Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Пневмококк инфекция первичных эндотелиальных клеток человека в постоянном потоке

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60323
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

Summary

Это исследование описывает микроскопический мониторинг пневмококка соблюдения фон Willebrand фактор строки, производимые на поверхности дифференцированных человеческих первичных эндотелиальных клеток под сдвига стресс в определенных условиях потока. Этот протокол может быть расширен до детальной визуализации конкретных клеточных структур и количественной оценки бактерий путем применения дифференциальных иммуностоинных процедур.

Abstract

Взаимодействие стрептококковой пневмонии с поверхностью эндотелиальных клеток опосредовано в кровотоке через механочувствительные белки, такие как фактор фон Виллебранд (VWF). Этот гликопротеин изменяет свою молекулярную конформацию в ответ на стресс сдвига, тем самым подвергая обязательные участки для широкого спектра взаимодействий хозяина-лигада. В целом, культивирование первичных эндотелиальных клеток под определенным потоком сдвига, как известно, способствует специфической клеточной дифференциации и образованию стабильного и тесно связанного эндотелиального слоя, напоминающего физиологию внутренней слизистой оболочки кровеносных сосудов . Таким образом, функциональный анализ взаимодействий между бактериальными патогенами и сосудами-хозяевами с использованием механочувствительных белков требует создания насосных систем, которые могут имитировать физиологические силы потока, которые, как известно, влияют на поверхность сосудистых клеток.

Микрофлюидическое устройство, используемое в данном исследовании, обеспечивает непрерывную и бесприсрадаемую рециркуляцию жидкостей с определенной скоростью потока. Компьютерная система насоса воздушного давления применяет определенный стресс сдвига на эндотелиальных поверхностях клеток, генерируя непрерывный, однонаправленный и контролируемый средний поток. Морфологические изменения клеток и бактериальной привязанности могут микроскопически контролироваться и количественно в потоке с помощью специальных слайдов канала, которые предназначены для микроскопической визуализации. В отличие от инфекции культуры статических клеток, которая в целом требует фиксации образца до иммунной маркировки и микроскопических анализов, микрофлюидные слайды позволяют как флуоресценции на основе обнаружения белков, бактерий и клеточных компонентов после фиксации образца; серийное окрашивание иммунофлуоресценции; и прямое обнаружение на основе флуоресценции в режиме реального времени. В сочетании с флуоресцентными бактериями и специфическими флуоресценцией помечены антитела, эта процедура инфекции обеспечивает эффективную систему визуализации нескольких компонентов для огромного спектра научных приложений, связанных с сосудистыми процессами.

Introduction

Патогенез пневмококковых инфекций характеризуется многогранным взаимодействием с разнообразием внеклеточных матричных соединений и компонентов гемостаза человека, таких как плазминоген и VWF1, 3,4,5,6,7,8. Мультидоменглиновая гликопротеина VWF служит ключевым регулятором сбалансированного гемостаза путем посредничества в наборе тромбоцитов и инкорпорации фибрина в месте образования сосудистого тромба9. Важность функционального, активного VWF для контроля кровотечения и заживления ран демонстрируетболезнь фон Виллебранд, распространенное наследственное кровотечение10.

Глобулярный VWF циркулирует в крови человека в концентрации до 14,0 мкг/мл11,10. В ответ на сосудистые травмы, локальный выпуск VWF эндотелиальных тел Вейбель Паладе (WBP) заметно увеличилось11,12. Предыдущие исследования показывают, что пневмококк приверженность человека эндотелиальных клеток и его производство порообразующего токсина пневмолиза значительно стимулирует светлую секрецию VWF13. Гидродинамические силы кровотока вызывают структурное открытие механоответственных доменов VWF. При норме потока 10 dyn/cm2 VWF мультимеризирует до длинных белковых струн длиной до нескольких сотен микрометров, которые остаются прикрепленными к субэндотелию10,12.

Чтобы понять функцию мультимеризированных струн VWF, генерируемых при стрессе сдвига при взаимодействии пневмококка с эндотелиальной поверхностью, был создан микрофлюидный подход к клеточной культуре. Использовалось микрофлюидное устройство с программно-управляемой системой насоса воздушного давления. Это позволило непрерывно, однонаправленное рециркуляции среды клеточной культуры с определенной скоростью потока. Таким образом, система применила определенный стресс сдвига на поверхности эндотелиальных клеток, которые оставались прикрепленными внутри специализированных слайдов канала. Этот подход позволил смоделировать силу сдвига в крови сосудистой системы человека, в которой строки VWF генерируются на дифференцированных эндотелиальных клетках при определенных постоянных условиях потока. Для этого эндотелиальные клетки культивировались в конкретных слайдах канала (см. Таблица материалов),которые были адаптированы для микроскопических анализов во время потока. Микрофлюидная насосная система обеспечивала высокоопределенную и контролируемую стрессовую ситуацию, необходимую для формирования расширенных струн VWF на сливочного эндотелиального клеточного слоя. После стимуляции VWF-секретации конфлентически выращенных человеческих пупочных клеток вены (HUVEC) гистаминовой добавкой, образование строки было вызвано применением сдвига стресс (я) 10 dyn/cm2. Стресс сдвига определяется как сила, действующая на клеточном слое. Он рассчитывается примерно в соответствии с Корниш и т.д. al.14 с уравнением 1:
Equation 1

В тех случаях, когда стресс сдвига в dyn/cm2, вязкость в (dyn)/cm2, h q half of высота канала, w й половина ширины канала, и й s flowrate в mL/min.

Результат уравнения 1 зависит от различных высот и ширины различных используемых слайдов (см. Таблица материалов). В этом исследовании был использован слайд канала Luer в 0,4 мкм, в результате чего коэффициент камерного слайда составил 131,6 (см. формулу 2).
Equation 2

Вискозность среды при 37 градусах Цельсия составляет 0,0072 дина/см2 и использовался стресс сдвига 10 dyn/cm2. Это привело к скорости потока 10,5 мл/мин (см. формулу 3).
Equation 3

Здесь подробно описана адаптация и продвижение процедуры культивирования микрофлюидных клеток с использованием однонаправленной системы ламинара для исследования и визуализации механизмов бактериальной инфекции в сосудистой системе хозяина. Поколение строк VWF на эндотелиальных слоях также может быть стимулировано с помощью других насосных систем, которые способны применять непрерывный и устойчивый стресс сдвига15.

После культивирования первичных эндотелиальных клеток для слияния в потоке и стимуляции формирования струнных VWF, пневмококки, выражающие красный флуоресценционный белок (RFP)16 были добавлены в эндотелиальный клеточный слой под постоянным микроскопическим контролем. Привязка бактерий к струнам VWF на поверхности эндотелиальных клеток была микроскопически визуализирована и контролироваться в течение трех часов в режиме реального времени с помощью флуоресцентных антител, маркированных VWF. При таком подходе, роль VWF как кофактор адгезии содействия бактериальной привязанности к сосудистому эндотелия была определена8.

В дополнение к микроскопической визуализации секреции белка и конформационных изменений, этот метод может быть использован для мониторинга отдельных шагов процессов бактериальной инфекции в режиме реального времени и количественное количество прикрепленных бактерий в разных точках времени Инфекции. Специфическая система насоса, управляемая программным обеспечением, также обеспечивает возможность культуры эндотелиальных ячеек в определенных условиях постоянного потока на срок до нескольких дней и обеспечивает определенную инкубацию импульсного среднего потока. Кроме того, этот метод может быть применен с использованием различных типов клеток. Адаптация протокола окрашивания также позволяет обнаруживать и визуализировать бактерии, интернализированные в эукариотические клетки.

Данная рукопись описывает этот передовой экспериментальный протокол, который может быть использован в качестве определенного, надежного и воспроизводимого подхода для эффективной и универсальной характеристики патофизиологических процессов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Микрофлюидная культивация клеток осуществлялась с помощью коммерческих первичных эндотелиальных клеток пуповины человека (HUVEC). Компания изолировала клетки с информированным согласием донора. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Doctors Chamber федеративного государства Баден-Вюртемберг с номером 219-04.

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу материалов для протокола поставок.

1. Предкультивация первичных эндотелиальных клеток

  1. Оттепель замороженный глицерол флакон, содержащий 1 х 105 первичных HUVEC от трех различных доноров мягко при 37 градусов по Цельсию и семян клеток в 7 мл предварительно прогретых эндотелиальных клеток среды роста (ECGM, готовы к использованию с добавками) в 25 см2 клеточной колбы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные эндотелиальные клетки теряют способность дифференциации после более чем 5 циклов распространения. Таким образом, только клетки с менее чем 5 проходов могут быть использованы, если высокие оценки дифференциации клеток не требуется.
  2. Культивировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере CO2 5% в течение 60 минут, чтобы позволить поверхностное крепление и обменять среду культуры клеток ECGM, чтобы избавиться от остатков от криоконсервации.
  3. Продолжайте культивировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 до тех пор, пока они не образуют подковорный слой клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: HUVEC не должен расти до сливаемого слоя, так как плотные контакты клеток предотвращают образование стабильного клеточного слоя позже в потоке.

2. Прекультация стрептококковой пневмонии

ВНИМАНИЕ: Streptococcus пневмонии является биобезопасности уровня 2 агента и разрешается культивироватьтолько только в биобезопасности уровня 2 лабораторий. Используйте чистую скамейку, классифицированную для безопасности уровня 2 для всех бактериальных процедур, строго избегайте образования аэрозолей и используйте центрифугу с защитой аэрозолей для отложений бактерий.

  1. Прививать Колумбийской крови агар пластины с Streptococcus пневмонии клинической изоляции ATCC11733, полученных из глицерола запасопостоянно хранится при -80 градусов по Цельсию и культивировать агар пластины на ночь при 37 КК и 5% CO2.
  2. Приготовьте 40 мл жидкого бульона Тодда Хьюитта, дополненного 1% дрожжевой экстрактом (THY) и 15 мл стерильного фосфатно-буферного солей (PBS) pH 7.4, для выращивания бактерий и стирки.
  3. Используйте стерильную трубку для выращивания бактерий и привить бульон жидкой культуры с бактериальной массой. Контролируйте количество прививки с помощью фотометрического измерения 1 мл aliquots на 600 нм против непривитого жидкого бульона в качестве эталона. Заполните бактериальную массу в жидкий бульон, пока он не достигнет оптической плотности на 600 нм (OD600) 0,15.
  4. Инкубировать привитый жидкий бульон без тряски при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 и определить OD600 каждые 30 минут, измеряя 1 мл аликвотсов с помощью пластиковых кювет.
  5. Как только бактериальная культура достигла OD600 0.4, что соответствует экспоненциальной фазе роста, центрифуга бактериальной культуры подвески в течение 10 минут при 1000 х г при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте пневмококковой культуры достичь OD600 из более чем 1,0, потому что высокая плотность культуры пневмококка, как известно, вызывают бактериальный автолиз, который может повлиять на общую бактериальную пригодность.
  6. Отрежь бактериальный осадок мягко с 10 мл PBS и осадки снова в течение 10 минут на 1000 х г на RT.
  7. Отрежь промытый бактериальный осадок мягко в 1 мл PBS и определить OD600 из 10 л бактериальной суспензии с использованием 1 мл PBS в качестве эталона.
  8. Отрегулируйте количество бактерий в PBS до OD600 из 2.0. Согласно ранее определяемым бактериальным подсчетам, OD600 из 2.0 соответствует 2 x 109 единицам колонии (CFU). Немедленно приступаем к инфекционной процедуре для профилактики бактериального аутолиза.

3. Эндотелиальная клеточная культивация HUVEC в микрофлюидных условиях

  1. Отсоедините первичные эндотелиальные клетки от колбы клеточной культуры контролируемым протеолиза. Выполните следующие шаги в стерильной среде с помощью чистой скамейки. Подготовьте объем 15 мл стерильных PBS для стирки.
    1. Удалите ECGM из подковотенно выращенного слоя HUVEC и промойте слой клетки с помощью серологического пипетки, чтобы избавиться от среды клеточной культуры.
    2. Инкубировать промытый HUVEC с 3 мл 37 C преронный раствор диссоциации клеток для отслоения клеток в течение 5 минут при 37 градусах Цельсия. Наблюдайте за отрядом протеолитических клеток с помощью микроскопического мониторинга каждую минуту.
    3. Pipette отдельной подвески клетки в трубку, содержащую 7 мл ECGM дополнены 2% плода икроножной сыворотки (FCS) для остановки протеолиза и осадка клеток в течение 3 мин при 220 х г на RT.
    4. Удалите супернатант и повторно ездовые HUVEC в 250 Зл ЭКГМ дополнен 5% FCS и 1 mM MgSO4. Используйте 10 qL суспензии клетки для подсчета клеток с помощью камеры подсчета клеток Neubauer и настроить количество клеток до 4 х 106 ячеек/мЛ ECGM дополнены 5% FCS и 1 mM MgSO4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого эксперимента потока потребуется 30 мл среды ECGM, дополненной 5% FCS и с 1 мМ MgSO4. Отсюда на этой средней композиции называется ECGMS-средний. Увеличение концентрации FCS в среде культуры от 2% до 5% поддерживает вложение клеток и жизнеспособность клеток HUVEC, посеянных в слайде канала. Средние добавки FCS и MgSO4 существенно стабилизируют клеточное крепление HUVEC в условиях сдвига стресса.
  2. Семена и культивировать HUVEC в слайде канала. Работайте в стерильной среде с помощью чистой скамейки. Клетки будут культивироваться под напряжением сдвига в течение 2 дней, а затем инфекции с бактериями и микроскопического мониторинга еще 2 ч.
    1. Уравновесить слайд канала, перфузии установить 1,6 мм в диаметре и 50 см в длину, aliquot ECGMS-средний, и Луер канал слайд 0,4 мкм в высоту, для 24 ч в инкубаторе с 5% CO2 атмосферы при 37 градусов по Цельсию, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура рекомендуется дегазировать пластиковое оборудование и предварительно разогреть среду, перфузионные трубки и резервуары. Если материалы или жидкости хранились на РТ или в холодильнике, газы, растворенные в пластике и жидкостях, будут выделяться при нагревании в инкубаторе во время эксперимента. Затем появятся пузырьки газа. Дегазации всех пластиковых компонентов до эксперимента устранит этот эффект. Каждый раз, когда система вынимся из инкубатора, процесс поглощения газа начинается снова. Таким образом, работать быстро на RT и никогда не оставляйте жидкости блок за пределами инкубатора в течение более длительных периодов времени.
    2. Используйте пипетку для введения 100 л стерильной фильтрованного свиного желатина в растворе PBS в один из резервуаров переживаемого скольжения канала. Инкубировать желатин-раствор на 1 ч при 37 градусах Цельсия и промыть канал слайда 1 мл PBS в стерильных условиях с помощью шприца 1 мл Luer.
    3. Поместите слайд канала с покрытием желатина на тонкой полистирола или пенополистирола пластины, чтобы предотвратить падение температуры слайда. Добавьте в слайд 100 qL из подвески 4 x10 6/мЛ HUVEC с шприцем 1 мл Luer.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение слайда канала на холодной металлической поверхности чистой скамейки может снизить температуру слайда дно, тем самым генерируя холодный стресс эндотелиальных клеток. Во время клеточной трубы удерживайте слайд немного вверх, чтобы пузырьки воздуха поднимались и исчезали изнутри слайда.
    4. Инкубировать слайд канала с HUVEC в течение 60 минут при 37 КС и 5% CO2 и заполнить средние резервуары на обоих концах слайда канала с 60 QL ECGMS-средний каждый. Инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
  3. Отрегулируйте микрофлюидный насос и настройки программного обеспечения.
    1. Подключите уравновешиваете перфузионный набор к насосному агрегату, заполните 13,6 мл ECGMS-среднего, и запустите программное обеспечение для управления насосом. Выберите адекватный набор перфузии и тип камерной слайда, используя окна прокрутки вниз в меню настроенного жидкого блока. Выберите 0.007 (dyn's/cm2)в программном обеспечении для средней вязкости. (Обратитесь к настройкам программного обеспечения насоса давления, отмеченным красными стрелками на дополнительной рисунке 1).
    2. Вне инкубатора соедините стеклянную бутылку, наполненную сушкой кремнезема, к трубам давления воздуха (см. Рисунок 1, Всет 3). Воздух насоса давления циркулирует между резервуарами перфузии и насосом и должен быть сухим перед повторного входом в насосное устройство. Выберите Параметры потока в меню программного обеспечения, установите давление до 40 мбар, и промойте трубки насоса с жидкой средой, запустив непрерывный средний поток. (Эти настройки также указаны красными стрелками на дополнительной рисунке 1).
    3. Программа желаемого сдвига циклов стресса культивирования потока. Начните с 5 dyn/cm2, контролировать сбалансированный резервуар pumpinng и заверить, что никакие пузырьки воздуха циркулируют в насосной системе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение стены сдвига в слайде канала зависит от скорости потока и вязкости перфузионной среды. При использовании другой насосной системы, пожалуйста, обратитесь к уравнениям, описанным во введении, чтобы установить скорость потока генерации желаемого уровня стресса сдвига. Описанные параметры соответствуют скорости потока 5,42 мл/мин. (Примерный снимок экрана, показывающий адекватные параметры потока в программном обеспечении насоса давления показано на дополнительной рисунке 2).
    4. Остановите циркуляцию потока в программном обеспечении управления насосом и удерживайте средний поток в перфузионных трубках, зажимая трубки вблизи соединений Luer. Подключите слайд канала, тем самым избегая пузырьков воздуха, и поместите жидкости единицы с подключенным каналом слайд в CO2 инкубатора на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Начните стресс сдвига на 5 dyn/cm2 в течение 30 минут, чтобы плавно адаптировать клетки к силам, генерируемым стрессом сдвига, прежде чем ускорять уровень стресса сдвига (см. Дополнительная рисунок 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы пузырьки воздуха не остались в системе трубки или в слайде после подключения к трубной системе, потому что движение пузырьков воздуха в потоке может привести к отслоению клеток.
    5. Ускорьте напряжение сдвига до 10 dyn/cm2 (которые соответствуют 10.86 mL/min в этой установке потока) и инкубировать скольжение канала в непрерывном усилии сдвига для 48 h в малом инкубаторе CO2 при 37 C и 5% CO2 для того чтобы позволить дифференциацию клетки ( соответствующее программное обеспечение settinngs указаны с красными стрелками в дополнительной рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HUVEC, как правило, отсоединяются от поверхности канала, если культивирование потока непосредственно начинается на 10 dyn/cm2. Клетки остают прикрепленными к поверхности камеры если культивирование потока начато с более менее усилием сдвига используя 5 dyn/cm2 на минимум 30 min после дова с последующим увеличивая усилие сдвига медленно до пожеланных 10 dyn/cm2. Напряжение сдвига 10 dyn/cm2 является минимальным значением в этой настройке перфузии, необходимой для формирования строкИ VWF.
    6. После 24 ч микрофлюидных культивирования клеток, остановить средний поток с программным обеспечением управления насосом именно тогда, когда сбалансированный средний уровень достигается в обоих средних резервуаров. Поместите жидкостное устройство в чистую скамейку и удалите 10 мл циркулирующей среды выращивания перфузийных резервуаров с помощью серологического пипетки размером 10 мл. Добавьте 10 мл ECGMS-medium в резервуары, чтобы обновить среду, поместите жидкостной блок обратно в инкубатор CO2 при 37-C и 5% CO2,и перезапустите культивирование жидкости с помощью программного обеспечения для управления насосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функция насоса давления может быть внезапно нарушена лабораторными машинами, такими как крупные центрифуги, которые могут создать сильное возмущение магнитного поля. Это внезапное нарушение может привести к отслоению клеток. Позаботьтесь о том, чтобы такие машины не были активны вблизи насоса давления во время эксперимента.
    7. Начните предощение температурной инкубационной камеры, покрывающей стадию флуоресцентного микроскопа до 37 градусов по Цельсию для уравновешенности температуры 24 ч до микроскопической визуализации. После того, как микроскоп предварительно разогрет, начните управление программным обеспечением микроскопа и отрегулируйте основные настройки для микроскопического мониторинга флуоресценции, выбрав соответствующие настройки фильтра (540 нм/590 нм для обнаружения бактерий, выражающих RFP и 470 нм/515 нм для обнаружения флуоресцентных выбросов антител, конъюгированных VWF). Предопрогрейте дополнительную отопительную камеру для инкубации жидкого блока при 37 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время анализа инфекции и микроскопического мониторинга температуры слайда канала и циркулирующей среды не должно существенно уменьшаться, так как это будет генерировать холодную нагрузку на клетки. В целом, размер температурных камер, покрывающих стадию микроскопа, недостаточен для покрытия всего жидкого блока. Поэтому рекомендуется использовать дополнительную отопительную камеру, предварительно разогретую до 37 градусов по Цельсию.
    8. Для микроскопической визуализации поместите жидкостную единицу в 37-C предварительно разогретую нагревательную камеру и поместите слайд канала на стадию предтеплого микроскопа 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для микроскопической визуализации, жидкости единицы и слайд канала должны быть удалены из инкубатора CO2 из-за ограниченной длины перфузионных труб. Если время заражения и микроскопический мониторинг длиной более 180 мин требуется за пределами 5% CO2 атмосферы для pH буферизации, рН-буферизированной среды должны быть использованы для микрофлюидирования культивирования.
    9. Контролируйте морфологию клеток и целостность слоя HUVEC до введения гистамина и бактерий в циркуляцию потока на протяжении всего времени эксперимента по течению и после окончания эксперимента по течению с помощью яркого полевого режима микроскопа.

4. Индукция VWF-релиз а визуализация мультимеризованных струн VWF

  1. Поддерживайте настройки потока, потому что напряжение сдвига 10 dyn/cm2 необходимо для того чтобы вызвать multimerization VWF к длинним шнурам up to 200 MDa. Побудить выпуск VWF из эндотелиальной WPB путем введения 136 Л гистаминового стока 100 мМ в ECGMS-средний, циркулирующих в перфузионных труб ахсеях с помощью порта инъекций. Окончательная концентрация гистамина в плавающей среде составит 1 мМ. Если нет порта инъекций, гистамин может быть добавлен альтернативно путем pipetting в среду резервуаров насоса.
  2. Для обнаружения иммунофлуоресценции мультимеризированных струн VWF, остановить поток, когда сбалансированный средний уровень в резервуарах достигается, и вводить 20 мкг VWF-специфических FITC-конъюгированных антител в объеме 200 ЛЛ PBS (pH 7.4) в циркулирующих 13,6 мл ECGMS-средний с использованием порта впрыска. Если нет порта инъекций, антитела могут быть добавлены альтернативно путем pipetting в среду резервуаров насоса. Это приводит к окончательной концентрации антител 1,3 мкг/мл.
  3. Для микроскопического сканирования нескольких полей зрения в течение короткого времени используйте флуоресценцию микроскопа с устройством флуоресценции Ксенона мощностью 30% и эпифлуоресценцией. Мониторинг формы и морфологии слоя HUVEC с помощью режима яркого поля для выбора репрезентативных ячеек, подходящих для визуализации VWF-строк.
  4. Для визуализации зеленых флуоресцентных строк VWF выберите цель масла 63x/1.40 и фильтр обнаружения 470 нм в меню флуоресценции программного обеспечения микроскопа (LasX). Создавайте снимки стекол, по крайней мере, 50 репрезентативных полевых представлений, каждый из которых содержит приблизительно 10 морфологически нетронутых HUVEC. Для количественной оценки зеленых флуоресцентных строк VWF в разных точках времени, сканирование нескольких полей зрения.

5. Микроскопическая оценка бактериальной привязанности к VWF-струнам в потоке в режиме реального времени

  1. Количественное пневмококкическое крепление к струнам VWF, генерируемым на поверхностях клеток HUVEC с помощью обнаружения иммунофлюоресценции.
    1. Держите поток и впрысните 1,35 x 108 CFU/mL RFP-expressing пневмококки в максимальном объеме 1 мл в ECGMS-среду с помощью порта инъекций. Кроме того, пипетка бактерий в среду в резервуаре насоса. Перезапустите напряжение сдвига на 10 dyn/cm2 для того чтобы позволить бактериям распространить внутри системы насоса.
    2. Выберите цель погружения масла 63x для увеличения микроскопа и отрегулируйте настройки флуоресценционного фильтра в программном обеспечении микроскопа к RFP-каналу (540 нм фильтр обнаружения) для обнаружения пневмококки RFP.
    3. Для количественной оценки бактериальной привязанности к струнам VWF, остановить поток и создать снимки, по крайней мере 30 репрезентативных полевых представлений, каждый из которых содержит около 10 морфологически нетронутыми HUVEC, и подсчитать количество пневмококков.
    4. Для оценки данных используйте алгоритм однофакторной статистики ANOVA, за которым следует пост-специальный двуххвостый неспаренный выборочный тест для детального статистического сравнения. Значения P lt;0.05 были сочтены статистически значимыми.

6. Микроскопическая оценка бактериальной привязанности к VWF-струнам после фиксации образца

  1. Пробуйте фиксацию до окрашивания иммунофлюоресценции.
    1. Остановите поток, удалите 10 мл ECGMS-medium из резервуаров насоса и добавьте 10 мл PBS, дополненного 5% параформальдегидом (PFA). Пусть раствор PFA циркулирует в течение 10 мин при стрессе сдвига 10 dyn/cm2.
    2. Отключите слайд канала от насосного блока.
  2. Блокируйте неспецифические узлы на поверхности клетки и выполняйте иммунообнаружение струнных VWF и прикрепленных бактерий.
    1. Приготовьте 4 мл стирального раствора, содержащего 100 мМ Na2CO3 (pH 9.2), дополненного 4% сахарозой для всех стирки. Подготовьте 1 мл блокирующего раствора, содержащего 100 мМ Na2CO3 (pH 9.2), дополненного 4% сахарозой и 2% бычьего сывороточных альбумина (BSA) для блокировки неспецифических связывающих сайтов.
    2. Вымойте PFA-инкубатор слайд 3x с помощью 1 мл Luer шприц вводить 200 л стирального раствора и инкубировать слайд в течение 120 минут на RT с 200 л блокирующего раствора.
    3. Приготовьте 4 мл другого блокирующего раствора, содержащего 100 мМ Na2CO3, (pH 9.2) дополненный 4% сахарозой и 0,5% BSA для разбавления антител. Используйте 200 зл этого блокирующего раствора, чтобы разбавить пневмококк-специфический кроличья антисыворотку 1:100. Используйте 200 qL этого блокирующего раствора, чтобы разбавить антитела для мыши, специфичную для VWF, чтобы сделать концентрацию антител, специфичную для VWF, в 4 мкг/мл. Разбавить AlexaFluor488-конъюгированные вторичные антитела из 2 мг/мл бульонного раствора 1:100 в 200 л PBS (pH 7.4) для получения конечной концентрации 20 мкг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В описанных параметрах иммунофлуоресценции обнаружение антител дает оптимальные результаты, когда антитела были разбавлены в вышеупомянутом щелочном карбонатном буфере. На основе предыдущих результатов, рекомендуемые блокирующие решения и количество антител подходят для многих приложений. Однако различные эксперименты могут потребовать индивидуальной оптимизации комбинации антител, концентрации антител, времени инкубации и конституции блокирующего буфера. В качестве альтернативы может быть подходящей или даже предпочтительной в качестве инкубационного буфера фосфатно-буферная система с нейтральным диапазоном рН. В случае слабых сигналов флуоресценции, концентрация вторичных антител должна быть увеличена. При обнаружении слишком большого количества неспецифического фонового шума флуоресценции следует увеличивать количество блокирующих веществ.
    4. Для VWF-иммунофлуоресценции окрашивания, мыть слайд канала с помощью 1 мл Luer шприц путем введения 200 злимост стирального раствора 3x и инкубировать слайд с 1:50 разбавленных VWF-специфических антител в течение 30 минут на RT. Потом, мыть слайд канала снова 3x с 200 L стирального раствора и инкубировать слайд с 1:100 разбавленных AlexaFluor488-конъюгированных мыши конкретных антител в течение 30 минут на RT. Наконец, мыть слайд канала снова 3x с 200 зл и раствором для мытья.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лексутор-фторофоры чувствительны к отбеливанию. Таким образом, слайд должен быть защищен, сохраняя его в темной камере во время инкубационных шагов с флюорофором-конъюгированных антител.
    5. Для иммунообнаружения пневмококков, инкубировать слайд с 1:100 разбавленных пневмококк-специфических антитела кролика кролика в течение 30 минут на RT. После этого, мыть слайд канала 3x с 200 злицы стирального раствора и инкубировать слайд с 1:100 разбавленной AlexaFluor568-конъюгированных кролика конкретных антител в течение 30 минут на RT. Вымойте канал слайд снова 3x с 200 злител мытье раствора.
    6. Чтобы испачкать клеточный актин цитоскелет флуоресцентным фаллоидином, пронизайте HUVEC путем инкубации с 120 зл и 0,1% Triton X-100 в течение 5 минут на RT. Вымойте канал слайд 3x с 200 л стирального раствора и инкубировать слайд с 120 мл 1:1,000 разбавленной AlexaFluor350-конъюгированный фаллоидин. Этот инкубационный шаг позволит визуализировать полимеризованный актин цитоскелет и позволит контролировать форму клетки и возможные вызванные стрессом морфологические изменения.
    7. Вымойте канал слайд 3x с 200 зл стирки раствора. Наконец, мыть слайд 4x с 200 Л л ddH2O и визуализировать зеленые флуоресцентные строки VWF, красные флуоресцентные бактерии, и синий флуоресцентный актовый цитоскелет с использованием соответствующих настроек фильтра на флуоресценционный микроскоп.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Культирование первичного HUVEC в постоянном однонаправленном потоке приводит к образованию сливательного и плотно упакованного клеточного слоя, который способствует генерации клеточных WPB, наполненных механочувствительным VWF13,14. Этот протокол описывает использование насоса давления воздуха на основе, беспульсивный рециркуляции системы для анализа инфекции, которая требует имитации сдвига стрессовой ситуации в крови человека.

Эта система позволяет определить, программно-контролируемое настройку условий потока. Схема потока на рисунке 1 иллюстрирует основной рабочий процесс, начиная с предкультивации первичных эндотелиальных клеток(рисунок 1, Ввод 1) и прекультации пневмококки(рисунок 1, Ввод 2). Прикладная микрофлюидная система(рисунок 1, ввод 3) состоит из специального слайда канала, который соединен через адаптер Luer с перфузионными трубками с двумя средними резервуарами. Набор перфузийных труб помещается на жидкостный блок, который служит в качестве стенда и использует перфузионные трубки в качестве клапанной системы. Для культивирования потока жидкостное устройство со средним заполненным набором перфузии и подключенным каналом помещаются в инкубатор CO2 (рисунок 1, Ввод 3). Флювоечное устройство подключено к насосу давления воздуха через воздушные трубы. Воздух в трубах должен проходить через сушильную бутылку, содержащую шарики кремнезема для удаления влаги из резервуаров перфузии, прежде чем воздух будет откачан в насосную систему(рисунок 1, Ввод 3). Насос давления воздуха управляется компьютерным программным обеспечением (PumpControl v1.5.0), что позволяет устанавливать непрерывную, определенную скорость потока в зависимости от диаметра слайда канала, длины и диаметра набора перфузионных труб и вязкости средний используется(рисунок 1, всет 3). Секреция VWF WPB exocytosis конфлентно выросли HUVEC индуцируется гистамина стимуляции8 применяется в средней циркуляции в перфузии трубки с помощью порта инъекций (Рисунок 1, Врез 4). При минимальном стрессе сдвига 10 dyn/cm2, выпущенные белки VWF мультимеризируют и образуют длинные белковые струны, достигающие длины более 100 мкм(Рисунок 1, Врез 4,5,6 и Рисунок 2A). Эти белковые струны микроскопически обнаружены и визуализированы после инъекции флуоресцеина изотоцианата (FITC)-конъюгированных VWF-специфических антител в среду. Циркулирующие антитела позволяют иммунофлуоресценции обнаружения клеточной поверхности связанных строк VWF в режиме реального времени(Рисунок 1, Врез 5)8.

Установленный микрофлюидной основе клеточной культуры инфекции подход с использованием первичных эндотелиальных клеток имитирует ситуацию локально воспаленной сосуды при проникновении в кровообращение бактериальных патобионов, таких как Streptococcus пневмонии. Приведены примеры визуализации и количественного анализа бактериального взаимодействия с дифференцированными сосудистыми клетками при сдвигах при стрессе с использованием микрофлюидного культивирования эндотелиальных клеток(рисунок 1, вставки 5,6). RFP-выражение пневмококков были введены в поток и после 30 мин циркуляции, первые признаки бактериальной привязанности к СТРУнам VWF гистамина стимулировали HUVEC были микроскопически обнаружены(Рисунок 1, Вставки 5,6 и Рисунок 2A, B белые стрелки)8. Таким образом, использование ПФР-выражения пневмококков позволило количественной оценки бактериальной привязанности к струнам VWF на эндотелиальных клетках без необходимости обнаружения бактериальных антител.

Гистограмма наложения участков интенсивности флуоресценции были созданы с помощью программного обеспечения оценки, предоставляемые Leica (т.е., LasX) для визуализации колокализации RFP-выражения пневмококки с VWF строки обнаружены с зелеными флуоресцентными антителами. Это позволило провести количественный анализ вероятности колокализации в определенных регионах, представляющих интерес (ROI) в изображении флуоресценции. Использование гистограммы наложения бактериальных сигналов в сочетании с флуоресценции сигналов VWF, перекрывающихся пиков флуоресценции для обоих может быть визуализирована и тем самым подтвердил пневмококковое крепление к струнам VWF. Бактериальное вложение сопротивляется непрерывно применяемому стрессу сдвига в течение как минимум 25 мин(рисунок 2B)8.

В целом, непрерывное культивирование потока первичного HUVEC позволило VWF секреции и генерации длинных струн белка VWF, которые служат в качестве сайтов адгезии для циркулирующих бактерий8.

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс для анализа бактериальной привязанности к струнам VWF с использованием микрофлюидного культивирования эндотелиальных клеток. Рабочий процесс основных экспериментальных шагов, начиная с предкультивации первичных эндотелиальных клеток до субсефлюкса в колбах клеточной культуры. Перед культивированием клеток в потоке, клетки посеяны в слайд канала с покрытием желатина(Всет 1). Бактерии выращиваются на агарпластинах с последующим культивированием в сложной жидкой среде до середины бревенчатого периода(Всет 2). Для микрофлюидной культуры клеток, слайд канала с эндотелиальными клетками подключен к перфузионных труб жидкости единицы насосной системы и подвергается постоянному потоку для дифференциации клеток(Всет 3). Поколение VWF-строк (зеленая стрелка) было индуцировано инъекцией гистамина при стрессе сдвига 10 dyn/cm2 и микроскопически контролируется с помощью иммунофлюоресценции с использованием FITC-маркированных VWF-специфических антител(Inset 4). После инъекции RFP-выражения бактерий в циркулирующей среде, пневмококки (красная стрелка) к VWF-строки был микроскопически визуализированы в режиме реального времени по флуоресценции выбросов на 450 нм (Всет 5). После фиксации клеток с использованием ПФА, дифференциальная иммунофлуоресценция окрашивания обеспечивает визуализацию бактериальной привязанности в конкретных точках времени инфекции(Вставка 6). Изображения насосной системы и слоя ячейки HUVEC, описанные в шагах 1, 3, и изображение порта впрыска(Inset 4) включены. Изображения иммунофлуоресценции, показанные в всцаниях 4 и 5, были изменены и использованы с разрешения Jagau et al.8. Длина брусков шкалы указана в правом нижнем правом.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель иммунофлуоресценции изображения пневмококка связывания с VWF строки, генерируемые в непрерывном потоке на поверхности гистамина стимулировали HUVEC. (A) Поколение струн VWF было микроскопически количественно после разоблачения сосверхлительно выросли HUVEC стрижки стресса с помощью микрофлюидной насосной системы на 10 dyn/cm2. FITC-конъюгированные VWF-специфические антитела обнаружили строки VWF. Белые стрелки указывают на пневмококки RFP с красной флуоресценцией, прикрепленной к длинным струнам VWF. (B) Бактериальное крепление к зеленым флуоресцентным струнам VWF было микроскопически наблюдаемо для up to 2 h в постоянн потоке (белые стрелки) и было подтвержено программно-основанной оценкой интенсивности флуоресценции определенной рентабельности инвестиций. В режиме реального времени изображения были сделаны с флуоресценции оборудования конфокального лазерного сканирующего микроскопа (SP8, Leica). Шкала баров 10 мкм. Эта цифра была изменена и использована с разрешения Jagau et al.8.

Дополнительная рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Моделирование бактериального взаимодействия с механочувствительными белками-хостами, такими как VWF, требует сложной системы культуры клеток, которая позволяет генерировать определенный, однонаправленный и непрерывный поток жидкостей, тем самым создавая надежный стресс сдвига . Уже описано несколько микрофлюидных насосных систем. Всеобъемлющий обзор от Bergmann et al. обобщает ключевые аспекты различных двух- и трехмерных моделей клеточной культуры17.

Микрофлюидическая технология является очень молодой метод, начатый в начале 1990-х годов с развитием управляемых, воспроизводимых и перфузивных микроэкологий в микрометре и даже в нанометровой шкале18. Представленный микрофлюидный подход может также применяться для изучения широкого спектра механизмов бактериальной адгезии и вовлеченных белков. Это лучше всего подходит для любого взаимодействия, которое включает в себя механоответные компоненты адгезии, такие как VWF, которые в целом не доступны с использованием стандартных методов клеточной культуры. Например, известно, что конформация нескольких внеклеточных матричных белков отличается в зависимости от их расположения. В кровеносной системе гликопротеины, такие как фибронектин, циркулируют в шаровой конформации, в то время как во внеклеточной матрице белки появляются как многофункциональные и мультимеризированные эшафоты19,20. Кроме того, несколько распространителей микрофлюидного оборудования предлагают стандартизированные слайды канала, предварительно покрытые различными типами коллагена (например, субэндотелиальные коллагены или другие белки, полученные из плазмы). Эти слайды канала подходят для визуализации и количественного анализа бактериальной адгезии к конкретным внеклеточным матричным белкам в различных ситуациях потока.

Различные микрофлюидные системы можно классифицировать на основе различных материалов, используемых для производства микроустройств. В связи с этим стеклянные/силиконовые платформы отличаются от полимерных и бумажных платформ21. Полимерные слайды канала производятся с эластично поддерживаемой поверхностью (ESS), как правило, требуют поверхностного покрытия для вложения клеток во время экспериментов потока. В качестве альтернативы покрытию с поддерживающими схватом компонентам, такими как коллаген, поверхность некоторых коммерчески доступных слайдов канала физически модифицирована, что создает гидрофильные и клеевые поверхности, пригодные для большинства типов клеток. Кроме того, некоторые слайды канала генерируются с помощью субстратов, как полидиметилсилоксан (PDMS), который является проницаемым кислородом, а также позволяет культуру клеток кровеносных сосудов на внутренней поверхности микроканалов в жидкостных системах насоса22, 23.

Микрофлюидическая система, которая использовалась в этих исследованиях, служила эффективной и надежной системой, которая применялась для анализа взаимодействия золотистого стафилококка с мультимеризированными волокнами VWF после культуры эндотелиальных клеток человека в потоке 24,25. Эта микрофлюидная система представляет собой закрытую круговую систему перфузии, которая позволила анализу инфекции патогенными бактериями при условиях биобезопасности 2. Кроме того, слайды канала подходят для микроскопического мониторинга во время течения и доступны с различными препоями (например, желатин, поли-Л-лизин, или коллаген-IV), которые обеспечивают сливки клеток и высокую степень экспериментальной воспроизводимости. Этот протокол использует микрофлюидную систему (см. Таблицу Материалов) для создания перфузируемой модели инфекции для S. pneumoniae, тем самым имитируя ситуацию потока в сосудистой системе человека8.

Описанная общая процедура вложения бактериальных клеток в этой микрофлюидной системе также может быть проведена с другими типами насосных систем, генерирующих определенный и непрерывный поток в стерильной среде. Для микрофлюидных целей используются в основном четыре типа систем управления потоком: i) перистальтические насосы и рециркуляционные насосы, которые используются в этом протоколе, ii) шприц-насосы, iii) контроллеры давления и iv) контроллеры давления с матрицами переключателя потока. Каждый вид системы управления потоком имеет преимущества и недостатки в зависимости от конкретного микрофлюидного применения и способности проводить микроскопическую визуализацию в режиме реального времени. В большинстве приложений, требующих непрерывной циркуляции образцов, рециркуляционные насосы сочетаются с контроллерами давления на основе программного обеспечения для обеспечения определенной ситуации потока. Это также оптимизировано в насосной системе, продемонстрированных здесь. Системы насосов на основе шприца можно разделить на «классические» шприц-насосы, которые генерируют колебания потока, и «беспульсивные» микрофлюидные шприцевые насосы. Эти шприц насосна системы, как правило, просты в использовании, но управление потоком в тупиковых каналов является сложной задачей с помощью шприцев насосов. Кроме того, изменения потока внутри чипа могут занять некоторое время, и для определения скорости потока требуется измеритель потока. Даже бесприсражающие шприц-насосы могут генерировать периодическую пульсацию на частоте потока из-за поэтапного двигателя шприца насоса. Еще два шприца насоса устройство способно генерировать "наполнить и вывести" на основе жидкости движения, которое применяется определенные силы сдвига на поверхности клеток и подходит для микродиализ приложений даже в ПК-независимым образом. Эта система должна сочетаться с микротрубами для соединения камер или слайдов каналов для культивирования клеток с последующим микроскопическим анализом.

