Summary
इस अध्ययन में परिभाषित प्रवाह स्थितियों में कतरनी तनाव के तहत विभेदित मानव प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की सतह पर उत्पादित वॉन Willebrand कारक तार के लिए न्यूमोकॉकस पालन की सूक्ष्म निगरानी का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल विशिष्ट सेल संरचनाओं की विस्तृत दृश्य और अंतर इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रियाओं को लागू करने से बैक्टीरिया के परिमाणीकरण के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह के साथ स्ट्रेप्टोकॉकस न्यूमोनिया की बातचीत को वॉन विलेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ) जैसे मेकेनोसेंसिटिव प्रोटीन के माध्यम से रक्त प्रवाह में मध्यस्थता की जाती है। यह ग्लाइकोप्रोटीन कतरनी तनाव के जवाब में अपनी आणविक रचना को बदलता है, जिससे मेजबान-लिगंड अन्योन्यक्रियाओं के व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए बाध्यकारी स्थलों को उजागर किया जाता है। सामान्य में, एक परिभाषित कतरनी प्रवाह के तहत प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की culturing विशिष्ट सेलुलर भेदभाव और एक स्थिर और कसकर जुड़े endothelial परत के गठन को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है एक रक्त वाहिका के भीतर की परत के शरीर क्रिया विज्ञान के समान . इस प्रकार, जीवाणु रोगजनकों और मैनेनोसेन्सेटिव प्रोटीन को शामिल मेजबान vascualature के बीच बातचीत के कार्यात्मक विश्लेषण पंप सिस्टम है कि शारीरिक प्रवाह बलों की सतह को प्रभावित करने के लिए जाना जाता अनुकरण कर सकते हैं की स्थापना की आवश्यकता है संवहनी कोशिकाओं.
इस अध्ययन में प्रयुक्त माइक्रोफ्लूइडिक उपकरण एक परिभाषित प्रवाह दर के साथ तरल पदार्थ के एक सतत और नाड़ीहीन पुनर्संचरण में सक्षम बनाता है। कंप्यूटर नियंत्रित हवा दबाव पंप प्रणाली एक सतत, undirectional, और नियंत्रित मध्यम प्रवाह पैदा करके endothelial सेल सतहों पर एक परिभाषित कतरनी तनाव लागू होता है. कोशिकाओं और जीवाणु लगाव के Morphological परिवर्तन सूक्ष्म दृष्टि से निगरानी की जा सकती है और विशेष चैनल स्लाइड है कि सूक्ष्म दृश्य के लिए डिजाइन किए हैं का उपयोग करके प्रवाह में मात्रा निर्धारित. स्थिर सेल संस्कृति संक्रमण के विपरीत, जो सामान्य रूप में प्रतिरक्षा लेबलिंग और सूक्ष्म विश्लेषण से पहले एक नमूना निर्धारण की आवश्यकता है, microfluidic स्लाइड प्रोटीन, बैक्टीरिया, और सेलुलर घटकों के फ्लोरोसेंट आधारित पता लगाने दोनों सक्षम नमूना निर्धारण के बाद; सीरियल इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला; और वास्तविक समय में प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट आधारित पता लगाने। फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया और विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के साथ संयोजन में, इस संक्रमण प्रक्रिया संवहनी प्रक्रियाओं से संबंधित वैज्ञानिक अनुप्रयोगों का एक बड़ा स्पेक्ट्रम के लिए एक कुशल एकाधिक घटक दृश्य प्रणाली प्रदान करता है।
Introduction
न्यूमोकॉकस संक्रमण के रोगजनन को अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स यौगिकों की विविधता और मानव हेमोटासिस के घटकों के साथ बहुमुखी बातचीत की विशेषता है, जैसे प्लाज्मिनोजेन और वीडब्ल्यूएफ1,2, 3,4,5,6,7,8. बहुडोमेन ग्लाइकोप्रोटीन वीडब्ल्यूएफ संवहनी थ्रोम्बस गठन9के स्थल पर थ्रोम्बोसाइट भर्ती और फाइब्रिन निगमन को मध्यस्थता करके संतुलित हेमेस्टासिस के प्रमुख नियामक के रूप में कार्य करता है . कार्यात्मक के महत्व, खून बह रहा नियंत्रण और घाव भरने के लिए सक्रिय VWF वॉन Willebrand रोग, एक आम विरासत में मिला खून बह रहा विकार10द्वारा प्रदर्शन किया है.
ग्लोबुलर वीडब्ल्यूएफ मानव रक्त प्रणाली में 14.0 ग्राम/एमएल11,10तक की सांद्रता में परिकलित करता है . संवहनी चोट के जवाब में, endothelial Weibel Palade निकायों (WBP) द्वारा VWF के स्थानीय रिलीज उल्लेखनीय रूप से11,12वृद्धि हुई है. पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि मानव endothelial कोशिकाओं के लिए न्यूमोकॉकस पालन और छिद्र बनाने विष न्यूमोलिसिन के अपने उत्पादन काफी luminal VWF स्राव को उत्तेजित करताहै 13. रक्त प्रवाह के हाइड्रोडायनामिक बलों mechanoresponsive VWF डोमेन के एक संरचनात्मक खोलने के लिए प्रेरित. 10 डाइन/सेमी2 की प्रवाह दरों पर वीडब्ल्यूएफ कई सौ माइक्रोमीटर तक के लंबे प्रोटीन तारों को बहुमद करता है जो सबएंडोथेलियम10,12से जुड़ा रहता है .
एंडोथेलियल सतह के साथ न्यूमोकॉकस की बातचीत में कतरनी तनाव के तहत उत्पन्न multimerized VWF तार के समारोह को समझने के लिए, एक microfluidic आधारित सेल संस्कृति संक्रमण दृष्टिकोण स्थापित किया गया था। एक सॉफ्टवेयर नियंत्रित हवा दबाव पंप प्रणाली के साथ एक microfluidic डिवाइस का इस्तेमाल किया गया था. यह एक परिभाषित प्रवाह दर के साथ सेल संस्कृति माध्यम के एक सतत, undirectional पुनर्संचरण सक्षम. इस प्रकार, प्रणाली endothelial कोशिकाओं की सतह पर एक परिभाषित कतरनी तनाव लागू है, जो विशेष चैनल स्लाइड के अंदर संलग्न रहे. इस दृष्टिकोण मानव संवहनी प्रणाली के रक्त प्रवाह के भीतर कतरनी बल के अनुकरण सक्षम है, जिसमें VWF तार परिभाषित निरंतर प्रवाह की स्थिति के तहत विभेदित endothelial कोशिकाओं पर उत्पन्न कर रहे हैं. इस उद्देश्य के लिए, endothelial कोशिकाओं विशिष्ट चैनल स्लाइड में खेती की गई (सामग्री की तालिकादेखें), जो प्रवाह के दौरान सूक्ष्म विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया. microfluidic पंप प्रणाली अत्यधिक परिभाषित और नियंत्रित कतरनी तनाव confluent endothelial सेल परत पर विस्तारित VWF तार के गठन के लिए आवश्यक स्थिति प्रदान की. हिस्टामाइन पूरकता द्वारा confluently विकसित मानव नाभि नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) के VWF-स्राव की उत्तेजना के बाद, स्ट्रिंग गठन एक कतरनी तनाव लागू करने से प्रेरित किया गया था (जेड) 10 dyn/ अपरूपण प्रतिबल को कोशिका परत पर कार्य करने वाले बल के रूप में परिभाषित किया जाता है। यह लगभग कॉर्निश एट के अनुसार गणना की है. अल.14 समीकरण 1 के साथ:
जहाँ र्ं र्ं र्ंर्ं र्ं र्ं र्ं र्ंर्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र्
समीकरण 1 का परिणाम उपयोग की जाने वाली विभिन्न स्लाइडों की विभिन्न ऊँचाइयों और चौड़ाई पर निर्भर करता है (सामग्री की सारणीदेखें ) इस अध्ययन में 131.6 के एक कक्ष स्लाइड कारक में जिसके परिणामस्वरूप 0.4 डिग्री उ की एक Luer चैनल स्लाइड का उपयोग किया गया था (सूत्र 2 देखें).
37 डिग्री सेल्सियस पर माध्यम की विशालता 0ण्0072 डाइन्स/सेमी2 है और 10 डाइन/सेमी2 के एक कतरनी तनाव का उपयोग किया गया था। इसके परिणामस्वरूप 10.5 एमएल/मिनट की प्रवाह दर हुई (सूत्र 3 देखें)।
यहाँ, जांच और मेजबान vasculature में जीवाणु संक्रमण तंत्र के दृश्य के लिए एक undirectional स्तरीय प्रवाह प्रणाली का उपयोग कर एक microfluidic सेल culturing प्रक्रिया के अनुकूलन और प्रगति विस्तार से वर्णित है. एंडोथेलियल परतों पर वीडब्ल्यूएफ तारों की पीढ़ी को अन्य पंप प्रणालियों का उपयोग करके भी प्रेरित किया जा सकता है जो सतत और स्थिर कतरनी तनाव15लागू करने में सक्षम हैं ।
VWF स्ट्रिंग गठन के प्रवाह और उत्तेजना में संगम के लिए प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की खेती के बाद, न्यूमोकोसी लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त (आरएफपी)16 लगातार सूक्ष्म नियंत्रण के तहत endothelial सेल परत में जोड़ा गया. एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह पर VWF तार करने के लिए बैक्टीरिया के लगाव सूक्ष्म रूप से कल्पना की थी और VWF विशेष फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करके वास्तविक समय में तीन घंटे के लिए निगरानी की. इस दृष्टिकोण के साथ, एक आसंजन सहकारक के रूप में VWF की भूमिका संवहनी endothelium के लिए जीवाणु लगाव को बढ़ावा देने8निर्धारित किया गया था.
प्रोटीन स्राव और अनुरूपता परिवर्तन के सूक्ष्म दृश्य के अलावा, इस विधि का उपयोग वास्तविक समय में जीवाणु संक्रमण प्रक्रियाओं के एकल चरणों की निगरानी करने और विभिन्न समय बिंदुओं पर संलग्न बैक्टीरिया की मात्रा को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है संक्रमण. विशिष्ट सॉफ्टवेयर नियंत्रित पंप प्रणाली भी कई दिनों के लिए परिभाषित निरंतर प्रवाह की स्थिति में endothelial कोशिकाओं संस्कृति के लिए संभावना प्रदान करता है और एक परिभाषित स्पंदित मध्यम प्रवाह ऊष्मायन सक्षम बनाता है. इसके अलावा, इस विधि विभिन्न प्रकार के सेल का उपयोग कर लागू किया जा सकता है. दाग प्रोटोकॉल अनुकूलन भी पता लगाने और यूकैरियोटिक कोशिकाओं में internalized बैक्टीरिया के दृश्य में सक्षम बनाता है.
इस पांडुलिपि इस उन्नत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि pathophysiological प्रक्रियाओं के एक कुशल और बहुमुखी विशेषता के लिए एक परिभाषित, विश्वसनीय, और पुन: उत्पादनीय दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन करता है.
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Protocol
microfluidic सेल खेती वाणिज्यिक प्राथमिक मानव नाभि नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) के साथ किया गया था. कंपनी ने दाता की सूचित सहमति से कोशिकाओं को अलग कर दिया। इस अध्ययन के संदर्भ संख्या 219-04 के साथ संघीय राज्य Baden-Wuertemberg के डॉक्टरों चैंबर की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.
नोट: प्रोटोकॉल आपूर्ति के लिए सामग्री की तालिका देखें.
1. प्राथमिक अंत:कक्षीय कोशिकाओं की पूर्वावचन
- एक जमे हुए ग्लिसरोल शीशी युक्त 1 x 105 प्राथमिक HUVEC तीन अलग-अलग दाताओं से धीरे से 37 डिग्री सेल्सियस पर और बीज कोशिकाओं prewarmed endothelial सेल विकास माध्यम के 7 एमएल में (ECGM, की खुराक के साथ उपयोग करने के लिए तैयार) एक 25 सेमी2 सेल फ्लास्क में.
नोट: प्राथमिक endothelial कोशिकाओं से अधिक 5 प्रसार चक्र के बाद भेदभाव क्षमता खो देते हैं. इसलिए, केवल कम से कम 5 मार्ग के साथ कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है अगर सेल भेदभाव के उच्च ग्रेड की आवश्यकता है. - सतह लगाव की अनुमति देने के लिए और cryoconservation से अवशेषों से छुटकारा पाने के लिए ईसीजीएम सेल संस्कृति माध्यम का आदान-प्रदान करने के लिए 60 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की खेती।
- 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं culturing जारी रखें जब तक वे एक subconfluent सेल परत फार्म.
नोट: HUVEC को एक confluent परत के लिए विकसित नहीं करना चाहिए क्योंकि तंग सेल-सेल संपर्क बाद में प्रवाह में एक स्थिर सेल परत के गठन को रोकते हैं।
2. स्ट्रेप्टोकॉकस न्यूमोनिया की पूर्वार्ध
चेतावनी: स्ट्रेप्टोकॉकस न्यूमोनिया एक जैव सुरक्षा स्तर 2 एजेंट है और केवल जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशालाओं में सुसंस्कृत होने की अनुमति है। सभी जीवाणु उपचार के लिए सुरक्षा स्तर 2 के लिए वर्गीकृत एक स्वच्छ बेंच का उपयोग करें, सख्ती से एयरोसोल गठन से बचें, और बैक्टीरिया के अवसादन के लिए एयरोसोल संरक्षण के साथ एक अपकेंद्रित्र का उपयोग करें।
- स्ट्रेप्टोकॉकस न्यूमोनिया के साथ कोलंबिया रक्त एगार प्लेट को टीका करें , जो लगातार -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ग्लिसरोल स्टॉक से व्युत्पन्न है और आगर प्लेट को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर खेती करें ।
- टोड हेविट तरल शोरबा के 40 एमएल 1% खमीर निकालने (THY) और बाँझ फॉस्फेट-बफर ्ड नमकीन (पीबीएस) पीएच 7.4 के 15 एमएल के साथ पूरक, जीवाणु की खेती और धोने के चरणों के लिए तैयार करें।
- जीवाणु की खेती के लिए एक बाँझ ट्यूब का प्रयोग करें और जीवाणु द्रव्यमान के साथ तरल संस्कृति शोरबा टीका। संदर्भ के रूप में गैर-inoculated तरल शोरबा के खिलाफ 600 एनएम पर 1 एमएल alicuots के photometric माप द्वारा टीका की मात्रा को नियंत्रित करें। तरल शोरबा में जीवाणु द्रव्यमान भरें जब तक कि यह 0.15 के 600 एनएम (ओडी600) पर ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंच न लें।
- 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर मिलाते हुए बिना inoculated तरल शोरबा इनक्यूबेट और OD600 हर 30 मिनट प्लास्टिक cuvettes का उपयोग कर 1 एमएल alicots को मापने के द्वारा निर्धारित करते हैं।
- जैसे ही जीवाणु संस्कृति 0.4 के एक OD600 तक पहुँच गया है, जो घातीय वृद्धि चरण से मेल खाती है, कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए जीवाणु संस्कृति निलंबन को अपकेंद्रण।
नोट: एक न्यूमोकॉकस संस्कृति को 1.0 से अधिक के ओडी600 तक पहुंचने की अनुमति न दें, क्योंकि एक उच्च न्यूमोकॉकस संस्कृति घनत्व बैक्टीरियल ऑटोलिसिस को ट्रिगर करने के लिए जाना जाता है, जो समग्र जीवाणु फिटनेस को प्रभावित कर सकता है। - बैक्टीरियल तलछट को 10 एमएल पीबीएस और तलछट के साथ फिर से 10 मिनट के लिए 10 मिनट के लिए आरटी पर 1,000 x ग्राम के साथ पुन: निलंबित करें।
- 1 एमएल पीबीएस में धीरे से धोया जीवाणु तलछट को फिर से निलंबित करें और एक संदर्भ के रूप में पीबीएस के 1 एमएल का उपयोग करके जीवाणु निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस के ओडी600 का निर्धारण करें।
- पीबीएस में बैक्टीरिया की मात्रा को 2.0 के ओडी600 में समायोजित करें। पूर्व निर्धारित जीवाणु गिनती के अनुसार, 2.0 के एक OD600 2 x 109 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) से मेल खाती है. जीवाणु ऑटोलिसिस को रोकने के लिए तुरंत संक्रमण प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ें।
3. माइक्रोफ्लूइडिक शर्तों के तहत एचयूईसी की एंडोथेलियल सेल खेती
- नियंत्रित प्रोटीओलिसिस द्वारा सेल कल्चर फ्लास्क से प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं को हटाएं। एक बाँझ वातावरण में निम्न चरणों का पालन एक साफ बेंच का उपयोग कर. धोने के चरणों के लिए बाँझ पीबीएस के 15 एमएल की एक मात्रा तैयार करें।
- एक subconfluent-growed HUVEC परत से ECGM निकालें और सेल संस्कृति माध्यम से छुटकारा पाने के लिए एक serological pipette का उपयोग कर 10 एमएल पीबीएस के साथ सेल परत धोने.
- 37 डिग्री सेल्सियस के 3 एमएल के साथ धोया गया HUVEC को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेल टुकड़ी के लिए सेल टुकड़ी के समाधान के साथ इनक्यूबेट करें। सूक्ष्म निगरानी प्रत्येक मिनट द्वारा प्रोटीओलिटिक सेल टुकड़ी का निरीक्षण करें।
- पिपेट एक ट्यूब में अलग सेल निलंबन ईसीजीएम के 7 एमएल के साथ पूरक 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) प्रोटीओलिसिस को रोकने के लिए और RT में 220 x g पर 3 मिनट के लिए तलछट कोशिकाओं.
- अधिनातंत को हटा दें और ईसीजीएम के 250 डिग्री एल में एचयूईसी को पुन: निलंबित करें 5% एफसीएस और 1 एम एम एमजीएसओ4के साथ पूरक हैं। एक Neubuer सेल गिनती कक्ष का उपयोग कर सेल गिनती के लिए सेल निलंबन के 10 $L का उपयोग करें और सेल गिनती को समायोजित करने के लिए 4 x 106 कोशिकाओं / एमएल ईसीजीएम 5% FCS और 1 MM MgSO4के साथ पूरक .
नोट: प्रत्येक प्रवाह प्रयोग के लिए ECGM मध्यम के 30 एमएल 5% FCS के साथ पूरक और के साथ 1 एम एम MgSO4 की आवश्यकता होगी. यहाँ से इस माध्यम संरचना का नाम ईसीजीएमएस-मध्यम है। 2% से 5% तक संस्कृति माध्यम में FCS एकाग्रता की वृद्धि चैनल स्लाइड में SEEDED HUVEC के सेल लगाव और सेल व्यवहार्यता का समर्थन करता है. मध्यम की खुराक FCS और MgSO4 काफी हद तक कतरनी तनाव की स्थिति के तहत HUVEC के सेल लगाव को स्थिर.
- बीज और एक चैनल स्लाइड में HUVEC खेती. एक बाँझ वातावरण में एक साफ बेंच का उपयोग कर काम करते हैं. कोशिकाओं कतरनी तनाव के तहत 2 दिनों के लिए खेती की जाएगी बैक्टीरिया और एक और 2 एच के लिए सूक्ष्म निगरानी के साथ संक्रमण के बाद.
- एक चैनल स्लाइड, एक perfusion सेट 1.6 मिमी व्यास में और लंबाई में 50 सेमी, ईसीजीएमएस-मध्यम के एक aliquot, और एक Luer चैनल स्लाइड 0.4 डिग्री मीटर ऊंचाई में, एक इनक्यूबेटर में 24 एच के लिए 5% सीओ2 वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर हवा के बुलबुले की संख्या को कम करने के लिए।
नोट: इस प्रक्रिया को प्लास्टिक के उपकरण degas करने के लिए और मध्यम prewarm करने के लिए सिफारिश की है, भ्रम ट्यूब, और जलाशयों. यदि सामग्री या तरल पदार्थ आरटी में या रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया गया है, प्लास्टिक और तरल पदार्थ में भंग गैसों जब प्रयोग के दौरान इनक्यूबेटर में गर्म जारी किया जाएगा. गैस बुलबुले तो दिखाई देगा. प्रयोग से पहले सभी प्लास्टिक घटकों degassing इस प्रभाव को खत्म कर देगा. हर बार जब प्रणाली इनक्यूबेटर से बाहर ले जाया जाता है, गैस अवशोषण की प्रक्रिया फिर से शुरू होता है. इसलिए, आरटी पर जल्दी से काम करें और लंबे समय तक अवधि के लिए इनक्यूबेटर के बाहर तरल इकाई को कभी न छोड़ें। - पीबीएस समाधान में 2% बाँझ-फिल्टर्ड पॉर्सिन जिलेटिन समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस को तापमान-समान चैनल स्लाइड के जलाशयों में से एक में इंजेक्ट करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए जिलेटिन-समाधान को इनक्यूबेट करें और 1 एमएल पीबीएस के साथ स्लाइड के चैनल को 1 एमएल लूर सिरिंज का उपयोग करके बाँझ शर्तों के तहत धोएं।
- स्लाइड तापमान में गिरावट को रोकने के लिए एक पतली पॉलीस्टाइरीन या स्टाइलोफोम प्लेट पर जिलेटिन लेपित चैनल स्लाइड रखें। स्लाइड में 1 एमएल लूर सिरिंज के साथ 4 x 106/एमएल ह्यूवेक निलंबन के 100 $L जोड़ें।
नोट: साफ बेंच की ठंड धातु की सतह पर चैनल स्लाइड रखने स्लाइड नीचे के तापमान को कम कर सकता है, जिससे endothelial कोशिकाओं को ठंडा तनाव पैदा. सेल पाइपिंग के दौरान स्लाइड को थोड़ा ऊपर की ओर पकड़ते हैं ताकि हवा के बुलबुले बढ़ तेजाब उठें और स्लाइड के अंदर से गायब हो जाएं। - 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 60 मिनट के लिए एचयूईसी के साथ चैनल स्लाइड को इनक्यूबेट करें और चैनल स्लाइड के दोनों सिरों पर मध्यम जलाशयों को 60 डिग्री ईसीजीएमएस-मध्यम प्रत्येक के साथ भरें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट और 5% सीओ2.
- एक चैनल स्लाइड, एक perfusion सेट 1.6 मिमी व्यास में और लंबाई में 50 सेमी, ईसीजीएमएस-मध्यम के एक aliquot, और एक Luer चैनल स्लाइड 0.4 डिग्री मीटर ऊंचाई में, एक इनक्यूबेटर में 24 एच के लिए 5% सीओ2 वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर हवा के बुलबुले की संख्या को कम करने के लिए।
- microfluidic पंप और सॉफ्टवेयर सेटिंग्स समायोजित करें.
- पंप इकाई के लिए सेट समभित perfusion कनेक्ट, ईसीजीएमएस-मध्यम के 13.6 एमएल के साथ भरें, और पंप नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं। fluidic इकाई सेट अप के मेनू में नीचे स्क्रॉल नीचे खिड़कियों का उपयोग कर पर्याप्त perfusion सेट और कक्ष स्लाइड के प्रकार का चयन करें. मध्यम चिपचिपापन के लिए सॉफ्टवेयर में 0.007 (dyn ]s/cm2)चुनें. (पूरक चित्र 1में लाल तीरों से चिह्नित दाब पंप सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स को देखें)।
- इनक्यूबेटर के बाहर, हवा के दबाव ट्यूबिंग के लिए सुखाने सिलिका मोती के साथ भरा एक गिलास बोतल कनेक्ट (चित्र 1, इनसेट 3देखें)। दबाव पंप की हवा भ्रम जलाशयों और पंप के बीच प्रसारित और पंप डिवाइस reentering से पहले सूखा होना चाहिए. सॉफ्टवेयर मेनू में फ्लो पैरामीटर का चयन करें, दबाव को 40 mbar पर सेट करें, और निरंतर मध्यम प्रवाह शुरू करके तरल माध्यम के साथ पंप ट्यूबों को फ्लश करें। (ये सेटिंग्स अनुपूरक चित्र 1में लाल तीरों द्वारा भी दर्शायी जाती हैं)।
- प्रवाह खेती के वांछित कतरनी तनाव चक्र कार्यक्रम. 5 dyn/cm2के साथ शुरू करो, संतुलित जलाशय pumpinng नियंत्रण और विश्वास दिलाता हूं कि कोई हवा बुलबुले पंप प्रणाली में घूम रहे हैं.
नोट: एक चैनल स्लाइड में दीवार कतरनी तनाव प्रवाह दर और भ्रम माध्यम की चिपचिपापन पर निर्भर करता है। यदि किसी अन्य पंप प्रणाली का उपयोग कर, इच्छित कतरनी तनाव स्तर पैदा करने के लिए एक प्रवाह दर निर्धारित करने के लिए परिचय में वर्णित समीकरणों को देखें. वर्णित सेटिंग्स 5.42 एमएल/मिनट की प्रवाह दर से मेल खाती हैं (दाब पंप सॉफ्टवेयर में पर्याप्त प्रवाह पैरामीटर सेटिंग्स दर्शाने वाला एक अनुकरणीय स्क्रीन शॉट अनुपूरक चित्र 2में दर्शाया गया है। - पंप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में प्रवाह परिसंचरण बंद करो और Luer कनेक्शन के पास ट्यूब clamping द्वारा भ्रम टयूबिंग में मध्यम प्रवाह पकड़. चैनल स्लाइड कनेक्ट करें, जिससे हवा के बुलबुले से बचें, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक सीओ2 इनक्यूबेटर में जुड़े चैनल स्लाइड के साथ तरल इकाई रखें। कतरनी प्रतिबल स्तर को तेज करने से पहले अपरूपण प्रतिबल द्वारा उत्पन्न बलों को सरल रूप से अनुकूलित करने के लिए 30 मिनट के लिए 5 डाइन/सेमी2 पर कतरनी प्रतिबल प्रारंभ करें (पूरक चित्र 3देखें)।
नोट: ध्यान रखें कि कोई हवा बुलबुले ट्यूब प्रणाली में या ट्यूब प्रणाली के लिए connectinng के बाद स्लाइड में रहते हैं क्योंकि प्रवाह में हवा के बुलबुले की आवाजाही सेल टुकड़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. - कतरनी तनाव को 10 dyn/cm2 (जो इस प्रवाह सेटिंग में 10.86 एमएल/मिनट के अनुरूप है) में तेजी लाएं और सेल विभेदन की अनुमति देने के लिए एक छोटे सीओ2 इनक्यूबेटर में 48 एच के लिए निरंतर कतरनी तनाव में चैनल स्लाइड को इनक्यूबेट करें ( संबंधित सॉफ्टवेयर settinngs अनुपूरक चित्र 4में लाल तीर के साथ संकेत दिया जाता है.
नोट: यदि प्रवाह की खेती सीधे 10 डाइन/ यदि प्रवाह की खेती कम कतरनी तनाव के साथ शुरू की जाती है तो कोशिकाएं कक्ष की सतह से जुड़ी रहती हैं , जिसमें कम से कम 30 मिनट के लिए 5 डाइन/सेमी2 का उपयोग किया जाता है जिसके बाद कतरनी प्रतिबल को धीरे- धीरे वांछित 10 डाइन/सेमी2तक बढ़ा देता है . 10 dyn/cm2 का एक कतरनी तनाव VWF स्ट्रिंग गठन के लिए आवश्यक इस perfusion सेटिंग में न्यूनतम मूल्य है। - microfluidic सेल खेती के 24 ज के बाद, पंप नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ मध्यम प्रवाह बिल्कुल बंद करो जब एक संतुलित मध्यम स्तर दोनों मध्यम जलाशयों में पहुँच जाता है. एक साफ बेंच में fluidic इकाई प्लेस और एक 10 एमएल सीरम पिपेट का उपयोग कर perfusion जलाशयों के प्रसारित खेती माध्यम के 10 एमएल हटा दें। माध्यम को नवीनीकृत करने के लिए जलाशयों में ईसीजीएमएस-मध्यम के 10 एमएल जोड़ें, तरल इकाई को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर सीओ2 में वापस रखें, और पंप नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके तरल खेती को पुनरारंभ करें।
नोट: दबाव पंप का कार्य अचानक प्रयोगशाला मशीनों जैसे बड़े सेंट्रीफ्यूज द्वारा बाधित किया जा सकता है, जो एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र अशांति पैदा कर सकता है। यह अचानक व्यवधान सेल टुकड़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. ध्यान रखें कि ऐसी मशीनें प्रयोग के दौरान दबाव पंप के पास सक्रिय नहीं हैं। - सूक्ष्म दृश्य से पहले तापमान तुल्यता 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के चरण को कवर तापमान ऊष्मायन कक्ष के prewarming शुरू करो। माइक्रोस्कोप prewarmed है के बाद, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर नियंत्रण शुरू करने और उपयुक्त फिल्टर सेटिंग्स का चयन करके फ्लोरोसेंट सूक्ष्म निगरानी के लिए मुख्य सेटिंग्स को समायोजित (540 एनएम / 470 nm/515 nm FITC-कंजुटेड VWF-विशिष्ट एंटीबॉडी के फ्लोरेसीइन उत्सर्जन का पता लगाने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर तरल इकाई के ऊष्मायन के लिए एक अतिरिक्त हीटिंग चैम्बर का सेवन करें।
नोट: संक्रमण विश्लेषण और सूक्ष्म चैनल स्लाइड के तापमान की निगरानी के दौरान और घूम माध्यम काफी हद तक कम नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह कोशिकाओं पर ठंड तनाव उत्पन्न होगा. सामान्य में, माइक्रोस्कोप चरण को कवर तापमान कक्षों का आकार पूरे तरल इकाई को कवर करने के लिए पर्याप्त नहीं है। इसलिए, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed एक अतिरिक्त हीटिंग चैम्बर के उपयोग की सिफारिश की है। - सूक्ष्म दृश्य के लिए, तरल इकाई को 37 डिग्री सेल्सियस prewarmed हीटिंग चैम्बर में रखें और चैनल स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस prewarmed माइक्रोस्कोप के एक चरण पर रखें।
नोट: सूक्ष्म दृश्य के लिए, fluidic इकाई और चैनल स्लाइड को कंफ्यूजन ट्यूबिंग की सीमित लंबाई के कारण सीओ2 इनक्यूबेटर से हटाने की जरूरत है। यदि पीएच बफरिंग के लिए 5% सीओ2 वातावरण के बाहर 180 मिनट से अधिक समय तक संक्रमण के समय और सूक्ष्म निगरानी की आवश्यकता होती है, तो माइक्रोफ्लूइडिक खेती के लिए एक पीएच-बफर माध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए। - प्रवाह प्रयोग के दौरान और माइक्रोस्कोप के उज्ज्वल क्षेत्र मोड का उपयोग कर प्रवाह प्रयोग खत्म करने के बाद प्रवाह परिसंचरण के लिए हिस्टामाइन और बैक्टीरिया के इंजेक्शन से पहले सेल आकारिकी और HUVEC परत की अखंडता को नियंत्रित करें।
4. VWF रिलीज और Multimerized VWF स्ट्रिंग्स के दृश्य का प्रेरण
- प्रवाह सेटिंग बनाए रखें, क्योंकि 10 dyn/cm2 के एक कतरनी तनाव अप करने के लिए की लंबी तार करने के लिए VWF के multimerization ट्रिगर करने के लिए आवश्यक है 200 MDa. एक इंजेक्शन बंदरगाह का उपयोग कर perfusion ट्यूबिंग में घूम ईसीजीएमएस-मध्यम में एक 100 एम एम हिस्टामाइन स्टॉक समाधान के 136 $L इंजेक्शन द्वारा endothelial WPB से VWF की रिहाई को प्रेरित. प्रवाह माध्यम में हिस्टामाइन की अंतिम सांद्रता 1 एम.एम. यदि कोई इंजेक्शन बंदरगाह उपलब्ध नहीं है, तो पंप जलाशयों के माध्यम में पाइपिंग द्वारा हिस्टामाइन को वैकल्पिक रूप से जोड़ा जा सकता है।
- बहुमीकृत वीडब्ल्यूएफ तारों का इम्यूनोफ्लोरेसन का पता लगाने के लिए, जलाशयों में एक संतुलित मध्यम स्तर तक पहुंचने पर प्रवाह को रोक दें, और 200 डिग्री सेल्सियस पीबीएस (पीएच 7.4) की मात्रा में एक वीडब्ल्यूएफ-विशिष्ट FITC-संयोजित एंटीबॉडी का 20$g इंजेक्ट करें। ईसीजीएमएस-मध्यम एक इंजेक्शन पोर्ट का उपयोग कर। यदि कोई इंजेक्शन बंदरगाह उपलब्ध नहीं है, तो एंटीबॉडी को पंप जलाशयों के माध्यम में पाइपिंग द्वारा वैकल्पिक रूप से जोड़ा जा सकता है। इसका परिणाम यह होता है कि अंतिम एंटीबॉडी सांद्रता 1ण्3 ग्राम/एमएल होती है।
- एक कम समय में देखने के कई क्षेत्रों के सूक्ष्म स्कैनिंग के लिए, 30% शक्ति और एक epifluorscence कैमरा पर एक Xenon फ्लोरेसेंस डिवाइस के साथ माइक्रोस्कोप के फ्लोरोसेंट इकाई का उपयोग करें. VWF-स्ट्रिंग दृश्य के लिए उपयुक्त प्रतिनिधि कोशिकाओं का चयन करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र मोड के साथ HUVEC परत के आकार और आकृति विज्ञान की निगरानी करें।
- हरी फ्लोरोसेंट VWF तार के दृश्य के लिए, एक 63x/1.40 तेल उद्देश्य और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर (LasX) के फ्लोरोसेंट इकाई मेनू में एक 470 एनएम का पता लगाने फिल्टर का चयन करें. कम से कम 50 प्रतिनिधि फ़ील्ड दृश्यों के $-स्टैक की स्नैपशॉट बनाएँ, जिनमें से प्रत्येक में लगभग 10 रूपात्मक रूप से बरकरार HUVEC होता है. अलग अलग समय बिंदुओं पर हरी फ्लोरोसेंट VWF तार के परिमाणीकरण के लिए, देखने के कई क्षेत्रों को स्कैन.
5. वास्तविक समय में प्रवाह में VWF-स्ट्रिंग के लिए बैक्टीरियल अनुलग्नक का सूक्ष्म मूल्यांकन
-
इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने के माध्यम से HUVEC सेल सतहों पर उत्पन्न VWF-स्ट्रिंग के लिए न्यूमोकोकल लगाव की मात्रा।
- प्रवाह पकड़ो और इंजेक्शन पोर्ट का उपयोग करईसीजीएमएस-मध्यम में 1 लाख की अधिकतम मात्रा में 1.35 x 108 CFU/mL RFP-एक्सप्रिंग न्यूमोकोची इंजेक्ट करें। वैकल्पिक रूप से, पंप जलाशय में माध्यम में बैक्टीरिया को पाइपेट करें। पंप प्रणाली के भीतर बैक्टीरिया प्रसारित करने के लिए 10 dyn/cm2 पर कतरनी तनाव को पुनरारंभ करें।
- माइक्रोस्कोप आवर्धन के लिए एक 63x तेल विसर्जन उद्देश्य का चयन करें और आरएफपी-एक्स्प्रेसिंग न्यूमोकोसी का पता लगाने के लिए आरएफपी चैनल (540 एनएम का पता लगाने फिल्टर) के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में फ्लोरोसेंट फिल्टर सेटिंग्स को समायोजित करें।
- VWF स्ट्रिंग्स के लिए जीवाणु लगाव के परिमाणीकरण के लिए, प्रवाह को रोकने और कम से कम 30 प्रतिनिधि क्षेत्र विचारों के $-स्टैक के स्नैपशॉट बनाने के लिए, प्रत्येक लगभग 10 आकृतिक रूप से बरकरार HUVEC युक्त, और न्यूमोकोकी की मात्रा की गणना.
- डेटा का मूल्यांकन करने के क्रम में ANOVA एक कारक सांख्यिकी एल्गोरिथ्म का प्रयोग करें, विस्तृत सांख्यिकीय तुलना के लिए एक पोस्ट हॉक दो पूंछ unpaired नमूना परीक्षण के बाद. के P मान;0.05 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया.
6. नमूना निर्धारण के बाद VWF-स्ट्रिंग के लिए बैक्टीरियल अनुलग्नक का सूक्ष्म मूल्यांकन
- इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने से पहले निर्धारण का नमूना।
- प्रवाह बंद करो, पंप जलाशयों से ईसीजीएमएस-मध्यम के 10 एमएल को हटा दें, और पीबीएस के 10 एमएल को 5% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ पूरक जोड़ें। पीएफए विलयन को 10 डाइन/सेमी 2 के कतरनीतनाव पर 10 मिनट के लिए परिचालित होने दें।
- चैनल स्लाइड को पंप इकाई से डिस्कनेक्ट करें.
- सेल की सतह पर विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को ब्लॉक करें और वीडब्ल्यूएफ स्ट्रिंग और संलग्न बैक्टीरिया का इम्यूनोडिटेक्शन करें।
- 100 एमएम ना2सीओ3 (पीएच 9.2) युक्त एक धोने के घोल के 4 एमएल तैयार करें जो सभी धोने के चरणों के लिए 4% सुक्रोज के साथ पूरक है। 100 एमएम ना2सीओ3 (पीएच 9.2) वाले एक अवरुद्ध समाधान के 1 एमएल को तैयार करें, जो 4% सुक्रोज और 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ अविशिष्ट बाइंडिंग साइटों को अवरुद्ध करने के लिए पूरक है।
- धोने के समाधान के 200 $L इंजेक्ट करने के लिए 1 एमएल लूर सिरिंज का उपयोग करके पीएफए-इनक्यूबेट ्ड चैनल स्लाइड 3x को धोएं और 200 डिग्री एल ब्लॉकिंग समाधान के साथ आरटी में 120 मिनट के लिए स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
- 100 एमएम ना2सीओ3,(पीएच 9.2) 4% सुक्रोज और एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के लिए 0.5% बीएसए के साथ पूरक युक्त एक और अवरुद्ध समाधान के 4 एमएल तैयार करें। न्यूमोकॉकस-विशिष्ट खरगोश एंटीसेरम 1:100 को पतला करने के लिए इस अवरुद्ध समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें। VWF-विशिष्ट माउस एंटीबॉडी 1:50 को पतला करने के लिए इस अवरुद्ध समाधान के 200 $L का उपयोग करें, जो 4 ग्राम/एमएल की एक VWF-विशिष्ट एंटीबॉडी सांद्रता बनाने के लिए है। PBS के 200 $L में 2 mg/mL स्टॉक समाधान 1:100 से AlexaFluor488-conzuted माध्यमिक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए 20 ग्राम/
नोट: वर्णित इम्यूनोफ्लोरेसींस सेटिंग्स में, एंटीबॉडी का पता लगाने इष्टतम परिणाम दिया जब एंटीबॉडी ऊपर उल्लिखित क्षारीय कार्बोनेट बफर में पतला थे। पिछले परिणामों के आधार पर, अनुशंसित अवरुद्ध समाधान और एंटीबॉडी की मात्रा कई अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं। हालांकि, विभिन्न प्रयोगों एंटीबॉडी संयोजन के व्यक्तिगत अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, एंटीबॉडी एकाग्रता, ऊष्मायन समय, और अवरुद्ध बफर के संविधान. एक विकल्प के रूप में, एक तटस्थ पीएच रेंज के साथ एक फॉस्फेट-बफर सिस्टम उपयुक्त या यहां तक कि एक ऊष्मायन बफर के रूप में पसंद किया जा सकता है। कमजोर फ्लोरोसेंट संकेतों के मामले में, माध्यमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता में वृद्धि की जानी चाहिए। यदि बहुत अधिक असामान्य फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि शोर का पता चला है, अवरुद्ध पदार्थों की मात्रा में वृद्धि की जानी चाहिए. - VWF-immunofluorscence धुंधला के लिए, धोने समाधान 3x के 200 $L इंजेक्शन द्वारा एक 1 एमएल Luer सिरिंज का उपयोग कर चैनल स्लाइड धोने और 1:50 पतला VWF-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ स्लाइड incubate RT. बाद में, चैनल स्लाइड फिर से 3x 200 के साथ धो लो धोने के समाधान के $L और 1:100 पतला AlexaFluor488-कंजुगेटेड माउस-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ स्लाइड को आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अंत में, धोने के समाधान के 200 डिग्री एल के साथ चैनल स्लाइड फिर से 3x धो लें।
नोट: AlexaFluor-fluorophores विरंजन के प्रति संवेदनशील हैं. इसलिए, स्लाइड को फ्लोरोफोर-कंजुटेड एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन चरणों के दौरान एक अंधेरे कक्ष में रखकर संरक्षित किया जाना चाहिए। - न्यूमोकोकी के इम्यूनोडिटेक्शन के लिए, आरटी में 30 मिनट के लिए 1:100 पतला न्यूमोकॉकस-विशिष्ट खरगोश एंटीबॉडी के साथ स्लाइड को इनक्यूबेट करें। बाद में, चैनल स्लाइड 3x को धोने के समाधान के 200 $L के साथ धोएं और स्लाइड को 1:100 पतला के साथ इनक्यूबेट करें AlexaFluor568-संयुग्मी खरगोश-विशिष्ट एंटीबॉडी RT. पर 30 मिनट के लिए चैनल स्लाइड फिर से धोने समाधान के 200 $L के साथ 3x धोएं.
- फ्लोरोसेंट phaloidin के साथ सेलुलर actin cytoskeleton दाग करने के लिए, आरटी में 5 मिनट के लिए 0.1% Triton X-100 के 120 $L के साथ ऊष्मायन द्वारा HUVEC permeabilize. धोने के समाधान के 200 $L के साथ चैनल स्लाइड 3x धोएं और 1:1,000 पतला के 120 जेडएल के साथ स्लाइड को इनक्यूबेट करें। एलेक्साफ्लुओर350-संयोजित फलालॉयडिन। यह ऊष्मायन कदम बहुलकactized actin cytoskeleton कल्पना और सेल आकार और संभव तनाव प्रेरित रूपात्मक परिवर्तन की निगरानी की अनुमति देगा.
- धोने के समाधान के 200 $L के साथ चैनल स्लाइड 3x धो लें। अंत में, 200 डिग्री एल डीडीएच2ओ के साथ स्लाइड 4x को धोएं और ग्रीन फ्लोरोसेंट वीडब्ल्यूएफ स्ट्रिंग, लाल फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया, और ब्लू फ्लोरोसेंट एक्टिन साइटोस्केलेटन को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर उपयुक्त फिल्टर सेटिंग्स का उपयोग करते हुए कल्पना करें।
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Representative Results
एक निरंतर दिशाहीन प्रवाह में प्राथमिक HUVEC को एक सतत एकात्मक प्रवाह में गढ़ने से एक अनुकूल और कसकर पैक की गई कोशिका परत का निर्माण होता है जो मेकेनोसेंसिटिव वीडब्ल्यूएफ13,14से भरे सेलुलर WPBs की पीढ़ी को बढ़ावा देता है . यह प्रोटोकॉल संक्रमण विश्लेषण के लिए एक वायु दबाव पंप आधारित, नाड़ीहीन पुनर्संचरण प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है जिसके लिए मानव रक्त प्रवाह में कतरनी तनाव की स्थिति की नकल करने की आवश्यकता होती है।
यह सिस्टम प्रवाह शर्तों की एक परिभाषित, सॉफ़्टवेयर-नियंत्रित सेटिंग सक्षम करता है. चित्र 1 में प्रवाह योजना प्राथमिक अंत:तलीय कोशिकाओं की पूर्व-कृषि से प्रारंभ करते हुए मुख्य कार्यप्रवाह को दर्शाती है (चित्र 1, इनसेट 1) और न्यूमोकोक्सी की पूर्व-कृषि(चित्र 1, इनसेट 2)। लागू microfluidic प्रणाली ( चित्र1, इनसेट 3) एक विशेष चैनल स्लाइड है कि एक Luer एडाप्टर के माध्यम से जुड़ा हुआ है दो मध्यम जलाशयों के साथ perfusion ट्यूबिंग से बना है. भ्रम टयूबिंग सेट एक तरल इकाई है कि एक स्टैंड के रूप में कार्य करता है और एक वाल्व प्रणाली के रूप में भ्रम ट्यूबों को रोजगार पर रखा गया है. प्रवाह की खेती के लिए, मध्यम से भरे परफ्यूजन सेट और कनेक्टेड चैनल स्लाइड के साथ तरल इकाई को सीओ2 इनक्यूबेटर में रखा गया है(चित्र 1, इनसेट 3)। तरल इकाई हवा टयूबिंग के माध्यम से एक हवा के दबाव पंप से जुड़ा हुआ है। ट्यूबिंग में हवा पंप प्रणाली में repumped है इससे पहले कि हवा से भ्रम जलाशयों से नमी को हटाने के लिए सिलिका मोती युक्त एक सुखाने की बोतल के माध्यम से पारित करना होगा (चित्र 1, इनसेट 3). हवा के दबाव पंप कंप्यूटर सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जाता है (PumpControl v1.5.0) कि चैनल स्लाइड के व्यास के आधार पर एक सतत, परिभाषित प्रवाह दर की स्थापना में सक्षम बनाता है, लंबाई और भ्रम टयूबिंग सेट के व्यास, और चिपचिपापन मध्यम प्रयोग किया जाता है (चित्र 1, इनसेट 3)। WPB के स्राव confluently बड़े HUVEC के exocytosis द्वारा प्रेरित है हिस्टामाइन-उत्तेजना8 एक इंजेक्शन बंदरगाह का उपयोग कर भ्रम टयूबिंग में मध्यम परिसंचरण में लागू (चित्र 1, इनसेट 4). 10 डाइन/सेमी2के न्यूनतम कतरनी तनाव में , जारी किए गए वीडब्ल्यूएफ प्रोटीन बहुमज और 100 डिग्री मीटर से अधिक की लंबाई तक पहुंचने वाले लंबे प्रोटीन तार बनाते हैं (चित्र 1, इनसेट 4,5,6 और चित्र 2ए) . इन प्रोटीन तार सूक्ष्म रूप से पता लगाया और माध्यम में fluorescein आइसोथियोसाइन (FITC)-conzugated VWF-विशिष्ट एंटीबॉडी के इंजेक्शन के बाद कल्पना कर रहे हैं। परिसंचरण एंटीबॉडी वास्तविक समय में सेल सतह से बंधे वीडब्ल्यूएफ तारों का इम्यूनोफ्लोरेंसेशन का पता लगाने में सक्षम होते हैं (चित्र 1, इनसेट 5 )8.
प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग कर स्थापित microfluidic आधारित सेल संस्कृति संक्रमण दृष्टिकोण ऐसे Streptococcus के रूप में जीवाणु pathobionts द्वारा रक्त परिसंचरण की घुसपैठ पर एक स्थानीय रूप से सूजन vasculature की स्थिति की नकल निमोनिया| माइक्रोफ्लूइडी एंडोथेलियल सेल खेती का उपयोग करके कतरनी तनाव के तहत विभेदित संवहनी कोशिकाओं के साथ जीवाणु संपर्क के दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण के उदाहरण दिखाए गए हैं (चित्र 1, इनसेट 5,6)। आरएफपी-अभिव्यक्त न्यूमोकोची प्रवाह में इंजेक्ट किया गया था और 30 मिनट के संचलन के बाद, हिस्टामाइन-उत्तेजित ह्यूवेक के वीडब्ल्यूएफ तार के जीवाणु लगाव के पहले लक्षण सूक्ष्म रूप से पाए गए थे (चित्र 1, इनसेट 5,6 और चित्रा 2 A, B सफेद तीर)8| इस प्रकार, आरएफपी-अत्यधिक न्यूमोकोसी के उपयोग ने जीवाणु एंटीबॉडी का पता लगाने की आवश्यकता के बिना एंडोथेलियल कोशिकाओं पर वीडब्ल्यूएफ स्ट्रिंग ्स्वामेंट के क्वांटिफिकेशन को सक्षम किया।
फ्लोरोसेंट तीव्रता के हिस्टोग्राम ओवरले भूखंडों Leica द्वारा प्रदान की मूल्यांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पन्न किए गए (यानी, LasX) के लिए हरी फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ पता लगाया VWF तार के साथ RF-expressing न्यूमोकोची के colocalization कल्पना. यह फ्लोरोसेंट छवि के भीतर ब्याज (ROI) के विशिष्ट क्षेत्रों में colocalization संभावना का एक मात्रात्मक विश्लेषण सक्षम. VWF के फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ संयोजन में जीवाणु संकेतों के हिस्टोग्राम ओवरले का उपयोग करना, दोनों के लिए फ्लोरोसेंट चोटियों ओवरलैपिंग कल्पना की जा सकती है और इस तरह VWF तार के लिए न्यूमोकॉकस लगाव की पुष्टि की. जीवाणु लगाव कम से कम 25 मिनट ( चित्र2 ख)8के लिए लगातार लागू कतरनी तनाव का विरोध करता है .
संक्षेप में, प्राथमिक HUVEC के निरंतर प्रवाह की खेती VWF स्राव और लंबे VWF प्रोटीन तार है कि बैक्टीरिया 8 घूम के लिए आसंजन साइटों के रूप में सेवा की पीढ़ीसक्षम.
चित्र 1: microfluidic endothelial सेल खेती का उपयोग कर VWF तार करने के लिए जीवाणु लगाव के विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह. सेल कल्चर फ्लास्क में उपसंबन्धन के लिए प्राथमिक अंत:मंडलीय कोशिकाओं की पूर्व-कृषि के साथ शुरू होने वाले प्रमुख प्रयोगात्मक चरणों का कार्यप्रवाह। प्रवाह में सेल की खेती से पहले, कोशिकाओं को जिलेटिन लेपित चैनल स्लाइड(इनसेट 1) मेंबीजित किया जाता है। एक जटिल तरल माध्यम में मध्य लॉग चरण(इनसेट 2)में खेती के बाद आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया उगाए जाते हैं। माइक्रोफ्लूइडी कोशिका संस्कृति के लिए, एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ एक चैनल स्लाइड पंप प्रणाली की एक तरल इकाई के भ्रम ट्यूबों से जुड़ा हुआ है और सेल विभेदन के लिए निरंतर प्रवाह के अधीन है (इनसेट 3)। VWF-स्ट्रिंग (हरा तीर) की पीढ़ी 10 dyn/cm2 के एक कतरनी तनाव पर हिस्टामाइन इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था और FITC लेबल VWF-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने के द्वारा सूक्ष्म रूप से निगरानी(इनसेट 4)। घूम माध्यम के लिए आरएफपी-उत्सर्जन बैक्टीरिया के इंजेक्शन के बाद, VWF-स्ट्रिंग के लिए न्यूमोकॉकस लगाव (लाल तीर) सूक्ष्म रूप से 450 एनएम(इनसेट 5) पर फ्लोरोसेंट उत्सर्जन द्वारा वास्तविक समय में कल्पना की गई थी। पीएफए का उपयोग कर कोशिकाओं के निर्धारण के बाद, अंतर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला विशिष्ट संक्रमण समय बिंदुओं पर जीवाणु लगाव के दृश्य प्रदान करता है (इनसेट 6)। पंप प्रणाली और HUVEC सेल परत की छवियों कदम 1, 3 में वर्णित है, और इंजेक्शन बंदरगाह की छवि(इनसेट 4) शामिल हैं. इनसेट 4 और 5 में दिखाए गए इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों को संशोधित किया गया है और जगाऊ एट अल से अनुमति के साथ उपयोग किया गयाहै। पैमाने सलाखों की लंबाई निचले सही पर संकेत दिया जाता है.
चित्रा 2: न्यूमोकॉकस के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों को हिस्टामाइन-उत्तेजित ह्यूवेक की सतह पर निरंतर प्रवाह में उत्पन्न वीडब्ल्यूएफ तारों के लिए बाध्यकारी। (क)वीडब्ल्यूएफ तारों का उत्पादन 10 डाइन/ FITC-कंजुटेड VWF-विशिष्ट एंटीबॉडी VWF तार का पता चला. सफेद तीर लंबे VWF तार से जुड़ी लाल फ्लोरोसेंट के साथ आरएफपी-एंड्युमेटिक न्यूमोकोसी को इंगित करते हैं। (बी) ग्रीन फ्लोरोसेंट वीडब्ल्यूएफ स्ट्रिंग ्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स ्स्स्स्स ्स्स्स ्स्स्स्स्स्स्स्स वास्तविक समय छवियों एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (SP8, Leica) के फ्लोरोसेंट उपकरण के साथ लिया गया. स्केल बार ] 10 डिग्री मी. इस आंकड़े को संशोधित किया गया है और जगाऊ एट अल से अनुमति के साथ इस्तेमाल कियागया है।
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Discussion
ऐसे VWF के रूप में mechanosensitive मेजबान प्रोटीन के साथ जीवाणु संपर्क के अनुकरण एक perfusable सेल संस्कृति प्रणाली है कि एक परिभाषित, undirectional, और तरल पदार्थ की निरंतर प्रवाह की पीढ़ी सक्षम बनाता है की आवश्यकता है, जिससे विश्वसनीय कतरनी तनाव पैदा . कई microfluidic पंप सिस्टम पहले से ही वर्णित किया गया है. Bergmann एट अल से एक व्यापक समीक्षा विभिन्न दो और तीन आयामी सेल संस्कृति मॉडल17के प्रमुख पहलुओं को संक्षेप में प्रस्तुत करता है.
माइक्रोफ्लूइडिक प्रौद्योगिकी एक बहुत ही युवा तकनीक है जो 1990 के दशक के आरंभ में एक माइक्रोमीटर में और यहां तक कि एक नैनोमीटर पैमाने18में नियंत्रणीय, पुनरुत्पाद्य, और पर्फ्यूसेबल माइक्रोएन्यूएसिस के विकास के साथ शुरू की गई थी। प्रस्तुत microfluidic दृष्टिकोण भी जीवाणु आसंजन तंत्र और शामिल प्रोटीन की व्यापक रेंज का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है. यह किसी भी बातचीत है कि ऐसे VWF के रूप में mechanoresponsive आसंजन घटक ों शामिल है, जो सामान्य रूप में मानक सेल संस्कृति तकनीकों का उपयोग करने योग्य नहीं हैं के लिए उपयुक्त है. उदाहरण के लिए, यह ज्ञात है कि कई extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के अनुरूप उनके स्थान के आधार पर अलग है. रक्त प्रणाली के भीतर, फाइब्रोनेक्टिन जैसे ग्लाइकोप्रोटीन एक गोलाकार रचना में प्रसारित होते हैं, जबकि बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स में प्रोटीन बहुसंबद्ध द्वि-तथा बहुगुणित पाड़19,20के रूप में दिखाई देते हैं। इसके अलावा, microfluidic उपकरण के कई वितरकों मानकीकृत चैनल स्लाइड कोलेजन के विभिन्न प्रकार के साथ precoated प्रदान करते हैं (उदा., subendothelial कोलेजन या अन्य प्लाज्मा व्युत्पन्न प्रोटीन). इन चैनल स्लाइड विभिन्न प्रवाह स्थितियों में विशिष्ट extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के लिए जीवाणु आसंजन के दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं.
विभिन्न microfluidic प्रणालियों माइक्रोडिवाइस उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया विभिन्न सामग्री के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है। इस संबंध में, कांच/सिलिकॉन आधारित प्लेटफार्म बहुलक-आधारित और कागज आधारितप्लेटफार्मों 21से भिन्न होते हैं। पॉलिमर आधारित चैनल स्लाइड एक elasticly समर्थित सतह (ESS) के साथ उत्पादित कर रहे हैं, आम तौर पर प्रवाह प्रयोगों के दौरान सेल लगाव के लिए एक सतह कोटिंग की आवश्यकता होती है. आसंजन का समर्थन घटकों के साथ एक कोटिंग के लिए एक विकल्प के रूप में इस तरह के कोलेजन के रूप में, कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चैनल स्लाइड की सतह शारीरिक रूप से संशोधित किया गया है, जो एक हाइड्रोफिलिक और चिपकने वाला सबसे सेल प्रकार के लिए उपयुक्त सतह बनाता है. इसके अलावा, कुछ चैनल स्लाइड polydimethylsiloxane (PDMS) की तरह substrates का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं, जो ऑक्सीजन पारगम्य है और यह भी fluidic पंप सिस्टम में microchannels की आंतरिक सतह पर रक्त वाहिका कोशिकाओं की संस्कृति सक्षम बनाता है22, 23.
इन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया था कि microfluidic प्रणाली एक कुशल और विश्वसनीय प्रणाली है कि विश्लेषण के लिए लागू किया गया था के रूप में सेवा की बहुमेरेड VWF फाइबर के साथ Staphylococcus ऑरियस की बातचीत प्रवाह में मानव endothelial कोशिकाओं की संस्कृति के बाद 24,25. यह माइक्रोफ्लूइडिक प्रणाली एक बंद परिपत्र परफ्यूजन सिस्टम थी जो जैव सुरक्षा 2 शर्तों के तहत रोगजनक बैक्टीरिया द्वारा संक्रमण के विश्लेषण को सक्षम करती थी। इसके अलावा, चैनल स्लाइड प्रवाह के दौरान सूक्ष्म निगरानी के लिए उपयुक्त थे और विभिन्न precoatings के साथ उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, जिलेटिन, पाली-L-lysine, या कोलेजन-IV) कि सेल आसंजन और प्रयोगात्मक पुन: उत्पादन क्षमता के एक उच्च डिग्री सुनिश्चित करते हैं. इस प्रोटोकॉल में एस न्यूमोनिया के लिए एक पर्फ्यूसेबलसंक्रमण मॉडल की स्थापना के लिए एक माइक्रोफ्लूइडिक प्रणाली (सामग्री तालिकादेखें) का उपयोग किया जाता है, जिससे मानव संवहनी प्रणाली8के भीतर प्रवाह की स्थिति की नकल की जा सकती है।
इस microfluidic प्रणाली में जीवाणु सेल लगाव की वर्णित सामान्य प्रक्रिया भी पंप सिस्टम के अन्य प्रकार के साथ आयोजित किया जा सकता है एक बाँझ वातावरण में एक परिभाषित और निरंतर प्रवाह पैदा. microfluidic प्रयोजनों के लिए, मुख्य रूप से प्रवाह नियंत्रण प्रणालियों के चार प्रकार का उपयोग किया जाता है: i) peristaltic पंप और recirculation पंप, जो इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है, ii) सिरिंज पंप, iii) दबाव नियंत्रकों, और iv) प्रवाह स्विच matrices के साथ दबाव नियंत्रकों. प्रवाह नियंत्रण प्रणाली के प्रत्येक प्रकार के लाभ और विशिष्ट microfluidic आवेदन और वास्तविक समय में सूक्ष्म दृश्य बाहर ले जाने की क्षमता के आधार पर कमियां है. नमूने की एक सतत परिसंचरण की आवश्यकता होती है सबसे अनुप्रयोगों में, recirculation पंप एक परिभाषित प्रवाह की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए सॉफ्टवेयर आधारित दबाव नियंत्रकों के साथ संयुक्त कर रहे हैं. यह भी पंप प्रणाली यहाँ प्रदर्शन में अनुकूलित है. सिरिंज आधारित पंप सिस्टम को "क्लासिक" सिरिंज पंपों में विभाजित किया जा सकता है, जो प्रवाह दोलन उत्पन्न करते हैं, और "पल्सलेस" माइक्रोफ्लूइडिक सिरिंज पंप। इन सिरिंज पंप आधारित प्रणालियों आम तौर पर उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं, लेकिन मृत अंत चैनलों में प्रवाह नियंत्रण सिरिंज पंप का उपयोग चुनौतीपूर्ण है. इसके अलावा, चिप के अंदर प्रवाह परिवर्तन कुछ समय लग सकता है, और एक प्रवाह मीटर प्रवाह दर निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. यहां तक कि पल्सलेस सिरिंज पंप सिरिंज पंप के कदम दर कदम मोटर के कारण प्रवाह दर पर आवधिक धड़कन उत्पन्न हो सकता है। एक और दो सिरिंज पंप डिवाइस एक उत्पन्न करने में सक्षम है "उपयोग और वापस लेने" आधारित fluidic आंदोलन है कि सेल सतहों पर परिभाषित कतरनी बलों लागू होता है और यहां तक कि एक पीसी स्वतंत्र तरीके से microdialysis अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है. इस प्रणाली को कक्षों या सेल खेती के लिए चैनल स्लाइड के कनेक्शन के लिए microtubing के साथ जोड़ा जाना चाहिए सूक्ष्म विश्लेषण के बाद.
उपर्युक्त दबाव नियंत्रक प्रवाह नियंत्रण प्रणाली है कि नमूना युक्त टैंक दबाव है, जो आसानी से एक microfluidic कक्ष में या एक चिप पर इंजेक्शन है. दबाव नियंत्रकों एक pulseless प्रवाह स्थापित कर सकते हैं और भी प्रवाह मीटर के साथ संयोजन में प्रवाह दर प्रदान करते हैं. प्रवाह स्विच matrices के साथ दबाव नियंत्रकों का एक संयोजन कोई वापस प्रवाह के साथ एक तेजी से प्रवाह स्विच सक्षम करें. यहाँ प्रस्तुत पुनर्परिचलन प्रणाली ने मानव संवहनी तंत्र26के लिए सामान्यतया रिपोर्ट किए जाने वाले कतरनी प्रतिबल मूल्यों की पीढ़ी को सक्षम किया . विवो संवहनी दीवार कतरनी तनाव में दीवार कतरनी दरों से अनुमान लगाया गया है के रूप में गैर आक्रामक दर्ज वेग प्रोफाइल से व्युत्पन्न, और बड़े धमनियों में पूरे रक्त चिपचिपापन और धमनी26में प्लाज्मा चिपचिपापन . रेनेमैन और होक्स ने फ्लोरोसेंट फ्लो वेग अनुरेखकों26का उपयोग करके ऑप्टिकल तकनीकके माध्यम से विशेष रूप से डिजाइन किए गए अल्ट्रासाउंड प्रणाली का उपयोग करके और आर्टेरियोल्स में बड़ी धमनियों में वेग प्रोफाइल दर्ज किए . ग्रीवा धमनी में 11-13 डाइन/सेमी2 का औसत कतरनी तनाव पहुंच जाता है, जबकि बाहु धमनी में केवल 4-5 डाइन/सेमी2 होता है। ग्रीवा धमनी के लिए 25-70 डाइन/सेमी2 तक के पीक मूल्यों की निगरानी की गई है। छोटी और मध्यम शिराओं के अपरूपण प्रतिबल मान 0ण्1 तथा0ण्5 डाइन/ यहाँ वर्णित microfluidic प्रणाली में, लागू कतरनी तनाव मूल्य चयनित perfusion ट्यूबिंग व्यास पर निर्भर करता है, चैनल स्लाइड की ऊंचाई, और fluidic माध्यम की चिपचिपापन इस्तेमाल किया. चयनित तरल सेटिंग की ऊँचाई 0.4 सेमी (100 डिग्री की मात्रा) के साथ एक स्लाइड से बना था, जिसकी लंबाई 50 बउ और व्यास में 1.6 मिमी के परफ्यूजन सेट के संयोजन में थी और मध्यम चिपचिपापन 0.0072 [dyn]s/cm2था। यह सेटिंग 3.8 डिग्री 33.9 एमएल/मिनट की प्रवाह दरों पर 3.5 और 31.2 dyn/cm2 के बीच एक कतरनी तनाव रेंज के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, दबाव पंप सॉफ्टवेयर नियंत्रण एक स्पंदित मध्यम प्रवाह है कि एक स्पंदित धमनी रक्त प्रवाह की नकल कर सकता लागू कर सकते हैं.
इस संयुक्त microfluidic संक्रमण विधि के सफल, विश्वसनीय, और reproduible उपयोग कुछ सावधानियों कि मन में रखा जाना चाहिए की आवश्यकता है. माइक्रोफ्लूइडिक शर्तों के तहत संक्रमण प्रक्रिया के दौरान, सेल परत को न्यूमोलिसिन जैसे साइटोटॉक्सिक या साइटोलिटिक बैक्टीरियल यौगिकों से अवगत कराया जा सकता है, जो यूकैरियोटिक सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है और स्लाइड सतह के सेल पालन को कमजोर करता है। इसलिए, प्रयोग के पूरे पाठ्यक्रम में एक निरंतर प्रवाह रखने की आवश्यकता है और सेल आकारिकी की अखंडता अक्सर निगरानी की जानी चाहिए. इसके अलावा, प्रवाह संस्कृति माध्यम endothelial कोशिकाओं के लिए सभी आवश्यक पोषक तत्वों प्रदान करने के लिए संक्रमण प्रयोग के दौरान कोशिकाओं की एक तंग सतह लगाव सुनिश्चित करना चाहिए. फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि मध्यम की खुराक पदार्थ है कि हस्तक्षेप या बैक्टीरिया और विशिष्ट मेजबान प्रोटीन के बीच बातचीत को बाधित हो सकता है होते हैं. उदाहरण के लिए न्यूमोकॉकस-वीडब्ल्यूएफ बातचीत के अध्ययन में, हेपरिन को सेल कल्चर मीडियम से समाप्त किया जाना चाहिए, क्योंकि यह न्यूमोकोकी की बाइंडिंग को वीडब्ल्यूएफ8तक रोकता है।
एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रवाह संस्कृति में एक और महत्वपूर्ण कदम तंग सेल आसंजन का रखरखाव है, जो समग्र सेल जीवन शक्ति पर और भेदभाव के स्तर पर निर्भर करता है। प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के शीने प्रवाह-प्रतिरोधी सेल आसंजन केवल तभी प्राप्त किया गया था जब कोशिकाओं को कतरनी तनाव के संपर्क में आने से पहले सख्ती से उपसंवितता में रखा गया था। दूसरी ओर, WPB का उत्पादन सीधे एंडोथेलियल सेल परत के संगम पर निर्भर करता है तंग सेल-सेल-संपर्क13को बढ़ावा देने के लिए. प्राथमिक endothelial कोशिकाओं के microfluidic सेल संस्कृति का लाभ दृढ़ता से प्रेरित सेल प्रसार है कि जल्दी से प्रवाह की स्थिति के तहत एक confluent सेल परत के गठन की ओर जाता है शामिल हैं. कोशिकाओं को कसकर एक दूसरे से जुड़े हुए हैं, सामूहिक रूप से प्रवाह की दिशा में उन्मुख हैं, और एक अत्यधिक विभेदित phenotype है कि स्रावी WPB उत्पादन के लिए आवश्यक है प्रतिनिधित्व करते हैं. ये WPB VWF के लिए भंडारण vesicles के रूप में सेवा, vasodilation उत्प्रेरक, और cytokines कि हिस्टामाइन उत्तेजना या न्यूमोलिसिन गतिविधि27,13पर प्रोटीन फटने के रूप में exocytosed हैं . इसलिए, कम प्रसार मार्ग में विभेदित प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की एक उच्च चिपकने वाला, confluent सेल परत की पीढ़ी कुशल VWF रिलीज और सेल सतह पर VWF तार के गठन के लिए एक अनिवार्य शर्त है और प्रवाह की स्थिति में बैक्टीरिया-VWF-इंटरैक्शन का विश्लेषण करता है। इस प्रकार, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एंडोथेलियल कोशिकाओं के भेदभाव ने कम से कम 48 एच प्रवाह खेती की और पंप दबाव में किसी भी बदलाव के बिना एक निरंतर कतरनी प्रवाह की आवश्यकता होती है। किसी भी बदलाव से अचानक मध्यम विस्फोट हो सकता है, जो कोशिकाओं को स्लाइड से बाहर निकाल देगा। इसके अलावा, सूक्ष्म दृश्य के दौरान microfluidic स्लाइड और पंप प्रणाली के मध्यम जलाशयों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर रखा जाना चाहिए के रूप में यह मानव कोशिकाओं के तापमान इष्टतम का प्रतिनिधित्व करता है.
अमर मानव सेल लाइनों कई वैज्ञानिक प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं और अक्सर सेल संस्कृति संक्रमण अध्ययन में कार्यरत हैं. इन सेल लाइनों कुछ सामान्य तकनीकी लाभ का हिस्सा है, इस तरह के कम या मध्यम संस्कृति आवश्यकताओं और असीमित प्रसार के रूप में, जो आकृति विज्ञान या रिसेप्टर प्रोफाइल में महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना कई सौ बार passaging सक्षम बनाता है. हालांकि, इन सेल लाइनों एक एकल मोनोकल्चर का प्रतिनिधित्व करते हैं और कृत्रिम दो आयामी विकास की स्थिति के अधीन हैं. 28 लापता शारीरिक स्रोत ऊतक पर्यावरण संस्कृति29के हर अंश के साथ कार्यात्मक और रूपात्मक कोशिका phenotype के पर्याप्त परिवर्तन में परिणाम . अन्य जीवाणु आसंजन प्रयोगों से पहले, सतह उजागर सेल प्रकार विशिष्ट मार्कर प्रोटीन और विभिन्न सेल संस्कृति मार्ग पर मानव प्राथमिक फेफड़ों endothelial कोशिकाओं के रिसेप्टर्स की प्रोफ़ाइल निर्धारित किया गया था. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सेल passaging के आठ दौर के भीतर इस तरह के प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु 1 (PECAM1) के रूप में विशिष्ट सतह प्रोटीन की एक दृढ़ता से कम अभिव्यक्ति से पता चला। इसके अलावा, व्यक्त integrin रिसेप्टर प्रोफ़ाइल काफी एक सेल प्रकार-अविशिष्ट integrin रिसेप्टर पैटर्न और एक कम सेल प्रकार-विशिष्ट integrin रिसेप्टर पैटर्न (Bergmann एट अल., अप्रकाशित डेटा) के पक्ष में उच्च सेल मार्ग में बदल गया था. ये परिणाम संक्रमण जीव विज्ञान के अध्ययन में रोगज़नक़-होस्ट इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं। phenotypic सेल विशेषताओं और जीवाणु संक्रमण के समय microfluidic सेल संस्कृति के दौरान कार्यात्मक भेदभाव के एक उच्च स्तर को बनाए रखने के उद्देश्य के साथ, कई दाताओं से प्राथमिक endothelial कोशिकाओं को इस मामले में चुना गया था और केवल इस्तेमाल किया अधिकतम पांच मार्ग तक, यथासंभव विशिष्ट लक्षणों को रखनेके लिए .
प्रवाह के दौरान बैक्टीरिया और विशिष्ट कोशिका सतह संरचनाओं के संयुक्त दृश्य एक अनुकूलित फ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल की आवश्यकता है। सीधे लेबल प्रोटीन के विभिन्न संयोजनों का उपयोग करना, फ्लोरोसेंट प्रोटीन-प्रव्यक्त करने वाले बैक्टीरिया, और फ्लोरोसेंट-संयोजित एंटीबॉडी, इम्यूनोफ्लोरेसी धुंधला प्रक्रियाओं को विशेष रूप से दृश्य लक्ष्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इन प्रक्रियाओं से एक परिभाषित और स्पष्ट सूक्ष्म दृश्य को समर्थ बनाया जा सकता है और जीवाणु पालन और आंतरिककरण3,13, 30,31का विभेद और परिमाणीकरण भी होता है . आंतरिक बैक्टीरिया का इम्यूनोफ्लोरेस-आधारित पता लगाने के लिए एक सेल permebilization कदम जैसे कि एक छोटी ट्राइटन एक्स-100 ऊष्मायन की आवश्यकता होती है, जो सेल टुकड़ी का कारण बन सकती है। इसलिए, एक प्रवाह संस्कृति में होने वाली जीवाणु आंतरिककरण प्रक्रियाओं का पता लगाने के बाद प्रवाह ऊष्मायन PFA-crosslinked नमूनों का उपयोग कर visualized किया जाना चाहिए. प्रवाह में बैक्टीरिया के वास्तविक समय दृश्य के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त आनुवंशिक रूप से संशोधित बैक्टीरिया का उपयोग एक त्वरित और लक्षित सूक्ष्म पता लगाने में सक्षम बनाता है। RFP-एक्सप्रेसिंग न्यूमोकॉकस उपभेदों कि एक कुशल आनुवंशिक केजोस और Veening द्वारा डिजाइन निर्माण का उपयोग कर उत्पन्न किया गया16,8 इस प्रयोगात्मक अध्ययन में इस्तेमाल किया गया. प्रवाह में VWF तार का पता लगाने के लिए, विभिन्न VWF-विशिष्ट fluorescein-लेबल एंटीबॉडी का परीक्षण किया गया और इस्तेमाल किया जा सकता है. एक कम से कम विशिष्ट पृष्ठभूमि पर एक इष्टतम संकेत प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए, पर्याप्त एंटीबॉडी एकाग्रता लगातार प्रत्येक लागू एंटीबॉडी के लिए titated था.
सूक्ष्म लाइव सेल इमेजिंग के लिए, तरल इकाई और चैनल स्लाइड को सीओ2 इनक्यूबेटर से हटा दिया जाता है और माइक्रोस्कोप पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed कक्ष में रखा जाता है। इस कक्ष को 5% सीओ2में समायोजित नहीं किया जा सका . एक कार्बोनेट-बफर वातावरण के बिना, HUVEC आकृति विज्ञान और जीवाणु फिटनेस 180 मिनट तक के लिए बरकरार रहे, जो VWF-मध्यस्थ जीवाणु पालन के विश्लेषण के लिए पर्याप्त है. यदि लंबे समय तक संक्रमण के समय और एक सीओ2 इनक्यूबेटर के बाहर सूक्ष्म निगरानी की आवश्यकता होती है, तो अपर्याप्त सीओ2 एकाग्रता के कारण पीएच बदलाव की क्षतिपूर्ति करने के लिए एक बफर सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, पूरे सिस्टम सूक्ष्म दृश्य की एक समय श्रृंखला के चरणों के बीच में सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखा जा सकता है.
वास्तविक समय में फ्लोरोसेंट का पता लगाने के अलावा, चैनल स्लाइड के भीतर एंडोथेलियम के जीवाणु संक्रमण को रोका जा सकता है और एक निर्धारण पदार्थ के रूप में पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ मध्यम विनिमय द्वारा संरक्षित किया जा सकता है। प्रवाह में निर्धारण के बाद, चैनल स्लाइड के भीतर सेल सतह के अनुकूलित और stepwise इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला मूल्यवान सूक्ष्म स्नैपशॉट visualizations की पीढ़ी सक्षम बनाता है और एक बहुमुखी संयुक्त संरचना का पता लगाने प्रदान करता है बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच बातचीत में शामिल विशिष्ट सेलुलर यौगिकों. इस संयुक्त विधि का वैज्ञानिक लाभ यह है कि पीएफए-उपचारित चैनल स्लाइड को भंडारित किया जा सकता है और ब्याज की संरचनाओं के पोस्ट-फ्लो इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयोग किया जा सकता है। पीएफए उपचार बैक्टीरिया को निष्क्रिय करता है और इस प्रकार आरएफपी प्रोटीन की अभिव्यक्ति को गिरफ्तार करता है। इसलिए, एक न्यूमोकॉकस-विशिष्ट एंटीसेरम जीवाणु प्रतिरक्षा का पता लगाने के लिए खरगोश में उत्पन्न किया गया था और दृश्य एक खरगोश विशेष AlexaFluor568-संयोजित माध्यमिक एंटीबॉडी8का उपयोग कर के साथ किया गया था। जैसा कि पहले ही उल्लेख किया है, विभिन्न एंटीबॉडी संयोजन के उपयोग एंटीबॉडी मात्रा और अवरुद्ध बफर संरचना का एक सटीक अनुकूलन की आवश्यकता है. अन्यथा, unspecific पृष्ठभूमि संकेतों और पार का पता लगाने प्रभाव कृत्रिम धुंधला परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. एक अनुकूलित इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रक्रिया का उपयोग कई अलग - अलग सेलुलर लक्ष्यों जैसे एक्टिन साइटोस्केलेटन या एंडोसोमल मार्कर13,31का पता लगाने के लिए आसानी से किया जा सकता है .
इस प्रक्रिया को एक और अधिक जटिल ऊतक वातावरण है कि एक हिस्टोलॉजिक, शारीरिक, और देखने के कार्यात्मक बिंदु से शरीर क्रिया विज्ञान mimics बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. प्रस्तुत संक्रमण विश्लेषण कुशलता से एक perfusion सेट करने के लिए कई चैनल स्लाइड की एक लाइन कनेक्शन का उपयोग करके एक ही समय में कई वैज्ञानिक सवालों के जवाब देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विस्तारित सेट अप समानांतर में एक ही प्रवाह सेटिंग के भीतर विभिन्न सेल प्रकार, सेल संगम, और विभिन्न स्लाइड-कोटिंग्स के विश्लेषण की सुविधा होगी और विभिन्न प्रकार के सेल संक्रमण के जीवाणु संक्रमण की सीधी तुलना की अनुमति होगी। इसके अलावा, लाइन कनेक्शन और कई चैनल स्लाइड के संयुक्त विश्लेषण में धारावाहिक भी समय श्रृंखला प्रयोगों की संभावना है, जो जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा के लिए लागू किया जा सकता है प्रदान करता है (उदाहरण के लिए, संक्रमण समय पर निर्भर उग्रता कारक का विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति).
संक्रमण विश्लेषण भी एक निरंतर स्तरीय प्रवाह हालत कई दिनों या सप्ताह तक चलने के लिए एक लंबी अवधि के पुराने संक्रमण चरण नकल की स्थिति में सेलुलर प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. प्रस्तुत एकल कोशिका प्रकार की संस्कृति के अतिरिक्त, माइक्रोफ्लूइडिक सेल कल्चर उपकरणों में विषमप्रय कोशिका संवर्धन के कुछ उदाहरण पहले ही32,33सूचित किए जा चुके हैं। यह उच्च थ्रूपुट औषधीय अध्ययनों के लिए अनुमति देता है और इसके परिणामस्वरूप अपक्षयी प्रयोजनों के लिए माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग भीहोसकता है .
सारांश में, प्रतिरक्षा धुंधला प्रक्रियाओं के साथ संयोजन में microfluidic प्रणाली एक वातावरण है कि संवहनी प्रणाली के भीतर शर्तों simulates में बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच pathomechanisms के विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान मॉडल के रूप में सेवा की.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस परियोजना को डीएफजी (बीई 4570/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of >2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| Histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| Reaction tubes 1.5/2.0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| Reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| Serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
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