Summary
Presentert her er en protokoll for produksjon av et implanterbart system for in vivo kronologisk registrering av fremkalt og spontanelektromyografisk potensial. Systemet brukes på undersøkelse av reinnervation av strupemuskulaturen etter nerveskade.
Abstract
Elektromyografi (EMG) måler muskelresponsen på elektrisk stimulering eller spontan aktivitet av motorenheter og spiller en viktig rolle i vurderingen av nevromuskulær funksjon. Kronisk registrering av EMG-aktivitet som gjenspeiler en muskels reinnervation status etter nerveskade har vært begrenset, på grunn av den invasive naturen til tradisjonelle EMG opptaksteknikker. I denne forbindelse er et implanterbart system designet for langsiktig, in vivo EMG-opptak og nervestimulering. Det har blitt brukt og testet i en studie på reinnervation av strupemuskulaturen. Dette systemet består av 1) to bipolare elektrode nerve mansjetter og fører for å stimulere hver av to nerver: den tilbakevendende laryndeal nerve (RLN) og indre gren av overlegen laryngeal nerve (SLN); 2) to EMG opptak elektroder og fører for hver av de to laryngeal muskler: bakre cricoarytenoid (PCA) muskel og thyroarytenoid-lateral cricoarytenoid (TA-LCA) muskel kompleks; og 3) en hudbeholder som krysser alle implanterte blyterminaler til en ekstern opptaksforforsterker og stimulator ved hjelp av en tilkoblingskabel. Ledningsledningene er Teflon-belagt, multi-filament, type 316 rustfritt stål. De er kveilet og kan strekke seg under kroppsbevegelse av det våkne dyret for å forhindre blybrudd og elektrodemigrasjon. Dette systemet implanteres under en aseptisk kirurgi. Etterpå utføres Baseline EMG-opptak før RLN er transected i den andre operasjonen for å studere muskelreinnervation. Gjennom hele studien utføres flere fysiologiske økter i det bedøvede dyret for å oppnå fremkalt og spontan EMG-aktivitet som gjenspeiler reinnervation status av larynde muskler. Systemet er kompakt, uten infeksjon i løpet av studien, og svært holdbar. Dette implanterbare systemet kan gi en pålitelig plattform for forskning der langsiktig opptak eller nervestimulering er nødvendig i et bedøvet eller fritt bevegelig dyr.
Introduction
EMG-opptak er en nyttig teknikk for måling av elektrisk aktivitet produsert av en skjelettmuskulatur når den aktiveres ved elektrisk stimulering av nerve eller spontan avfyring av motorenhetene. Overvåking Av EMG-signaler kan brukes til vurdering av nevromuskulær overføring og muskelbiomekanikk1. EMG-opptak spiller også en viktig rolle i å karakterisere kvaliteten og omfanget av muskelreinnervation etter nerveskade2,3,4,5. Flere EMG-opptak i hele perioden med reinnervation kan imidlertid ikke oppnås ved en invasiv tilnærming. Derfor er implanterbare enheter designet og utviklet for gjentatt, kronisk stimulering og opptak i nevromuskulære systemer6,,7,8,9,10,11,12,13. Målet med dette papiret er å beskrive en protokoll for produksjon og implantasjon av et stabilt system for å skaffe pålitelige kronologiske EMG-data fra strupehodet.
Dette systemet brukes her til studiet av laryngeal muskelreinnervation. En kort oversikt over strupehodet er gitt for orientering (Figur 1). En nøyaktig koordinering mellom sensoriske og motoriske komponenter er avgjørende for riktig muskelbevegelse under åndedrett, voicing og luftveisbeskyttelse. PCA-muskelen, som ligger i det bakre strupehodet, er den eneste bortføreren av vokalfolden. Denne muskelen aktiveres spontant under inspirasjon for å øke glottalområdet for innånding. TA-LCA-komplekset er den viktigste adductoren til vokalfolden. Aktivering av dette muskelkomplekset sammen med en annen adductor (dvs. interarytenoid muskel) medialize folden for vibrasjon og lydproduksjon og lukk folden for luftveisbeskyttelse under svelging.
I tillegg, motor neuron fibre innervate både abductor og adductor muskler i RLN. Bortføreren og adductor musklene kan skilles basert på motorenhet sammensetning14,15. PCA-muskelen viser økt avfyring under hyperkapnisk og/eller hypoksiske forhold16 på grunn av tilstedeværelsen av inspiratoriske motorenheter. Refleksglottisk lukking (RGC) motorenheter, som lukker glottisrefleksivt gjennom aktivering av sensoriske reseptorer i laryneal slimhinnen, er til stede i TA-LCA muskelkompleks. Den indre grenen av den overlegne laryngeal nerven (SLN) bærer de afferent fibrene av sensoriske reseptorer i strupehodet17. Selv om voicing er først og fremst en adductor funksjon, både abductor og adductor motor enheter er involvert i denne svært utviklet laryngeal atferd.
Figur 1: Anatomi av strupehodet. Komponentene i dette implanterbare systemet vises også. SLN = overlegen strupenerven; RLN = tilbakevendende laryndenerve; PCA = posterior cricoarytenoid muskel; TA-LCA = thyroarytenoid-lateral cricoarytenoid muskelkompleks; DBS = dyp hjernestimulering. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra Wiley27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Skade på RLN kan resultere i vokal fold lammelse (VFP), som kompromisser både bortføre og adducting funksjoner på grunn av laryngeal muskel denervation14,18,19. Deretter oppstår regenerering av RLN nervefibre og reinnervation av muskler vanligvis. Men, reinnervation er en tilfeldig prosess og resulterer i feilsendt, upassende muskel reconnection i de fleste tilfeller. Dette kalles synkinesis, der spontan aktivering av abductor og adductor antagonister er feil og produserer ineffektiv eller paradoksal bevegelse av vokalfolder14,19,20,21. Med synkinesis er den kritiske funksjonen som går tapt vokal fold bortføring, noe som resulterer i utilstrekkelig ventilasjon. Selv om det er pågående forsøk på å behandle laryngeal synkinesis ved enten 1) blokkerer glottisk lukking med Botox22,23 eller 2) elektrisk stimulere glottisk åpning med en implanterbar pacemaker24,25, det er ingen klinisk intervensjon som pålitelig hindrer synkinesis26. Det er imidlertid bevis for at elektrisk kondisjonering av PCA-muskelen under reinnervation ved lav frekvens fremmer passende nevromuskulær tilkobling og minimerer synkinesis fra å skje. Studier utføres for tiden for å belyse de underliggende mekanismene2.
Fokuset i dette papiret er å beskrive et enkelt og billig implanterbart system for kronisk nervestimulering og EMG-opptak. Dette systemet kan brukes til å undersøke effekten av lavfrekvent elektrisk kondisjonering av PCA muskel en spesifisitet av sin påfølgende reinnervation. EMG-signaler oppnådd av dette systemet kan gjenspeile kvaliteten og kvantiteten av laryngeal muskelreinnervation over tid.
Protocol
Denne studien er godkjent av den institusjonelle dyreomsorgs- og brukskomiteen (IACUC) ved Vanderbilt University og ble utført i samsvar med Guide for care and use of Laboratory Animals (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Dette systemet inneholder fem implanterbare komponenter og en ekstern kabel.
1. To bipolare RLN stimulus elektrode mansjetter, hver med par kveilet bly ledninger og terminal pins
- Bruk Teflon-belagt, multi-filament, type 316 rustfritt stål wire (med isolert diameter på 0,0078" eller 0,198 mm) for hver mansjett ledningwire. Skjær en 70 cm lang ledning og sveitre den inn i en 12 cm lang fjær ved hjelp av en kveileenhet eller skaffe prefabrikkerte kveilet ledninger. Trekk om nødvendig fjæren for å øke lengden for hvert implantatsted. La endene av de kveilet ledningene stå rett ved 3 mm og 10 mm lengder og deinsulatdem.
- Lodde en gullbelagt kobber kvinnelig pin på 3 mm enden av den kveilet bly.
- For å forberede nervemansjetten, kutt et 5 mm segment silikonrør (OD = 0,156", ID = 0,094"; eller OD = 3,96 mm, ID = 2,39 mm) fra en rull med slangen.
- For å sette en bly inn i røret, bruk en 25 G hypodermisk nål for å pierce gjennom rørveggen 1,5 mm fra enden og off-center nær den indre veggen. Fyll 10 mm enden av ledningen inn i kanylens spiss. Trekk nålen for å sette den deisolerte delen ut i røret. Bøy tilbake den nakne ledningen utenfor røret og vri på ledningen på sitt inngangspunkt i røret.
MERK: Bruk et driftsmikroskop til å utføre disse trinnene. En sonde kan plasseres i røret for å kurve ledningen mot den indre veggen. Målet er å plassere den nakne delen av ledningen slik at stimuli kan leveres til nerven uten å risikere mekanisk skade på nerven. - Sett inn den andre ledningen 1,5 mm fra motsatt ende av røret ved hjelp av samme prosedyre. Juster inngangspunktet til det første kundeemnet. Pierce veggen med nålen slik at den nakne delen av ledningen er avsatt nær den indre veggen motsatt til den første ledningen.
MERK: Ser ned røret, bør de to stimulanselektrodene danne en 45 ° "V" form, som vil straddle nerven en gang på plass og sikre gjeldende levering gjennom nerven fra anode til katode. - Lag en S-formet spalte i rørveggen på motsatt side av elektrodeinngangspunktene ved hjelp av et par buede saks.
MERK: Spiralleppene i mansjetten kan deretter åpnes for å plassere nerven inne mellom elektrodene under operasjonen. - Sett inn en lengde på 6-0 monofilament, ikke-absorberbar sutur inn i mansjettveggen i hver ende ved hjelp av en buet mikrokirurgisk nål for eventuell sikring av mansjetten rundt nerven.
- Påfør medisinsk karakter type-A silikon gel for å reinsulate alle eksponert bar wire utenfor mansjetten.
2. To bipolare SLN stimulus elektrode mansjetter, hver med par kveilet bly ledninger og terminal pins
- Monter SLN stimulus elektrodemansjetten på samme måte som RLN stimulus elektrode cuff. Bruk imidlertid mindre diameter (OD = 0,125", ID = 0,062"; eller OD = 3,18 mm, ID = 1,57 mm) rør, fordi nerven er mindre i diameter.
3. To PCA muskel EMG opptakelektroder, hver med kveilet blywire og terminal pin
- Monter en kveilet ledning for PCA muskelelektrode som gjort i trinn 1.1.
- Lodde en kvinnelig pin på ledelsen som gjort i trinn 1.2.
- Sett inn 10 mm enden av PCA muskelledningen i spissen av en dyp hjernestimuleringselektrode (DBS) ved hjelp av samme strategi for nålledninginnsetting i en mansjett (trinn 1.4). Bøy enden av ledningen for å danne en krok og klips den for å gi totalt 5 mm opptakslengde.
MERK: I dette programmet er PCA-muskelen og dens reinnervating nerveterminaler utsatt for elektrisk kondisjonering. Stimuli genereres av en implanterbar pulsgenerator (IPG) og leveres til strupemuskulaturen gjennom en DBS-elektrode (figur 1, innfelt). Dette systemet er tilpasset fra terapeutisk hjernestimulering (f.eks. Parkinsons sykdom). DBS-elektroden vil bli satt inn i en submuskulær lomme og forankret på plass. Hvis teknologi for elektrisk kondisjonering av muskelen ikke er nødvendig, pca EMG elektroden kan settes direkte inn i muskelen og forankret av kroken.
4. To TA-LCA muskelkompleks EMG opptakelektroder, hver med kveilet blyledning og klemmepinne
- Monter en kveilet ledning for TA-LCA muskelelektroden som gjort i trinn 1.1.
- Lodde en kvinnelig pin på ledelsen som gjort i trinn 1.2.
- Avgift ser en 5 mm x 10 mm rektangulær stykke strikket polyester pode. Lag et hull i midten av nettet med en 20 G hypodermisk nål. Sett 10 mm enden av ledningen inn i hullet med ytterligere 3 mm spole som stikker ut utover hullet. Fest ledningen til nettet ved hjelp av 6-0 monofilament, ikke-absorberbar sutur.
MERK: Dette stykke mesh vil bli brukt til å forankre elektroden føre til skjoldbruskbrusk overliggende muskelkomplekset. - Bøy enden av ledningen for å danne en krok og klips den for å gi totalt 5 mm opptakslengde.
5. Hudbeholder for grensesnitttilkoblinger mellom elektroder og eksternt utstyr
- Bruk en enkelt rad kvinnelig pin stripe kontakt for å gjøre beholderen. Klipp to stykker (hver 17,5 mm lang) fra stripen, hver med åtte pinners hull. Først grov de ytre overflatene av hvert stykke med sandpapir, lim dem sammen med fenol i en røykhette for å lage en dobbel radkontakt. Plasser kontakten i 60–80 °C vann i en røykhette i 30 minutter for å muliggjøre limherding.
MERK: Dette doble radmonteringsformatet vil gi bekvemmelighet i tildeling av pinholes for venstre- vs høyre side elektroder. - Klipp et 25,6 mm lengdestykke fra stripen for å gjøre kontaktens frontplate (den delen som vil stikke ut utenfor implantatstedet for hudforankring). Klipp et 5,4 mm x 17,4 mm rektangulært hull midt i frontplaten med en skalpell.
- Plasser den dobbeltradskontakten inne i det rektangulære hullet på frontplaten til den skylles med frontplateoverflaten uten fremspring. Hvis kontakten ikke passer inn i det rektangulære hullet på frontplaten, kan hullet forstørres litt med en fil. Siden koblingshullene ikke er symmetriske, setter du koblingskanten med hullene med større diameter inn i frontplaten.
MERK: Som et resultat vil en kvinnelig pin satt inn i motsatt kant av kontakten med det mindre diameterhullet knipse og låses på plass. - Bruk fenol til å lime kontakten og frontplaten sammen. Plasser enheten i 60–80 °C vann i en røykhette i 30 minutter for å muliggjøre limherding.
- Bor et hull på 1,3 mm i hvert hjørne av frontplaten og på hver side av frontplaten halvveis fra endene i totalt seks hull.
MERK: Disse hullene vil bli brukt til å suturere den endelige hudbeholderen på implantatstedet. - Klipp et 15 mm langt rør med strikket polyestertransplantat for å omgi enheten under frontplaten, noe som gjør enheten biokompatibel. For å feste røret til enheten, bruk en hypodermisk nål til å tre rustfritt stål ledninger gjennom veggen på tre like mellomrom posisjoner (hver 3,8 mm fra hverandre) langs lengden.
- Plasser like mellomromihvert hjørne av kontakten for å forankre ledningene mot monteringsoverflaten. Vri endene av hver ledning med et par tang for å klemme røret til forsamlingen for å danne et skjørt.
- Sett et permanent merke på polyesterplasteret i den ene enden av beholderen.
MERK: Bruk dette merket for orientering for å identifisere rosenkransenden av beholderen under implantatkirurgi. I rostral til caudal retning, følgende pin elektrode tildeling for hver av de to radene (venstre side og høyre side) bør være som følger: PCA EMG, TA-LCA EMG, tomt hull, tomt hull, RLN anode, RLN katode, SLN anode, og SLN katode.
6. Ekstern tilkoblingskabel for opptak av forforsterker og stimulator
MERK: En kabel brukes til å lage forbindelser mellom implantert hudbeholder og eksternt utstyr under nervestimulering-EMG opptaksøkter (avsnitt 8 og 10). Den består av 12 isolerte ledninger som avsluttes med mannlige pinner for å sette inn i kvinnelige pinner i hudbeholderen. Denne kabelen består av to deler: en EMG-opptaksplugg og nervestimuleringsledninger. En opptaksplugg er nødvendig for å isolere lavspennings-EMG-signaler fra høyere spenningsstimulusartefakter som stråler fra stimulanspinner. Av samme grunn er to hull i hver rad av hudbeholderen igjen ledig for å skille opptakspinner fra stimuleringspinner.
- For å lage EMG-opptakspluggen, bruk en mannlig stripekontakt (samme lengde og bredde, men halvparten av høyden på en kvinnelig kontakt). Skjær den i to stykker, hver inneholder bare to hull. Fest de to bitene ved hjelp av fenollim ved hjelp av samme tilnærming for å gjøre dobbel radkontakten i hudbeholderen (trinn 5.1). Ta de fire EMG-opptaksledningene i kabelen og sett sine terminale mannlige pinner inn i hvert av de fire hullene til de låses på plass med spissene som stikker ut utover stripekanten.
- Bruk beinsement til å forsegle toppen av pluggen for å isolere tråd-pin-veikryss.
- Bruk de resterende åtte ledningene i kabeltermineringen i mannlige pinner for å gjøre individuelle tilkoblinger til nervestimuleringsmansjettene via deres kvinnelige pinner.
7. Første implantatkirurgi
- Få en 1-2 år gammel, 20-25 kg hund av begge kjønn fra en lisensiert gård. Akklimatiser dyret før aseptisk implantatkirurgi. Autoklav alt utstyr før operasjonen. Hold tilbake mat i 10–12 timer før operasjonen.
- Forbered dyret for kirurgi.
- Barber dyrets hode og nakke og rengjør huden med alkohol og betadinskrubbløsning. Bedøve dyret ved intravenøs injeksjon på 2–4 mg/kg tiletamin og zolazepam kombinasjon, etterfulgt av 3% isofluran i oksygen gjennom intubasjon.
- Plasser dyret på et operasjonsbord med en varmepute i supinstilling og kirurgisk drapere dyret. Overvåk dyrets hjertefrekvens, respirasjonsfrekvens, kroppstemperatur og oksygenmetning minst hver 15.
- Lag et midtlinjenakkesnitt fra skjoldbruskhakket til manubrium. Dissekere luftrøret fri fra spiserøret og utsett den dårligere grensen til den cricoid brusk.
- Plasser stimulansmansjetten på hver av de bilaterale slNene og RLNene. Lukk leppene til hver mansjett ved hjelp av de vedlagte suturene.
- Lag et bruskvindu med et biopsislag (4 mm i diameter) på den fremre overflaten av skjoldbruskbruskbrusk på hver side. Utsett de laterale aspektene ved begge TA-LCA muskelkomplekser. Sett inn EMG-opptakselektrodene i TA-LCA muskelkomplekser ved hjelp av en 23 G nål ved å sette barb inn i spissen av nålen. Sutur elektroden polyester patch på brusk.
- Plasser DBS-elektroden sammen med sin ledsager krok-wire EMG opptakelektrode under PCA muskelen på hver side. Bruk et endoskop for å bekrefte at stimulering produserer vokal fold bortføring for hver kanal. Forankre DBS-elektrodene til cricoid brusk med 4-0 ikke-absorberbare suturer.
- Sett alle ledningene til nervestimulering-EMG-opptakselektrodene inn i beholderen via sine kvinnelige pinner. Trykk pinnene inn i hull med et innsettingsverktøy laget av en hemostat. Forsegle den dårligere overflaten av beholderen for å isolere bly-pin veikryss ved hjelp av bein sement.
- Etter sementen stivner, plasser beholderen på rosenkransenden av midtlinjen snitt gjennom huden og suturerden til subkutane vev via sin polyester skjørt. Fest hudkanten til beholderen ved suturer som passerer gjennom hullene i frontplaten.
MERK: En kjeve av hemostat har en ende spalte som fører til en motvask hull. Ledningen kan plasseres gjennom spalten inn i hullet og motsen plassert mot hodet på pinnen. Den andre kjeven er plassert på motsatt side av beholderen. Klemme hemostat presser pinnen inn i sin respektive beholder hull.
- Etter sementen stivner, plasser beholderen på rosenkransenden av midtlinjen snitt gjennom huden og suturerden til subkutane vev via sin polyester skjørt. Fest hudkanten til beholderen ved suturer som passerer gjennom hullene i frontplaten.
- Lag et snitt på venstre hals for å avsløre trapezius muskelen. Utfør disseksjon for å lage en submuskulær lomme for plassering av den implanterbare pulsgeneratoren. Tunnel hver DBS føre subkutant til nakkesnitt for innsetting i IPG.
- Lukk alle kirurgiske sår med suturer. Overvåk dyret nøye til full gjenoppretting fra operasjonen.
- Gi postoperative analgetika (f.eks. buprenorfin: 0,01–0,02 mg/kg) rutinemessig i opptil 48 timer. Administrer antibiotika (f.eks. cefpodoksim: 10 mg/kg) oralt til dyret i minst 3 dager. Hus dyret singly deretter for gjennom hele studien, og begrense trening for en periode på 10 dager for å tillate normal sårheling og stabilisering av implantert enhet.
MERK: Hudbeholderen skal rengjøres daglig med vevskompatibel antiseptisk løsning. I tillegg bør dummy mannlige pinner settes inn i de kvinnelige pinnene i hudbeholderen rutinemessig unntatt under EMG-opptaksøktene. Denne manøveren vil unngå akkumulering av rusk i beholderen, tillate effektive forbindelser som skal gjøres med den ytre kabelen, og forhindre infeksjon.
8. Nerve stimulering-EMG opptakøkter ved baseline
MERK: Utfør disse øktene 2x–3x etter implantatkirurgi (avsnitt 7) og før nervetransseksjonskirurgi (avsnitt 9) for å få EMG-signaler ved baseline når de bilaterale RLNene er intakte. Bruk følgende protokoll under en standard nervestimulering-EMG-opptaksøkt (avsnitt 8 og 10).
- Hold tilbake mat før prosedyren for 10–12 timer. Bedøve dyret med tiletamin- og zolazepam-kombinasjon (startstartdose 2–4 mg/kg ved intravenøs injeksjon, og opprettholde sto di med 0,4 mg/kg per time via en i.v.-linje). Plasser dyret på en varmepute i supine posisjon og opprettholde dyret i et moderat plan av anestesi. Overvåk dyrets vitale under prosedyren som beskrevet i trinn 7.2.
- Sett inn et nullgrads stivt endoskop med et vedlagt CCD-videokamera gjennom et laryngoskop for å visualisere vokalfoldbevegelse på nivået av glottten.
- Grensesnitt den eksterne kabelen som kobles til laboratoriet stimulator og EMG forsterkere til huden beholderen via pluggen og pinnene. Koble utgangene fra forforsterkerne til en datainnsamlingsenhet og/eller et oscilloskop for å vise, registrere og måle EMG-signaler.
- Lever stimuli (enkelt firkantede bølgepulser, 0,1–0,5 ms varighet, 0,5–2,0 mA amplitude) til henholdsvis venstre og høyre RLNer for å registrere fremkalt EMG-svar fra bilaterale TA-LCA-komplekser og PCA-muskler under hver tilstand.
- Lever stimuli (enkelt firkantede bølgepulser, 0,1–0,5 ms varighet, 0,5–2,0 mA amplitude) til henholdsvis venstre og høyre reflekser for å registrere fremkalt EMG-svar fra bilaterale TA-LCA-komplekser og PCA-muskler under hver tilstand.
- Lever CO2 blandet med romluft gjennom dyrets munn for å indusere hyperkapni og øke dyrets respiratoriske innsats. Begrense eksponering til 1 min, der maksimal inspiratorisk motorenhet rekruttering vil oppstå. Registrer spontane EMG-aktiviteter av TA-LCA-komplekser og PCA-muskler under denne hyperkapnisk tilstanden.
- Overvåk dyret til full gjenoppretting fra anestesi og returner dyret til anlegget.
9. Andre kirurgi for nerve transseksjon og anastomose
- Utfør den andre operasjonen 10–14 dager etter den første operasjonen. Hold tilbake mat i 10–12 timer før operasjonen.
- Bedøve dyret, drapere og monitor vitale intraoperativt ved hjelp av teknikken som er beskrevet i trinn 7.2.
- Fjern suturene og åpne midtsnittsnittet igjen ved stump disseksjon når det er mulig. Unngå skade på den forrige implantasjonen under disseksjonen. Utsett de bilaterale RLNene gjennom disseksjon. Isoler, transect og anastomose hver nerve med 7-0 monofilament, ikke-absorberbare suturer for å indusere bilateral laryneal lammelse.
- Vanne nakkesnittet med steril saltvann og gentamycinantibiotika. Lukk muskel og subkutan vev ved hjelp av 3-0 absorberbare suturer. Lukk huden med 3-0 ikke-absorberbare monofilament suturer.
- Nøye overvåke dyret til full gjenoppretting fra kirurgi.
- Gi smertestillende midler (f.eks. buprenorfin: 0,01–0,02 mg/kg) rutinemessig i opptil 48 timer postoperativt. Gi antibiotika (f.eks. cefpodoxime: 10 mg/kg) oralt til dyret i minst 3 dager. Begrens dyret fra trening i en periode på 10 dager for å tillate normal sårheling.
10. Nerve stimulering-EMG opptak økter etter bilaterale RLN skader
- Utfør disse øktene 1x per uke i løpet av de første 3 månedene, deretter annenhver uke deretter. Følg protokollen som er beskrevet i avsnitt 8 for disse øktene.
Representative Results
Eksempler på komponentene vises i figur 2. Fra venstre til høyre i figur 2A er nervestimulusmansjetten, TA-LCA-opptakselektroden, PCA-opptakselektrode og hudgrensesnittbeholder. Den relative størrelsen på disse komponentene kan verdsettes. Hudbeholderen (Figur 2B) har to rader med hull der de kvinnelige pinnene på enden av hver kveilet ledning (Figur 2D) settes inn. De settes inn på motsatt side av frontplaten (pilen) under implantasjonsoperasjonen. Beholderen har et polyesterskjørt (Figur 2C) festet til kontaktsideveggene. Dette skjørtet er designet for å forankre beholderen i posisjon ved bindevevinfiltrasjon. Hver Teflon-belagt emg-bly i rustfritt stål (figur 2E) er deisolert (5 mm) på spissen for å danne en krokformet elektrode for muskelopptak. Stimuleringsmansjetten har to elektroder gjenget mot den indre mansjettveggen. De er atskilt med en avstand på 2 mm (Figur 2F) og danner en "V" form (Figur 2G) for å sikre gjeldende levering over nerven.
Figur 2: Komponenter i implantatsystemet. (A) Fra venstre til høyre er nervestimulusmansjetten, TA-LCA-opptakselektroden, PCA-opptakselektrode og hudgrensesnittbeholder. (B) Hudbeholderen som viser to rader med hull. (C) Beholderen som viser et polyesterskjørt festet til kontaktsideveggene. (D) Spoletetråd som inneholder kvinnelige pinner som skal settes inn i B. (E) Teflon-belagt rustfritt stål EMG-bly er deinsulated (5 mm) på spissen for å danne en krokformet elektrode for muskelopptak. (F) Stimuleringsmansjetten har to elektroder gjenget mot den indre mansjettveggen, som er atskilt med 2 mm. (G) "V" formdannelse av elektroder for å sikre strømtilførsel over nerven. Dette tallet er endret med tillatelse27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 viser den implanterte hudbeholderen og hvordan kabelen fra eksternt utstyr er koblet til beholderne. Det bør bemerkes at dummy mannlige pinner (ikke vist) er satt inn i de kvinnelige pinnene på beholderen for å holde dem fri for rusk mellom opptaksøkter.
Figur 3: Hudbeholder og grensesnittkabel. (A) Den implanterte hudbeholderen på den fremre halsen uten dummy mannlige pinner er vist. (B) Bildet viser hvordan stimulanspinnene og EMG-opptakspluggen (pilen) på kabelen fra eksternt utstyr er koblet til beholderen under en nervestimulering-EMG-opptaksøkt. Dette tallet er endret med tillatelse27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 viser et EMG-opptak fra en av grunnlinjeøktene med RLNene intakt.
Figur 4: EMG-opptak fra laryngeale muskler med normal innervering. (A) Eksempel opptak fra PCA muskelen der RLN stimulering produserer en stimulans artefakt (pil) etterfulgt av en stor fremkalt EMG potensial. (B) Eksempelopptak av TA-LCA muskelkompleks, der SLN stimulering produserer en stimulans artefakt (pil). Representert her er (a) en kort ventetid monosynaptisk muskelrespons og (b) en lengre ventetid polysynaptisk RGC-respons. (C)Brister (piler) av spontan EMG-aktivitet registrert fra PCA-muskelen under normale inspirasjoner. (D)Økning av inspiratorisk EMG-aktivitet i løpet av CO2-levering. Dette tallet er endret med tillatelse27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I et opptak fra PCA muskelen (Figur 4A), RLN stimulering produserer en stimulans artefakt (pil) etterfulgt av en stor fremkalt EMG potensial. De maksimale RLN-fremkalte svarene gir en god indeks av den generelle størrelsen på normal innervering, samt nivået av reinnervation etter påfølgende neurorrhaphy, uavhengig av motorenhetstype. Dette gjelder fordi RLN inneholder nervefibre av både inspiratoriske og refleks glottiske nedleggelse (RGC) motorenheter. RLN stimulering rekrutterer begge typer enheter. Fremkalt EMG motorenhet aktivitet er utbedret og integrert over en 20 ms tidsperiode for å oppnå et kvantitativt mål på muskel innervering.
I et opptak fra TA-LCA muskelkompleks (Figur 4B), produserer SLN stimulering en stimulansartefakt (pil). Denne artefakten etterfølges av en kort ventetid monosynaptisk muskelrespons (a) og polysynaptisk RGC-respons (b) med kort ventetid. Potensialet (a) er en direkte respons fra cricothyroid muskelen, fordi denne muskelen er innervert av den nærliggende eksterne grenen av SLN. Stray aktivering av denne grenen oppstår vanligvis under nerve mansjett stimulering av den interne grenen for å aktivere RGC respons. Cricothyroid potensialet registreres av TA-LCA elektroden, da denne muskelen ligger i nærheten av komplekset. Tidligere studier har vist at cricothyroid potensialfremkalt av intern gren stimulering kan selektivt avskaffes ved snitting den ytre grenen av SLN (Zealear, upubliserte observasjoner). De maksimale SLN-fremkalte EMG-svarene gjenspeiler omfanget av naturlig innervering av TA-LCA-komplekset gjennom sin RGC sensoriske motorbane. Før RLN neurorrhaphy, Det er ingen RGC innervering av PCA muskelen, så ingen SLN potensial bør oppdages fra denne muskelen. Etter nervetransseksjon og reparasjon reflekterer SLN-fremkaltpotensiale mengden riktig RGC-reinnervation av TA-LCA-komplekset og feil RGC-reinnervation av PCA-muskelen. RGC-aktivitet kvantifiseres ved utbedring og integrering over en 20 ms tidsperiode for å fange opp hele RGC-bølgeformen.
I (Figur 4C),bursts (piler) av spontan EMG aktivitet registreres fra PCA muskelen under normale inspirasjoner. Denne inspiratoriske EMG-aktiviteten øker2 i løpet av CO 2-levering, som vist i (Figur 4D) med en langsommere feiehastighet. Spontan PCA EMG aktivitet gir et godt estimat av omfanget av normal inervation av denne muskelen ved sin opprinnelige inspiratorisk motoneurons. Det er ingen inspiratorisk innervering av TA-LCA-komplekset, så ingen inspiratoriske potensialer bør oppdages fra disse musklene. Dette er fordi bare inspiratoriske motorenheter er involvert i å bortføre vokalfolden ved maksimal inspiratorisk innsats i det bedøvede dyret. Etter nervetransseksjon og reparasjon reflekterer spontane inspiratoriske potensialer omfanget av riktig reinnervation av PCA-muskelen og omfanget av feil reinnervation av TA-LCA-komplekset. Opptak av inspiratorisk EMG-aktivitet forsterkes, rettes og integreres over en 8-s tidsperiode.
Discussion
Dette papiret beskriver trinnene som kreves i produksjonen av et nytt, økonomisk og implanterbart system for stimulering av strupenerver og registrering av EMG-svar fra strupemuskulatur på lang sikt. Protokollen er ukomplisert og kan produsere et implantat som er kompakt nok til å bli utnyttet i et dyr så lite som en rotte. Det er flere kritiske skritt som bør vektlegges. For det første bør blyledninger kveiles forsiktig og jevnt for å forhindre blyde-isolasjon, kinking eller brudd. Hvis en kveilemaskin ikke er tilgjengelig, kan prefabrikkerte kveilet ledninger fås kommersielt. For det andre er strategien om å sette inn blyledninger i et silikonrør for å danne en "V" som strekker seg over nerven, avgjørende for å fremme dagens levering gjennom nerven inne i mansjetten. Hvis begge ledningene er plassert på samme side av røret, kan det oppstå shunting av strøm mellom elektroder. Det er også viktig at ledningene er plassert mot rørindreveggen for å unngå muligheten for skiveskade på nerven.
Tredje, under implantasjonsoperasjonen, bør strupenervene dissekeres nøye for å forhindre skade. På det senere implantasjonsstadiet, når du setter pinner inn i beholderen, bør kraften påføres pinnen i justering til hullet for å forhindre plutselig bøyning av pinens hode. Deretter bør beinsement distribueres grundig på beholderbunnen for fullstendig isolasjon og forebygging av krysstilkog mellom kanaler. Til slutt er forebygging av infeksjon avgjørende for å sikre integriteten til implantatsystemet over tid. Det kan oppnås ved en kombinasjon av flere manøvrer: tillegg av et skjørt til beholderen, administrasjon av antibiotika, daglig rengjøring av såret og beholderen med vevskompatibel antiseptisk løsning, og plassering av dummy mannlige pinner i de kvinnelige pinnene på beholderen for å holde dem rene av rusk mellom øktene.
Protokollen har vist seg vellykket i denne hundestrupemodellen. Noen endringer eller alternative strategier kan imidlertid vurderes for andre applikasjoner. Deisolerte sensingsspissene til PCA- og TA-LCA EMG-elektrodene er for eksempel forankret i musklene med et eksternt middel – enten polyestertransplantatet eller DBS-elektroden. I et program der ekstern forankring ikke er nødvendig eller utført, kan elektrodens barb alene tjene som anker. I et slikt tilfelle kan Teflon-belagt, rustfritt stål, monofilamenttråd være å foretrekke fremfor multifilamenttråd i lys av sin større strekkfasthet, noe som gir en barb som er mer stabil i vev. Det bør imidlertid bemerkes at multifilamentledninger kan være mindre utsatt for brudd. En alternativ strategi for fabrikasjon og montering av hudbeholderen er å 3D-print ved hjelp av biokompatible polymerer (f.eks. MED610 av Stratasys). Dette kan forenkle produksjonsprosessen.
Etter implantasjonskirurgi og gjenoppretting av dyret utføres fysiologiske økter med RLNene fortsatt intakt for å oppnå baselinedata. I løpet av en økt kan fravær av EMG-signaler fra en laryngeal muskel oppstå etter RLN-stimulering. For å feilsøke årsaken (Tabell 1),bør det først avgjøres om vokalfoldbevegelse er til stede. Hvis det er til stede, betyr dette at nerven effektivt aktiveres av mansjetten, men det er et problem med EMG-ledningen. I denne situasjonen bør brukerne videre se på EMG stimulus artefakten. Hvis EMG-artefakten er fraværende, er det sannsynligvis en diskontinuitet i EMG-inngangen til forforsterkeren. Seksti-syklus støy vil også være til stede og stor i amplitude. Hvis artefakten er stor, kan shunting fra en stimulanspin til opptakspinnen være ansvarlig for å mette kanalforforsterkeren og utslette EMG-responsen. Hvis artefakten er normal, har EMG-ledningen sannsynligvis forstuet seg fra muskelen og kan ikke oppdage aktiviteten. På den annen side, hvis vokalfoldbevegelsen er fraværende, blir ikke nerven aktivert. Hvis artefakten er fraværende, kan det være en diskontinuitet i stimuleringskretsen, og forhindrer nerveaktivering. Hvis artefakten ser normal ut, kan nerven ha blitt skadet under implantatkirurgi eller mansjetten kan ha migrert av nerven. En lignende strategi kan brukes for å feilsøke årsaken til fraværende EMG-signaler under SLN-stimulering.
| Stimulert nerve | Målmuskler(er) | Ipsilateral vokal fold bevegelse | Stimulus artefakt | Årsaker |
| RLN (andre er i seg selv | PCA og/eller TA-LCA | ja | Fraværende (60-syklus støy til stede) | Seponering i EMG-inngangen til forforsterkeren (f.eks. bly, pin, kabel); |
| Store | Krysssnakk mellom stim og opptakspinner på beholderen | |||
| Normal | Forvridning av EMG-elektrode | |||
| nei | Fraværende | Seponering i stimuleringskrets | ||
| Normal | 1. RLN skade; 2. Forvridning av mansjetter | |||
| SLN (andre er i seg selv | Ta-LCA (andre er i seg selv) | ja | Fraværende (60-syklus støy til stede) | Seponering i EMG-inngangen til forforsterkeren (f.eks. bly, pin, kabel); |
| Store | Krysssnakk mellom stim og opptakspinner på beholderen | |||
| Normal | Forvridning av EMG-elektrode | |||
| nei | Fraværende | Seponering i stimuleringskrets | ||
| Normal | 1. SLN- eller RLN-skade; 2. Forvridning av mansjetter |
Tabell 1: Feilsøkingsveiledning.
Det bør nevnes at det er to mindre begrensninger i dagens anvendelse av denne teknologien. Først har plutselig bøyning av den kvinnelige pinnen under innsetting i beholderen forekommet i flere tilfeller. Heldigvis kan pinnene rettes og settes inn i hullene med hell. Hvis pinskade er uopprettelig, må ledningen og hele komponenten skiftes ut. Derfor bør reservekomponenter være lett tilgjengelige før operasjonen. For det andre er tiden det tar å fullføre kirurgisk implantasjon lang (~ 10 h). Den lange varigheten gjenspeiler delvis det store antallet stimulerings- og omkodingskomponenter som kreves for denne studien: fire nerver, fire muskler, en beholder og en IPG. Hvis det kreves færre komponenter ved bruk av denne teknologien, bør implantasjonstiden reduseres betydelig (f.eks. rottetungemodellen28).
Denne teknologiske tilnærmingen introduserer flere funksjoner som har fordel over eksisterende metoder. Kveiking av blyledninger er den mest nye og viktige funksjonen i dette systemet. Kveilet fører er ikke allment tilgjengelig for ikke-kommersielle dyr eksperimentering til tross for de mange fordelene de gir. En kveilet bly kan utvides til ønsket lengde under implantasjon. Videre vil det strekke seg i det våkne, bevegelige dyret for å forhindre forvridning av elektrodespissen eller ledningsbrudd etter implantasjon. Denne funksjonen sikrer levetiden til implantatet og stabil nervestimulering og muskelopptak på lang sikt. Videre forhindrer det å legge til et vevkompatibel skjørt rundt beholderen eksponering av såret til denne fremmedlegemen og fremmer normal fibrose og sårheling i fravær av infeksjon. Tidligere studier uten dette skjørtet resulterte i tidlig infeksjon og for tidlig avslutning av eksperimentet. Til slutt er dette implantatsystemet kompakt og flerkanals, slik at effektive datainnhenting fra mange nevromuskulære strukturer i dyremodeller av forskjellig størrelse.
Denne tekniske tilnærmingen er tilpasset og vellykket oversatt til en rottemodell. Denne studien ble designet for å undersøke effekten av elektrisk kondisjonering i å forebygge tunge muskelatrofi og dysfunksjon i den aldrende rotte. Hypoglossal nervene ble implantert med mansjettelektrodene for kondisjonering og tungen implantert med EMG-opptakselektrodene28. Denne teknologien kan også benyttes i andre forskningsapplikasjoner. Som en forlengelse av den nåværende protokollen i hundestrupestrupe, blir effekten av elektrisk kondisjonering på å fremme selektiv reinnervation for tiden studert i kaninansiktsmuskler. Denne studien kan gi et grunnlag for forebygging av ansiktssynkinese hos pasienter med Bells parese, en vanlig og ødeleggende medisinsk tilstand. En endelig potensiell bruk av denne teknologien er å stimulere og registrere fra våkne, fritt bevegelige dyr. I dag er slike data innhentet via ekstern kabel fra våken, uhemmet rotter28. I fremtiden kan dette økonomiske systemet også kombineres med ekstern opptaksstimuleringsteknologi (f.eks. telemetri) for å aktivere eller undersøke nevromuskulære systemer trådløst.
Disclosures
Dr. David Zealear markedsfører denne implanterbare, nervestimulering-EMG-teknologien for en rekke nevromuskulære systemer og dyremodeller.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Hongmei Wu for hennes bidrag til dyrepleie og datainnsamling gjennom hele studien. Vi takker Amy Nunnally, Jamie Adcock og Phil Williams for deres hjelp med sterile operasjoner. Kompetansen og engasjementet til de ansatte ved Vanderbilt University Animal Care Facility var uvurderlig. Denne forskningen ble støttet av NIH-stipendet U01DC016033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305175 | |
| 23 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305145 | |
| 25 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305125 | |
| 3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL | Ethicon | J219H | |
| 3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8684G | |
| 4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8871H | |
| 6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene | Ethicon | 8805 | |
| 7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | M8735 | |
| Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98% | ACROS | code 194790100 | for dilution of modical adhesive silicone |
| Bone cement | Zimmer | 1102-16 | 20g powder 10 mL liquid |
| Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1 mLl) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd | 12496-0757-1 | |
| CCD video camera attached to the endoscope | Sony | MCC500MD | |
| Cefpodoxime (Simplicef 100 mg tablets) | Zoetis | 5228 | |
| Data acquisition device , PowerLab 16/35 | ADInstruments, Inc | 5761-E | |
| Deep-brain stimulation (DBS) electrodes | Abbott | 6172ANS | |
| Digital oscilloscope | Tektronix | DPO71304SX | |
| Implantable pulse generator (IPG), Infinity | Abbott | 6660ANS | |
| Knitted polyester graft | Meadox Medical Inc | 92220 | 20 mm in diameter |
| Medical Grade Polyethylene Micro Tubing | Amazon.com | BB31695-PE/13-10 | OD 0.156", ID 0.094" |
| Metal female pin | Allied Electronics & Automation | 220-S02-100 | |
| Metal male pin | CDM electronics | 220-p02-1 | |
| Prefabricated coiled leads | Medical innovations Inc. | ||
| Silastic Laboratory Tubing | Cole-Parmer | 2415569 | OD 0.125", ID 0.062" |
| Silastic Medical Adhesive Silicone | Dow corning | Type A, 2 oz | |
| Stainless steel monofilament wire | The Harris Products Group | type 316 | 0.008" (coated), 0.005" (bare) |
| Sterile Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Sklar Instruments | 96-1146 | |
| Strip connector | CDM electronics | 2.6 x 11.6 x 101.5 mm | single row, round, through hole |
| Teflon-coated multi-filament stainless steel wire | Medwire | Part 316, ss7/44T | |
| Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol - 5 mL | Zoetis | 004866 | |
| Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan - 1 Gallon | Zoetis | 540561 | |
| Zero-degree rigid endoscope | Karl Storz | 8712AA |
References
- Wikipedia contributors. Electromyography. Wikipedia, The Free Encyclopedia. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Electromyography (2019).
- Zealear, D. L., et al. Stimulation of denervated muscle promotes selective reinnervation, prevents synkinesis, and restores function. The Laryngoscope. 124 (5), 180-187 (2014).
- Gaweł, M. Electrodiagnostics: MUNE and MUNIX as methods of estimating the number of motor units - biomarkers in lower motor neurone disease. Neurologia i neurochirurgia polska. 53 (4), 251-257 (2019).
- Foerster, G., Mueller, A. H. Laryngeal EMG: Preferential damage of the posterior cricoarytenoid muscle branches especially in iatrogenic recurrent laryngeal nerve lesions. Laryngoscope. 128 (5), 1152-1156 (2018).
- Lin, R. J., Smith, L. J., Munin, M. C., Sridharan, S., Rosen, C. A. Innervation status in chronic vocal fold paralysis and implications for laryngeal reinnervation. Laryngoscope. 128 (7), 1628-1633 (2018).
- Koh, T. J., Leonard, T. R. An implantable electrical interface for in vivo studies of the neuromuscular system. Journal of Neuroscience Methods. 70 (1), 27-32 (1996).
- Grimonprez, A., et al. A Preclinical Study of Laryngeal Motor-Evoked Potentials as a Marker Vagus Nerve Activation. International Journal of Neural Systems. 25 (8), 1550034 (2015).
- Haidar, Y. M., et al. Selective recurrent laryngeal nerve stimulation using a penetrating electrode array in the feline model. The Laryngoscope. 128 (7), 1606-1614 (2018).
- Kneisz, L., Unger, E., Lanmüller, H., Mayr, W. In Vitro Testing of an Implantable Wireless Telemetry System for Long-Term Electromyography Recordings in Large Animals. Artificial Organs. 39 (10), 897-902 (2015).
- Inzelberg, L., Rand, D., Steinberg, S., David-Pur, M., Hanein, Y. A Wearable High-Resolution Facial Electromyography for Long Term Recordings in Freely Behaving Humans. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Horn, K. M., Pong, M., Batni, S. R., Levy, S. M., Gibson, A. R. Functional specialization within the cat red nucleus. Journal of Neurophysiology. 87 (1), 469-477 (2002).
- Larson, C. R., Kistler, M. K. The relationship of periaqueductal gray neurons to vocalization and laryngeal EMG in the behaving monkey. Experimental Brain Research. 63 (3), 596-606 (1986).
- Zealear, D., Larson, C. A Microelectrode Study of Laryngeal Motoneurons in the Nucleus Ambiguus of the Awake Vocalizing Monkey. Vocal Fold Physiology Volume. 2, 229-238 (1988).
- Zealear, D. L., Billante, C. R. Neurophysiology of vocal fold paralysis. Otolaryngologic Clinics of North America. 37 (1), 1-23 (2004).
- Zealear, D. L., et al. Electrical Stimulation of a Denervated Muscle Promotes Selective Reinnervation by Native Over Foreign Motoneurons. Journal of Neurophysiology. 87 (4), 2195-2199 (2002).
- Insalaco, G., Kuna, S. T., Cibella, F., Villeponteaux, R. D. Thyroarytenoid muscle activity during hypoxia, hypercapnia, and voluntary hyperventilation in humans. Journal of Applied Physiology. 69 (1), 268-273 (1990).
- Ludlow, C. L., Van Pelt, F., Koda, J. Characteristics of Late Responses to Superior Laryngeal Nerve Stimulation in Humans. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (2), 127-134 (1992).
- Li, Y., et al. Comparison of Ventilation and Voice Outcomes between Unilateral Laryngeal Pacing and Unilateral Cordotomy for the Treatment of Bilateral Vocal Fold Paralysis. ORL. 75 (2), 68-73 (2013).
- Mueller, A. H. Laryngeal pacing for bilateral vocal fold immobility. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (6), 439-443 (2011).
- Crumley, R. L. Laryngeal Synkinesis Revisited. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 109 (4), 365-371 (2000).
- Hydman, J., Mattsson, P. Collateral reinnervation by the superior laryngeal nerve after recurrent laryngeal nerve injury. Muscle & Nerve. 38 (4), 1280-1289 (2008).
- Marie, J. P., Navarre, I., Lerosey, Y., Magnier, P., Dehesdin, D., Andrieu Guitrancourt, J. Bilateral laryngeal movement disorder and synkinesia: value of botulism toxin. Apropos of a case. Rev Laryngol Otol Rhinol (Bord). 119 (4), 261-264 (1998).
- Zealear, D. L., Billante, C. R., Sant’anna, G. D., Courey, M. S., Netterville, J. L. Electrically stimulated glottal opening combined with adductor muscle botox blockade restores both ventilation and voice in a patient with bilateral laryngeal paralysis. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (6), 500-506 (2002).
- Zealear, D. L., et al. Reanimation of the paralyzed human larynx with an implantable electrical stimulation device. Laryngoscope. 113 (7), 1149-1156 (2003).
- Mueller, A. H., et al. Laryngeal pacing via an implantable stimulator for the rehabilitation of subjects suffering from bilateral vocal fold paralysis: A prospective first-in-human study. Laryngoscope. 126 (8), 1810-1816 (2016).
- Li, Y., Garrett, G., Zealear, D. Current Treatment Options for Bilateral Vocal Fold Paralysis: A State-of-the-Art Review. Clinical and Experimental Otorhinolaryngology. 10 (3), 203-212 (2017).
- Li, Y., Huang, S., Zealear, D. An implantable system for In Vivo chronic electromyographic study in the larynx. Muscle & Nerve. 55 (5), 706-714 (2017).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle & Nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
