Summary
Questo studio descrive il monitoraggio microscopico dell'aderenza allo pneumococco alle stringhe del fattore von Willebrand prodotte sulla superficie di cellule endoteliali primarie umane differenziate sotto stress da taglio in condizioni di flusso definite. Questo protocollo può essere esteso alla visualizzazione dettagliata di specifiche strutture cellulari e alla quantificazione dei batteri applicando procedure di immunostaining differenziale.
Abstract
L'interazione di Streptococcus pneumoniae con la superficie delle cellule endoteliali è mediata nel flusso sanguigno attraverso proteine meccanosensibili come il Von Willebrand Factor (VWF). Questa glicoproteina cambia la sua conformazione molecolare in risposta allo stress da taglio, esponendo così i siti di legame per un ampio spettro di interazioni ospite-ligando. In generale, la coltura delle cellule endoteliche primarie sotto un flusso di taglio definito è nota per promuovere la differenziazione cellulare specifica e la formazione di uno strato endoteliale stabile e strettamente collegato simile alla fisiologia del rivestimento interno di un vaso sanguigno . Pertanto, l'analisi funzionale delle interazioni tra patogeni batterici e la vascolatura ospite che coinvolge proteine meccanosensibili richiede l'istituzione di sistemi di pompaggio in grado di simulare le forze di flusso fisiologico note per influenzare la superficie cellule vascolari.
Il dispositivo microfluidico utilizzato in questo studio consente un ricircolo continuo e senza impulsi dei fluidi con una portata definita. Il sistema di pompaggio a pressione dell'aria controllato dal computer applica una sollecitazione di taglio definita sulle superfici delle cellule endote generando un flusso medio continuo, unidirezionale e controllato. I cambiamenti morfologici delle cellule e dell'attaccamento batterico possono essere monitorati e quantificati al microscopio nel flusso utilizzando speciali vetrini di canale progettati per la visualizzazione microscopica. A differenza dell'infezione da coltura cellulare statica, che in generale richiede una fissazione del campione prima dell'etichettatura immunitaria e delle analisi microscopiche, i vetrini microfluidici consentono sia il rilevamento basato sulla fluorescenza di proteine, batteri e componenti cellulari dopo la fissazione del campione; colorazione dell'immunofluorescenza seriale; e rilevamento diretto basato sulla fluorescenza in tempo reale. In combinazione con batteri fluorescenti e anticorpi specifici con etichettatura a fluorescenza, questa procedura di infezione fornisce un efficiente sistema di visualizzazione di componenti multipli per un enorme spettro di applicazioni scientifiche relative ai processi vascolari.
Introduction
La patogenesi delle infezioni da pneumococco è caratterizzata da un'interazione sfaccettata con una diversità di composti di matrice extracellulare e componenti dell'emostasi umana, come plasminogen e VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. La VWF glicoproteina multidominio funge da regolatore chiave di un'emostasi bilanciata mediando il reclutamento di trombociti e l'incorporazione di fibrina nel sito di formazione di trombosi vascolare9. L'importanza del VWF funzionale e attivo per il controllo delle emorragie e la guarigione delle ferite è dimostrata dalla malattia di von Willebrand, un comune disturbo ereditario del sanguinamento10.
Il VWF globulare circola nel sistema sanguigno umano ad una concentrazione fino a 14,0 g/mL11,10. In risposta alle lesioni vascolari, il rilascio locale di VWF da parte di Weibel Palade Bodies (WBP) endoteliale è notevolmente aumentatodi 11,12. Studi precedenti dimostrano che l'aderenza allo pneumococco alle cellule endoteliali umane e la sua produzione della pneumolysin tossina che formano i pori stimola noannamente la secrezione VWF luminale13. Le forze idrodinamiche del flusso sanguigno inducono un'apertura strutturale dei domini VWF meccanorenti. Con una portata di 10 dyn/cm2 il VWF si multimerisce a lunghe stringhe proteiche fino a diverse centinaia di micrometri di lunghezza che rimangono attaccate al subendotelio10,12.
Per comprendere la funzione delle stringhe VWF multimeriche generate sotto stress da taglio nell'interazione dello pneumococco con la superficie endoteliale, è stato stabilito un approccio di infezione da coltura cellulare basato su microfluidica. È stato utilizzato un dispositivo microfluidico con un sistema di pompa a pressione dell'aria controllato dal software. Ciò ha permesso un continuo, unidirezionale ricircolo del mezzo di coltura cellulare con una portata definita. Di conseguenza, il sistema ha applicato una sollecitazione di taglio definita sulla superficie delle cellule endoteliali, che sono rimaste attaccate all'interno di vetrini di canale specializzati. Questo approccio ha permesso la simulazione della forza di taglio all'interno del flusso sanguigno del sistema vascolare umano, in cui le stringhe VWF vengono generate su cellule endoteliali differenziate in condizioni di flusso costante definite. A tale scopo, le cellule endoteliali sono state coltivate in specifici vetrini di canale (vedi Tabella dei materiali), che sono stati adattati per analisi microscopiche durante il flusso. Il sistema di pompaggio microfluidico ha fornito la situazione di sollecitazione di taglio altamente definita e controllata necessaria per la formazione di corde VWF estese sullo strato di cellule endoteliali confluenti. Dopo la stimolazione della secrezione di VWF delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) coltivate confluentemente dal completamento dell'istamina, la formazione delle corde è stata indotta applicando uno stress da taglio di 10 disiniettorio2. La sollecitazione di taglio è definita come la forza che agisce sul livello della cella. Viene calcolato approssimativamente secondo Cornish et. al.14 con l'equazione 1:
Dove , e lo stress da taglio in dyn/cm2, la viscosità (dyn s)/cm2, h , la metà dell'altezza del canale, la larghezza del canale e la metà della larghezza del canale e la linea di flusso in mL/min.
Il risultato dell'equazione 1 dipende dalle diverse altezze e larghezze delle diverse diapositive utilizzate (vedere Tabella dei materiali). In questo studio è stata utilizzata una diapositiva di canale Luer di 0,4 m risultante in un fattore di scorrimento della camera di 131,6 (vedere la formula 2).
La viscosità del mezzo a 37 gradi centigradi è 0,0072 dynos/cm2 ed è stata utilizzata una sollecitazione di taglio di 10 dini/cm2. Ciò ha comportato una portata di 10,5 mL/min (vedi formula 3).
Qui, l'adattamento e l'avanzamento di una procedura di coltura cellulare microfluidica utilizzando un sistema di flusso laminare unidirezionale per l'indagine e la visualizzazione dei meccanismi di infezione batterica nella vascolatura ospite è descritto in dettaglio. La generazione di stringhe VWF su strati endoteliali può essere stimolata anche utilizzando altri sistemi di pompaggio in grado di applicare una sollecitazione di taglio continua e costante15.
Dopo la coltivazione di cellule endoteliali primarie alla confluenza nel flusso e nella stimolazione della formazione delle corde VWF, gli pneumococci che esprimono la proteina di fluorescenza rossa (RFP)16 sono stati aggiunti allo strato di cellule endoteliali sotto costante controllo microscopico. L'attaccamento dei batteri alle stringhe VWF sulla superficie delle cellule endoteliali è stato visualizzato e monitorato al microscopio per un massimo di tre ore in tempo reale utilizzando anticorpi con etichettafluenza specifica VWF. Con questo approccio, il ruolo del VWF come cofattore di adesione che promuove l'attaccamento batterico all'endotelio vascolare è stato determinato8.
Oltre alla visualizzazione microscopica della secrezione proteica e ai cambiamenti conformazionali, questo metodo potrebbe essere utilizzato per monitorare singoli passaggi dei processi di infezione batterica in tempo reale e per quantificare la quantità di batteri collegati in diversi punti temporali di infezione. Lo specifico sistema di pompe software-controllato offre anche la possibilità di coltura le cellule endoteliali in condizioni di flusso costante definite per un massimo di diversi giorni e consente un'incubazione a flusso medio pulsato definito. Inoltre, questo metodo può essere applicato utilizzando diversi tipi di cella. L'adattamento del protocollo di colorazione consente anche il rilevamento e la visualizzazione di batteri interiorizzati in cellule eucariotiche.
Questo manoscritto descrive questo protocollo sperimentale avanzato che può essere utilizzato come approccio definito, affidabile e riproducibile per una caratterizzazione efficiente e versatile dei processi patofisiologici.
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Protocol
La coltivazione delle cellule microfluidiche è stata eseguita con cellule endoteliali otiliarie primarie commerciali (HUVEC). L'azienda ha isolato le cellule con il consenso informato del donatore. Questo studio è stato approvato dalla Camera etica dei medici del Baden-Wuerttemberg dello Stato federale con il numero di referenza 219-04.
NOT: Vedere Tabella dei materiali per le forniture di protocollo.
1. Precoltivazione delle cellule primarie
- Scongelare una fiala glicerol congelata contenente 1 x 105 HUVEC primario da tre donatori diversi delicatamente a 37 s e seminare le cellule in 7 mL di mezzo di crescita delle cellule endoteliali preriscaldate (ECGM, pronto per l'uso con integratori) in un flacone di 25 cme 2.
NOT: Le cellule endoteliali primarie perdono capacità di differenziazione dopo più di 5 cicli di proliferazione. Pertanto, solo le cellule con meno di 5 passaggi possono essere utilizzate se sono necessari alti gradi di differenziazione cellulare. - Coltivare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera di CO2 del 5% per 60 min per consentire l'attaccamento superficiale e scambiare il mezzo di coltura cellulare ECGM per eliminare i residui della crioconservazione.
- Continuare a coltivare le cellule a 37 gradi centigradi nell'atmosfera di CO2 del 5% fino a formare uno strato di cellule subconfluenti.
NOT: L'HUVEC non deve crescere fino a diventare uno strato confluente poiché i contatti cellulari stretti impediscono la formazione di uno strato cellulare stabile in seguito nel flusso.
2. Precoltivazione di Streptococcus pneumoniae
AVVISO: Streptococcus pneumoniae è un agente di livello 2 di biosicurezza e può essere coltivato solo nei laboratori di livello 2 di biosicurezza. Utilizzare una panca pulita classificata per il livello di sicurezza 2 per tutti i trattamenti batterici, evitare rigorosamente la formazione di aerosol e utilizzare una centrifuga con protezione dagli aerosol per la sedimentazione dei batteri.
- Inoculare una piastra di agar di sangue Columbia con Streptococcus pneumoniae clinica isolaATCC11733 derivata da uno stock di glicerolo costantemente conservato a -80 gradi centigradi e coltivare la piastra di agar durante la notte a 37 e 5% CO2.
- Preparare 40 mL di brodo liquido Todd Hewitt integrato con 1% di estratto di lievito (THY) e 15 mL di sterile fosfato-buffered (PBS) pH 7.4, per la coltivazione batterica e passaggi di lavaggio.
- Utilizzare un tubo sterile per la coltivazione batterica e inoculare il brodo di coltura liquida con massa batterica. Controllare la quantità di inoculazione mediante misurazione fotometrica di 1 mL aliquote a 600 nm rispetto al brodo liquido non inoculato come riferimento. Riempire la massa batterica nel brodo liquido fino a raggiungere una densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,15.
- Incubare il brodo liquido inoculato senza agitare a 37 e 5% di CO2 e determinare l'OD600 ogni 30 min misurando 1 mL di aliquote con cuvette di plastica.
- Non appena la coltura batterica ha raggiunto un OD600 di 0,4, che corrisponde alla fase di crescita esponenziale, centrifugare la sospensione della coltura batterica per 10 min a 1.000 x g a temperatura ambiente (RT).
NOT: Non permettere a una coltura di pneumococco di raggiungere un OD600 di più di 1,0, perché un'alta densità di coltura dello pneumococco è noto per innescare l'autolisi batterica, che potrebbe influenzare la forma fisica batterica complessiva. - Risospendere delicatamente i sedimenti batterici con PBS da 10 mL e di nuovo i sedimenti per 10 min a 1.000 x g a RT.
- Risospendere delicatamente i sedimenti batterici lavati in PBS da 1 mL e determinare l'OD600 di 10 -L della sospensione batterica utilizzando 1 mL di PBS come riferimento.
- Regolare la quantità di batteri in PBS in base a un OD600 di 2.0. Secondo il conteggio batterico precedentemente determinato, un OD600 di 2.0 corrisponde a 2 x 109 unità formanti colonia (CFU). Procedere immediatamente con la procedura di infezione per prevenire l'autolisi batterica.
3. Coltivazione di cellule endoteliali di HUVEC in condizioni microfluidiche
- Staccare le cellule endoteliali primarie dal pallone di coltura cellulare mediante proteolisi controllata. Eseguire i seguenti passaggi in un ambiente sterile utilizzando un banco pulito. Preparare un volume di 15 mL di PBS sterile per le fasi di lavaggio.
- Rimuovere l'ECGM da uno strato HUVEC coltivato in modo subconfluente e lavare lo strato cellulare con 10 mL PBS utilizzando una pipetta sierologica per sbarazzarsi del mezzo di coltura cellulare.
- Incubare l'HUVEC lavato con 3 mL di 37 gradi centigradi, soluzione di dissociazione cellulare preriscaldata per il distacco cellulare per 5 min a 37 gradi centigradi. Osservare il distacco delle cellule proteolitiche monitorando microscopico ogni minuto.
- Pipetta la sospensione cellulare staccata in un tubo contenente 7 mL di ECGM integrato con 2% siero di vitello fetale (FCS) per fermare la proteolisi e sedimentare le cellule per 3 min a 220 x g a RT.
- Rimuovere il supernatante e risospendere l'HUVEC in 250 gradi l di ECGM integrato con 5% FCS e 1 mM MgSO4. Utilizzare 10 volte la sospensione cellulare per il conteggio cellulare utilizzando una camera di conteggio delle celle Neubauer e regolare il numero di celle a 4 x 106 celle/mL ECGM integrato con 5% FCS e 1 mM MgSO4.
NOT: Per ogni esperimento di flusso saranno necessari 30 mL di mezzo ECGM integrati con 5% FCS e 1 mM MgSO4. Da qui in questo medio composizionino si chiama ECGMS-medium. L'aumento della concentrazione di FCS nel mezzo di coltura dal 2% al 5% supporta l'attaccamento cellulare e la vitalità cellulare delle semi HUVEC nella diapositiva del canale. Il mezzo integratori FCS e MgSO4 sostanzialmente stabilizzare l'attaccamento cellulare di HUVEC in condizioni di stress taglio.
- Seme e coltivare l'HUVEC in uno scivolo di canale. Lavorare in un ambiente sterile utilizzando un banco pulito. Le cellule saranno coltivate sotto stress da taglio per 2 giorni seguite da infezione da batteri e monitoraggio microscopico per altri 2 h.
- E' uno scivolo a canale, un set di perfusione di 1,6 mm di diametro e 50 cm di lunghezza, un'aliquota del mezzo ECGMS e un canale di Luer di 0,4 m di altezza, per 24 h in un'incubatrice con 5% di CO2 atmosfera a 37 gradi centigradi per ridurre il numero di bolle d'aria.
NOT: Questa procedura è consigliata per degas l'apparecchiatura plastica e per preriscaldare il mezzo, i tubi di perfusione, ei serbatoi. Se materiali o liquidi sono stati immagazzinati in RT o in frigorifero, i gas disciolti nella plastica e i liquidi saranno rilasciati quando vengono riscaldati nell'incubatrice durante l'esperimento. Appariranno poi le bolle di gas. Degassare tutti i componenti in plastica prima dell'esperimento eliminerà questo effetto. Ogni volta che il sistema viene estratto dall'incubatrice, il processo di assorbimento del gas ricomincia. Pertanto, lavorare rapidamente alla RT e non lasciare mai l'unità fluida al di fuori dell'incubatrice per periodi di tempo più lunghi. - Utilizzare una pipetta per iniettare 100 -L di una soluzione di gelatina di porcivi filtrata sterile del 2% in soluzione PBS in uno dei serbatoi di uno scivolo di canale equilibrato a temperatura. Incubare la soluzione di gelatina per 1 h a 37 gradi centigradi e sciacquare il canale del vetrino con 1 mL di PBS in condizioni sterili utilizzando una siringa Luer da 1 mL.
- Posizionare il vetrino a canale rivestito di gelatina su una sottile piastra di polistirolo o polistirolo per evitare un calo della temperatura della diapositiva. Aggiungere 100 l of the 4 x 106/mL SUSPENSION HUVEC con una siringa Luer da 1 mL nello scivolo.
NOT: Posizionare il vicolo di canale sulla superficie metallica fredda del banco pulito potrebbe diminuire la temperatura del fondo di scorrimento, generando così stress da freddo alle cellule endoteliali. Durante la pertintura cellulare tenere la diapositiva un po 'verso l'alto per consentire bolle d'aria salire e scomparire dall'interno della diapositiva. - Incubare il vetrino del canale con l'HUVEC per 60 min a 37 e 5% di CO2 e riempire i serbatoi medi ad entrambe le estremità del vetrino del canale con 60 ECGMS-medium ciascuno. Incubare per 1 h a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
- E' uno scivolo a canale, un set di perfusione di 1,6 mm di diametro e 50 cm di lunghezza, un'aliquota del mezzo ECGMS e un canale di Luer di 0,4 m di altezza, per 24 h in un'incubatrice con 5% di CO2 atmosfera a 37 gradi centigradi per ridurre il numero di bolle d'aria.
- Regolare la pompa microfluidica e le impostazioni del software.
- Collegare il set di perfusione equilibrata all'unità pompa, riempire con 13,6 mL di ECGMS-medio, e avviare il software di controllo della pompa. Selezionare il set di perfusione adeguato e il tipo di diapositiva della camera utilizzando le finestre scorrevoli verso il basso nel menu dell'unità fluidica impostata. Scegliete 0,007 (dyn s/cm2) nel software per una viscosità media. (Fare riferimento alle impostazioni del software della pompa di pressione contrassegnate con frecce rosse nella figura 1 supplementare).
- Al di fuori dell'incubatrice, collegare una bottiglia di vetro riempita con perline di silice essiccanti al tubo di pressione dell'aria (fare riferimento alla Figura 1, Inset 3). L'aria della pompa di pressione circola tra i serbatoi di perfusione e la pompa e deve essere asciutta prima di rientrare nel dispositivo di pompaggio. Selezionare Parametri di flusso nel menu del software, impostare la pressione a 40 mbar e lavare i tubi della pompa con il mezzo liquido avviando il flusso medio continuo. (Queste impostazioni sono indicate anche da frecce rosse nella figura supplementare 1).
- Programmare i cicli di sollecitazione di taglio desiderati di coltivazione del flusso. Iniziare con 5 dyn/cm2, controllare pompaggio serbatoio bilanciato e assicurare che nessuna bolla d'aria circolano nel sistema di pompaggio.
NOT: La sollecitazione di taglio a parete in una diapositiva di canale dipende dalla portata e dalla viscosità del mezzo perfusione. Se si utilizza un altro sistema di pompaggio, fare riferimento alle equazioni descritte nell'introduzione per impostare una portata che genera il livello di sollecitazione di taglio desiderato. Le impostazioni descritte corrispondono a una portata di 5,42 mL/min. (una schermata esemplare che mostra le impostazioni appropriate dei parametri di flusso nel software della pompa di pressione è mostrata nella figura supplementare 2). - Arrestare la circolazione del flusso nel software di controllo della pompa e mantenere il flusso medio nel tubo di perfusione bloccando i tubi vicino ai collegamenti Luer. Collegare lo scivolo del canale, evitando così le bolle d'aria, e posizionare l'unità fluida con la diapositiva di canale collegata in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi e 5% di CO2. Iniziare la sollecitazione di taglio a 5 dyn/cm2 per 30 min per adattare agevolmente le cellule alle forze generate dallo stress di taglio prima di accelerare il livello di sollecitazione di taglio (vedere Figura supplementare 3).
NOT: Fare attenzione che nessuna bolla d'aria rimanga nel sistema di tubi o nel vetrino dopo il collegamento al sistema di tubi perché il movimento delle bolle d'aria nel flusso potrebbe portare al distacco delle cellule. - Accelerare lo stress di taglio a 10 dyn/cm2 (che corrispondono a 10,86 mL/min in questa impostazione di flusso) e incubare il flusso del canale in sollecitazione di taglio continua per 48 h in una piccola incubatrice di CO2 a 37 e 5% CO2 per consentire la differenziazione cellulare ( i rispettivi settinngs software sono indicati con frecce rosse nella Figura 4 supplementare).
NOT: Le cellule HUVEC tendono a staccarsi dalla superficie del canale se la coltivazione del flusso viene avviata direttamente a 10 dyn/cm2. Le cellule rimangono attaccate alla superficie della camera se la coltivazione del flusso viene avviata con meno sollecitazione di taglio utilizzando 5 dyn/cm2 per un minimo di 30 min seguito aumentando lentamente lo stress di taglio fino al desiderato 10 dyn/cm2. Una sollecitazione di taglio di 10 dyn/cm2 è il valore minimo in questa impostazione di perfusione necessaria per la formazione di stringhe VWF. - Dopo 24 h di coltivazione cellulare microfluidica, arrestare il flusso medio con il software di controllo della pompa esattamente quando viene raggiunto un livello medio bilanciato in entrambi i serbatoi medi. Mettere l'unità fluidica in un panca pulito e rimuovere 10 mL del mezzo di coltivazione circolato dei serbatoi di perfusione utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Aggiungere 10 mL di ECGMS-medium nei serbatoi per rinnovare il mezzo, rimettere l'unità fluida nell'incubatrice di CO2 a 37 e 5% di CO2e riavviare la coltivazione fluidica utilizzando il software di controllo della pompa.
NOT: La funzione della pompa di pressione può essere improvvisamente interrotta da macchine di laboratorio come grandi centrifughe, che potrebbero creare un forte disturbo del campo magnetico. Questa improvvisa interruzione potrebbe portare al distacco delle cellule. Fare attenzione che tali macchine non siano attive vicino alla pompa di pressione durante l'esperimento. - Iniziare il preriscaldamento della camera di incubazione della temperatura che copre lo stadio del microscopio a fluorescenza a 37 gradi centigradi per l'equilibratura della temperatura 24 h prima della visualizzazione microscopica. Dopo aver preriscaldato il microscopio, avviare il controllo software del microscopio e regolare le impostazioni principali per il monitoraggio microscopico a fluorescenza selezionando le impostazioni di filtro appropriate (540 nm/590 nm per il rilevamento dei batteri che esprimono RFP e 470 nm/515 nm per il rilevamento dell'emissione di fluoresceina degli anticorpi specifici di VWF coniugati FITC). Preriscaldare una camera di riscaldamento supplementare per l'incubazione dell'unità fluidica a 37 gradi centigradi.
NOT: Durante l'infezione analisi e monitoraggio microscopico la temperatura del vetrino del canale e il mezzo circolante non dovrebbe diminuire in modo sostanziale, perché questo genererebbe stress da freddo sulle cellule. In generale, la dimensione delle camere di temperatura che coprono lo stadio del microscopio non è sufficiente a coprire l'intera unità fluidica. Pertanto, si raccomanda l'uso di una camera di riscaldamento supplementare preriscaldata a 37 gradi centigradi. - Per la visualizzazione microscopica, posizionare l'unità fluida nella camera di riscaldamento preriscaldata da 37 gradi centigradi e posizionare lo scivolo del canale su uno stadio del microscopio preriscaldato a 37 gradi centigradi.
NOT: Per la visualizzazione microscopica, l'unità fluidica e lo scivolo canale dovevano essere rimossi dall'incubatrice di CO2 a causa della lunghezza limitata del tubo perfusione. Se i tempi di infezione e il monitoraggio microscopico superiore a 180 min sono necessari al di fuori dell'atmosfera di CO2 del 5% per il buffering del pH, è necessario utilizzare un mezzo tamponato per il pH per la coltivazione microfluidica. - Controllare la morfologia cellulare e l'integrità dello strato HUVEC prima dell'iniezione di istamina e batteri alla circolazione del flusso durante il tempo dell'esperimento di flusso e dopo aver terminato l'esperimento di flusso utilizzando la modalità campo luminoso del microscopio.
4. Induzione del rilascio VWF e visualizzazione di stringhe VWF multimerizzate
- Mantenere l'impostazione del flusso, poiché è necessaria una sollecitazione di taglio di 10 dyn/cm2 per attivare la multimerizzazione di VWF a stringhe lunghe fino a 200 MDa. Indurre il rilascio di VWF da WPB endoteliale iniettando 136 -L di una soluzione di stock di istamina da 100 mM nel mezzo ECGMS circolante nel tubo di perfusione utilizzando una porta di iniezione. La concentrazione finale di istamina nel mezzo di flusso sarà di 1 mM. Se non è disponibile alcuna porta di iniezione, l'istamina può essere aggiunta alternativamente pipettando nel mezzo dei serbatoi di pompaggio.
- Per il rilevamento immunofluorescenza di stringhe VWF multimerizzate, arrestare il flusso quando viene raggiunto un livello medio bilanciato nei serbatoi e iniettare 20 g di un anticorpo coniugato specifico di VWF in un volume di 200L PBS (pH 7.4) nel ECGMS-medium utilizzando una porta di iniezione. Se non è disponibile alcuna porta di iniezione, l'anticorpo può essere aggiunto alternativamente pipetting nel mezzo dei serbatoi di pompa. Ciò si traduce in una concentrazione finale di anticorpi di 1,3 g/mL.
- Per la scansione microscopica di diversi campi visivi in breve tempo, utilizzare l'unità di fluorescenza del microscopio con un dispositivo di fluorescenza Xenon al 30% di potenza e una fotocamera a epiorescenza. Monitorare la forma e la morfologia del livello HUVEC con la modalità campo luminoso per selezionare le celle rappresentative adatte per la visualizzazione delle stringhe VWF.
- Per la visualizzazione delle stringhe VWF fluorescenti verdi, selezionare un obiettivo di olio 63x/1.40 e un filtro di rilevamento di 470 nm nel menu dell'unità di fluorescenza del software al microscopio (LasX). Creare istantanee di stack z di almeno 50 viste di campo rappresentative, ognuna contenente circa 10 HUVEC morfologicamente intatto. Per la quantificazione delle stringhe VWF fluorescenti verdi in punti temporali diversi, eseguire la scansione di diversi campi visivi.
5. Valutazione microscopica dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF in flusso in tempo reale
-
Quantificare l'attaccamento pneumococcico alle stringhe VWF generate sulle superfici cellulari HUVEC tramite il rilevamento dell'immunofluorescenza.
- Tenere il flusso e iniettare pneumococci di 1,35 x 108 CFU/mL RFP in un volume massimo di 1 mL nel mezzo ECGMS utilizzando la porta di iniezione. In alternativa, pipette i batteri nel mezzo nel serbatoio della pompa. Riavviare lo stress di taglio a 10 dyn/cm2 per far circolare i batteri all'interno del sistema di pompaggio.
- Selezionare un obiettivo di immersione dell'olio 63x per l'ingrandimento del microscopio e regolare le impostazioni del filtro a fluorescenza nel software del microscopio sul canale RFP (filtro di rilevamento 540 nm) per il rilevamento di pneumococci che esprime RFP.
- Per la quantificazione dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF, arrestare il flusso e creare istantanee di stack z di almeno 30 viste di campo rappresentative, ognuna contenente circa 10 HUVEC morfologicamente intatti, e contare la quantità di pneumococci.
- Utilizzare l'algoritmo delle statistiche unfattoriali ANOVA per valutare i dati, seguito da un test di campione non accoppiato a due code post hoc per un confronto statistico dettagliato. I valori P di <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
6. Valutazione microscopica dell'attaccamento batterico alle corde VWF dopo la fissazione del campione
- Campionare la fissazione prima della colorazione dell'immunofluorescenza.
- Arrestare il flusso, rimuovere 10 mL di ECGMS-medio dai serbatoi di pompaggio, e aggiungere 10 mL di PBS integrato con 5% paraformaldeide (PFA). Lasciare circolare la soluzione PFA per 10 min ad uno stress di taglio di 10 dyn/cm2.
- Scollegare lo scivolo del canale dall'unità di pompa.
- Bloccare siti di legame non specifici sulla superficie cellulare ed eseguire il rilevamento immuno-rilevamento delle stringhe VWF e dei batteri collegati.
- Preparare 4 mL di una soluzione di lavaggio contenente 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) integrata con il 4% di saccarosio per tutte le fasi di lavaggio. Preparare 1 mL di una soluzione di blocco contenente 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) integrata con il 4% di saccarosio e il 2% di albumina di siero bovino (BSA) per il blocco di siti di legame non specifici.
- Lavare lo scivolo a canale 3x incubato pFA utilizzando una siringa Luer da 1 mL per iniettare 200 l della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo per 120 min a RT con soluzione di blocco di 200 .L.
- Preparare 4 mL di un'altra soluzione di blocco contenente 100 mM Na2CO3, (pH 9.2) integrata con il 4% di saccarosio e lo 0,5% di BSA per la diluizione degli anticorpi. Utilizzare 200 - L di questa soluzione di blocco per diluire l'antisiero di coniglio specifico per lo pneumococco 1:100. Utilizzare 200 l di questa soluzione di blocco per diluire l'anticorpo del mouse specifico di VWF 1:50 per creare una concentrazione di anticorpi specifica di VWF pari a 4 g/mL. Diluire l'anticorpo secondario coniugato AlexaFluor488 da una soluzione di riserva da 2 mg/mL 1:100 in 200 -L di PBS (pH 7.4) per generare una concentrazione finale di 20g/mL.
NOT: Nelle impostazioni di immunofluorescenza descritte, il rilevamento degli anticorpi ha fornito risultati ottimali quando gli anticorpi sono stati diluiti nel suddetto buffer di carbonato alcalino. Sulla base dei risultati precedenti, le soluzioni di blocco consigliate e la quantità di anticorpi sono adatte per molte applicazioni. Tuttavia, diversi esperimenti potrebbero richiedere l'ottimizzazione individuale della combinazione di anticorpi, concentrazione di anticorpi, tempo di incubazione e costituzione del buffer di blocco. In alternativa, un sistema con buffer di fosfato con un intervallo di pH neutro potrebbe essere adatto o addirittura preferito come buffer di incubazione. In caso di deboli segnali di fluorescenza, la concentrazione di anticorpi secondari dovrebbe essere aumentata. Se viene rilevato troppo rumore di fondo a fluorescenza non specifica, la quantità di sostanze bloccanti deve essere aumentata. - Per la colorazione VWF-immunofluorescence, lavare la diapositiva del canale utilizzando una siringa Luer da 1 mL iniettando 200 l della soluzione di lavaggio 3x e incubare il vetrino con l'anticorpo specifico VWF diluito 1:50 per 30 min a RT. In seguito, lavare nuovamente il canale 3x con 200 Ll della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo con l'anticorpo diluito AlexaFluor488-formigò specifico del mouse per 30 min a RT. Infine, lavare di nuovo lo scivolo del canale 3x con 200 l della soluzione di lavaggio.
NOT: Gli AlexaFluor-fluorofori sono sensibili allo sbiancamento. Pertanto, il vetrino deve essere protetto tenendolo in una camera oscura durante le fasi di incubazione con gli anticorpi coniugati a fluoroforo. - Per l'immunorilevamento degli pneumococchi, incubare lo scivolo con un anticorpo di coniglio specifico per pneumococcus diluito per 30 min a RT. Successivamente, lavare la diapositiva del canale 3x con 200 L della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo con 1:100 diluito Anticorpo specifico per coniglio coniugato AlexaFluor568 per 30 min a RT. Lavare nuovamente lo scivolo del canale 3x con 200 l della soluzione di lavaggio.
- Per macchiare il citoscheletro di actina cellulare con phalloidina fluorescente, permeabilizzare l'HUVEC per incubazione con 120 gradi L dello 0,1% Triton X-100 per 5 min a RT. Lavare lo scivolo del canale 3x con 200 gradi l della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo con 120 . Phalloidingiugone alfaficata AlexaFluor350. Questa fase di incubazione visualizzerà il citoscheletro actina polimerizzato e permetterà il monitoraggio della forma cellulare e dei possibili cambiamenti morfologici indotti dallo stress.
- Lavare lo scivolo del canale 3x con 200 l della soluzione di lavaggio. Infine, lavare la diapositiva 4x con 200 s L ddH2O e visualizzare le corde VWF fluorescenti verdi, i batteri fluorescenti rossi e il citoscheletro afluorescente blu utilizzando le impostazioni di filtro appropriate al microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
La culminazione dell'HUVEC primario in un flusso unidirezionale costante comporta la formazione di uno strato cellulare confluente e strettamente imballato che promuove la generazione di MDB cellulari riempiti con il VWF meccanosensibile13,14. Questo protocollo descrive l'uso di un sistema di ricircolo senza impulsi basato sulla pressione dell'aria per l'analisi delle infezioni che richiede di imitare la situazione di stress da taglio nel flusso sanguigno umano.
Questo sistema consente un'impostazione definita e controllata dal software delle condizioni di flusso. Lo schema di flusso nella Figura 1 illustra il flusso di lavoro principale, a partire dalla precoltivazione delle cellule endoteliali primarie (Figura 1, Inset 1) e la precoltivazione di pneumococci ( Figura1, Inset 2). Il sistema microfluidico applicato ( Figura1, Inset 3) è composto da una speciale diapositiva di canale che è collegata tramite un adattatore Luer a tubi di perfusione con due serbatoi medi. Il set di tubi perfusione è posto su un'unità fluida che funge da supporto e impiega i tubi di perfusione come sistema valvolare. Per la coltivazione del flusso, l'unità fluidica con il set di perfusione di media riempimento e il vetrino a canale collegato vengono collocati in un'incubatrice di CO2 (Figura 1, Inset 3). L'unità fluidica è collegata a una pompa di pressione dell'aria tramite tubi d'aria. L'aria nel tubo deve passare attraverso una bottiglia di essiccazione contenente perline di silice per la rimozione dell'umidità dai serbatoi di perfusione prima che l'aria venga ripompata nel sistema di pompaggio (Figura 1, Inset 3). La pompa di pressione dell'aria è controllata da un software per computer (PumpControl v1.5.0) che consente l'impostazione di una portata continua e definita a seconda del diametro del tubo del canale, della lunghezza e del diametro del set di tubi perfusione e della viscosità (Figura1, inset tolsa 3). La secrezione di VWF da parte di esocitosi WPB di HUVEC coltivata confluente è indotta dalla stimolazione dell'istamina8 applicata nella circolazione media nel tubo di perfusione utilizzando una porta di iniezione (Figura 1, Inset 4). Con uno stress minimo di taglio di 10 dyn/cm2,le proteine VWF rilasciate multimeralizzare e formare lunghe stringhe proteiche raggiungendo lunghezze superiori a 100 sm (Figura 1, Inset 4,5,6 e Figura 2A). Queste stringhe proteiche sono microscopicamente rilevate e visualizzate dopo l'iniezione di fluoresceina isothiocyanate (FITC) -sibilazione di anticorpi specifici VWF nel mezzo. Gli anticorpi circolanti consentono il rilevamento dell'immunofluorescenza delle stringhe VWF legate alla superficie cellulare in tempo reale(Figura 1, Inset 5)8.
L'approccio di infezione da coltura cellulare a base microfluidica consolidata utilizzando le cellule endoteliali primarie imita la situazione di una vascolatura infiammata localmente dopo l'infiltrazione della circolazione sanguigna da parte di pathobionti batterici come Lo Streptococcus polmonite. Esempi di visualizzazione e analisi quantitativa dell'interazione batterica con cellule vascolari differenziate sottoposte a stress di taglio mediante la coltivazione di cellule endoteliali microfluidiche (Figura 1, Insets 5,6). I pneumococchi che esprimono RFP sono stati iniettati nel flusso e dopo 30 min di circolazione, i primi segni di attaccamento batterico alle stringhe VWF stimolate all'istamina di HUVEC stimolato dall'istamina sono stati rilevati al microscopio (Figura 1, Insets 5,6 e Figura 2A, B frecce bianche)8. Pertanto, l'uso di pneumococci che esprime RFP ha permesso la quantificazione dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF sulle cellule endoteliali senza il requisito di rilevamento di anticorpi batterici.
I grafici sovrapposti all'istogramma delle intensità di fluorescenza sono stati generati utilizzando il software di valutazione fornito da Leica (cioè LasX) per visualizzare la co-localizzazione dei pneumocici che esprimono RFP con le corde VWF rilevate con anticorpi fluorescenti verdi. Ciò ha permesso un'analisi quantitativa della probabilità di co-localizzazione in specifiche regioni di interesse (ROI) all'interno dell'immagine a fluorescenza. Utilizzando sovrapposizioni di istogrammi di segnali batterici in combinazione con i segnali di fluorescenza del VWF, i picchi di fluorescenza sovrapposti per entrambi potrebbero essere visualizzati e quindi confermati l'attaccamento del pneumococcus alle stringhe VWF. L'attaccamento batterico resiste allo stress di taglio applicato continuamente per un minimo di 25 min (Figura 2B)8.