Вышеупомянутые контроллеры давления являются системами управления потоком, которые давят на бак, содержащий образец, который плавно вводится в микрофлюидной камере или на чипе. Контроллеры давления могут установить беспристыный поток, а также обеспечить скорость потока в сочетании с счетчиками потока. Сочетание контроллеров давления с матрицами переключателя потока позволяет быстроперемливаться без обратных потоков. Рециркуляционная система, представленная здесь, позволила порода сдвига значения стресса обычно сообщается для сосудистой системы человека26. В vivo сосудистых стенок сдвига стресс был оценен из стенки сдвига ставки, полученные из неинвазивно зарегистрированных профилей скорости, и вся вязкость крови в крупных артериях и вязкость плазмы в артериолях26. Ренеман и Hoeks записали профили скорости в крупных артериях с помощью специально разработанной ультразвуковой системы и в артериолах с помощью оптических методов с использованием флуоресцентных трассификаторов скорости потока26. Средний стресс сдвига 11-13 dyn/cm2 достигается в сонной артерии, в отличие от только 4-5 dyn/cm2 в брахиальной артерии. Пиковые значения до 25-70 dyn/cm2 были проверены для сонной артерии. Значения напряжения сдвига малых и средних вен колеблют от 0,1 до 0,5 дина/см2. В описанной здесь микрофлюидной системе применимое значение стресса сдвига зависит от выбранного диаметра перфузийных труб, высоты слайда канала и вязкости используемой жидкостной среды. Выбранная текучая установка состояла из слайда высотой 0,4 см (объем 100 л) в сочетании с перфузионным набором длиной 50 см и диаметром 1,6 мм, а средняя вязкость составляла 0,0072 дюйма/см2. Эта настройка подходит для диапазона напряжения сдвига между 3,5 и 31,2 dyn/cm2 при нормах потока 3,8-33,9 мл/мин. Кроме того, управление программным обеспечением насоса давления может применять импульсный средний поток, который может имитировать импульсный артериальный кровоток.

Успешное, надежное и воспроизводимое использование этого комбинированного метода микрофлюидной инфекции требует некоторых мер предосторожности, которые необходимо иметь в виду. Во время процесса инфекции в микрофлюидных условиях, клеточный слой может подвергаться цитотоксических или цитолитических бактериальных соединений, таких как пневмолизин, которые влияют на жизнеспособность эукариотических клеток и ослабить присоединение клеток к поверхности слайда. Таким образом, сохранение постоянного потока требуется на протяжении всего курса эксперимента и целостность морфологии клеток должны часто контролироваться. Кроме того, среда культуры потока должна обеспечивать все необходимые питательные вещества эндотелиальным клеткам, чтобы обеспечить плотное поверхностное крепление клеток на протяжении всего инфекционного эксперимента. Тем не менее, следует отметить, что средние добавки содержат вещества, которые могут вмешиваться или препятствовать взаимодействию между бактериями и конкретными белками хозяина. В исследованиях взаимодействия пневмококка-VWF, например, гепарин должен быть истощен из среды клеточной культуры, потому что он подавляет связывание пневмококки к VWF8.

Другим важным шагом в культуре потока эндотелиальных клеток является поддержание плотной клеточной сливки, которая зависит от общей жизнеспособности клеток и от уровня дифференциации. Сдвига потока устойчивых клеток сцепление первичных эндотелиальных клеток было достигнуто только тогда, когда клетки были строго хранятся в субстойности до воздействия сдвига стресса. С другой стороны, производство WPB напрямую зависит от сближи эндотелиального клеточного слоя, способствующего жесткой ячейке-контактов13. Преимущество микрофлюидной клеточной культуры первичных эндотелиальных клеток покрывает сильно индуцированную пролиферацию клеток, которая быстро приводит к образованию сливаемого клеточного слоя в условиях потока. Клетки плотно прикреплены друг к другу, коллективно ориентированы в направлении потока, и представляют собой высоко дифференцированный фенотип, который необходим для производства секреторных WPB. Эти WPB служить в качестве хранения пузырьков для VWF, вазодилатации активаторов, и цитокинов, которые exocytosed как белок очередей на стимуляцию гистамина или пневмолиза деятельности27,13. Таким образом, генерация высоко клей, сливая слой клетки дифференцированных первичных эндотелиальных клеток в низкой пролиферации проходов является необходимым условием для эффективного выпуска VWF и формирования строк VWF на поверхности клетки и анализ бактерий-VWF-взаимодействия в условиях потока. Таким образом, следует отметить, что дифференциация эндотелиальных клеток приняла 48 ч культивирования потока, как минимум, и требует постоянного потока сдвига без каких-либо изменений в давлении насоса. Любые изменения могут привести к внезапному среднему взрыву, который выведет клетки из слайда. Кроме того, во время микроскопической визуализации микрофлюидная горка и средние резервуары насосной системы должны быть сохранены при температуре 37 градусов по Цельсию, поскольку это представляет собой оптимальный температурный оптимальный показатель человеческих клеток.

Увековеченные линии клеток человека подходят для многих научных экспериментов и часто используются в исследованиях клеточной культуры инфекции. Эти клеточные линии имеют некоторые общие технические преимущества, такие как низкие или умеренные требования к культуре и неограниченное распространение, что позволяет пропускать несколько сотен раз без значительных изменений в морфологии или профилях рецепторов. Однако эти клеточные линии представляют собой одиночную монокультуру и подвергаются искусственным двумерным условиям роста. 28 Недостающий физиологический источник среды ткани приводит к существенным изменениям функционального и морфологического фенотипа клеток с каждым прохождением культуры29. До других экспериментов с бактериальной адгезией, был определен профиль поверхностно-экспонированных клеточных белков и рецепторов основных эндотелиальных клеток легких человека в различных проходах клеточной культуры. Анализ цитометрии потока показал сильно уменьшенное выражение специфических белков поверхности such as молекула адотелиальной клетки стежка сколы тромбоцитов 1 (PECAM1) в пределах 8 кругов пропускания клетки. Кроме того, выраженный профиль рецепторов интегрина был значительно изменен в более высоких клеточных проходах в пользу клеточного типа неспецифических атегринов и уменьшенного типового шаблона рецепторов интегрина (Bergmann et al., неопубликованные данные). Эти результаты особенно актуальны для анализа взаимодействий патогенно-хозяина в исследованиях инфекционной биологии. С целью поддержания фенотипических клеточных характеристик и высокого уровня функциональной дифференциации во время микрофлюидной клеточной культуры во время бактериальной инфекции, первичные эндотелиальные клетки из нескольких доноров были выбраны в этом случае и используются только до пяти проходов максимум для того, чтобы сохранить фенотипические характеристики как можно болееконкретными 8.

Комбинированная визуализация бактерий и специфических структур поверхности клеток во время потока требует оптимизированного протокола окрашивания флуоресценции. Используя различные комбинации непосредственно обозначенных белков, флуоресцентных белково-выражающих бактерии и флуоресцентно-конъюгированные антитела, процедуры окрашивания иммунофлюоресценции могут быть специально адаптированы к целям визуализации. Эти процедуры позволяют определить и четко микроскопической визуализации, а также дифференциации и количественной бактериальной приверженности и интернализации3,13,30,31. Иммунофлуоресценция на основе обнаружения интернализированных бактерий требует клеточной пермяки шаг, таких как короткий Triton X-100 инкубации, которая может привести к отслоению клеток. Таким образом, обнаружение процессов интернализации бактерий, происходящих в культуре потока, должно быть визуализировано после инкубации потока с использованием образцов, связанных с ПФА-перекрестными. Для визуализации бактерий в потоке в реальном времени, использование генетически модифицированных бактерий, выражающих флуоресценцию белков позволяет быстро и целенаправленное микроскопическое обнаружение. RFP-выражая штаммы пневмококка, которые были созданы с помощью эффективной генетической конструкции, разработанной Kjos и Veening16,8 были использованы в этом экспериментальном исследовании. Для обнаружения строк VWF в потоке были протестированы различные антитела с флуоресцеи, маркированные ФЛуоресцеем. Для получения оптимального сигнального ответа на минимизированном неспецифическом фоне, адекватная концентрация антител последовательно титра для каждого прикладного антитела.

