Summary
该协议旨在使整个科学界的深层欧洲系统的准备工作标准化，以便这些系统能够重现。
Abstract
制备深结构系统（DES）是一个简单的程序。根据定义，两个或多个组件以给定摩尔比混合在一起，形成 DES。然而，根据我们在实验室的经验，有必要标准化编写、描述和报告不同研究人员遵循的方法的程序，以便可以重现所发表的结果。在这项工作中，我们测试了文献中报告的不同方法，以制备环境系统，并评估水在室温下成功制备液体系统的重要性。这些已发表的eutec系统由柠檬酸、葡萄糖、蔗糖、苹果酸、β-丙氨酸、L-酒石酸和βine组成，并非所有所述制备方法都可以重现。然而，在某些情况下，有可能重现所述系统，将水作为欧特克混合物的第三个组成部分。
Introduction
深溶剂被命名为21世纪的溶剂，被认为是新一代的溶剂。它们被定义为两种或两种以上化合物的混合物，其比重为特定的摩尔比，导致单个组分的熔融温度显著降低，在室温1、2下变成液体。3.从这个意义上说，溶剂的制备不需要任何化学反应，因此产量为100%。2011年，Choi和同事报告了自然发生DES的可能性，并命名为它们，天然深水溶剂（NADES）3，4，5。NADES可以从糖、氨基酸、有机酸和胆碱衍生物的不同组合中制备;这些由天然成分制备的系统具有固有的生物相容性和可生物降解性，与其他替代溶剂（如离子液体）5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、6、5、 7，8.自2015年以来，该领域的出版物数量呈指数级增长，NADES的可能应用非常广泛。尽管许多手稿和评论已经出版，但一些基本问题依然存在，科学家尚未找到诸如DES形成机制等有趣问题的答案。了解DES的形成机制将导致对开发新系统采取综合办法，而不是目前的试验和错误办法。此外，随着消费者更加意识到其产品的可持续性，不仅在其最终寿命方面，而且在加工本身方面，这一机会每天都在增加。 10.为了推动深溶剂领域的重大创新，首先需要生产和表征方法的标准化。文献中报告的一些系统缺乏可重复性，这是我们多次面对这个问题时发展这项工作的动机。在此，我们证明了准确描述材料和方法的必要性和关键的重要性，并表明，虽然DES的编制是一个简单明了的程序，但有一些关键方面（例如，存在/水量），即必须始终讨论。
Protocol
注：研究的NADES为βine：L-（+）-酒石酸（2：1），β-丙氨酸：DL-苹果酸（3：2），葡萄糖：蔗糖（1：1）和柠檬酸：葡萄糖（2：1）。这些系统采用不同方法制备：冷冻干燥（FD）、真空蒸发（VE）以及带水和无水的热和搅拌（HS）。例如，给出了系统柠檬酸：葡萄糖（2：1）的协议。NADES的特点是差分扫描热度（DSC）、极化光学显微镜（POM）、含水量和核磁共振（NMR）光谱。
1. NADES 准备
- 冷冻干燥
- 在单独的容器中，加入2克柠檬酸单水合物和0.9530克葡萄糖单水合物。在每个水中加入10 mL的去离子水，搅拌，直到化合物完全溶解。
- 将两种解决方案混合在一起，确保最终解决方案的均质化。将溶液放入圆形底瓶中。
- 用液氮冷冻。将烧瓶放入冷冻干燥器中 48 小时，以确保从样品中取出所有水。
- 真空蒸发
- 在单独的容器中称量2克柠檬酸单水合物和0.9530克葡萄糖单水合物。在每个水中加入10 mL的去离子水，搅拌，直到化合物完全溶解。
- 将两种解决方案混合在一起，确保解决方案的均质化。将溶液放入圆形底瓶中。
- 使用旋转蒸发器干燥样品，直到形成透明粘性液体。
- 加热和搅拌
- 将2克柠檬酸单水合物和0.9530克葡萄糖单水合水液称重至同一小瓶中。加入278 μL的水。
- 将小瓶与磁性搅拌棒放在 50°C 水浴中。
- 离开样品，直到形成透明粘性液体。
2. NADES 特性
- 极化光学显微镜 （POM）
- 将一滴 NADES 放在显微镜玻璃幻灯片上进行观察。
- 使用显微镜的传输模式，在室温下对样品进行光学表征。
- 卡尔-菲舍尔滴定
- 在注射器中收集100μL的NADES，然后清洁外部多余的液体。
- 将注射器放在秤上，然后将其放入。
- 按 KF 设备上的START，向容器中添加一小滴样品。
- 称量注射器，进入 KF 设备上的质量，然后按ENTER。结果将以 ppm 的水为单位显示在屏幕上。
- 差分扫描热度 （DSC）
- 将每个样品的3-10毫克放入带盖盖的密封铝锅中。用样品按压机关闭平底锅。
- 使用温度范围为-90°C到降解温度的DSC分析样品，加热速率为10°C/min。在氮气（50 mL/min）下，以2分钟的等温保持执行两个循环，并进行分析。
- 核磁共振（NMR）
- 用250μL的二甲基磺酸-d6（DMSO-d6）溶解250μL的NADES，制备5毫米NMR管。
- 在 400 MHz 光谱仪上以 25 °C 采集1 个H 和 NOESY 光谱。
- 使用适当的软件分析光谱，并使用 DMSO-d6 的化学偏移（± 2.50 ppm）分配每个组件的所有信号。
Representative Results
从NADES的制备，我们期望得到的结果如图1所示。下面将介绍每个系统。使用冷冻干燥方法，结果应该是固体或非常密集的糊状物，因为所有的水都从系统中去除。使用蒸发法，结果应该是透明粘性液体。使用加热和搅拌方法，加入少量水，结果应该是一个清晰和非常粘稠的液体。
从 POM 获得的结果如图1所示。当 NADES 完全形成时，我们期望看到一个黑色图像，表明样品是完全无定形的，并且系统中没有残留的晶体。表2描述了从KF滴定中获得的结果。除了添加到系统中的水量外，最终混合物的水量也取决于试剂的含水量。
关于DSC，该技术的目标还在于确认系统在将应用的温度范围内是液体，因此预期的结果是具有一个热图，在感兴趣的温度范围内显示没有热事件（表2）).NMR技术用于确认氢键形成的存在，这是NADES系统的主要特征。这可以通过观察每个信号的化学变化，并通过对NOESY光谱的分析来证实，该光谱显示了空间和分子间的相关性（图2）。
| 组件 1 | 组件 2 | 制备方法 | 参考 |
| 贝塔因（贝特） | L-（+）-酒石酸（LTA） | 真空蒸发 （VE） | 戴等人（2013年）5和埃斯皮诺等人（2016年）6 |
| β-阿兰宁 （β-A） | DL-马里奇酸（MA） | 真空蒸发 （VE） | 戴等人（2013年）5和埃斯皮诺等人（2016年）6 |
| 葡萄糖（葡萄糖） | 蔗糖（蔗） | 冷冻干燥 （FD） | Choi等人（2011年）4和埃斯皮诺等人（2016年） 6 |
| 柠檬酸 | 葡萄糖（葡萄糖） | 冷冻干燥 （FD） | Choi等人（2011年）4和埃斯皮诺等人（2016年） 6 |
表 1：文献中报告的系统及其制备方法。
| NADES | 制备方法 | 含水量（%） |
| 卡尔·菲舍尔测量 | ||
| 投注：LTA （2：1 + 20% 水） | 加热和搅拌，加水 | 19.94 × 1.28 |
| 投注：LTA （2：1） | 真空蒸发 | 11.36 ± 0.78 |
| +-A：MA （3：2 + 11% 水） | 加热和搅拌，加水 | 11.45 ± 0.25 |
| +-A：MA （3：2） | 真空蒸发 | 18.84 × 1.78 |
| 格鲁克：苏克（1：1 + 21%水） | 加热和搅拌，加水 | 20.88 × 0.13 |
| 格鲁克：苏克 （1：1） | 真空蒸发 | 22.56 × 0.48 |
| CA：格鲁克（2：1 + 17% 水） | 加热和搅拌，加水 | 17.33 ± 0.68 |
| CA：格鲁克 （2：1） | 真空蒸发 | 20.04 ± 0.26 |
表 2：含水量（%）用不同方法制备的系统。
图1：NADES的代表性结果，当由a）冷冻干燥，b）真空蒸发和c）加热和搅拌加水。图片显示，当系统冻结干燥时，获得的结果是晶体，因为所有水都从混合物中去除，而当使用VE和HS方法时，NADES形成所需的水量存在，所得结果是一个水室温下原体液体。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：CA：Glu（2：1）的极化光学显微镜采用不同方法制备，具有交叉偏振器（左图）和平行偏振器（右图）=100μm（10倍放大）。黑色图像显示样品在室温下是液体。FD样品是完全结晶的，因为从该技术获得的结果不是液体。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：a）（A） NADES 系统柠檬酸的1H NMR 光谱：葡萄糖：水 （2：1：4）、（B） 葡萄糖和 （C） 柠檬酸;b） NADES系统柠檬酸的NOESY光谱：葡萄糖：水（2：1：4）。叠加光谱显示了DES形成时每个组分的化学变化差异，其起因是它们之间建立氢键。NOESY光谱显示来自柠檬酸的OH质子与两个组分的其余质子之间的相互作用。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
文献中报告的用于制备NADES的不同方法是加热和搅拌方法（HS）、真空蒸发（VE）和冷冻干燥（FD）。我们在这项工作中准备的系统是由不同的作者在文献4，5，6，10，11中描述。表1列出了原稿中报告的每种混合物的成分及其制备方法。
经过对上述系统的重现研究，我们意识到在某些情况下，不可能在室温下实现类似的NADES，即透明、粘性液体样品。准备 NADES 取决于许多因素。有些可以很容易地控制，但有些更难标准化。要考虑的最重要因素是，最终产品不能依赖于外部因素，如所使用的设备。
然后对采用不同方法制备的系统进行了描述。使用偏振光学显微镜（POM），观察到在HS方法没有水的情况下，即使在不同的温度下，NADES也没有形成清晰和粘稠的液体。然而，在用少量水应用HS方法和VE方法制备NADES时，观察到了同质和透明粘性液体，如图1所示。
DSC 用于确定混合物的热事件。结果表明，该系统在室温下为液体，温度高达130°C，因为热图显示无热事件。每个样品的含水量由卡尔-菲舍尔滴定测量，结果在表2中显示。必须报告系统的含水量，因为它是影响所获取液体特性的参数，如粘度和极性。这些变化对设计 NADES 的应用程序的结果有很大的影响。
NMR还用于确认上述NADES系统的形成，通过在每个系统的分子之间形成氢键。在 NADES系统柠檬酸：葡萄糖 （2：1） 图 2 中给出了一个示例，其中 HS 获取了 17% 的水，其中此 NADES 的质子光谱和起始材料（柠檬酸和葡萄糖）覆盖（图 2a）。从中，可以观察到每个分子中某些质子的化学转移变化。主要的变化是OH质子从柠檬酸的转移。最初，此信号出现在 5.16 ppm，但由于氢键的形成，该信号转移到 6.22 ppm。这一点由NOESY光谱（图2b）证实，其中来自柠檬酸的OH和其余质子之间的强相互作用是可见的。其他NADES系统也观察到类似的相互作用。
在这项研究中，我们观察到，由于缺乏有关大多数系统含水量的信息，文献中报告的eutectic系统的制备方法的描述有时不完整。在VE方法中，通过制备不同成分的溶液并在温度下混合，从而形成水系系统来添加水;但是，我们无法确定所需的最低含水量。因此，考虑对形成系统所需的水百分比的了解，这是应始终报告的一个关键点，以便其他人能够重现不同水混合物的制备。
最好的使用方法是添加水的 HS 方法，因为对于已经描述含水量的情况，准备时间更少。但是，如果此信息不可用，最简单的方法是 VE 方法，其中所有可用水被移除，系统中仅保留与 NADES 组件交互的水。在任何情况下，研究人员都应该让系统蒸发足够长的时间，以确保从系统中去除游离水。此时间取决于设备，因此在材料部分描述 VE 方法的持续时间是不够的，但水含量始终要报告。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目根据No ERC-2016-CoG 725034的赠款协议，根据欧盟Horizon 2020研究和创新计划，获得了欧洲研究理事会（ERC）的资助。这项工作还得到了绿色化学-LAQV副实验室的支持，该实验室由FCT/MCTES（UID/QUI/50006/2019）的国家基金资助，并通过CryoDES项目（PTDC/EQU-EQU/29851/2017）获得FCT/MCTES的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mm NMR tube | Norell | ||
| Acid citric monohydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Advance III spectrometer | Bruker | ||
| Deionized water | |||
| dimethyl sulfoxide-d6 | Sigma-Aldrich | ||
| DSC Q200 | TA Instruments, USA | ||
| Freeze-dryer CHRIST ALPHA 1-4 | Braun Biotec International | ||
| Glucose monohydrate | Cmd chemicals | ||
| Karl Fisher Coulometer | Metrohm | ||
| Olympus BX-51 polarized optical microscope | Olympus |
References
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