In sintesi, la coltivazione a flusso continuo di HUVEC primario ha permesso la secrezione VWF e la generazione di lunghe stringhe proteiche VWF che fungono da siti di adesione per i batteri circolanti8.
Figura 1: flusso di lavoro per l'analisi dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF mediante la coltivazione di cellule endoteliali microfluidiche. Flusso di lavoro dei principali passaggi sperimentali che iniziano con la precoltivazione delle cellule endoteliali primarie alla sottoconfluenza nei flaconi di coltura cellulare. Prima della coltivazione cellulare nel flusso, le cellule vengono semiate in uno scivolo di canale rivestito di gelatina (Inset 1). I batteri vengono coltivati su placche di agar seguite dalla coltivazione in una fase complessa da media a metà del tronco (Inset 2). Per la coltura cellulare microfluidica, uno scivolo di canale con cellule endoteliali è collegato ai tubi di perfusione di un'unità fluidica del sistema di pompaggio e sottoposto a un flusso costante per la differenziazione cellulare (Inset 3). La generazione delle corde VWF (freccia verde) è stata indotta dall'iniezione di istamina a uno stress di taglio di 10 dyn/cm2 e monitorata microscopicamente dal rilevamento dell'immunofluorescenza utilizzando anticorpi specifici VWF (Inset 4). Dopo l'iniezione di batteri che esprimono RFP al mezzo circolante, l'attaccamento allo pneumococco (freccia rossa) alle corde VWF è stato visualizzato al microscopio in tempo reale dall'emissione di fluorescenza a 450 nm(Inset 5). Dopo la fissazione delle cellule utilizzando PFA, l'colorazione differenziale dell'immunofluorescenza fornisce la visualizzazione dell'attaccamento batterico in specifici punti temporali di infezione (Inset 6). Sono incluse le immagini del sistema di pompaggio e dello strato di cellule HUVEC descritte nei passaggi 1, 3 e l'immagine della porta di iniezione (Inset 4). Le immagini di immunofluorescenza mostrate negli Inset 4 e 5 sono state modificate e utilizzate con il permesso di Jagau et al.8. Le lunghezze delle barre della scala sono indicate in basso a destra.
Figura 2: Immagini rappresentative immunofluorescenza del legame dello pneumococco alle stringhe VWF generate in flusso continuo sulla superficie dell'HUVEC stimolato dall'istamina. (A) La generazione delle corde VWF è stata quantificata al microscopio dopo aver esposto HUVEC coltivati confluenti per la sollecitazione di taglio utilizzando un sistema di pompa microfluidico a 10 dyn/cm2. Gli anticorpi specifici di VWF coniugati fitC hanno rilevato le stringhe VWF. Le frecce bianche indicano pneumococci che esprimono RFP con fluorescenza rossa attaccata a lunghe stringhe VWF. (B) L'attaccamento batterico alle stringhe VWF fluorescenti verdi è stato osservato al microscopio fino a 2 h a flusso costante (frecce bianche) ed è stato confermato dalla valutazione basata su software delle intensità di fluorescenza di un ROI definito. Le immagini in tempo reale sono state scattate con l'apparecchiatura a fluorescenza di un microscopio a scansione laser confocale (SP8, Leica). Barre della scala: 10 m. Questa cifra è stata modificata e utilizzata con il permesso di Jagau etal.
Figura supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La simulazione dell'interazione batterica con proteine ospiti meccanosensibili come VWF richiede un sistema di coltura cellulare perffubile che consente la generazione di un flusso definito, unidirezionale e continuo di liquidi, generando così uno stress di taglio affidabile . Sono già stati descritti diversi sistemi di pompe microfluidiche. Una revisione completa di Bergmann et al. riassume gli aspetti chiave dei diversi modelli di coltura cellulare bidimensionali e tridimensionali17.
La tecnologia microfluidica è una tecnica molto giovane iniziata nei primi anni '90 con lo sviluppo di microambienti controllabili, riproducibili e perfutilizzabili in un micrometro e persino in una scala nanometrica18. L'approccio microfluidico presentato può essere applicato anche per studiare l'ampia gamma di meccanismi di adesione batterica e proteine coinvolte. È più adatto per qualsiasi interazione che coinvolga componenti di adesione meccanoressimi come VWF, che in generale non sono raggiungibili utilizzando tecniche standard di coltura cellulare. Ad esempio, è noto che la conformazione di diverse proteine della matrice extracellulare varia a seconda della loro posizione. All'interno del sistema sanguigno, le glicoproteine come la fibronectina circolano in una conformazione globulare, mentre nella matrice extracellulare le proteine appaiono come scaffold multiconnessi e multimerici19,20. Inoltre, diversi distributori di apparecchiature microfluidiche offrono vetrini standardizzati di canale preririvestiti con diversi tipi di collagene (ad esempio, collageni subendoliali o altre proteine derivate dal plasma). Questi vetrini di canale sono adatti per la visualizzazione e l'analisi quantitativa dell'adesione batterica a specifiche proteine della matrice extracellulare in diverse situazioni di flusso.
Diversi sistemi microfluidici possono essere classificati in base ai diversi materiali utilizzati per la produzione di microdispositivi. A questo proposito, le piattaforme a base di vetro/silicone differiscono dalle piattaforme a base di polimeri e di carta21. I vetrini a canale polimerici sono prodotti con una superficie sostenuta elasticamente (ESS), generalmente richiedono un rivestimento superficiale per l'attacco cellulare durante gli esperimenti di flusso. In alternativa a un rivestimento con componenti che sostengono l'adesione come il collagene, la superficie di alcuni vetrini di canale disponibili in commercio è fisicamente modificata, il che crea una superficie idrofila e adesiva adatta alla maggior parte dei tipi di cellule. Inoltre, alcuni vetrini di canale sono generati utilizzando substrati come il polidimetilsiloxane (PDMS), che è permeabile all'ossigeno e consente anche la coltura di cellule dei vasi sanguigni sulla superficie interna dei microcanali nei sistemi di pompafluidia fluidici22, 23.
Il sistema microfluidico utilizzato in questi studi è servito come un sistema efficiente e affidabile che è stato applicato per l'analisi dell'interazione dello Staphylococcus aureus con fibre VWF multimerizzate dopo la coltura di cellule endoteliali umane nel flusso 24,25. Questo sistema microfluidico era un sistema chiuso di perfusione circolare che ha permesso l'analisi dell'infezione da batteri patogeni in condizioni di biosicurezza 2. Inoltre, i vetrini del canale erano adatti per il monitoraggio microscopico durante il flusso e sono disponibili con diversi prerivestimenti (ad esempio gelatina, poli-L-lyssina o collagene-IV) che garantiscono l'adesione cellulare e un alto grado di riproducibilità sperimentale. Questo protocollo utilizza un sistema microfluidico (cfr. tabella dei materiali) per la creazione di un modello di infezione perfutilizzabile per S. pneumoniae, imitando così la situazione del flusso all'interno del sistema vascolare umano8.
La procedura generale descritta di attaccamento delle cellule batteriche in questo sistema microfluidico può essere condotta anche con altri tipi di sistemi di pompazione che generano un flusso definito e continuo in un ambiente sterile. Per scopi microfluidici, vengono utilizzati principalmente quattro tipi di sistemi di controllo del flusso: i) pompe peristalitiche e pompe di ricircolo, che vengono utilizzate in questo protocollo, ii) pompe siringhe, iii) controller di pressione, e iv) controller di pressione con matrici di interruttore di flusso. Ogni tipo di sistema di controllo del flusso presenta vantaggi e svantaggi a seconda dell'applicazione microfluidica specifica e della capacità di eseguire la visualizzazione microscopica in tempo reale. Nella maggior parte delle applicazioni che richiedono una circolazione continua dei campioni, le pompe di ricircolo sono combinate con i controller di pressione basati su software per garantire una situazione di flusso definita. Questo è anche ottimizzato nel sistema di pompaggio dimostrato qui. I sistemi di pompaggio a base di siringhe possono essere suddivisi in pompe a siringa "classiche", che generano oscillazione del flusso, e pompe di siringhe microfluidiche "senza polso". Questi sistemi a base di pompa di siringa sono generalmente facili da usare, ma il controllo del flusso nei canali senza uscita è impegnativo utilizzando pompe di siringa. Inoltre, le variazioni di flusso all'interno del chip potrebbero richiedere del tempo ed è necessario un misuratore di flusso per determinare la portata. Anche le pompe di siringhe senza polso potrebbero generare una pulsazione periodica sulla portata a causa del motore passo-passo della pompa della siringa. Un altro dispositivo a pompa a due siringhe è in grado di generare un movimento fluido basato su "infusione e ritiro" che applica forze di taglio definite sulle superfici cellulari ed è adatto per applicazioni di microdialisi anche in modo indipendente dal PC. Questo sistema deve essere combinato con microtubing per il collegamento di camere o vetrini di canale per la coltivazione cellulare seguita da analisi microscopiche.
I controllori di pressione di cui sopra sono sistemi di controllo di flusso che pressurizzano il serbatoio contenente il campione, che viene iniettato senza problemi in una camera microfluidica o su un chip. I controllori di pressione possono stabilire un flusso senza impulsi e anche fornire portate in combinazione con i misuratori di flusso. Una combinazione di controller di pressione con matrici di interruttore di flusso consentono un commutatore di flusso veloce senza flussi indietro. Il sistema di ricircolo qui presentato ha permesso la generazione di valori di sollecitazione di taglio tipicamente riportati per il sistema vascolare umano26. Lo stress da taglio della parete vascolare in vivo è stato stimato dai tassi di taglio della parete come derivati da profili di velocità non registrati in modo invasivo e viscosità del sangue intero nelle grandi arterie e viscosità plasmatica nelle arteriole26. Reneman e Hoeks hanno registrato profili di velocità in grandi arterie utilizzando un sistema a ultrasuoni appositamente progettato e nelle arteriole tramite tecniche ottiche utilizzando traccianti di velocità del flusso fluorescente26. Nello stato di taglio medio di 11-13 dyn/cm 2 si raggiunge uno stress di taglio medio di 11-13 dyn/cm2, invece di soli 4-5 disfano/cm2 nell'arteria brachiale. Per l'arteria carotide sono stati monitorati valori massimi fino a 25-70 dyn/cm2. I valori di sollecitazione di taglio delle vene piccole e medie variano tra 0,1 e 0,5 dyn/cm2. Nel sistema microfluidico qui descritto, il valore di sollecitazione di taglio applicabile dipende dal diametro del tubo di perfusione selezionato, dall'altezza del vetrino del canale e dalla viscosità del mezzo fluidico utilizzato. L'impostazione fluidica selezionata era composta da una diapositiva con 0,4 cm di altezza (volume di 100 gradi) in combinazione con un set di perfusione di 50 cm di lunghezza e 1,6 mm di diametro e la viscosità media era di 0,0072 [dyns]/cm2. Questa impostazione è appropriata per un intervallo di sollecitazione di taglio compreso tra 3,5 e 31,2 dyn/cm2 a una velocità di flusso di 3,8,33 mL/min. Inoltre, il controllo software della pompa di pressione può applicare un flusso medio pulsato che potrebbe imitare un flusso sanguigno arterioso pulsato.
L'uso riuscito, affidabile e riproducibile di questo metodo combinato di infezione microfluidica richiede alcune precauzioni che devono essere tenute a mente. Durante il processo di infezione in condizioni microfluidiche, lo strato cellulare potrebbe essere esposto a composti batterici citotossici o citolitici come la pneumolisina, che influenzano la vitalità delle cellule eucariotiche e indeboliscono l'aderenza cellulare alla superficie del vetrino. Pertanto, è necessario mantenere un flusso costante per tutto il corso dell'esperimento e l'integrità della morfologia cellulare deve essere monitorata frequentemente. Inoltre, il mezzo di coltura del flusso dovrebbe fornire tutti i nutrienti essenziali alle cellule endoteliali per garantire un attaccamento superficiale stretto delle cellule durante l'esperimento di infezione. Tuttavia, va notato che gli integratori medi contengono sostanze che potrebbero interferire o inibire l'interazione tra i batteri e specifiche proteine ospiti. Negli studi sull'interazione pneumococco-VWF, ad esempio, l'eparina deve essere esaurita dal mezzo di coltura cellulare, perché inibisce l'associazione di pneumococci a VWF8.
Un altro passo fondamentale nella coltura del flusso delle cellule endoteliali è il mantenimento dell'adesione cellulare stretta, che dipende dalla vitalità complessiva delle cellule e dal livello di differenziazione. L'adesione cellulare resistente al flusso di taglio delle cellule endoteliali primarie è stata raggiunta solo quando le cellule erano rigorosamente tenute in subconfluenza prima dell'esposizione allo stress da taglio. D'altra parte, la produzione di WPB dipende direttamente dalla confluenza dello strato di cellule endoteliali promuovendo stretti contatti cellulari13. Il beneficio della coltura microfluidica delle cellule endoteliali primarie copre la proliferazione cellulare fortemente indotta che porta rapidamente alla formazione di uno strato di cellule confluenti in condizioni di flusso. Le cellule sono strettamente attaccate l'una all'altra, sono collettivamente orientate nella direzione del flusso e rappresentano un fenotipo altamente differenziato che è necessario per produrre wpB secretoria. Questi WPB servono come vesciche di archiviazione per VWF, attivatori vasodilazione e citochine che vengono esocito come proteine scoppia su stimolazione dell'istamina o attività di pneumolisina27,13. Pertanto, la generazione di uno strato cellulare altamente adesivo e confluente di cellule endoteliali primarie differenziate in passaggi a bassa proliferazione è un prerequisito indispensabile per un rilascio efficiente di VWF e la formazione di stringhe VWF sulla superficie cellulare e analisi dell'interazione batterico-VWF in condizioni di flusso. Pertanto, va notato che la differenziazione delle cellule endoteliali ha preso 48 h di coltivazione del flusso al minimo e ha richiesto un flusso di taglio costante senza variazioni nella pressione della pompa. Eventuali variazioni potrebbero portare a un'improvvisa esplosione media, che avrebbe scovagliato le cellule fuori dalla diapositiva. Inoltre, durante la visualizzazione microscopica, lo scivolo microfluidico e i serbatoi medi del sistema di pompaggio dovevano essere mantenuti ad una temperatura di 37 gradi centigradi in quanto ciò rappresenta la temperatura ottimale delle cellule umane.
Le linee cellulari umane immortalate sono adatte a molti esperimenti scientifici e sono spesso impiegate negli studi sulle infezioni della coltura cellulare. Queste linee cellulari condividono alcuni vantaggi tecnici generali, come i requisiti di coltura bassa o moderata e la proliferazione illimitata, che consente di passare diverse centinaia di volte senza cambiamenti significativi nella morfologia o profili dei recettori. Tuttavia, queste linee cellulari rappresentano una monocultura solitaria e sono soggette a condizioni di crescita bidimensionale artificiali. 28 L'ambiente tissutale della fonte fisiologico mancante si traduce in sostanziali cambiamenti di fenotipo cellulare funzionale e morfologico ad ogni passaggio della coltura29. Prima di altri esperimenti di adesione batterica, è stato determinato il profilo delle proteine marcatore specifiche di tipo cellulare esposte alla superficie e dei recettori delle cellule endoteliali polmonari primarie umane a diversi passaggi di coltura cellulare. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato un'espressione fortemente ridotta di specifiche proteine superficiali come la molecola di adeso delle cellule endoteliali piastriche 1 (PECAM1) entro otto cicli di passaggio cellulare. Inoltre, il profilo espresso del recettore dell'integrina è stato significativamente modificato nei passaggi cellulari più alti a favore di un modello di recettore dell'integrina tipo di cellula non specifico e di un modello di recettore dell'integrina specifico del tipo di cellula ridotta (Bergmann et al., dati inediti). Questi risultati sono particolarmente rilevanti per le analisi delle interazioni patogeno-ospite negli studi di biologia delle infezioni. Con l'obiettivo di sostenere le caratteristiche delle cellule fenotipiche e un alto livello di differenziazione funzionale durante la coltura delle cellule microfluidiche al momento dell'infezione batterica, le cellule endoteliali primarie provenienti da donatori multipli sono state scelte in questo caso e utilizzate solo fino a cinque passaggi al massimo al fine di mantenere le caratteristiche fenotipiche il più specifico possibile8.
La visualizzazione combinata dei batteri e delle strutture specifiche della superficie cellulare durante il flusso richiede un protocollo ottimizzato per la colorazione a fluorescenza. Utilizzando diverse combinazioni di proteine direttamente etichettate, batteri che emolemprimono le proteine a fluorescenza e anticorpi coniugati a fluorescenza, le procedure di colorazione immunofluorescenza possono essere adattate in modo specifico agli obiettivi di visualizzazione. Queste procedure consentono una visualizzazione microscopica definita e chiara e anche una differenziazione e quantificazione dell'aderenza batterica e dell'internalizzazione3,13,30,31. Il rilevamento basato sull'immunofluorescenza dei batteri interiorizzati richiede un passo di permeabilizzazione cellulare come una breve incubazione Triton X-100, che potrebbe portare al distacco cellulare. Pertanto, il rilevamento dei processi di interiorizzazione batterica che si verificano in una coltura di flusso dovrebbe essere visualizzato dopo l'incubazione del flusso utilizzando campioni incrociati PFA. Per la visualizzazione in tempo reale dei batteri in flusso, l'uso di batteri geneticamente modificati che esprimono proteine di fluorescenza consente un rilevamento microscopico rapido e mirato. I ceppi di pneumococco che esprimono RFP che sono stati generati utilizzando un costrutto genetico efficiente progettato da Kjos e Veening16,8 sono stati utilizzati in questo studio sperimentale. Per il rilevamento di stringhe VWF nel flusso, sono stati testati e potevano essere utilizzati diversi anticorpi con etichettatura fluoresceina specifici di VWF. Per ottenere una risposta ottimale del segnale in uno sfondo non specifico ridotto al minimo, l'adeguata concentrazione di anticorpi è stata costantemente titolata per ogni anticorpo applicato.
Per l'imaging microscopico delle cellule vive, l'unità fluida e il vetrino del canale vengono rimossi dall'incubatrice di CO2 e collocati in una camera preriscaldata a 37 gradi al microscopio. Questa camera non poteva essere regolata al 5% di CO2. Senza un'atmosfera gassata, la morfologia HUVEC e la forma fisica batterica sono rimaste intatte fino a 180 min, il che è sufficiente per l'analisi dell'aderenza batterica mediata da VWF. Se sono necessari tempi di infezione più lunghi e un monitoraggio microscopico al di fuori di un'incubatrice di CO2, è necessario utilizzare un mezzo di coltura cellulare tamponato per compensare gli spostamenti di pH dovuti a una concentrazione inadeguata di CO2. In alternativa, l'intero sistema potrebbe essere rimesso nell'incubatore di CO2 tra le fasi di una serie temporale di visualizzazione microscopica.
Oltre al rilevamento della fluorescenza in tempo reale, l'infezione batterica dell'endotelio all'interno del vetrino del canale può essere fermata e preservata da uno scambio medio con paraformaldeide (PFA) come sostanza di fissazione. Dopo la fissazione del flusso, la colorazione dell'immunofluorescenza ottimizzata e graduale della superficie cellulare all'interno del vetrino del canale consente la generazione di preziose visualizzazioni microscopiche delle istantanee e fornisce un rilevamento versatile della struttura combinata di composti cellulari specifici coinvolti nell'interazione tra batteri e cellule ospiti. Il vantaggio scientifico di questo metodo combinato è che lo scivolo del canale trattato con PFA può essere conservato e utilizzato per una colorazione dell'immunofluorescenza post-flusso delle strutture di interesse. Il trattamento PFA inattiva i batteri e quindi arresta l'espressione di proteina RFP. Pertanto, è stato generato un antisiero specifico per lo pneumococco nel coniglio per la rilevazione e la visualizzazione batterica del sistema immunitario utilizzando un anticorpo secondario coniugato specifico per il coniglio8. Come già accennato, l'uso di diverse combinazioni di anticorpi richiede un'ottimizzazione esatta delle quantità di anticorpi e la composizione del buffer di blocco. In caso contrario, segnali di sfondo non specifici ed effetti di rilevamento incrociato potrebbero portare a risultati di colorazione artificiale. Una procedura ottimizzata di colorazione immunofluorescenza può essere facilmente utilizzata per il rilevamento di molti bersagli cellulari diversi come il citoscheletro actino o i marcatori endosomici13,31.
Questa procedura può essere adattata per creare un ambiente tissutale più complesso che imita la fisiologia da un punto di vista istologico, fisiologico e funzionale. Le analisi delle infezioni presentate possono essere utilizzate in modo efficiente per rispondere a diverse domande scientifiche contemporaneamente utilizzando una connessione in linea di più diapositive di canale a un set di perfusione. Questa messa a punto estesa faciliterebbe l'analisi di diversi tipi di cellule, confluenze cellulari e diversi rivestimenti a scorrimento all'interno dello stesso ambiente di flusso in parallelo e consentirebbe un confronto diretto di infezioni batteriche di diversi tipi di cellule. Inoltre, la connessione seriale in linea e l'analisi combinata di diversi vetrini di canale fornisce anche la possibilità di esperimenti di serie temporali, che possono essere applicati per la profilazione dell'espressione genica (ad esempio, l'analisi del fattore di virulenza dipendente dal tempo dell'infezione espressione genica).
Le analisi dell'infezione possono anche essere estese a una condizione di flusso laminare costante che dura diversi giorni o addirittura settimane al fine di analizzare la risposta cellulare in condizioni che imitano una fase di infezione cronica a lungo termine. Oltre alla coltura di tipo a cellula singola presentata, alcuni esempi di coltura cellulare eterotipica nei dispositivi di coltura cellulare microfluidica sono già stati segnalati32,33. Ciò consente studi farmacologici ad alto rendimento e potrebbe in ultima analisi l'utilizzo di sistemi di coltura cellulare microfluidica per scopi rigenerativi e34 .
In sintesi, il sistema microfluidico in combinazione con procedure di colorazione immunitaria ha servito come modello prezioso per l'analisi dei patologi tra batteri e cellule ospiti in un ambiente che simula le condizioni all'interno del sistema vascolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il progetto è stato finanziato dal DFG (BE 4570/4-1) a S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of >2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| Histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| Reaction tubes 1.5/2.0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| Reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| Serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
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