Summary
Этот протокол направлен на стандартизацию подготовки глубоких эветэктицических систем во всем научном сообществе, с тем чтобы эти системы могли быть воспроизведены.
Abstract
Подготовка глубоких эвтектических систем (DES) является априори простой процедурой. По определению, два или более компонентов смешиваются вместе в данном соотношении моляров к форме DES. Однако, исходя из нашего опыта в лаборатории, необходимо стандартизировать процедуру подготовки, характеристики и отчета о методологиях, с которыми следуют различные исследователи, с тем чтобы результаты, опубликованные, могли быть воспроизведены. В этой работе мы тестируем различные подходы, о которых сообщается в литературе, для подготовки эвтектических систем и оцениваем важность воды в успешной подготовке жидких систем при комнатной температуре. Эти опубликованные эвтектические системы состояли из лимонной кислоты, глюкозы, сахарозы, яблочной кислоты, з-аланина, L-тартарной кислоты и бетаина, и не все описанные методы приготовления могут быть воспроизведены. Однако в некоторых случаях можно было воспроизвести описанные системы с включением воды в качестве третьего компонента эвтектической смеси.
Introduction
Глубокие эвтектические растворители были названы растворителями для 21-го века и считаются новым поколением растворителей. Они определяются как смесь из двух или более химических соединений в определенном соотношении моляров, что приводит к значительному снижению температуры плавления отдельных компонентов, становясь жидкостью при комнатной температуре1,2, 3. В этом смысле подготовка растворителей не требует какой-либо химической реакции и, следовательно, урожайность составляет 100%. В 2011 году Цой и его коллеги сообщили о возможности естественного DES и назвали их естественными глубокими эвтектическими растворителями (NADES)3,4,5. NADES можно приготовить из различных комбинаций сахаров, аминокислот, органических кислот и производных холина; и эти системы, подготовленные из натуральных компонентов, по своей сути биосовместимы и биоразлагаемы, что значительно меньше токсичности по сравнению с другими альтернативными растворителями (например, ионными жидкостями)5,6, 7,8. С 2015 года количество публикаций на местах выросло в геометрической прогрессии, а возможные применения NADES очень широки3. Несмотря на то, что многие рукописи и обзоры были опубликованы, есть фундаментальные вопросы, которые сохраняются, и ученые до сих пор не нашли ответа на интригующие вопросы, такие как механизмы, лежащие в основе формирования DES. Понимание механизма формирования DES приведет к консолидированной подходке к разработке новых систем, а не к нынешнему подходу к пробивным и ошибочным ошибкам. Кроме того, возможности в этой области растут с каждым днем, как потребители становятся все более осведомлены об устойчивости своей продукции, а не только с точки зрения их конечного срока службы, но и с точки зрения обработки себя8,9, 10. Для внедрения основных инноваций в области глубоких эвтектических растворителей в первую очередь требуется стандартизация методов производства и характеристик. Отсутствие воспроизводимости некоторых систем, о которых сообщается в литературе, было мотивацией для развития этой работы, поскольку мы сталкивались с этой проблемой несколько раз. В этом мы демонстрируем необходимость и важнейшее значение для точного описания материалов и методов и показывают, что, хотя подготовка DES является простой и простой процедурой, есть некоторые ключевые аспекты (например, наличие/количество воды), которые всегда должны быть обсуждены.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Изучаемые NADES были бетаин:L-((я)-тартаровая кислота (2:1), З-аланина: DL-яблической кислоты (3:2), глюкоза:сахароза (1:1) и лимонная кислота: глюкоза (2:1). Эти системы были подготовлены различными методами: замораживанием сушки (FD), вакуумным испарением (VE), а также теплом и перемешиванием (HS) с водой и без нее. В качестве примера приводится протокол для системной лимонной кислоты: глюкоза (2:1). Для NADES характеризовались дифференциальной сканирующей калории (ДСК), поляризованной оптической микроскопией (POM), содержанием воды и спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
1. Подготовка NADES
- Заморозить сушку
- В отдельные контейнеры добавьте 2 г моногидрата лимонной кислоты и 0,9530 г моногидрата глюкозы. Добавьте 10 мл деионированной воды к каждому и перемешайте, пока соединения не будут полностью растворены.
- Смешайте два решения вместе и обеспечите гомогенизацию конечного решения. Поместите раствор в круглую нижнюю колбу.
- Заморозить его с помощью жидкого азота. Поместите колбу в замораживание сушилки на 48 ч, чтобы убедиться, что вся вода удаляется из образца.
- Вакуумное испарение
- Взвесить 2 г моногидрата лимонной кислоты и 0,9530 г моногидрата глюкозы в отдельных контейнерах. Добавьте 10 мл деионированной воды к каждому и перемешайте, пока соединения не будут полностью растворены.
- Смешайте два решения вместе и обеспечите гомогенизацию раствора. Поместите раствор в круглую нижнюю колбу.
- Используя роторный испаритель, высушите образец до образования прозрачной, вязкой жидкости.
- Отопление и перемешивание
- Взвесить 2 г моногидрата лимонной кислоты и 0,9530 г моногидрата глюкозы в тот же флакон. Добавьте 278 л воды.
- Поместите флакон с магнитным перемешивание мальве в 50 градусов воды.
- Оставьте образец до тех пор, пока не образуется прозрачная вязкая жидкость.
2. Характеристика NADES
- Поляризованная оптическая микроскопия (POM)
- Поместите каплю NADES на стеклянный слайд микроскопа для наблюдения.
- Используя режим передачи микроскопа, выполните оптическую характеристику образца при комнатной температуре.
- Карл-Фишер титрации
- Соберите 100 л NADES в шприце, а затем очистите лишнюю жидкость снаружи.
- Поместите шприц на весы и тазы его.
- Нажмите на сНВ на оборудовании KF и добавьте небольшую каплю образца к судну.
- Взвесьте шприц, введите массу на оборудовании KF и нажмите ENTER. Результат появится на экране в промилле воды.
- Дифференциальная сканирующая калория (DSC)
- Поместите 3-10 мг каждого образца в герметичную алюминиевую кастрюлю с крышкой. Закройте кастрюлю с помощью пресса образца.
- Проанализируйте образцы с помощью DSC с температурным диапазоном -90 градусов по Цельсию до температуры деградации, с температурой нагрева 10 градусов/мин. Выполните два цикла с изотермальным удержанием 2 мин и проанализируйте под атмосферой азота (50 мл/мин).
- Ядерный магнитный резонанс (ЯМР)
- Подготовьте 5-мм трубку ЯМР, растворив 250 Л Л NADES с 250 л диметилсульфида-d6 (DMSO-d6).
- Приобретайте спектры 1H и NOESY при 25 градусах Цельсия на спектрометре 400 МГц.
- Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа спектров и используйте химический сдвиг DMSO-d6 (2,50 промилле), чтобы назначить все сигналы каждого компонента.
Representative Results
Результаты, полученные на рисунке 1, показаны на рисунке 1. Описание каждой системы приведено ниже. Используя метод замораживания сушки, результат должен быть твердым или очень плотной пастой, так как вся вода удаляется из системы. Используя метод испарения, результат должен быть прозрачной и вязкой жидкостью. Используя метод нагрева и перемешивания с добавлением небольшого количества воды, результатом должна быть прозрачная и очень вязкая жидкость.
Результаты, полученные от POM можно увидеть на рисунке 1. Когда NADES полностью сформирован, мы ожидаем увидеть черное изображение, указывая, что образец полностью аморфный и что в системе не осталось кристаллов. Результаты, полученные от KF титрования описаны в таблице 2. Помимо количества воды, которая добавляется в системы, процент воды конечной смеси также зависит от содержания воды в реагентах.
Что касается DSC, цель этого метода также подтвердить, что система жидкости в диапазоне температур, что он будет применяться, так что ожидаемый результат, чтобы иметь термограмму, которая не показывает тепловых событий на температурном диапазоне интереса (Таблица 2 ). Метод ЯМР используется для подтверждения существования образования водородных связей, что является основной характеристикой систем NADES. Это может быть подтверждено наблюдением за изменениями химических сдвигов каждого сигнала и анализом спектра NOESY, который показывает пространственные и межмолекулярные корреляции(рисунок 2).
| Компонент 1 | Компонент 2 | Метод приготовления | Ссылки |
| Бетаин (Ставка) | L-(Я)-Тартарная кислота (LTA) | Вакуумная испаряющаяся (VE) | Dai et al. (2013)5 и Espino et al. (2016)6 |
| - Аланин (З-А) | DL-яблочная кислота (MA) | Вакуумная испаряющаяся (VE) | Dai et al. (2013)5 и Espino et al. (2016)6 |
| Глюкоза (Глюк) | Сахароза (Сук) | Замораживание сушеных (FD) | Чхве и др. (2011)4 и Эспино и др. (2016)6 |
| Лимонная кислота (CA) | Глюкоза (Глюк) | Замораживание сушеных (FD) | Чхве и др. (2011)4 и Эспино и др. (2016)6 |
Таблица 1: Системы, представленные в литературе и методе их подготовки.
| НЕДЕС | Метод приготовления | Содержание воды (%) |
| Карл Фишер мера | ||
| Ставка:LTA (2:1 и 20% воды) | Отопление и помешивая, добавляя воду | 19.94 и 1,28 |
| Ставка:LTA (2:1) | Вакуумная испаряющаяся | 11.36 и 0,78 |
| З-А:МА (3:2 и 11% воды) | Отопление и помешивая, добавляя воду | 11,45 х 0,25 евро |
| З-А:МА (3:2) | Вакуумная испаряющаяся | 18,84 и 1,78 |
| Gluc:Suc (1:1 и 21% воды) | Отопление и помешивая, добавляя воду | 20,88 и 0,13 |
| Глюк:Сук (1:1) | Вакуумная испаряющаяся | 22,56 х 0,48 |
| CA:Gluc (2:1 и 17% воды) | Отопление и помешивая, добавляя воду | 17,33 и 0,68 |
| CA:Gluc (2:1) | Вакуумная испаряющаяся | 20.04 и 0,26 |
Таблица 2: Содержание воды (%) систем, подготовленных различными методами.
Рисунок 1: Репрезентативные результаты NADES при приготовлении а) замораживания сушки, б) вакуумного испарения и в) нагревания и перемешивания с добавлением воды. На рисунке видно, что, когда система лиофилизирована, полученный результат является кристаллом, так как вся вода удаляется из смеси, в то время как при использовании методов VE и HS, количество воды, необходимой для формирования NADES, присутствует, и полученный результат является хомомом огенистая жидкость при комнатной температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Поляризованная оптическая микроскопия CA:Glu (2:1), подготовленная различными методами, с перекрестными поляризаторами (левое изображение) и параллельными поляризаторами (правое изображение) - 100 мкм (10x усиление). На черных снимках видно, что образец представляет собой жидкость при комнатной температуре. Образец FD полностью кристаллизуется, так как результат, полученный от этой техники, не был жидкостью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: а) Наложение 1HN-спектра (A) системы НАДЕС лимонной кислоты:глюкоза:вода (2:1:4), (B) глюкоза и (C) лимонная кислота; б) NOESY спектр системы NADES лимонной кислоты: глюкоза: вода (2:1:4). Накладные спектры показывают разницу в химических сдвигах каждого компонента при формировании DES, возникшую в связи с установлением между ними водородных связей. Спектр NOESY показывает взаимодействие протона OH из лимонной кислоты с оставшимися протонами из обоих компонентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Различные методологии, представленные в литературе для подготовки NADES являются нагревательный и перемешивание метод (HS), вакуумного испарения (VE), и замораживания сушки (FD). Системы, которые мы подготовили в этой работе, описаны разными авторами в литературе4,5,6,10,11. В таблице 1 перечислены компоненты каждой смеси, как уверяется в оригинальной рукописи, а также метод их приготовления.
После наших исследований, чтобы воспроизвести описанные системы, мы поняли, что в некоторых случаях не было возможности достичь аналогичного NADES, как ясный, вязкий, жидкий образец при комнатной температуре. Подготовка NADES опирается на многие факторы. Некоторые из них можно легко контролировать, но другие труднее стандартизировать. Самое главное, чтобы рассмотреть, что конечный продукт не может полагаться на внешние факторы, такие как используемое оборудование.
Затем были охарактеризованы системы, подготовленные различными методами. С поляризованной оптической микроскопией (POM), было замечено, что с методом HS без воды, даже при различных температурах, NADES не образуют четкую и вязкую жидкость. Однако при применении метода ГС с небольшим количеством воды и метода ВЭО для подготовки НАДЕС наблюдалась однородная и ясная вязкая жидкость, представленная на рисунке 1.
DSC был использован для определения тепловых событий смеси. Результаты показали, что система жидкая при комнатной температуре и до 130 градусов по Цельсию, так как термограмма не показывает тепловых явлений. Содержание воды в каждой выборке измерялось титрой Карла-Фишера, а результаты представлены в таблице 2. Содержание воды в системах должно быть сообщено, так как это параметр, который в наибольшей мере влияет на свойства полученной жидкости, такие как вязкость и полярность. Эти изменения оказывают большое влияние на результаты применения, для которого предназначена NADES.
ЯМР также использовался для подтверждения формирования упомянутых систем NADES путем формирования водородных связей между молекулами каждой системы. Один пример приведен в рисунке 2 для системы NADES лимонной кислоты: глюкоза (2:1) с 17% воды, полученной HS, где протонный спектр этого NADES и исходные материалы (лимонная кислота и глюкоза) накладываются(Рисунок 2a). Из этого можно наблюдать изменения в химических сдвигах некоторых протонов от каждой молекулы. Основным изменением является смещение ПРОтона OH из лимонной кислоты. Первоначально этот сигнал появляется на уровне 5,16 промилле, но этот сигнал смещается до 6,22 промилле из-за образования водородных связей. Это подтверждается спектром NOESY(Рисунок 2b),где видно сильное взаимодействие между OH от лимонной кислоты и оставшимися протонами. Аналогичное взаимодействие наблюдалось и в других системах НАДЕС.
В этом исследовании мы отметили, что описание метода подготовки к эвтектическим системам, о которых сообщается в литературе, иногда является неполным из-за отсутствия информации о содержании воды в большинстве систем. В методе VE вода добавляется путем подготовки растворов различных компонентов и смешивания при температуре, что приводит к образованию эвтектических систем; однако мы не можем быть уверены в минимальном необходимом содержании воды. Знания о процентном соотношении воды, необходимой для формирования систем, рассматриваются в этой области, что является важным моментом, о чем всегда следует сообщать, с тем чтобы другие могли воспроизвести подготовку различных эвтектических смесей.
Лучшим методом использования является метод HS с добавлением воды, так как на подготовку уходит меньше времени, в тех случаях, когда содержание воды уже описано. Однако, если эта информация недоступна, самым простым методом является метод VE, где вся доступная вода удаляется и в системе остается только вода, взаимодействующая с компонентами NADES. В любом случае, исследователи должны позволить системам испаряться в течение достаточного времени, чтобы гарантировать, что бесплатная вода удаляется из системы. Это время зависит от оборудования, и поэтому недостаточно описать в разделе материалов продолжительность метода ВЭ, но содержание воды всегда должно быть сообщено.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках научно-исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения No ERC-2016-CoG 725034. Эта работа была также поддержана Ассоциированной лабораторией зеленой химии-ЛАЗВ, которая финансируется за счет национальных средств ФСТ/МКТЕС (УИД/Куи/КВИ/50006/2019) и ФСТ/МКТЕС в рамках проекта CryoDES (ПТДК/ЭКУ-ЭКУ/29851/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mm NMR tube | Norell | ||
| Acid citric monohydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Advance III spectrometer | Bruker | ||
| Deionized water | |||
| dimethyl sulfoxide-d6 | Sigma-Aldrich | ||
| DSC Q200 | TA Instruments, USA | ||
| Freeze-dryer CHRIST ALPHA 1-4 | Braun Biotec International | ||
| Glucose monohydrate | Cmd chemicals | ||
| Karl Fisher Coulometer | Metrohm | ||
| Olympus BX-51 polarized optical microscope | Olympus |
References
- Paiva, A., et al. Natural deep eutectic solvents - solvents for the 21st century. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 2, 1063-1071 (2014).
- Abbott, A. P., Capper, G., Davies, D. L., Rasheed, R. K., Tambyrajah, V. Novel solvent properties of choline chloride/urea mixtures. Chemical Communications. , 70-71 (2003).
- Liu, Y., et al. Natural deep eutectic solvents: properties, applications, and perspectives. Journal of Natural Products. 81, 679-690 (2018).
- Choi, Y. H., et al. Are natural deep eutectic solvents the missing link in understanding cellular metabolism and physiology. Plant Physiology. 156, 1701-1705 (2011).
- Dai, Y., Spromsen, J. V., Witkamp, G. -J., Verpoorte, R., Choi, Y. H. Natural deep eutectic solvents as new potential media for green technology. Analytica Chimica Acta. 766, 61-68 (2013).
- Espino, M., Fernández, M. A., Gomez, F. J. V., Silva, M. F. Natural designer solvents for greening analytical chemistry. Trends in Analytical Chemistry. 76, 126-136 (2016).
- Hayyan, M., et al. Natural deep eutectic solvents: cytotoxic profile. Springer Plus. 5, 913 (2016).
- Dai, Y., Witkamp, G. -J., Verpoorte, R., Choi, Y. H. Tailoring properties of natural deep eutectic solvents with water to facilitate their applications. Food Chemistry. 187, 14-19 (2015).
- Choi, Y. H., Verpoorte, R. Green solvents for the extraction of bioactive compounds from natural products using ionic liquids and deep eutectic solvents. Current Opinion in Food Science. 26, 87-93 (2019).
- Guitérrez, M. C., Ferrer, M. L., Mateo, C. R., Del Monte, F. Freeze-drying of aqueous solutions of deep eutectic solvents: a suitable approach to deep eutectic suspensions of self-assembled structures. Langmuir. 25, 5509-5515 (2009).
- Gomez, F. J. V., Espino, M., Fernández, M. A., Silva, M. F. A greener approach to prepare natural deep eutectic solvents. Chemistry Select. 3, 6122-6125 (2018).
