Summary
Præsenteret her er en protokol til fremstilling af et implantabelt system til in vivo kronologisk registrering af fremkaldte og spontane elektromyografiske potentialer. Systemet anvendes til undersøgelse af reinnervation af larynx muskler efter nerveskade.
Abstract
Elektromyografi (EMG) måler muskelrespons på elektrisk stimulation eller spontan aktivitet af motoriske enheder og spiller en vigtig rolle i vurderingen af neuromuskulær funktion. Kronisk registrering af EMG aktivitet afspejler en muskels reinnervation status efter nerveskade har været begrænset, på grund af den invasive karakter af traditionelle EMG optagelse teknikker. I denne henseende er et implantabelt system designet til langsigtet, in vivo EMG-optagelse og nervestimulation. Det er blevet anvendt og testet i en undersøgelse om reinnervation af larynx muskler. Dette system består af 1) to bipolarelektrode nerve manchetter og fører til at stimulere hver af to nerver: den tilbagevendende larynx nerve (RLN) og interne gren af den overlegne larynx nerve (SLN); 2) to EMG registrering elektroder og fører til hver af de to larynx muskler: posterior cricoarytenoid (PCA) muskel og thyroarytenoid-lateral cricoarytenoid (TA-LCA) muskel kompleks; og 3) en hudbeholder, der kan sammenkoble alle implanterede blyterminaler til en ekstern optagelsesforforstærker og stimulator ved hjælp af et tilslutningskabel. Trådledningerne er Teflon-belagte, multi-filamenter, type 316 rustfrit stål. De er oprullet og kan strække sig under kroppens bevægelse af vågen dyr for at forhindre bly brud og elektrode migration. Dette system er implanteret under en aseptisk operation. Bagefter udføres baseline EMG-optagelser, før RLN transected i den anden operation for at studere muskelreinnervation. Gennem hele undersøgelsen, flere fysiologiske sessioner udføres i bestøvet dyr for at opnå fremkaldt og spontan EMG aktivitet, der afspejler reinnervation status af larynx muskler. Systemet er kompakt, fri for infektion i løbet af undersøgelsen, og meget holdbare. Dette implantable system kan give en pålidelig platform for forskning, hvor langsigtet optagelse eller nervestimulation er påkrævet i et bestøvet eller frit bevægeligt dyr.
Introduction
EMG-optagelse er en nyttig teknik til måling af elektrisk aktivitet produceret af en skeletmuskulatur, når den aktiveres ved elektrisk stimulering af dens nerve eller spontan affyring af dens motorenheder. Overvågning af EMG-signaler kan anvendes til vurdering af neuromuskulær transmission og muskelbiomekanik1. EMG-optagelse spiller også en vigtig rolle i at karakterisere kvaliteten og omfanget af muskelreinnervation efter nerveskade2,3,4,5. Flere EMG-optagelser i hele perioden med reinnervation kan imidlertid ikke opnås ved hjælp af en invasiv tilgang. Derfor er implantable anordninger designet og udviklet til gentagen, kronisk stimulation og optagelse i neuromuskulære systemer6,7,8,,9,10,11,12,13. Formålet med dette dokument er at beskrive en protokol for fremstilling og implantation af et stabilt system til opnåelse af pålidelige kronologiske EMG data fra strubehovedet.
Dette system anvendes her til studiet af larynx muskel reinnervation. Der gives en kort oversigt over strubehovedet til orientering (figur 1). En præcis koordinering mellem sensoriske og motoriske komponenter er afgørende for korrekt muskuløs bevægelse under respiration, fakturering og luftvejsbeskyttelse. PCA musklen, placeret i den bageste strubehoved, er den eneste bortfører af vokal fold. Denne muskel aktiveres spontant under inspiration for at øge glottalområdet til indånding. TA-LCA-komplekset er den største adductor af vokalfolden. Aktivering af denne muskel kompleks sammen med en anden adductor (dvs. den interarytenoid muskel) medialize folden for vibrationer og lyd produktion og lukke folden for luftvejsbeskyttelse under synvning.
Derudover, motor neuron fibre innervate både bortfører og adductor muskler i RLN. Bortføreren og adductor musklerne kan skelnes baseret på motorenhed sammensætning14,15. PCA musklen udviser øget fyring under hypercaponiske og / eller hypoxiske forhold16 på grund af tilstedeværelsen af inspiratorisk motorenheder. I modsætning hertil er refleks glottic lukning (RGC) motorenheder, som lukker glottis refleksivt gennem aktivering af sensoriske receptorer i larynx slimhinden, til stede i TA-LCA muskel kompleks. Den interne gren af den overlegne larynx nerve (SLN) bærer afferente fibre af sensoriske receptorer i strubehovedet17. Selv om stemmefakturering er primært en adductor funktion, både bortfører og adductor motorenheder er involveret i denne højt udviklede larynx adfærd.
Figur 1: Strubehovedets anatomi. Komponenterne i dette implantable system vises også. SLN = overlegen larynx nerve; RLN = tilbagevendende larynx nerve; PCA = posterior cricoarytenoid muskel; TA-LCA = thyroarytenoid-lateral cricoarytenoid muskel kompleks; DBS = dyb hjernestimulation. Dette tal er blevet gengivet med tilladelse fra Wiley27. Klik her for at se en større version af dette tal.
Skade på RLN kan resultere i vokal fold lammelse (VFP), som kompromitterer både bortføre og adducting funktioner på grund af larynx muskel denervation14,18,19. Efterfølgende, regenerering af RLN nervefibre og reinnervation af muskler almindeligt forekommende. Men, reinnervation er en tilfældig proces og resulterer i fejladresseret, uhensigtsmæssig muskel gentilslutning i de fleste tilfælde. Dette kaldes synkinese, hvor spontan aktivering af bortfører- og adductorantagonister er defekt og frembringer ineffektiv eller endog paradoksal bevægelse af vokalfolderne14,19,20,21. Med synkinese, den kritiske funktion, der er tabt, er vokal fold bortførelse, hvilket resulterer i utilstrækkelig ventilation. Selv om der er igangværende forsøg på at behandle larynx synkinese ved enten 1) blokering glottic lukning med Botox22,23 eller 2) elektrisk stimulere glottic åbning med en implantabel pacemaker24,25, der er ingen klinisk intervention, der pålideligt forhindrer synkinese26. Men, der er tegn på, at elektrisk konditionering af PCA musklen under reinnervation på en lav frekvens fremmer passende neuromuskulær gentilslutning og minimerer synkinese sker. Der er i øjeblikket undersøgelser i gang for at belyse de underliggende mekanismer2.
Fokus for dette papir er at beskrive en enkel og billig implantable system til kronisk nerve stimulation og EMG optagelse. Dette system kan bruges til at undersøge virkningerne af lavfrekvent elektrisk konditionering af PCA musklen på specificiteten af dens efterfølgende reinnervation. EMG signaler opnået ved dette system kan afspejle kvaliteten og mængden af larynx muskel reinnervation over tid.
Protocol
Denne undersøgelse er blevet godkendt af den institutionelle dyrepleje og brug udvalg (IACUC) af Vanderbilt University og blev gennemført i overensstemmelse med guide for pleje og brug af laboratoriedyr (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Dette system indeholder fem implantable komponenter og et eksternt kabel.
1. To bipolarRLN Stimulus Elektrode Manchetter, hver med par oprullede blyledninger og terminal pins
- Brug Teflon-belagt, multi-filament, type 316 rustfrit stål tråd (med isoleret diameter på 0,0078" eller 0,198 mm) for hver manchet ledning. Skær en 70 cm længde af tråd og spole det ind i en 12 cm lang fjeder ved hjælp af en coiling enhed eller anskaffe præfabrikerede oprullede ledninger. Hvis det er nødvendigt, strække foråret for at øge dens længde for hvert implantat site. Lad enderne af de oprullede ledninger lige ved 3 mm og 10 mm længder og deinsulate dem.
- Lod en guldbelagt kobberhunner på den 3 mm ende af den oprullede ledning.
- For at klargøre nervemanchetten skæres et 5 mm segment af silikonerør (OD = 0,156", ID = 0,094" eller OD = 3,96 mm, ID = 2,39 mm) fra en slangerulle.
- For at indsætte en ledning i røret, skal du bruge en 25 G hypodermisk nål til at gennembore gennem slangevæggen 1,5 mm fra enden og off-center tæt på den indre væg. Fyld 10 mm enden af ledningen op i spidsen af nålen. Træk nålen ud for at deponere den deisolerede del i røret. Bøj den nøgne trådende uden for røret og drej på ledningen ved indgangsstedet i røret.
BEMÆRK: Brug et fungerende mikroskop til at udføre disse trin. En sonde kan placeres i røret for at kurve ledningen mod den indre væg. Målet er at placere den nøgne del af ledningen, så stimuli kan leveres til nerven uden at risikere mekanisk skade på nerven. - Den anden ledning indsættes 1,5 mm fra den modsatte ende af røret efter samme fremgangsmåde. Juster indgangspunktet til indgangspunktet for det første kundeemne. Pierce væggen med nålen, så den nøgne del af ledningen er deponeret i nærheden af den indre væg modsat den første bly.
BEMÆRK: Ser man ned i røret, bør de to stimulus elektroder danne en 45 ° "V" form, som vil strække nerven en gang på plads og sikre den nuværende levering gennem nerven fra anode til katode. - Lav en S-formet slids i rørvæggen overfor elektrodeindgangspunkterne ved hjælp af en buet saks.
BEMÆRK: Manchettens spirallæber kan derefter åbnes for at placere nerven inde mellem elektroderne under operationen. - Indsæt en længde på 6-0 monofilamenter, ikke-absorberbar sutur i manchetvæggen i hver ende ved hjælp af en buet mikrokirurgisk nål til eventuel sikring af manchetten omkring nerven.
- Påfør medicinsk kvalitet type-A silikone gel til at reisolere alle udsatte nøgne ledning uden for manchetten.
2. To bipolarE SLN Stimulus Elektrode Manchetter, hver med par oprullede blyledninger og terminalpins
- Saml SLN stimulus elektrode manchetpå samme måde som RLN stimulus elektrode manchet. Brug dog det mindre diameter (OD = 0,125", ID = 0,062" eller OD = 3,18 mm, ID = 1,57 mm) rør, fordi nerven er mindre i diameter.
3. To PCA muskel EMG optagelse elektroder, hver med oprullet bly wire og Terminal Pin
- Saml en oprullet bly til PCA muskelelektroden som udført i trin 1.1.
- Lodende en kvindelig pin på føringen som gjort i trin 1.2.
- Sæt 10 mm enden af PCA-muskelledningen ind i spidsen af en dyb hjernestimulationselektrode (DBS) ved hjælp af samme strategi for indføring af nåleledning i en manchet (trin 1.4). Bøj enden af ledningen til at danne en krog og klip den til at give i alt 5 mm optagelse længde.
BEMÆRK: I denne ansøgning, PCA muskel og dens reinnervating nerveterminaler er udsat for elektrisk konditionering. Stimuli genereres af en implantabel pulsgenerator (IPG) og leveres til larynxmusklen gennem en DBS-elektrode (Figur 1, indsat). Dette system er tilpasset fra terapeutisk hjernestimulation (f.eks. DBS-elektroden indsættes i en submuskulær lomme og forankres på plads. Hvis teknologi til elektrisk konditionering af musklen ikke er påkrævet, kan PCA EMG elektroden indsættes direkte i musklen og forankres af krogen.
4. To TA-LCA Muskel Complex EMG Optagelse Elektroder, hver med oprullet blywire og terminal pin
- Saml en oprullet bly til TA-LCA muskelelektroden som udført i trin 1.1.
- Lodende en kvindelig pin på føringen som gjort i trin 1.2.
- Punktafgifter en 5 mm x 10 mm rektangulære stykke strikket polyester graft. Lav et hul i midten af masken med en 20 G hypodermisk nål. Ledningens 10 mm ende føres ind i hullet med yderligere 3 mm spole, der stikker ud over hullet. Anbring ledningen på masken ved hjælp af 6-0 monofilamenter, ikke-absorberbare sutur.
BEMÆRK: Dette stykke mesh vil blive brugt til at forankre elektroden føre til skjoldbruskkirtlen brusk overliggende muskel kompleks. - Bøj enden af ledningen til at danne en krog og klip den til at give i alt 5 mm optagelse længde.
5. Hudbeholder til sammenkobling af forbindelser mellem elektroder og eksternt udstyr
- Udnyt en enkelt række kvindelige pin stribe stik til at gøre beholderen. Skær to stykker (hver 17,5 mm i længden) fra strimlen, der hver indeholder otte ben huller. Først ru de udvendige overflader af hvert stykke med sandpapir, derefter lim dem sammen med phenol i en røg hætte til at gøre en dobbelt-række stik. Sæt stikket i 60-80 °C vand i en røghætte i 30 minutter for at give mulighed for limhærdning.
BEMÆRK: Denne dobbelt-række samling format vil give bekvemmelighed i tildelingen af pinholes til venstre-vs højre side elektroder. - Skær et stykke med en længde på 25,6 mm fra strimlen for at gøre stikkets frontplade (den del, der stikker ud uden for implantatstedet til hudforankring). Skær et 5,4 mm x 17,4 mm rektangulært hul i midten af frontpladen med en skalpel.
- Placer dobbelt-række stikket inde i det rektangulære hul i frontpladen, indtil det flugter med frontpladens overflade uden fremspring. Hvis stikket ikke passer ind i frontpladens rektangulære hul, kan hullet forstørres en smule med en fil. Da stikhullerne ikke er symmetriske, sættes forbindelseskanten ind med de større huller i frontpladen.
BEMÆRK: Som et resultat, en kvindelig pin indsat i den modsatte kant af stikket med den mindre diameter hul vil snap og låse på plads. - Brug fenol til at lime stikket og frontpladen sammen. Anbring samlingen i 60-80 °C vand i en røghætte i 30 minutter for at give mulighed for limhærdning.
- Bor et 1,3 mm hul i hvert hjørne af frontpladen og på hver side af frontpladen halvvejs fra enderne for i alt seks huller.
BEMÆRK: Disse huller vil blive brugt til at sutureden endelige hudbeholder på implantatstedet. - Skær et 15 mm langt rør af strikket polyestergraft til at omgive samlingen under frontpladen, hvilket gør samlingen biokompatibel. For at fastgøre røret til samlingen skal du bruge en hypodermisk nål til at føre trådledninger i rustfrit stål gennem væggen på tre lige store positioner (hver 3,8 mm fra hinanden) langs dens længde.
- Placer lige store hak i hvert hjørne af stikket for at forankre ledningerne mod samlingsoverfladen. Drej enderne af hver ledning med en tang til at cinch røret til forsamlingen til at danne en nederdel.
- Lav et permanent mærke på polyesterplasteret i den ene ende af beholderen.
BEMÆRK: Brug dette mærke til orientering for at identificere den rostrale ende af beholderen under implantatkirurgi. I rostral til haleretning skal følgende benelektrodetildeling for hver af de to rækker (venstre og højre side) være som følger: PCA EMG, TA-LCA EMG, tomt hul, tomt hul, RLN-anode, RLN-katode, SLN-anode og SLN-katode.
6. Eksternt tilslutningskabel til indspilningsforforstærker og stimulator
BEMÆRK: Et kabel bruges til at skabe forbindelser mellem den implanterede hudbeholder og eksternt udstyr under nervestimulation-EMG-optagelsessessioner (afsnit 8 og 10). Det er sammensat af 12 isolerede ledninger afslutning med mandlige stifter til at indsætte i kvindelige ben i huden beholder. Dette kabel består af to dele: en EMG optagelse stik og nerve stimulation ledninger. En optagelse stik er nødvendig for at isolere lav spænding EMG signaler fra højere spænding stimulus artefakter udstrålende fra stimulus pins. Af samme grund, to huller i hver række af huden beholder efterlades ubesatte til at adskille optagelse stifter fra stimulation stifter.
- For at gøre EMG optagelse stik, skal du bruge en mandlig strimmel stik (samme længde og bredde, men halvdelen af højden af en kvindelig stik). Skær det i to stykker, der hver kun indeholder to huller. Anbring de to stykker ved hjælp af fenollim ved hjælp af samme fremgangsmåde for at gøre dobbelt-rækken stik i huden beholder (trin 5.1). Tag de fire EMG-optageledninger i kablet og sæt deres klemmer ind i hvert af de fire huller, indtil de låses på plads med spidserne fremspringende ud over strimlen.
- Brug knoglecement til at forsegle toppen af stikket til at isolere wire-pin vejkryds.
- Brug de resterende otte ledninger i kablet endeiering i mandlige stifter til at gøre individuelle forbindelser til nerve stimulation manchetter via deres kvindelige stifter.
7. Første implantatoperation
- Få en 1-2 år gammel, 20-25 kg hunde af begge køn fra en autoriseret gård. Akklimatiserdyret før aseptisk implantatkirurgi. Autoklave alt udstyr før operationen. Hold mad tilbage i 10-12 timer før operationen.
- Gør dyret klar til operation.
- Barber dyrets hoved og hals og rengør huden med alkohol og betadine scrub opløsning. Bedøve dyret ved intravenøs injektion af 2-4 mg/kg tiletamin og zolazepam kombination, efterfulgt af 3% isofluran i ilt gennem intubation.
- Placer dyret på et operationsbord med en varmepude i supinposition og kirurgisk drapere dyret. Overvåg dyrets puls, respirationsfrekvens, kropstemperatur og iltmætning mindst hver 15.
- Lav en midterlinjen hals snit fra skjoldbruskkirtlen hak til manubrium. Dissekere luftrøret fri for spiserøret og udsætte ringere grænsen af cricoid brusk.
- Placer stimulusmanchetten på hver af de bilaterale SMR'er og RLN'er. Luk læberne på hver manchet med de medfølgende suturer.
- Lav en brusk vindue med en biopsi punch (4 mm i diameter) på den foranhændelige overflade af skjoldbruskkirtlen brusk på hver side. Eksponere de laterale aspekter af både TA-LCA muskel komplekser. Sæt EMG-optageelektroderne ind i TA-LCA muskelkomplekserne ved hjælp af en 23 G nål ved at sætte modhagen ind i spidsen af nålen. Suture elektrode polyester patch på brusk.
- Placer DBS elektroden sammen med sin følgesvend krog-wire EMG optagelse elektrode under PCA musklen på hver side. Brug et endoskop til at bekræfte, at stimulation producerer vokal fold bortførelse for hver kanal. Forankre DBS elektrodertilcricoid brusk med 4-0 ikke-absorberbare suturer.
- Indsæt alle wire ledninger af nerve stimulation-EMG optagelse elektroder i beholderen via deres kvindelige stifter. Tryk stifterne ind i huller med et indføringsværktøj formet fra en hemostat. Forsegl den ringere overflade af beholderen til at isolere bly-pin vejkryds ved hjælp af knogle cement.
- Efter cementhærderne anbringes beholderen i den tortorrale ende af midterlinjens snit gennem huden og suturedet til subkutant væv via polyesternederdelen. Fastgør hudkanten til beholderen ved suturer, der passerer gennem hullerne i frontpladen.
BEMÆRK: Den ene kæbe af hemostaten har en ende spalte, der fører til en counter-sink hul. Ledningen kan placeres gennem slidsen ind i hullet og kontravasken placeret mod stiftens hoved. Den anden kæbe er placeret på den modsatte side af beholderen. Klemme hemostat presser stiften ind i sin respektive beholder hul.
- Efter cementhærderne anbringes beholderen i den tortorrale ende af midterlinjens snit gennem huden og suturedet til subkutant væv via polyesternederdelen. Fastgør hudkanten til beholderen ved suturer, der passerer gennem hullerne i frontpladen.
- Lav et snit på venstre hals for at afsløre trapezmusklen. Udfør dissektion for at lave en submuskulær lomme til placering af den implantable pulsgenerator. Tunnel hver DBS bly subkutant til halsen snit til indsættelse i IPG.
- Luk alle kirurgiske sår med suturer. Overvåg dyret nøje, indtil det er fuldt tilbagebetalt efter operationen.
- Angiv postoperativ analgetika (f.eks. buprenorphin: 0,01-0,02 mg/kg) rutinemæssigt i op til 48 timer. Indgift antibiotika (f.eks. cefpodoxime: 10 mg/kg) oralt til dyret i mindst 3 dage. Hus dyret singly derefter for hele undersøgelsen, og begrænse motion i en periode på 10 dage for at tillade normal sårheling og stabilisering af den implanterede enhed.
BEMÆRK: Hudbeholderen skal rengøres dagligt med vævskompatibel antiseptisk opløsning. Desuden bør dummy mandlige stifter indsættes i de kvindelige stifter af huden beholder rutinemæssigt undtagen under EMG optagelse sessioner. Denne manøvre vil undgå ophobning af snavs i beholderen, tillade effektive forbindelser, der skal foretages med det eksterne kabel, og forhindre infektion.
8. Nerve stimulation-EMG optagelse sessioner på Baseline
BEMÆRK: Udfør disse sessioner 2x-3x efter implantatkirurgi (afsnit 7) og før nerve transektion kirurgi (afsnit 9) for at opnå baseline EMG signaler, når de bilaterale RLNs er intakte. Påfør følgende protokol under en standard nerve stimulation-EMG optagelse session (afsnit 8 og 10).
- Hold mad før proceduren for 10-12 h. Bedøve dyret med tiletamin og zolazepam kombination (indledende belastning dosis 2-4 mg/kg ved intravenøs injektion, derefter vedligeholdes med 0,4 mg /kg i timen via en i.v. linje). Placer dyret på en varmepude i supine position og vedligeholde dyret i en moderat plan af anæstesi. Overvåg dyrets vitaler under proceduren som beskrevet i trin 7.2.
- Indsæt en nul-graders stiv endoskop med en vedhæftet CCD videokamera gennem et laryngoscope at visualisere vokal fold bevægelse på niveau med glottis.
- Interface det eksterne kabel, der forbinder til laboratoriet stimulator og EMG forforstærkere til huden beholder via dens stik og stifter. Tilslut udgangene fra forforstærkerne til en dataindsamlingsenhed og/eller et oscilloskop for at vise, registrere og måle EMG-signaler.
- Levér stimuli (enkelt kvadratbølgeimpulser, 0,1-0,5 ms varighed, 0,5-2,0 mA amplitude) til henholdsvis venstre og højre RLN'er for at registrere fremkaldte EMG-responser fra bilaterale TA-LCA-komplekser og PCA-muskler under hver betingelse.
- Levér stimuli (enkelt kvadratbølgeimpulser, 0,1-0,5 ms varighed, 0,5-2,0 mA amplitude) til henholdsvis venstre og højre SLN'er for at registrere fremkaldte EMG-svar fra bilaterale TA-LCA-komplekser og PCA-muskler under hver betingelse.
- Levér CO2 blandet med rumluft gennem dyrets munding for at fremkalde hyperkapni og øge dyrets respiratoriske indsats. Begræns eksponeringen til 1 min, hvor den maksimale rekruttering af inspiratorisk motorenhed vil finde sted. Optag spontane EMG-aktiviteter af TA-LCA-komplekser og PCA-muskler under denne hypercaponiske tilstand.
- Overvåg dyret, indtil det er fuldt ud at komme sig efter bedøvelse, og før dyret tilbage til anlægget.
9. Anden operation for Nerve Transection og anastomose
- Udfør den anden operation 10-14 dage efter den første operation. Hold mad tilbage i 10-12 timer før operation.
- Bedøve dyret, drapere og overvåge vitals intraoperativt ved hjælp af den teknik, der er beskrevet i trin 7.2.
- Fjern suturerne og genåbne midterlinjen snit ved stump dissektion når det er muligt. Undgå skader på den tidligere implantation under dissektion. Eksponere de bilaterale RLNs gennem dissektion. Isoler, transect og anastomose hver nerve med 7-0 monofilamenter, ikke-absorberbare suturer til at fremkalde bilateral larynx lammelse.
- Skyl halsen snit med sterilt saltvand og gentamycin antibiotika. Luk muskuløse og subkutane væv ved hjælp af 3-0 absorberbare suturer. Luk huden med 3-0 ikke-absorberbare monofilamenter suturer.
- Nøje overvåge dyret, indtil fuld helbredelse fra kirurgi.
- Giv analgetika (f.eks. buprenorphin: 0,01-0,02 mg/kg) rutinemæssigt i op til 48 timer postoperativt. Giv dyret antibiotika (f.eks. cefpodoxime: 10 mg/kg) oralt til dyret i mindst 3 dage. Begrænse dyret fra motion i en periode på 10 dage for at tillade normal sårheling.
10. Nerve stimulation-EMG Optagelse Sessioner Efter bilaterale RLN skader
- Udfør disse sessioner 1x om ugen i løbet af de første 3 måneder, derefter hver anden uge. Følg den protokol, der er beskrevet i afsnit 8, for disse sessioner.
Representative Results
Eksempler på komponenterne er vist i figur 2. Fra venstre mod højre i figur 2A er nerve stimulus manchet, TA-LCA optagelse elektrode, PCA optagelse elektrode, og hud interface beholder, henholdsvis. Den relative størrelse af disse komponenter kan værdsættes. Hudbeholderen (Figur 2B) har to rækker huller, hvori hunstifterne for enden af hver oprullet tråd (Figur 2D) indsættes. De indsættes overfor frontpladen (pil) under implantationsoperationen. Beholderen har en polyester nederdel (Figur 2C) fastgjort til sin stik sidevægge. Denne nederdel er designet til at forankre beholderen på plads ved bindevæv infiltration. Hver Teflon-belagt rustfrit stål EMG bly (Figur 2E) er deisoleret (5 mm) på spidsen til at danne en krog-formet elektrode til muskel optagelse. Stimuleringsmanchetten har to elektroder, der er gevind mod den indvendige manchetvæg. De er adskilt af en afstand på 2 mm (Figur 2F) og danner en "V" form (Figur 2G) for at sikre den aktuelle levering på tværs af nerven.
Figur 2: Komponenter i implantatsystemet. (A)Fra venstre mod højre er nerve stimulus manchet, TA-LCA optagelse elektrode, PCA optagelse elektrode, og hud interface beholder, henholdsvis. (B) Hudbeholderen med to rækker huller. (C) Den beholder, der viser en polyester nederdel fastgjort til sin stik sidevægge. (D) Oprullet tråd indeholdende hunstifter, der skal indsættes i B. (E) Teflon-belagt eMG-bly i rustfrit stål er deisoleret (5 mm) på spidsen for at danne en krogformet elektrode til muskeloptagelse. (F) Stimuleringsmanchetten har to elektroder, der er gevind mod den indvendige manchetvæg, som er adskilt af 2 mm. (G) "V" form dannelse af elektroder for at sikre den nuværende levering på tværs af nerven. Dette tal er blevet ændret med tilladelse27. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 viser den implanterede hudbeholder, og hvordan kablet fra eksternt udstyr er forbundet med beholderne. Det skal bemærkes, at dummy mandlige stifter (ikke vist) indsættes i de kvindelige stifter af beholderen for at holde dem fri for snavs mellem optagelse sessioner.
Figur 3: Hudbeholder og grænsefladekabel. (A) Den implanterede hudbeholder på den anteriore hals uden attrap hanstifter er vist. (B) Billedet viser, hvordan stimulus-stifter og EMG-optagelsesstik (pil) fra eksternt udstyr er forbundet til beholderen under en nervestimulation-EMG optagelse session. Dette tal er blevet ændret med tilladelse27. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 viser en EMG-optagelse fra en af de grundlæggende sessioner med RLNs intakte.
Figur 4: EMG-optagelser fra larynxmuskler med normal innervation. (A) Eksempel optagelse fra PCA musklen, hvor RLN stimulation producerer en stimulus artefakt (pil) efterfulgt af en stor fremkaldt EMG potentiale. (B) Eksempel optagelse af TA-LCA muskel kompleks, hvor SLN stimulation producerer en stimulus artefakt (pil). Repræsenteret her er (a) en kort latenstid monosynaptic muskel respons og (b) en længere latenstid polysynaptic RGC svar. (C)Bursts (pile) af spontan EMG aktivitet registreres fra PCA musklen under normale inspirationer. (D) Forøgelse af inspiratorisk EMG-aktivitet i løbet af CO 2-leveringen.2 Dette tal er blevet ændret med tilladelse27. Klik her for at se en større version af dette tal.
I en optagelse fra PCA muskel (Figur 4A), RLN stimulation producerer en stimulus artefakt (pil) efterfulgt af en stor fremkaldt EMG potentiale. De maksimale RLN-fremkaldte responser giver et godt indeks over den samlede størrelse af normal innervation samt niveauet af reinnervation efter efterfølgende neurorrhaphy, uanset motorenhedstype. Dette er sandt, fordi RLN indeholder nervefibre af både inspiratory og refleks glottic lukning (RGC) motorenheder. RLN stimulation rekrutterer begge typer af enheder. Fremkaldt EMG motorenhed aktivitet er udbedret og integreret over en 20 ms periode for at opnå et kvantitativt mål for muskel innervation.
I en optagelse fra TA-LCA muskel kompleks (Figur 4B), SLN stimulation producerer en stimulus artefakt (pil). Denne artefakt efterfølges af et monosynaptisk muskelrespons (a) kort ventetid og polysynaptisk RGC-respons (b). Potentialet (a) er en direkte reaktion fra cricothyroid muskel, fordi denne muskel er innervated af den nærliggende eksterne gren af SLN. Omstrejfende aktivering af denne gren opstår almindeligvis under nerve manchet stimulation af den interne gren for at aktivere RGC respons. Cricothyroid potentiale registreres af TA-LCA elektrode, da denne muskel er placeret i nærheden af komplekset. Tidligere undersøgelser har vist, at cricothyroid potentiale fremkaldt af interne gren stimulation kan selektivt afskaffes ved at dele den eksterne gren af SLN (Zealear, ikke-offentliggjorte observationer). De maksimale SLN-fremkaldte EMG-responser afspejler omfanget af den naturlige indre vation af TA-LCA-komplekset gennem dets RGC-sensorisk-motoriske vej. Før RLN neurorrhaphy, der er ingen RGC innervation af PCA musklen, så ingen SLN potentiale bør påvises fra denne muskel. Efter nervetransektion og reparation afspejler SLN-fremkaldte potentialer mængden af korrekt RGC-reinnervation af TA-LCA-komplekset og forkert RGC-reinnervation af PCA-musklen. RGC-aktiviteten kvantificeres ved berigtigelse og integration over en periode på 20 ms for at registrere hele RGC-bølgeformen.
I (Figur 4C) registreres eksplosioner (pile) af spontan EMG-aktivitet fra PCA-musklen under normale inspirationer. Denne inspiratoriske EMG aktivitet stiger i løbet af CO2 levering, som vist i (Figur 4D) ved en langsommere feje hastighed. Spontan PCA EMG aktivitet giver et godt skøn over omfanget af normal innervation af denne muskel ved sin oprindelige inspiratory motoneuroner. Der er ingen inspiratorisk innervation af TA-LCA kompleks, så ingen inspiratory potentialer bør påvises fra disse muskler. Dette skyldes, at kun inspiratory motorenheder er involveret i at bortføre den vokale fold på maksimal inspiratory indsats i bestøveret dyr. Efter nerve transektion og reparation, spontane inspiratory potentialer afspejler omfanget af korrekt reinnervation af PCA muskel og omfanget af forkert reinnervation af TA-LCA kompleks. Optagelser af inspiratorisk EMG aktivitet forstærkes, udbedres og integreres over en 8 s periode.
Discussion
Dette papir beskriver de skridt, der kræves i fremstillingen af en roman, økonomisk, og implantable system til stimulering af larynx nerver og registrering af EMG svar fra larynx muskler på lang sigt. Protokollen er ukompliceret og kan producere et implantat, der er kompakt nok til at blive udnyttet i et dyr så lille som en rotte. Der er flere kritiske trin, der bør understreges. For det første skal ledningerne vikles omhyggeligt og ensartet for at forhindre blydeisolering, knæk eller brud. Hvis en coiling maskine ikke er tilgængelig, præfabrikerede oprullede ledninger kan opnås kommercielt. For det andet, strategien med at indsætte blyledninger i et silikonerør til at danne et "V", der strækker sig over nerven er afgørende for at fremme den nuværende levering gennem nerven inde i manchetten. Hvis begge ledninger er placeret på samme side af røret, kan der forekomme rangering af strøm mellem elektroder. Det er også vigtigt, at ledningerne er placeret mod røret sindre væg for at undgå muligheden for skive skade på nerven.
For det tredje, under implantation kirurgi, larynx nerver bør dissekeres omhyggeligt for at forhindre skader. På det senere stadium af implantation, når du indsætter stifter i beholderen, skal der påføres kraft på stiften i tilpasningen til sit hul for at forhindre pludselig bøjning af hovedet af stiften. Efterfølgende bør knoglecement fordeles grundigt på beholderbunden for fuldstændig isolering og forebyggelse af krydstale mellem kanaler. Endelig, forebyggelse af infektion er afgørende for at sikre integriteten af implantatsystemet over tid. Det kan opnås ved en kombination af flere manøvrer: tilføjelse af en nederdel til beholderen, administration af antibiotika, daglig rengøring af såret og beholder med væv-kompatibel antiseptisk opløsning, og placering af dummy mandlige stifter i de kvindelige stifter af beholderen for at holde dem rene af snavs mellem sessioner.
Protokollen har vist sig vellykket i denne hund larynx model. Nogle ændringer eller alternative strategier kan dog overvejes i andre applikationer. For eksempel er de deisolerede sensing tips af PCA og TA-LCA EMG elektroder forankret i musklerne ved en ekstern midler-enten polyester graft eller DBS elektrode. I et program, hvor ekstern forankring ikke er nødvendig eller udføres, kan modhager af elektroden alene tjene som anker. I et sådant tilfælde kan Teflon-belagt, rustfrit stål, monofilamenter tråd være at foretrække frem for multifilamenttråd i betragtning af sin større trækstyrke, hvilket giver en modhager, der er mere stabil i væv. Det skal dog bemærkes, at flerfitrådledninger kan være mindre tilbøjelige til brud. En alternativ strategi for fremstilling og samling af hudbeholderen er at 3D-print ved hjælp af biokompatible polymerer (f.eks. Dette kan forenkle fremstillingsprocessen.
Efter implantationskirurgi og genindvinding af dyret udføres fysiologiske sessioner med RLN'erne stadig intakte for at opnå baselinedata. Under en session kan der forekomme fravær af EMG-signaler fra en larynxmuskel efter RLN-stimulation. For at fejlfinde årsagen (tabel 1) skal det først afgøres, om vokal fold bevægelse er til stede. Hvis det er til stede, betyder det, at nerven effektivt aktiveres af manchetten, men der er et problem med EMG bly. I denne situation, brugere bør yderligere se på EMG stimulus artefakt. Hvis EMG artefakt er fraværende, er der sandsynligvis en diskontinuitet i EMG input til forforstærkeren. Tres-cyklus støj vil også være til stede og store i amplitude. Hvis artefaktet er stort, kan rangering fra en stimuluspin til optagelsesstiften være ansvarlig for at mætte kanalforforstærkeren og udslette EMG-responsen. Hvis artefakter er normal, så EMG bly har sandsynligvis forvredet fra musklen og kan ikke registrere sin aktivitet. På den anden side, hvis vokalfoldbevægelse er fraværende, så nerven ikke bliver aktiveret. Hvis artefaktet er fraværende, kan der være en diskontinuitet i stimuleringskredsløbet, hvilket forhindrer nerveaktivering. Hvis artefaktet ser normal ud, kan nerven være kommet til skade under implantatoperationen, eller manchetten kan have migreret fra nerven. En lignende strategi kan anvendes til fejlfinding af årsagen til fraværende EMG-signaler under SLN-stimulering.
| Stimuleret nerve | Målmuskler | Ipsilateral vokal fold bevægelse | Stimulus artefakt | Årsager |
| Rln | PCA og/eller TA-LCA | Ja | Fraværende (60-cyklus støj til stede) | Diskontinuitet i EMG-indgangen til forforstærkeren (f.eks. bly, stift, kabel) |
| Store | Krydstale mellem stim og optagelse af stifter ved beholderen | |||
| Normal | Dislokation af EMG-elektrode | |||
| Nej | Fraværende | Diskontinuitet i stimuleringskredsløbet | ||
| Normal | 1. RLN-skade 2. Cuff dislokation | |||
| Sln | TA-LCA | Ja | Fraværende (60-cyklus støj til stede) | Diskontinuitet i EMG-indgangen til forforstærkeren (f.eks. bly, stift, kabel) |
| Store | Krydstale mellem stim og optagelse af stifter ved beholderen | |||
| Normal | Dislokation af EMG-elektrode | |||
| Nej | Fraværende | Diskontinuitet i stimuleringskredsløbet | ||
| Normal | 1. SLN- eller RLN-skade 2. Cuff dislokation |
Tabel 1: Vejledning til fejlfinding.
Det skal nævnes, at der er to mindre begrænsninger i den nuværende anvendelse af denne teknologi. For det første har pludselig bøjning af den kvindelige pin under indsættelse i beholderen fundet sted i flere tilfælde. Heldigvis kan stifterne rettes og indsættes i deres huller med succes. Hvis pin-skaden er uoprettelig, skal ledningen og hele komponenten udskiftes. Derfor bør backup komponenter være let tilgængelige før operationen. For det andet er den tid, det tager at fuldføre den kirurgiske implantation lang (~ 10 h). Den lange varighed afspejler delvist det store antal stimulations- og omkodningskomponenter, der kræves til denne undersøgelse: fire nerver, fire muskler, en beholder og en IPG. Hvis der kræves færre komponenter ved hjælp af denne teknologi, skal implantationstiden28reduceres betydeligt (f.eks.
Denne teknologiske tilgang introducerer flere funktioner, der har fordel i forhold til eksisterende metoder. Oprulningen af blyledninger er det mest nye og vigtigste træk ved dette system. Oprullede kundeemner er ikke almindeligt tilgængelige for ikke-kommercielle dyreforsøg på trods af de mange fordele, de giver. En oprullet bly kan udvides til den ønskede længde under implantationen. Yderligere, det vil strække sig i vågen, bevægelige dyr for at forhindre dislokation af elektrode spidsen eller wire brud efter implantation. Denne funktion sikrer levetiden af implantatet og stabil nerve stimulation og muskel optagelse på lang sigt. Desuden, tilføje et væv kompatibel nederdel omkring beholderen forhindrer eksponering af såret til dette fremmedlegeme og fremmer normal fibrose og sårheling i mangel af infektion. Tidligere undersøgelser uden denne nederdel resulterede i tidlig infektion og for tidlig afslutning af forsøget. Endelig, dette implantat system er kompakt og multi-kanaliseret, så effektiv dataindsamling fra mange neuromuskulære strukturer i dyremodeller af forskellig størrelse.
Denne tekniske tilgang er blevet tilpasset og med succes oversat til en rottemodel. Denne undersøgelse var designet til at undersøge effekten af elektrisk konditionering i forebyggelseaf tunge muskelatrofi og dysfunktion i den aldrende rotte. Hypoglossal nerverne blev implanteret med manchetelektroderne til konditionering, og tungen implanteret med EMG-optagelseselektroderne28. Denne teknologi kan også anvendes i andre forskningsapplikationer. Som en forlængelse af den nuværende protokol i hunde strubehovedet, virkningerne af elektrisk konditionering på at fremme selektiv reinnervation er i øjeblikket ved at blive undersøgt i kanin ansigtsmuskler. Denne undersøgelse kan give et fundament for forebyggelse af ansigtssynkinese hos patienter med Bell's parese, en fælles og invaliderende medicinsk tilstand. En endelig potentiel anvendelse af denne teknologi er at stimulere og registrere fra vågen, frit bevægende dyr. På nuværende tidspunkt er sådanne data er opnået via eksternt kabel fra vågne, uhæmmede rotter28. I fremtiden kan dette økonomiske system også kombineres med fjernoptagelsesstimuleringsteknologi (f.eks. telemetri) for at aktivere eller sonde neuromuskulære systemer trådløst.
Disclosures
Dr. David Zealear markedsfører denne implantable, nervestimulation-EMG-teknologi til en række neuromuskulære systemer og dyremodeller.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Hongmei Wu for hendes bidrag til dyrepleje og dataindsamling i hele undersøgelsen. Vi takker Amy Nunnally, Jamie Adcock og Phil Williams for deres hjælp med sterile operationer. Den ekspertise og dedikation af personalet på Vanderbilt University Animal Care Facility var uvurderlig. Denne forskning blev støttet af NIH tilskud U01DC016033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305175 | |
| 23 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305145 | |
| 25 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305125 | |
| 3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL | Ethicon | J219H | |
| 3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8684G | |
| 4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8871H | |
| 6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene | Ethicon | 8805 | |
| 7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | M8735 | |
| Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98% | ACROS | code 194790100 | for dilution of modical adhesive silicone |
| Bone cement | Zimmer | 1102-16 | 20g powder 10 mL liquid |
| Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1 mLl) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd | 12496-0757-1 | |
| CCD video camera attached to the endoscope | Sony | MCC500MD | |
| Cefpodoxime (Simplicef 100 mg tablets) | Zoetis | 5228 | |
| Data acquisition device , PowerLab 16/35 | ADInstruments, Inc | 5761-E | |
| Deep-brain stimulation (DBS) electrodes | Abbott | 6172ANS | |
| Digital oscilloscope | Tektronix | DPO71304SX | |
| Implantable pulse generator (IPG), Infinity | Abbott | 6660ANS | |
| Knitted polyester graft | Meadox Medical Inc | 92220 | 20 mm in diameter |
| Medical Grade Polyethylene Micro Tubing | Amazon.com | BB31695-PE/13-10 | OD 0.156", ID 0.094" |
| Metal female pin | Allied Electronics & Automation | 220-S02-100 | |
| Metal male pin | CDM electronics | 220-p02-1 | |
| Prefabricated coiled leads | Medical innovations Inc. | ||
| Silastic Laboratory Tubing | Cole-Parmer | 2415569 | OD 0.125", ID 0.062" |
| Silastic Medical Adhesive Silicone | Dow corning | Type A, 2 oz | |
| Stainless steel monofilament wire | The Harris Products Group | type 316 | 0.008" (coated), 0.005" (bare) |
| Sterile Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Sklar Instruments | 96-1146 | |
| Strip connector | CDM electronics | 2.6 x 11.6 x 101.5 mm | single row, round, through hole |
| Teflon-coated multi-filament stainless steel wire | Medwire | Part 316, ss7/44T | |
| Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol - 5 mL | Zoetis | 004866 | |
| Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan - 1 Gallon | Zoetis | 540561 | |
| Zero-degree rigid endoscope | Karl Storz | 8712AA |
References
- Wikipedia contributors. Electromyography. Wikipedia, The Free Encyclopedia. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Electromyography (2019).