Для микроскопической визуализации живых клеток, жидкостной блок и слайд канала удаляются из инкубатора CO2 и помещаются в камеру, предварительно разогретую до 37 градусов по Цельсию в микроскопе. Эта камера не может быть скорректирована до 5% CO2. Без карбонатной буферизированной атмосферы морфология HUVEC и бактериальная пригодность оставались нетронутыми в течение 180 мин, что достаточно для анализа бактериального присоединения, опосредованного VWF. Если требуется более длительное время инфицирования и микроскопический мониторинг за пределами инкубатора CO2, необходимо использовать среду культуры буферизированных клеток для компенсации сдвига рН из-за недостаточной концентрации CO2. Кроме того, вся система может быть помещена обратно в инкубатор CO2 между шагами временных рядов микроскопической визуализации.

В дополнение к обнаружению флуоресценции в режиме реального времени, бактериальная инфекция эндотелия в слайде канала может быть остановлена и сохранена путем среднего обмена с параформальдегидом (PFA) в качестве вещества фиксации. После фиксации в потоке, оптимизированное и пошаговое иммунофлуоресценции окрашивание поверхности клетки в слайде канала позволяет создавать ценные микроскопические визуализации снимка и обеспечивает универсальное комбинированное обнаружение структуры специфические клеточные соединения, участвующие во взаимодействии между бактериями и клетками-хозяинами. Научная выгода этого комбинированного метода заключается в том, что слайд канала, обработанный PFA, может храниться и использоваться для окрашивания структур, представляющих интерес, после потока иммунофлуоресценции. Лечение PFA инактивирует бактерии и таким образом арестовывает экспрессию RFP-белка. Таким образом, пневмококк-специфический антисыворот кашель был создан в кролика для бактериального обнаружения иммунной и визуализации была выполнена с помощью кролика конкретных AlexaFluor568-конъюгированных вторичных антител8. Как уже упоминалось, использование различных комбинаций антител требует точной оптимизации количества антител и блокирующего буферного состава. В противном случае неспецифические фоновые сигналы и эффекты перекрестного обнаружения могут привести к результатам искусственного окрашивания. Оптимизированная процедура окрашивания иммунофлуоресценции может быть легко использована для обнаружения различных клеточных целей, таких как актиновый цитоскелет или эндосомальные маркеры13,31.

Эта процедура может быть адаптирована для создания более сложной среды тканей, которая имитирует физиологию с гистологической, физиологической и функциональной точки зрения. Представленный анализ инфекции может быть эффективно использован для ответа на несколько научных вопросов одновременно с помощью в линии соединения нескольких слайдов канала к одному набору перфузии. Эта расширенная настройка облегчила бы анализ различных типов клеток, клеточных слияний и различных слайд-покрытий в пределах одного и того же потока, параметра устанавливающегося параллельно, и позволила бы прямое сравнение бактериальных инфекций различных типов клеток. Кроме того, серийный в линии соединения и комбинированный анализ нескольких слайдов канала также предоставляет возможность экспериментов временных рядов, которые могут быть применены для профилирования экспрессии генов (например, анализ фактора вирулентности, зависящей от времени инфекции экспрессии гена).

Анализ инфекции также может быть расширен до постоянного состояния ламинарного потока продолжительностью несколько дней или даже недель для того, чтобы проанализировать клеточную реакцию в условиях, имитирующих долгосрочную фазу хронической инфекции. В дополнение к представленной одноклеточной культуры типа, некоторые примеры гетеротипической культуры клеток в микрофлюидных устройств культуры клеток уже сообщалось32,33. Это позволяет высокой пропускной фармакологических исследований и может в конечном итоге привести к использованию микрофлюидных систем культуры клеток для регенеративных целей, а также34.

Таким образом, микрофлюидная система в сочетании с процедурами иммунного окрашивания служила ценной моделью для анализа патомеханизмок между бактериями и клетками-хозяевами в среде, имитирующей условия в сосудистой системе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Проект финансировался DFG (BE 4570/4-1) в S.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-syringe Fisher Scientific 10303002 with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe Sarstedt 9077136 For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase eBioscience now thermo fisher 00-4555-56 protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin Abcam ab176751 no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody Thermo Fisher Sientific A11001 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody Thermo Fisher Scientific A-11011 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth Becton Dickinson GmbH BD 249210 complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-25G solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter TPP 90026 subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R Beckman Coulter Life Sciences 392304 spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30 Beckman Coulter Life Sciences B06314 spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK Hermle 305.00 V05 - Z 216 M spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3886.2 used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing ibidi 10821 for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator Fisher Scientific MIDI 40 incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-Incubator Sanyo MCO-18 AIC for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar plates Becton Dickinson GmbH PA-254005.06 agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer Dell Latitude 3440 Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) Leica DMi8 An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3904.1 used for PBS buffer
Drying material Merck 101969 orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix Promocell C-39215 supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMS Promocell C-22010 ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) Promocell C-22010 culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS) biochrome now Merck S 0415 supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody Abcam ab8822 stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit ibidi 10903 fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G-1890-100g for precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochloride Sigma Aldrich H-7250-10MG for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) Promocell C-12203 Lot-Nr. 396Z042 primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) Santa Cruz sc73268 stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port ibidi 10820 for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope Zeiss Axiovert 35M inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) ibidi 80176 physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) Sigma Aldrich M7506-500G For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump ibidi 10905 air pressure pump
Neubauer cell counting chamber Karl Hecht GmbH&Co KG 40442002 microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710-S for cross linking of samples
Perfusion Set ibidi 10964 Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS) the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes Sarstedt 67,741 (2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum Pineda raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 6781.1 used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) ibidi v1.5.4 Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mL Sarstedt 72.706/ 72.695.500 required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volume Sarstedt 6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci National Collection of Type Cultures, Public Health England 10,319 Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mL Sarstedt 86.1253.025/ 86.1254.025 for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) Sigma Aldrich 451614-25G for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe P030.2 used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22 Biochrom 80-2115-20 measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose Sigma Aldrich S0389-500G for preparation of blocking buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-500ML Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract oxoid LP0021 bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
  29. Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218 (1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 152 Стрептококк пневмонии микрофлюидные эндотелиальные клетки микроскопия флуоресценция сдвига стресс присоединение
Пневмококк инфекция первичных эндотелиальных клеток человека в постоянном потоке
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jagau, H., Behrens, I. K., Steinert, … More

Jagau, H., Behrens, I. K., Steinert, M., Bergmann, S. Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow. J. Vis. Exp. (152), e60323, doi:10.3791/60323 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter