Summary
Denne protokol har til formål at standardisere forberedelsen af dybe, eutektiske systemer i hele det videnskabelige samfund, således at disse systemer kan gengives.
Abstract
Forberedelsen af dybe eutektisk Systems (des) er a priori en simpel procedure. Ved definition blandes to eller flere komponenter sammen på et givet molært forhold for at danne en DES. Men fra vores erfaring i laboratoriet, er der behov for at standardisere proceduren for at forberede, karakterisere og rapportere de metoder, efterfulgt af forskellige forskere, således at de offentliggjorte resultater kan gengives. I dette arbejde tester vi forskellige tilgange rapporteret i litteraturen til at forberede eutektisk systemer og evalueret vigtigheden af vand i den vellykkede forberedelse af flydende systemer ved stuetemperatur. Disse offentliggjorte eutektisk-systemer bestod af citronsyre, glucose, saccharose, æblesyre, β-alanin, L-vinsyre og betain, og ikke alle de beskrevne tilberedningsmetoder kunne gengives. I nogle tilfælde var det imidlertid muligt at reproducere de beskrevne systemer med medtagelse af vand som en tredje bestanddel af den eutectiske blanding.
Introduction
Dybe eutektisk opløsningsmidler er blevet navnet opløsningsmidler til det 21 århundrede og betragtes som en ny generation af opløsningsmidler. De defineres som en blanding af to eller flere kemiske forbindelser ved et bestemt molært forhold for at resultere i et betydeligt fald i Smeltetemperaturen for de enkeltekomponenter, idet de bliver flydende ved stuetemperatur1,2 3. i den forstand kræver tilberedning af opløsningsmidler ingen kemisk reaktion, og produktionsudbyttet er derfor 100%. I 2011 rapporterede Choi og co-Workers muligheden for naturligt forekommende des og navnet dem, naturlige dybe eutektisk opløsningsmidler (Nades)3,4,5. NADES kan fremstilles af forskellige kombinationer af sukker, aminosyrer, organiske syrer og cholin derivater; og disse systemer, der er fremstillet af naturlige komponenter, er i sig selv biokompatible og bionedbrydelige og præsenterer betydeligt mindre toksicitet sammenlignet med andre alternative opløsningsmidler (f. eks. Ioniske væsker)5,6, 7,8. Siden 2015 er antallet af publikationer i marken steget eksponentielt, og de mulige anvendelser af NADES er meget brede3. Selv om mange manuskripter og anmeldelser er blevet offentliggjort, er der grundlæggende spørgsmål, der fortsætter, og forskerne har endnu ikke fundet svaret på spændende spørgsmål som de mekanismer underliggende DES formation. Forståelse af DES formation-mekanismen ville føre til en konsolideret tilgang til udviklingen af nye systemer i stedet for den nuværende retssag og fejl tilgang. Desuden vokser mulighederne på området hver dag, da forbrugerne bliver mere bevidste om bæredygtigheden af deres produkter, ikke kun med hensyn til deres endelige levetid, men også med hensyn til selve behandlingen af8,9, 10. For at drive store innovationer inden for dybe eutektisk opløsningsmidler, standardisering af produktion og karakterisering metoder er først påkrævet. Den manglende reproducerbarhed af nogle af de systemer, som blev rapporteret i litteraturen, var motivationen til at udvikle dette arbejde, da vi oplevede dette problem flere gange. Heri viser vi behovet og afgørende betydning for præcist at beskrive materialer og metoder og vise, at selv om forberedelsen af DES er en enkel og ligetil procedure, er der nogle vigtige aspekter (f. eks. tilstedeværelsen/mængden af vand), der skal altid diskuteres.
Protocol
Bemærk: de undersøgte NADER var betain: L-(+)-vinsyre (2:1), β-alanin: DL-æblesyre (3:2), glucose: saccharose (1:1) og citronsyre: glucose (2:1). Disse systemer blev fremstillet ved forskellige metoder: Frysetørring (FD), vakuum fordampning (VE) og varme og omrøring (HS) med og uden vand. Som et eksempel, protokollen for systemet citronsyre: glucose (2:1) er givet. Nades var karakteriseret ved differentiel scanning hele kroppen vha (DSC), polariseret Optisk mikroskopi (POM), vandindhold og nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi.
1. forberedelse af NADES
- Frysetørring
- I separate beholdere tilsættes 2 g citronsyremonohydrat og 0,9530 g glucosemonohydrat. Tilsæt 10 mL deioniseret vand til hver og rør, indtil forbindelserne er helt opløst.
- Bland de to opløsninger sammen, og sørg for homogenisering af den endelige opløsning. Opløsningen anbringes i en rund bund kolbe.
- Fryse det ved hjælp af flydende nitrogen. Kolben anbringes i en fryse tørrer til 48 h for at sikre, at vandet fjernes fra prøven.
- Vakuum fordampning
- 2 g citronsyremonohydrat og 0,9530 g glucosemonohydrat vejes i separate beholdere. Tilsæt 10 mL deioniseret vand til hver og rør, indtil forbindelserne er helt opløst.
- Bland de to opløsninger sammen, og sørg for homogenisering af opløsningen. Opløsningen anbringes i en rund bund kolbe.
- Ved hjælp af en rotationsfordamper tørres prøven, indtil der dannes en klar, viskøs væske.
- Opvarmning og omrøring
- 2 g citronsyremonohydrat og 0,9530 g glucosemonohydrat vejes i samme hætteglas. Tilsæt 278 μL vand.
- Anbring hætteglasset med en magnetisk omrørings stang i et 50 °C-vandbad.
- Lad prøven stå, indtil der dannes en klar, viskøs væske.
2. NADES Karakteristik
- Polariseret Optisk mikroskopi (POM)
- Placer en dråbe NADES på et mikroskop glas rutsjebane til observation.
- Ved hjælp af et mikroskop transmissions tilstand udføres den optiske karakterisering af prøven ved stuetemperatur.
- Karl-Fisher-titrering
- Saml 100 μL NADES i en sprøjte, og rengør derefter den overskydende væske udvendigt.
- Placer sprøjten på en skala og Tara den.
- Tryk på Start på KF-udstyret, og tilsæt en lille dråbe af prøven til beholderen.
- Afvejes sprøjten, Indtast massen på KF-udstyret, og tryk på Enter. Resultatet vises på skærmen i ppm af vand.
- Differens scanning hele kroppen vha (DSC)
- Placer 3-10 mg af hver prøve i en hermetisk aluminiums gryde med et dæklåg. Luk gryden med et prøvetryk.
- Prøverne analyseres ved hjælp af en DSC med et temperaturområde på-90 °C op til nedbrydningstemperaturen med en opvarmningshastighed på 10 °C/min. Udfør to cyklusser med et isotermisk hold på 2 min og analysér under en nitrogenatmosfære (50 mL/min).
- Nuklear magnetisk resonans (NMR)
- Forbered et 5 mm NMR-rør ved at opløse 250 μL NADES med 250 μL dimethylsulfoxid-D6 (DMSO-d6).
- Få 1H og NOESY Spectra ved 25 °c på et 400 MHz spektrometer.
- Brug en passende software til at analysere spektrene, og brug den kemiske forskydning af DMSO-D6 (δ 2,50 ppm) til at tildele alle signalerne fra hver komponent.
Representative Results
Fra forberedelsen af NADES vises de resultater, vi forventer at opnå, på figur 1. En beskrivelse af hvert system er lavet nedenfor. Ved hjælp af frysetørring metode, bør resultatet være en solid eller en meget tæt pasta, da alt vandet er fjernet fra systemet. Ved anvendelse af fordampnings metoden skal resultatet være en klar og viskøs væske. Ved hjælp af opvarmning og omrøring metode med tilsætning af små mængder vand, bør resultatet være en klar og meget viskøs væske.
De opnåede resultater fra POM kan ses på figur 1. Når en NADES er helt dannet, forventer vi at se et sort billede, hvilket indikerer, at prøven er helt amorfe, og at der ikke er nogen krystaller tilbage i systemet. De resultater, der opnås ved KF-titrering, er beskrevet i tabel 2. Ud over mængden af vand, der tilsættes til systemerne, afhænger procentdelen af vand af den endelige blanding også af reagenserne vandindhold.
Med hensyn til DSC, er målet med denne teknik også at bekræfte, at systemet er flydende i det temperaturområde, at det vil blive anvendt, så det forventede resultat er at have et termo gram, der viser ingen termiske hændelser på temperaturområdet af interesse (tabel 2 ). NMR-teknikken bruges til at bekræfte eksistensen af hydrogen obligations dannelse, hvilket er det vigtigste kendetegn ved NADES-systemer. Dette kan bekræftes ved observation af ændringen i den kemiske forskydning af hvert signal, og ved analyse af NOESY Spectra, der viser rumlige og intermolekylære korrelationer (figur 2).
| Komponent 1 | Komponent 2 | Tilberedningsmetode | Reference |
| Betaine (bet) | L-(+)-vinsyre (LTA) | Vakuum fordampende (VE) | Dai et al. (2013)5 og Espino et al. (2016)6 |
| β-alanin (β-A) | DL-æblesyre (MA) | Vakuum fordampende (VE) | Dai et al. (2013)5 og Espino et al. (2016)6 |
| Glucose (Gluc) | Saccharose (suc) | Frysetørret (FD) | Choi et al. (2011)4 og Espino et al. (2016)6 |
| Citronsyre (CA) | Glucose (Gluc) | Frysetørret (FD) | Choi et al. (2011)4 og Espino et al. (2016)6 |
Tabel 1: Systemer, som er indberettet i litteraturen og deres tilberedningsmetode.
| SOM | Tilberedningsmetode | Vandindhold (%) |
| Karl Fischer-foranstaltning | ||
| Indsats: LTA (2:1 + 20% vand) | Opvarmning og omrøring, tilsætning af vand | 19,94 ± 1,28 |
| Indsats: LTA (2:1) | Vakuum fordampende | 11,36 ± 0,78 |
| β-A:MA (3:2 + 11% vand) | Opvarmning og omrøring, tilsætning af vand | 11,45 ± 0,25 |
| β-A:MA (3:2) | Vakuum fordampende | 18,84 ± 1,78 |
| Gluc: suc (1:1 + 21% vand) | Opvarmning og omrøring, tilsætning af vand | 20,88 ± 0,13 |
| Gluc: suc (1:1) | Vakuum fordampende | 22,56 ± 0,48 |
| CA: Gluc (2:1 + 17% vand) | Opvarmning og omrøring, tilsætning af vand | 17,33 ± 0,68 |
| CA: Gluc (2:1) | Vakuum fordampende | 20,04 ± 0,26 |
Tabel 2: Vandindhold (%) af de systemer, som er udarbejdet af forskellige metoder.
Figur 1: repræsentative resultater af NADES, når de tilberedes af a) frysetørring, b) vakuum fordampning og c) opvarmning og omrøring med tilsætning af vand. Billedet viser, at når systemet er frysetørret, er det opnåede resultat en krystal, da alt vandet fjernes fra blandingen, hvorimod når ve-og HS-metoder anvendes, er den mængde vand, der er nødvendig for at danne NADES, til stede, og det opnåede resultat er et Hom ved stuetemperatur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: polariseret Optisk mikroskopi af ca: Glu (2:1) fremstillet af forskellige metoder, med tvær polarisatorer (venstre billede) og parallelle polarisatorer (højre billede) – 100 μm (10x forstærkning). De sorte billeder viser, at prøven er en væske ved stuetemperatur. FD prøven er helt endelig da resultatet opnået fra denne teknik ikke var en væske. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: a) Overlay af 1H NMR Spectra af (A) Nades systemet citronsyre: glucose: vand (2:1:4), (B) glucose, og (C) citronsyre; b) NOESY spektrum af NADES systemet citronsyre: glucose: vand (2:1:4). De overlagte spektre viser forskellen i kemiske forskydninger af hver komponent på des formation, som stammer fra etableringen af brint obligationer mellem dem. Det NOESY spektrum viser samspillet mellem OH proton fra citronsyre med de resterende protoner fra begge komponenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
De forskellige metoder, der er indberettet i litteraturen til fremstilling af NADES, er en opvarmnings-og omrørings metode (HS), vakuum fordampning (VE) og Frysetørring (FD). De systemer, vi har forberedt i dette arbejde er beskrevet af forskellige forfattere i litteraturen4,5,6,10,11. Tabel 1 indeholder en liste over komponenterne i hver blanding som angivet i det oprindelige manuskript samt deres tilberedningsmetode.
På vores undersøgelser for at reproducere de beskrevne systemer, vi indså, at i nogle tilfælde var det ikke muligt at opnå en lignende NADES, som en klar, viskøs, flydende prøve ved stuetemperatur. Forberedelse af en NADES afhænger af mange faktorer. Nogle kan let styres, men andre er vanskeligere at standardisere. Det vigtigste at overveje er, at det endelige produkt ikke kan stole på eksterne faktorer, såsom det anvendte udstyr.
De systemer, der er udarbejdet af forskellige metoder, blev derefter karakteriseret. Med polariseret Optisk mikroskopi (POM), blev det observeret, at med HS-metoden uden vand, selv ved forskellige temperaturer, de NADES ikke danne en klar og viskøs væske. Der blev dog observeret en homogen og klar, viskøs væske som repræsenteret i figur 1 ved anvendelse af HS-metoden med små mængder vand og ve-metoden til fremstilling af Nades.
DSC blev brugt til at bestemme blandingens termiske hændelser. Resultaterne viste, at systemet er flydende ved stuetemperatur og op til 130 °C, da termo grammet ikke viser termiske hændelser. Vandindholdet i hver prøve blev målt ved Karl-Fischer-titrering, og resultaterne er gengivet i tabel 2. Vandindholdet i systemerne skal rapporteres, da det er det parameter, der mest påvirker egenskaberne af den opnåede væske, såsom viskositet og polaritet. Disse ændringer har stor indflydelse på udfaldet af den ansøgning, som NADES er udformet til.
NMR blev også brugt til at bekræfte dannelsen de nævnte NADES systemer, gennem dannelsen af hydrogenbindinger mellem molekylerne i hvert system. Et eksempel er givet i figur 2 for Nades-systemet citronsyre: glucose (2:1) med 17% vand opnået af HS, hvor proton spektret af disse Nader og udgangsmaterialerne (citronsyre og glucose) er overlagt (figur 2a). Fra dette, er det muligt at observere ændringer i de kemiske forskydninger af nogle protoner fra hvert molekyle. Den store ændring er skiftet af OH proton fra citronsyre. Oprindeligt, dette signal vises på 5,16 ppm, men dette signal skifter til 6,22 ppm på grund af dannelsen af brint obligationer. Dette bekræftes af det NOESY spektrum (figur 2b), hvor den stærke interaktion mellem Oh fra citronsyre og de resterende protoner er synlig. En lignende interaktion blev observeret for de andre NADES systemer.
I denne undersøgelse bemærkede vi, at beskrivelsen af forberedelses metoden til eutektisk-systemer, der er indberettet i litteraturen, sommetider er ufuldstændig på grund af manglende oplysninger om vandindholdet i de fleste systemer. I ve-metoden tilsættes vandet ved at tilberede opløsninger af forskellige komponenter og blande ved en temperatur, der fører til dannelsen af eutektisk-systemer; men vi kan ikke være sikre på det nødvendige minimum vandindhold. Den viden om procentdel af vand, der er nødvendige for at danne systemerne anses derfor, et afgørende punkt, der bør altid rapporteres, for andre at være i stand til at reproducere forberedelsen af de forskellige eutektisk blandinger.
Den bedste metode til at bruge er den HS-metode med vand tilsat, da det tager mindre tid at forberede, for tilfælde, hvor vandindholdet er allerede beskrevet. Men hvis disse oplysninger ikke er tilgængelige, er den letteste metode VE-metoden, hvor alt tilgængeligt vand fjernes, og kun vandet, der interagerer med NADES-komponenterne, forbliver i systemet. Under alle omstændigheder bør forskerne lade systemerne fordampe i tilstrækkelig tid til at sikre, at det frie vand fjernes fra systemet. Denne timing afhænger af udstyret, og det er derfor ikke nok at beskrive varigheden af VE-metoden i materiale afsnittet, men vandindholdet skal altid rapporteres.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under den Europæiske Unions Horisont 2020-forsknings-og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. ERC-2016-CoG 725034. Dette arbejde blev også støttet af det associerede laboratorium for Green Chemistry-LAQV, som er finansieret af nationale fonde fra FCT/MCTES (UID/QUI/50006/2019) og af FCT/MCTES gennem projektet CryoDES (PTDC/EQU-EQU/29851/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mm NMR tube | Norell | ||
| Acid citric monohydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Advance III spectrometer | Bruker | ||
| Deionized water | |||
| dimethyl sulfoxide-d6 | Sigma-Aldrich | ||
| DSC Q200 | TA Instruments, USA | ||
| Freeze-dryer CHRIST ALPHA 1-4 | Braun Biotec International | ||
| Glucose monohydrate | Cmd chemicals | ||
| Karl Fisher Coulometer | Metrohm | ||
| Olympus BX-51 polarized optical microscope | Olympus |
References
- Paiva, A., et al. Natural deep eutectic solvents - solvents for the 21st century. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 2, 1063-1071 (2014).
- Abbott, A. P., Capper, G., Davies, D. L., Rasheed, R. K., Tambyrajah, V. Novel solvent properties of choline chloride/urea mixtures. Chemical Communications. , 70-71 (2003).
- Liu, Y., et al. Natural deep eutectic solvents: properties, applications, and perspectives. Journal of Natural Products. 81, 679-690 (2018).
- Choi, Y. H., et al. Are natural deep eutectic solvents the missing link in understanding cellular metabolism and physiology. Plant Physiology. 156, 1701-1705 (2011).
- Dai, Y., Spromsen, J. V., Witkamp, G. -J., Verpoorte, R., Choi, Y. H. Natural deep eutectic solvents as new potential media for green technology. Analytica Chimica Acta. 766, 61-68 (2013).
- Espino, M., Fernández, M. A., Gomez, F. J. V., Silva, M. F. Natural designer solvents for greening analytical chemistry. Trends in Analytical Chemistry. 76, 126-136 (2016).
- Hayyan, M., et al. Natural deep eutectic solvents: cytotoxic profile. Springer Plus. 5, 913 (2016).
- Dai, Y., Witkamp, G. -J., Verpoorte, R., Choi, Y. H. Tailoring properties of natural deep eutectic solvents with water to facilitate their applications. Food Chemistry. 187, 14-19 (2015).
- Choi, Y. H., Verpoorte, R. Green solvents for the extraction of bioactive compounds from natural products using ionic liquids and deep eutectic solvents. Current Opinion in Food Science. 26, 87-93 (2019).
- Guitérrez, M. C., Ferrer, M. L., Mateo, C. R., Del Monte, F. Freeze-drying of aqueous solutions of deep eutectic solvents: a suitable approach to deep eutectic suspensions of self-assembled structures. Langmuir. 25, 5509-5515 (2009).
- Gomez, F. J. V., Espino, M., Fernández, M. A., Silva, M. F. A greener approach to prepare natural deep eutectic solvents. Chemistry Select. 3, 6122-6125 (2018).