- Zealear, D. L., et al. Stimulation of denervated muscle promotes selective reinnervation, prevents synkinesis, and restores function. The Laryngoscope. 124 (5), 180-187 (2014).
- Gaweł, M. Electrodiagnostics: MUNE and MUNIX as methods of estimating the number of motor units - biomarkers in lower motor neurone disease. Neurologia i neurochirurgia polska. 53 (4), 251-257 (2019).
- Foerster, G., Mueller, A. H. Laryngeal EMG: Preferential damage of the posterior cricoarytenoid muscle branches especially in iatrogenic recurrent laryngeal nerve lesions. Laryngoscope. 128 (5), 1152-1156 (2018).
- Lin, R. J., Smith, L. J., Munin, M. C., Sridharan, S., Rosen, C. A. Innervation status in chronic vocal fold paralysis and implications for laryngeal reinnervation. Laryngoscope. 128 (7), 1628-1633 (2018).
- Koh, T. J., Leonard, T. R. An implantable electrical interface for in vivo studies of the neuromuscular system. Journal of Neuroscience Methods. 70 (1), 27-32 (1996).
- Grimonprez, A., et al. A Preclinical Study of Laryngeal Motor-Evoked Potentials as a Marker Vagus Nerve Activation. International Journal of Neural Systems. 25 (8), 1550034 (2015).
- Haidar, Y. M., et al. Selective recurrent laryngeal nerve stimulation using a penetrating electrode array in the feline model. The Laryngoscope. 128 (7), 1606-1614 (2018).
- Kneisz, L., Unger, E., Lanmüller, H., Mayr, W. In Vitro Testing of an Implantable Wireless Telemetry System for Long-Term Electromyography Recordings in Large Animals. Artificial Organs. 39 (10), 897-902 (2015).
- Inzelberg, L., Rand, D., Steinberg, S., David-Pur, M., Hanein, Y. A Wearable High-Resolution Facial Electromyography for Long Term Recordings in Freely Behaving Humans. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Horn, K. M., Pong, M., Batni, S. R., Levy, S. M., Gibson, A. R. Functional specialization within the cat red nucleus. Journal of Neurophysiology. 87 (1), 469-477 (2002).
- Larson, C. R., Kistler, M. K. The relationship of periaqueductal gray neurons to vocalization and laryngeal EMG in the behaving monkey. Experimental Brain Research. 63 (3), 596-606 (1986).
- Zealear, D., Larson, C. A Microelectrode Study of Laryngeal Motoneurons in the Nucleus Ambiguus of the Awake Vocalizing Monkey. Vocal Fold Physiology Volume. 2, 229-238 (1988).
- Zealear, D. L., Billante, C. R. Neurophysiology of vocal fold paralysis. Otolaryngologic Clinics of North America. 37 (1), 1-23 (2004).
- Zealear, D. L., et al. Electrical Stimulation of a Denervated Muscle Promotes Selective Reinnervation by Native Over Foreign Motoneurons. Journal of Neurophysiology. 87 (4), 2195-2199 (2002).
- Insalaco, G., Kuna, S. T., Cibella, F., Villeponteaux, R. D. Thyroarytenoid muscle activity during hypoxia, hypercapnia, and voluntary hyperventilation in humans. Journal of Applied Physiology. 69 (1), 268-273 (1990).
- Ludlow, C. L., Van Pelt, F., Koda, J. Characteristics of Late Responses to Superior Laryngeal Nerve Stimulation in Humans. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (2), 127-134 (1992).
- Li, Y., et al. Comparison of Ventilation and Voice Outcomes between Unilateral Laryngeal Pacing and Unilateral Cordotomy for the Treatment of Bilateral Vocal Fold Paralysis. ORL. 75 (2), 68-73 (2013).
- Mueller, A. H. Laryngeal pacing for bilateral vocal fold immobility. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (6), 439-443 (2011).
- Crumley, R. L. Laryngeal Synkinesis Revisited. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 109 (4), 365-371 (2000).
- Hydman, J., Mattsson, P. Collateral reinnervation by the superior laryngeal nerve after recurrent laryngeal nerve injury. Muscle & Nerve. 38 (4), 1280-1289 (2008).
- Marie, J. P., Navarre, I., Lerosey, Y., Magnier, P., Dehesdin, D., Andrieu Guitrancourt, J. Bilateral laryngeal movement disorder and synkinesia: value of botulism toxin. Apropos of a case. Rev Laryngol Otol Rhinol (Bord). 119 (4), 261-264 (1998).
- Zealear, D. L., Billante, C. R., Sant’anna, G. D., Courey, M. S., Netterville, J. L. Electrically stimulated glottal opening combined with adductor muscle botox blockade restores both ventilation and voice in a patient with bilateral laryngeal paralysis. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (6), 500-506 (2002).
- Zealear, D. L., et al. Reanimation of the paralyzed human larynx with an implantable electrical stimulation device. Laryngoscope. 113 (7), 1149-1156 (2003).
- Mueller, A. H., et al. Laryngeal pacing via an implantable stimulator for the rehabilitation of subjects suffering from bilateral vocal fold paralysis: A prospective first-in-human study. Laryngoscope. 126 (8), 1810-1816 (2016).
- Li, Y., Garrett, G., Zealear, D. Current Treatment Options for Bilateral Vocal Fold Paralysis: A State-of-the-Art Review. Clinical and Experimental Otorhinolaryngology. 10 (3), 203-212 (2017).
- Li, Y., Huang, S., Zealear, D. An implantable system for In Vivo chronic electromyographic study in the larynx. Muscle & Nerve. 55 (5), 706-714 (2017).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle & Nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
