorescentie kleurings procedure kan gemakkelijk worden gebruikt voor de detectie van veel verschillende cellulaire doelen, zoals het actine cytoskelet of endosomale markers13,31.

Deze procedure kan worden aangepast om een complexere weefsel omgeving te creëren die fysiologie nabootst vanuit een histologisch, fysiologisch en functioneel oogpunt. De gepresenteerde infectie analyses kunnen efficiënt worden gebruikt om verschillende wetenschappelijke vragen tegelijkertijd te beantwoorden door gebruik te maken van een in line-aansluiting van verschillende kanaal dia's op één perfusie-set. Deze uitgebreide opzet zou de analyse van verschillende celtypen, celconfluences en verschillende glij coatings binnen dezelfde stromings instelling parallel en een directe vergelijking van bacteriële infecties van verschillende celtypen mogelijk maken. Bovendien biedt de seriële in-line aansluiting en gecombineerde analyses van verschillende kanaal dia's ook de mogelijkheid van Time Series-experimenten, die kunnen worden toegepast voor genexpressie profilering (bijv. de analyse van de infectie tijdafhankelijke virulentie factor genexpressie).

De infectie analyses kunnen ook worden uitgebreid tot een constante laminaire stroming voorwaarde blijvende meerdere dagen of zelfs weken om te analyseren van cellulaire reactie in omstandigheden nabootsen van een langdurige chronische infectie fase. In aanvulling op de gepresenteerde eencellige type cultuur, zijn enkele voorbeelden van van celcultuur in microfluïdische celkweek apparaten al gerapporteerd32,33. Dit zorgt voor een hoge doorvoer farmacologische studies en kan uiteindelijk resulteren in het gebruik van microfluïdische celkweek systemen voor regeneratieve doeleinden evenals34.

Samengevat, het microfluïdische systeem in combinatie met immune kleurings procedures diende als een waardevol model voor de analyse van pathomechanismen tussen bacteriën en gastheer cellen in een omgeving die de omstandigheden in het vasculaire systeem simuleert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het project werd gefinancierd door de DFG (BE 4570/4-1) naar S.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-syringe Fisher Scientific 10303002 with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe Sarstedt 9077136 For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase eBioscience now thermo fisher 00-4555-56 protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin Abcam ab176751 no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody Thermo Fisher Sientific A11001 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody Thermo Fisher Scientific A-11011 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth Becton Dickinson GmbH BD 249210 complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-25G solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter TPP 90026 subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R Beckman Coulter Life Sciences 392304 spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30 Beckman Coulter Life Sciences B06314 spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK Hermle 305.00 V05 - Z 216 M spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3886.2 used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing ibidi 10821 for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator Fisher Scientific MIDI 40 incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-Incubator Sanyo MCO-18 AIC for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar plates Becton Dickinson GmbH PA-254005.06 agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer Dell Latitude 3440 Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) Leica DMi8 An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3904.1 used for PBS buffer
Drying material Merck 101969 orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix Promocell C-39215 supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMS Promocell C-22010 ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) Promocell C-22010 culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS) biochrome now Merck S 0415 supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody Abcam ab8822 stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit ibidi 10903 fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G-1890-100g for precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochloride Sigma Aldrich H-7250-10MG for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) Promocell C-12203 Lot-Nr. 396Z042 primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) Santa Cruz sc73268 stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port ibidi 10820 for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope Zeiss Axiovert 35M inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) ibidi 80176 physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) Sigma Aldrich M7506-500G For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump ibidi 10905 air pressure pump
Neubauer cell counting chamber Karl Hecht GmbH&Co KG 40442002 microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710-S for cross linking of samples
Perfusion Set ibidi 10964 Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS) the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes Sarstedt 67,741 (2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum Pineda raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 6781.1 used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) ibidi v1.5.4 Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mL Sarstedt 72.706/ 72.695.500 required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volume Sarstedt 6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci National Collection of Type Cultures, Public Health England 10,319 Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mL Sarstedt 86.1253.025/ 86.1254.025 for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) Sigma Aldrich 451614-25G for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe P030.2 used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22 Biochrom 80-2115-20 measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose Sigma Aldrich S0389-500G for preparation of blocking buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-500ML Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract oxoid LP0021 bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
  29. Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218 (1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

Tags

Immunologie en infectie probleem 152 Streptococcus pneumoniae microfluïdische endotheel cellen microscopie fluorescentie shear stress hechting
Pneumococcus-infectie van primaire humane endotheliale cellen in constante stroming
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jagau, H., Behrens, I. K., Steinert, … More

Jagau, H., Behrens, I. K., Steinert, M., Bergmann, S. Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow. J. Vis. Exp. (152), e60323, doi:10.3791/60323 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter