Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um sistema implantável para registro cronológico in vivo de potenciais eletromiográficos evocados e espontâneos. O sistema é aplicado à investigação da reinervação dos músculos laríngeos após lesão nervosa.
Abstract
A eletromiografia (EMG) mede a resposta muscular à estimulação elétrica ou atividade espontânea das unidades motoras e desempenha um papel importante na avaliação da função neuromuscular. O registro crônico da atividade emg refletindo o estado de reinervação do músculo após lesão nervosa foi limitado, devido à natureza invasiva das técnicas tradicionais de gravação de EMG. Nesse sentido, um sistema implantável é projetado para gravação de EMG in vivo a longo prazo e estimulação nervosa. Foi aplicado e testado em um estudo sobre reinervação de músculos laríngeos. Este sistema consiste em 1) duas algemas nervosas de eletrodos bipolares e leva para estimular cada um dos dois nervos: o nervo laríngeo recorrente (RLN) e o ramo interno do nervo laríngeo superior (SLN); 2) dois eletrodos de gravação emg e condutores para cada um dos dois músculos laríngeos: músculo cricoarytenoide posterior (PCA) e complexo muscular de cricotenoide-lateral-tricoienoide (TA-LCA); e 3) um recipiente de pele que interentro todos os terminais de chumbo implantados a um pré-amplificador e estimulador de gravação externa usando um cabo de conexão. Os cabos são revestidos de Teflon, multifilamento, tipo 316 de aço inoxidável. Eles são enrolados e podem esticar durante o movimento corporal do animal acordado para evitar a quebra do chumbo e a migração de eletrodos. Este sistema é implantado durante uma cirurgia asséptica. Posteriormente, as gravações de EMG de linha de base são realizadas antes que o RLN seja transecido na segunda cirurgia para estudar a reinervação muscular. Ao longo do estudo, várias sessões fisiológicas são realizadas no animal anestesiado para obter atividade EMG evocada e espontânea que reflete o estado de reinervação dos músculos laríngeos. O sistema é compacto, livre de infecções ao longo do estudo, e altamente durável. Este sistema implantável pode fornecer uma plataforma confiável para pesquisas nas quais o registro de longo prazo ou a estimulação nervosa são necessários em um animal anestesiado ou livremente em movimento.
Introduction
O registro emg é uma técnica útil para medir a atividade elétrica produzida por um músculo esquelético quando ativado por estimulação elétrica de seu nervo ou disparo espontâneo de suas unidades motoras. O monitoramento de sinais EMG pode ser utilizado para avaliação da transmissão neuromuscular e da biomecânica muscular1. A gravação emg também desempenha um papel importante na caracterização da qualidade e magnitude da reinervação muscular após lesão nervosa2,3,4,5. No entanto, várias gravações emg durante todo o período de reinervação não podem ser alcançadas por uma abordagem invasiva. Portanto, os dispositivos implantáveis foram projetados e desenvolvidos para estimulação e gravação repetidas e crônicas em sistemas neuromusculares66,77,8,,9,,10,,11,,12,,13. O objetivo deste artigo é descrever um protocolo para a fabricação e implantação de um sistema estável para a obtenção de dados EMG cronológicos confiáveis da laringe.
Este sistema é aplicado aqui ao estudo da reinervação muscular laríngea. Uma breve visão geral da laringe é fornecida para orientação (Figura 1). Uma coordenação precisa entre componentes sensoriais e motores é essencial para o movimento muscular adequado durante a respiração, a voz e a proteção das vias aéreas. O músculo PCA, localizado na laringe posterior, é o único sequestrador da dobra vocal. Este músculo é ativado espontaneamente durante a inspiração para aumentar a área glotal para inalação. O complexo TA-LCA é o principal adutor da dobra vocal. Ativação deste complexo muscular juntamente com outro adutor (ou seja, o músculo interarytenoide) medializam a dobra para vibração e produção de som e fecham a dobra para proteção das vias aéreas durante a deglutição.
Além disso, as fibras dos neurônios motores inervam os músculos abdutores e adutores no RLN. Os músculos abdutor e adutor podem ser distinguidos com base na composição da unidademotora 14,15. O músculo PCA apresenta aumento do disparo durante as condições hipercapnicas e/ou hipóxica16 devido à presença de unidades motoras inspiratórias. Em contrapartida, as unidades motoras de fechamento glotático reflexo (RGC), que fecham a glote reflexivamente através da ativação de receptores sensoriais dentro da mucosa laríngea, estão presentes no complexo muscular TA-LCA. O ramo interno do nervo laríngeo superior (SLN) carrega as fibras aferentes dos receptores sensoriais na laringe17. Embora a voz seja principalmente uma função adutora, tanto as unidades de motor abdutor quanto adutora estão envolvidas neste comportamento laríngeo altamente evoluído.
Figura 1: Anatomia da laringe. Os componentes deste sistema implantável também são exibidos. SLN = nervo laríngeo superior; RLN = nervo laríngeo recorrente; PCA = músculo cricoarytenoide posterior; TA-LCA = complexo muscular de trítesioide-lateral cricoarytenoide; DBS = estimulação cerebral profunda. Este número foi reproduzido com permissão de Wiley27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A lesão no RLN pode resultar em paralisia da dobra vocal (VFP), o que compromete tanto as funções de abdução quanto a adutora devido à denervação do músculo laríngeo14,,18,19. Posteriormente, ocorre a regeneração das fibras nervosas rln e a reinervação dos músculos. No entanto, a reinervação é um processo aleatório e resulta em reconexão muscular inadequada e mal direcionada na maioria dos casos. Isto é referido como sincinese, na qual a ativação espontânea de antagonistas abdutores e adutores é defeituosa e produz movimento ineficaz ou mesmo paradoxal das dobras vocais14,,19,20,21. Com a sincinese, a função crítica que se perde é o sequestro da dobra vocal, resultando em ventilação inadequada. Embora existam tentativas contínuas de tratar a sinese laríngea por qualquer um dos 1) bloqueio do fechamento glotésico com Botox22,23 ou 2) estimulando eletricamente a abertura glotética com um marca-passo implantável24,25, não há intervenção clínica que previne de forma confiável a sincinese26. No entanto, há evidências de que o condicionamento elétrico do músculo PCA durante a reinervação em baixa frequência promove a reconexão neuromuscular adequada e minimiza a sincinese de acontecer. Estudos estão sendo conduzidos para elucidar os mecanismos subjacentes2.
O foco deste artigo é descrever um sistema implantável simples e barato para estimulação nervosa crônica e gravação de EMG. Este sistema pode ser usado para investigar os efeitos do condicionamento elétrico de baixa frequência do músculo PCA sobre a especificidade de sua reinervação subseqüente. Os sinais EMG obtidos por este sistema podem refletir a qualidade e a quantidade de reinervação muscular laríngea ao longo do tempo.
Protocol
Este estudo foi aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade Vanderbilt e foi conduzido de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Este sistema inclui cinco componentes implantáveis e um cabo externo.
1. Dois punhos bipolares de eletrodos de estímulo RLN, cada um com par de fios de chumbo enrolados e pinos de terminal
- Use o fio de aço inoxidável tipo 316 revestido de teflon (com diâmetro isolado de 0,0078" ou 0,198 mm) para cada fio de chumbo da braçadeira. Corte um fio de 70 cm de comprimento e enrole-o em uma mola de 12 cm de comprimento usando um dispositivo de enrolamento ou obtenha cabos enrolados pré-fabricados. Se necessário, estique a mola para aumentar seu comprimento para cada local de implante. Deixe as extremidades dos cabos enrolados em linha reta em 3 mm e 10 mm de comprimento e desisole-as.
- Soldar um pino feminino de cobre banhado a ouro na extremidade de 3 mm do chumbo enrolado.
- Para preparar o manguito nervoso, corte um segmento de 5 mm de tubo de silicone (OD = 0,156", ID = 0,094"; ou OD = 3,96 mm, ID = 2,39 mm) de um rolo da tubulação.
- Para inserir um fio no tubo, use uma agulha hipodérmica de 25 G para perfurar a parede do tubo a 1,5 mm da extremidade e fora do centro perto da parede interna. Encha a extremidade de 10 mm do chumbo na ponta da agulha. Retire a agulha para depositar a porção isolada no tubo. Dobre a extremidade do fio nu fora do tubo e gire sobre o fio no ponto de entrada do tubo.
NOTA: Use um microscópio operacional para executar essas etapas. Uma sonda pode ser colocada no tubo para curvar o fio contra a parede interna. O objetivo é posicionar a porção nua do fio para que os estímulos possam ser entregues ao nervo sem correr o risco de danos mecânicos no nervo. - Insira o segundo chumbo 1,5 mm da extremidade oposta do tubo usando o mesmo procedimento. Alinhe o ponto de entrada ao da primeira pista. Fure a parede com a agulha para que a parte nua do fio seja depositada perto da parede interna em frente ao primeiro fio.
NOTA: Olhando para baixo do tubo, os dois eletrodos de estímulo devem formar uma forma de 45° "V", que irá amparar o nervo uma vez no lugar e garantir a entrega da corrente através do nervo do ânodo ao cátodo. - Faça uma fenda em forma de S na parede do tubo em frente aos pontos de entrada do eletrodo usando um par de tesouras curvas.
NOTA: Os lábios em espiral da braçadeira podem então ser abertos para situar o nervo dentro entre os eletrodos durante a cirurgia. - Insira um comprimento de monofilamento 6-0, sutura não absorvível na parede da braçadeira em cada extremidade usando uma agulha microcirúrgica curva para eventual fixação da braçadeira ao redor do nervo.
- Aplique gel de silicone tipo A de grau médico para resisolar todos os fios nus expostos fora da braçadeira.
2. Dois punhos bipolares de eletrodos de estímulo SLN, cada um com par de fios de chumbo enrolados e pinos de terminal
- Monte a braçadeira de estímulo SLN da mesma forma que a braçadeira de estímulo RLN. No entanto, utilize o tubo de diâmetro menor (OD = 0,125", ID = 0,062"; ou OD = 3,18 mm, ID = 1,57 mm), pois o nervo é menor em diâmetro.
3. Dois eletrodos de gravação de emgamento muscular PCA, cada um com fio de chumbo enrolado e pino terminal
- Monte um chumbo enrolado para o eletrodo muscular PCA, como feito na etapa 1.1.
- Soldar um pino feminino na liderança como feito na etapa 1.2.
- Insira a extremidade de 10 mm do chumbo muscular PCA na ponta de um eletrodo de estimulação cerebral profunda (DBS) usando a mesma estratégia para inserção de chumbo de agulha em uma braçadeira (etapa 1.4). Dobre a extremidade do fio para formar um gancho e corte-o para fornecer um comprimento total de gravação de 5 mm.
NOTA: Nesta aplicação, o músculo PCA e seus terminais nervosos reinervadores estão expostos ao condicionamento elétrico. Os estímulos são gerados por um gerador de pulso implantável (IPG) e entregues ao músculo laríngeo através de um eletrodo DBS(Figura 1, inset). Este sistema é adaptado a partir da estimulação cerebral terapêutica (por exemplo, doença de Parkinson). O eletrodo DBS será inserido em um bolso submuscular e ancorado no lugar. Se a tecnologia para condicionamento elétrico do músculo não for necessária, o eletrodo PCA EMG pode ser diretamente inserido no músculo e ancorado pelo gancho.
4. Dois eletrodos de gravação emg de complexo muscular TA-LCA, cada um com fio de chumbo enrolado e pino terminal
- Monte um chumbo enrolado para o eletrodo muscular TA-LCA, como feito na etapa 1.1.
- Soldar um pino feminino na liderança como feito na etapa 1.2.
- Excisão de 5 mm x 10 mm peça retangular de enxerto de poliéster de malha. Faça um buraco no centro da malha com uma agulha hipodérmica de 20 G. Introduza a extremidade de 10 mm do chumbo no orifício com uma bobina adicional de 3 mm saliente além do orifício. Fixar o chumbo à malha usando 6-0 monofilamento, sutura não absorvível.
NOTA: Este pedaço de malha será usado para ancorar o eletrodo que leva à cartilagem tireóide sobreposto ao complexo muscular. - Dobre a extremidade do fio para formar um gancho e corte-o para fornecer um comprimento total de gravação de 5 mm.
5. Recipiente de pele para conexões interfacetadas entre eletrodos e equipamentos externos
- Utilize um conector de listras de pino fêmea de uma única linha para fazer o recipiente. Corte duas peças (cada uma com 17,5 mm de comprimento) da tira, cada uma contendo oito pinos. Primeiro, endureça as superfícies externas de cada peça com lixa, em seguida, cole-as juntamente com fenol em uma capa de fumaça para fazer um conector de linha dupla. Coloque o conector em água de 60-80 °C em uma coifa de fumaça por 30 min para permitir o endurecimento da cola.
NOTA: Este formato de montagem de duas linhas fornecerá conveniência na atribuição de pinholes para eletrodos do lado esquerdo versus direito. - Corte uma peça de 25,6 mm de comprimento da tira para fazer a placa facial do conector (a porção que se projetará fora do local do implante para ancoragem da pele). Corte um orifício retangular de 5,4 mm x 17,4 mm no meio da placa facial com um bisturi.
- Coloque o conector de duas linhas dentro do orifício retangular da placa facial até que esteja corado com a superfície da placa facial sem saliência. Se o conector não se encaixar no orifício retangular da placa facial, o orifício pode ser ligeiramente ampliado com um arquivo. Como os orifícios do conector não são simétricos, insira a borda do conector com os orifícios de diâmetro maior na placa facial.
NOTA: Como resultado, um pino feminino inserido na borda oposta do conector com o orifício de diâmetro menor se encaixará e travará no lugar. - Use fenol para colar o conector e a placa facial juntos. Coloque a montagem em água de 60-80 °C em uma coifa de fumaça por 30 min para permitir o endurecimento da cola.
- Faça um furo de 1,3 mm em cada canto da placa facial e em cada lado da placa facial a meio caminho das extremidades para um total de seis furos.
NOTA: Esses orifícios serão usados para suturar o recipiente final da pele no local do implante. - Corte um tubo de 15 mm de comprimento de enxerto de poliéster de malha para cercar o conjunto abaixo da placa facial, tornando o conjunto biocompatível. Para fixar o tubo ao conjunto, use uma agulha hipodérmica para enfiar fios de aço inoxidável através da parede em três posições igualmente espaçadas (cada uma com 3,8 mm de distância) ao longo de seu comprimento.
- Coloque entalhes igualmente espaçados em cada canto do conector para ancorar os fios contra a superfície do conjunto. Torça as extremidades de cada fio com um alicate para apertar o tubo até o conjunto para formar uma saia.
- Faça uma marca permanente no patch de poliéster em uma extremidade do recipiente.
NOTA: Use esta marca para orientação para identificar a extremidade rostral do recipiente durante a cirurgia de implante. Na direção rostral para caudal, a seguinte atribuição de eletrodo de pino para cada uma das duas linhas (lado esquerdo e direito) deve ser a seguinte: PCA EMG, TA-LCA EMG, orifício vazio, orifício vazio, ânodo RLN, cátodo RLN, ânodo SLN e cátodo SLN.
6. Cabo de conexão externa para gravação pré-amplificador e estimulador
NOTA: Um cabo é usado para fazer conexões entre o recipiente de pele implantado e equipamentos externos durante as sessões de gravação de estimulação nervosa-EMG (seções 8 e 10). É composto por 12 fios isolados terminando com pinos masculinos para inserir em pinos femininos no recipiente da pele. Este cabo consiste em duas partes: um plugue de gravação EMG e fios de estimulação nervosa. Um plugue de gravação é necessário para isolar sinais EMG de baixa tensão de artefatos de estímulo de alta tensão que irradiam de pinos de estímulo. Pela mesma razão, dois orifícios em cada fileira do recipiente de pele são deixados desocupados para separar pinos de gravação dos pinos de estimulação.
- Para fazer o plugue de gravação EMG, use um conector de tira masculino (mesmo comprimento e largura, mas metade da altura de um conector feminino). Corte-o em dois pedaços, cada um contendo apenas dois buracos. Afixar as duas peças usando adesivo de fenol usando a mesma abordagem para fazer o conector de linha dupla no recipiente da pele (passo 5.1). Pegue os quatro fios de gravação EMG no cabo e insira seus pinos masculinos terminais em cada um dos quatro orifícios até que eles se tranquem no lugar com as pontas salientes além da borda da tira.
- Use cimento ósseo para selar a parte superior do plugue para isolar as junções de pino de arame.
- Use os oito fios restantes no cabo terminando em pinos masculinos para fazer conexões individuais com as algemas de estimulação nervosa através de seus pinos femininos.
7. Primeira cirurgia de implante
- Obtenha um canino de 1 a 2 5 anos de idade, 20-25 kg de ambos os sexos de uma fazenda licenciada. Aclimatar o animal antes da cirurgia de implante asséptico. Autoclave todos os equipamentos antes da cirurgia. Retenha comida por 10-12 h antes da cirurgia.
- Prepare o animal para a cirurgia.
- Raspe a cabeça e o pescoço do animal e limpe a pele com álcool e solução de esfoliante betadine. Anestesiar o animal por injeção intravenosa de 2-4 mg/kg de tiletamina e zolazepam, seguido de 3% de isoflurano em oxigênio através de intubação.
- Coloque o animal sobre uma mesa de operação com uma almofada de aquecimento na posição supina e enrapeo cirurgicamente o animal. Monitore a freqüência cardíaca do animal, a freqüência respiratória, a temperatura corporal e a saturação de oxigênio pelo menos a cada 15 min durante toda a cirurgia para garantir estabilidade fisiológica em um plano moderado de anestesia.
- Faça uma incisão no pescoço da tireóide até o manúbrio. Dissecar a traqueia livre do esôfago e expor a borda inferior da cartilagem cricoide.
- Posicione a braçadeira de estímulo em cada uma das LNs bilaterais e RLNs. Feche os lábios de cada braçadeira usando as suturas fechadas.
- Faça uma janela de cartilagem com um soco de biópsia (4 mm de diâmetro) na superfície anterior da cartilagem da tireóide em cada lado. Exponha os aspectos laterais de ambos os complexos musculares TA-LCA. Insira os eletrodos de gravação EMG nos complexos musculares TA-LCA usando uma agulha de 23 G inserindo a farpa na ponta da agulha. Suture o remendo de poliéster eletrodo na cartilagem.
- Coloque o eletrodo DBS juntamente com seu eletrodo de gravação EMG de fio de gancho companheiro sob o músculo PCA de cada lado. Use um endoscópio para confirmar que a estimulação produz abdução da dobra vocal para cada canal. Ancore os eletrodos DBS na cartilagem cricoid por suturas não absorvíveis de 4-0.
- Insira todos os fios dos eletrodos de gravação de estimulação nervosa-EMG no recipiente através de seus pinos femininos. Pressione os pinos em furos com uma ferramenta de inserção feita a partir de um hemostat. Sele a superfície inferior do recipiente para isolar as junções de pino de chumbo usando cimento ósseo.
- Após o cimento endurecer, coloque o recipiente na extremidade rostral da incisão midline através da pele e sutura-o para tecidos subcutâneos através de sua saia de poliéster. Conecte a borda da pele ao recipiente por suturas que passam pelos orifícios na placa facial.
NOTA: Uma mandíbula do hemostat tem uma fenda final que leva a um buraco na contra-pia. O fio de chumbo pode ser posicionado através da fenda no orifício e o contra-dissipador colocado contra a cabeça do pino. A segunda mandíbula é colocada no lado oposto do recipiente. Espremer o hemostato pressiona o pino em seu respectivo orifício de receptáculo.
- Após o cimento endurecer, coloque o recipiente na extremidade rostral da incisão midline através da pele e sutura-o para tecidos subcutâneos através de sua saia de poliéster. Conecte a borda da pele ao recipiente por suturas que passam pelos orifícios na placa facial.
- Faça uma incisão no pescoço esquerdo para expor o músculo trapézio. Realizar dissecção para fazer um bolso submuscular para colocação do gerador de pulso implantável. Túnel cada DBS leva subcutâneamente à incisão do pescoço para inserção no IPG.
- Feche todas as feridas cirúrgicas com suturas. Monitore o animal de perto até a recuperação completa da cirurgia.
- Fornecer analgésicos pós-operatórios (por exemplo, buprenorfina: 0,01-0,02 mg/kg) rotineiramente por até 48 h. Administrar antibióticos (por exemplo, cefpodoxime: 10 mg/kg) oralmente para o animal por pelo menos 3 dias. Abrigar o animal sozinho depois durante todo o estudo, e restringir o exercício por um período de 10 dias para permitir a cicatrização normal da ferida e estabilização do dispositivo implantado.
NOTA: O recipiente da pele deve ser limpo diariamente com solução antisséptica compatível com tecido. Além disso, os pinos masculinos dummy devem ser inseridos nos pinos femininos do recipiente de pele rotineiramente, exceto durante as sessões de gravação do EMG. Esta manobra evitará o acúmulo de detritos no recipiente, permitirá que conexões eficazes sejam feitas com o cabo externo e evitará infecções.
8. Sessões de gravação de estimulação nervosa-EMG na linha de base
NOTA: Realize estas sessões 2x-3x após a cirurgia de implante (seção 7) e antes da cirurgia de transsecção nervosa (seção 9) para obter sinais EMG de linha de base quando as RLNs bilaterais estiverem intactas. Aplique o protocolo a seguir durante uma sessão padrão de gravação de estimulação nervosa-EMG (seções 8 e 10).
- Reter alimentos antes do procedimento para 10-12 h. Anestesiar o animal com a combinação de tiletamina e zolazepam (dose inicial de carga de 2-4 mg/kg por injeção intravenosa, em seguida, manter com 0,4 mg/kg por hora através de uma linha i.v. ). Coloque o animal em uma almofada de aquecimento em posição supina e mantenha o animal em um plano moderado de anestesia. Monitore os sinais vitais do animal durante o procedimento conforme descrito na etapa 7.2.
- Insira um endoscópio rígido de zero grau com uma câmera de vídeo CCD anexada através de um laringoscópio para visualizar o movimento da dobra vocal ao nível da grunagem.
- Interface o cabo externo que se conecta ao estimulador de laboratório e pré-amplificadores EMG ao recipiente de pele através de seu plugue e pinos. Conecte as saídas dos pré-amplificadores a um dispositivo de aquisição de dados e/ou um osciloscópio para exibir, gravar e medir sinais EMG.
- Fornecer estímulos (pulsos de onda quadrada única, 0,1-0,5 ms de duração, 0,5-2,0 mA amplitude) para as RLNs esquerda e direita, respectivamente, para registrar respostas EMG evocadas de complexos bilaterais ta-LCA e músculos PCA em cada condição.
- Fornecer estímulos (pulsos de onda quadrada única, 0,1-0,5 ms de duração, 0,5-2,0 mA amplitude) para as SLNs esquerda e direita, respectivamente, para registrar respostas EMG evocadas de complexos bilaterais ta-LCA e músculos PCA em cada condição.
- Entregar CO2 misturado com ar de quarto através da boca do animal para induzir hipercapnia e aumentar o esforço respiratório do animal. Limitar a exposição a 1 min, durante o qual ocorrerá o recrutamento máximo de unidades motoras inspiratórias. Registre atividades espontâneas de EMG de complexos TA-LCA e músculos PCA sob esta condição hipercapnica.
- Monitore o animal até a recuperação total da anestesia e devolva o animal para a instalação.
9. Segunda Cirurgia para Transsecção Nervosa e Anastomose
- Realizar a segunda cirurgia 10-14 dias após a primeira cirurgia. Retenha comida por 10-12 h antes da cirurgia.
- Anestesiar o animal, cortina rastizar e monitorar os sinais vitais intraoperatóriamente utilizando a técnica descrita na etapa 7.2.
- Remova as suturas e reabra a incisão da linha média por dissecção contundente sempre que possível. Evite danos à implantação anterior durante a dissecção. Exponha as RLNs bilaterais através da dissecção. Isolam, transecto e anastomose cada nervo com monofilamento 7-0, suturas não absorvíveis para induzir paralisia laríngea bilateral.
- Irrigar a incisão do pescoço com soro estona estéril e antibiótico de gentamicina. Feche os tecidos musculares e subcutâneos usando suturas absorvíveis 3-0. Fechar a pele com 3-0 suturas monofilamentonão absorvíveis.
- Monitore o animal de perto até a recuperação completa da cirurgia.
- Fornecer analgésicos (por exemplo, buprenorfina: 0,01-0,02 mg/kg) rotineiramente por até 48 h no pós-operatório. Dê antibióticos (por exemplo, cefpodoxime: 10 mg/kg) oralmente ao animal por pelo menos 3 dias. Restringir o animal do exercício por um período de 10 dias para permitir a cicatrização normal da ferida.
10. Sessões de gravação de estimulação nervosa-EMG após lesões bilaterais de RLN
- Realize essas sessões 1x por semana durante os primeiros 3 meses e, em seguida, quinzenalmente. Siga o protocolo descrito na seção 8 para estas sessões.
Representative Results
Exemplos dos componentes são mostrados na Figura 2. Da esquerda para a direita na Figura 2A estão o manguito de estímulo nervoso, o eletrodo de gravação TA-LCA, o eletrodo de gravação PCA e o recipiente de interface da pele, respectivamente. O tamanho relativo desses componentes pode ser apreciado. O recipiente de pele (Figura 2B) tem duas linhas de orifícios em que os pinos femininos no final de cada fio enrolado(Figura 2D) são inseridos. São inseridos em frente à placa facial (seta) durante a cirurgia de implantação. O recipiente tem uma saia de poliéster(Figura 2C)presa às paredes laterais do conector. Esta saia foi projetada para ancorar o recipiente em posição por infiltração de tecido conjuntivo. Cada chumbo EMG de aço inoxidável revestido de Teflon(Figura 2E)é desisolado (5 mm) na ponta para formar um eletrodo em forma de gancho para gravação muscular. O manguito de estimulação tem dois eletrodos roscados contra a parede interna do punho. Eles são separados por uma distância de 2 mm(Figura 2F) e formam uma forma "V"(Figura 2G)para garantir a entrega da corrente através do nervo.
Figura 2: Componentes do sistema de implante. (A) Da esquerda para a direita está o manguito de estímulo nervoso, eletrodo de gravação TA-LCA, eletrodo de gravação PCA e recipiente de interface da pele, respectivamente. (B) O recipiente de pele mostra duas fileiras de orifícios. (C) O recipiente mostra ndo uma saia de poliéster presa às paredes laterais do conector. (D) O fio enrolado contendo pinos femininos a serem inseridos em B. (E) O chumbo EMG revestido de teflon é desisolado (5 mm) na ponta para formar um eletrodo em forma de gancho para gravação muscular. (F) O manguito de estimulação tem dois eletrodos roscados contra a parede interna do punho, que são separados por 2 mm. (G)Formação de forma "V" de eletrodos para garantir a entrega da corrente através do nervo. Este número foi modificado com a permissão27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 3 mostra o recipiente de pele implantado e como o cabo do equipamento externo é conectado aos recipientes. Deve-se notar que os pinos masculinos manequim (não mostrados) são inseridos nos pinos femininos do recipiente para mantê-los livres de detritos entre as sessões de gravação.
Figura 3: Recipiente de pele e cabo de interface. (A)O recipiente de pele implantado no pescoço anterior sem pinos masculinos de bonecos é mostrado. (B) A imagem mostra como os pinos de estímulo e o plugue de gravação EMG (seta) do cabo do equipamento externo são interfaceados ao recipiente durante uma sessão de gravação de estimulação nervosa-EMG. Este número foi modificado com a permissão27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 4 mostra uma gravação EMG de uma das sessões de linha de base com as RLNs intactas.
Figura 4: Gravações EMG de músculos laríngeos com inervação normal. (A) Exemplo de gravação do músculo PCA onde a estimulação RLN produz um artefato de estímulo (seta) seguido de um grande potencial EMG evocado. (B) Exemplo de gravação do complexo muscular TA-LCA, no qual a estimulação SLN produz um artefato de estímulo (seta). Representado aqui é(a)uma resposta muscular monossináptica de latência curta e (b) uma resposta mais longa de latência polissináptica RGC. (C) Rajadas (setas) da atividade emg espontânea registrada susturada do músculo PCA durante inspirações normais. (D) Aumento da atividade inspiratória de EMG ao longo da entrega de CO2. Este número foi modificado com a permissão27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em uma gravação do músculo PCA(Figura 4A),a estimulação RLN produz um artefato de estímulo (seta) seguido de um grande potencial EMG evocado. As respostas máximas evocadas pelo RLN fornecem um bom índice da magnitude global da inervação normal, bem como o nível de reinervação após neurorrhafia subseqüente, independentemente do tipo de unidade motora. Isso é verdade porque o RLN contém fibras nervosas de unidades motoras de fechamento glotático inspiratório e reflexo (RGC). A estimulação RLN recruta ambos os tipos de unidades. A atividade da unidade motora EMG evocada é retificada e integrada durante um período de 20 ms para obter uma medida quantitativa de inervação muscular.
Em uma gravação do complexo muscular TA-LCA(Figura 4B),a estimulação SLN produz um artefato de estímulo (seta). Este artefato é seguido por uma resposta muscular monossináptica de latência curta (a) e resposta polissináptica de latência mais longa (b). O potencial (a) é uma resposta direta do músculo cricotireóide, porque este músculo é inervado pelo ramo externo próximo do SLN. A ativação desviada deste ramo ocorre comumente durante a estimulação da braçadeira nervosa do ramo interno para ativar a resposta do RGC. O potencial da cricotireóide é registrado pelo eletrodo TA-LCA, já que este músculo está localizado perto do complexo. Estudos anteriores mostraram que o potencial da cricotireóide evocado pela estimulação do ramo interno pode ser seletivamente abolido pela secção do ramo externo do SLN (Observações Zealear, inéditas). As respostas máximas de EMG evocadas pelo SLN refletem a magnitude da inervação natural do complexo TA-LCA através de sua via sensorial-motora RGC. Antes da neurorrhafia RLN, não há inervação rgc do músculo PCA, de modo que nenhum potencial SLN deve ser detectado a partir deste músculo. Após a transsecção e reparação do nervo, os potenciais evocados pelo SLN refletem a quantidade de reinervação correta do complexo TA-LCA e a reinervação incorreta do músculo PCA. A atividade do RGC é quantificada pela retificação e integração durante um período de tempo de 20 ms para capturar toda a forma de onda RGC.
In (Figura 4C), rajadas (setas) da atividade emg espontânea são registradas a partir do músculo PCA durante inspirações normais. Esta atividade emg inspiradora aumenta ao longo da entrega de CO2, como mostrado em (Figura 4D) a uma velocidade de varredura mais lenta. A atividade espontânea pca emg fornece uma boa estimativa da magnitude da inervação normal deste músculo por seus motoneurônios inspiratórios originais. Não há inervação inspiradora do complexo TA-LCA, de modo que não devem ser detectados potenciais inspiradores desses músculos. Isso porque apenas unidades motoras inspiradoras estão envolvidas no sequestro da dobra vocal em esforço inspiratório máximo no animal anestesiado. Após a transsecção e reparação dos nervos, potenciais inspiratórios espontâneos refletem a magnitude da reinervação correta do músculo PCA e a magnitude da reinervação incorreta do complexo TA-LCA. As gravações da atividade inspiratória do EMG são amplificadas, retificadas e integradas durante um período de 8 s.
Discussion
Este artigo descreve os passos necessários na fabricação de um novo sistema econômico e implantável para estimulação de nervos laríngeos e registro de respostas emg de músculos laríngeos a longo prazo. O protocolo é descomplicado e pode produzir um implante que é compacto o suficiente para ser utilizado em um animal tão pequeno quanto um rato. Existem várias etapas críticas que devem ser enfatizadas. Primeiro, os fios de chumbo devem ser enrolados com cuidado e uniformemente para evitar o desinlserção de chumbo, torção ou quebra. Se uma máquina de enrolamento não estiver disponível, os cabos enrolados pré-fabricados podem ser obtidos comercialmente. Em segundo lugar, a estratégia de inserir fios de chumbo em um tubo de silicone para formar um "V" que atravessa o nervo é fundamental para promover a entrega da corrente através do nervo dentro da braçadeira. Se ambos os cabos forem colocados no mesmo lado do tubo, pode ocorrer desvio de corrente entre eletrodos. Também é importante que as pistas estejam posicionadas contra a parede interna do tubo para evitar a possibilidade de lesão de fatia no nervo.
Em terceiro lugar, durante a cirurgia de implantação, os nervos laríngeos devem ser dissecados cuidadosamente para evitar danos. Na fase posterior da implantação, ao inserir pinos no recipiente, deve-se aplicar força ao pino em alinhamento ao seu orifício para evitar a dobra súbita da cabeça do pino. Posteriormente, o cimento ósseo deve ser distribuído minuciosamente no fundo do recipiente para isolamento completo e prevenção de crosstalk entre os canais. Por fim, a prevenção da infecção é fundamental para garantir a integridade do sistema de implanteao longo do tempo. Pode ser alcançado por uma combinação de várias manobras: adição de uma saia ao recipiente, administração de antibióticos, limpeza diária da ferida e recipiente com solução antisséptica compatível com tecido, e colocação de pinos masculinos manequim nos pinos femininos do recipiente para mantê-los limpos de detritos entre as sessões.
O protocolo foi comprovado como bem sucedido neste modelo laríngeo de cachorro. No entanto, algumas modificações ou estratégias alternativas podem ser consideradas para outras aplicações. Por exemplo, as pontas de sensoriamento desisoladas dos eletrodos EMG PCA e TA-LCA são ancoradas nos músculos por um meio externo - seja o enxerto de poliéster ou o eletrodo DBS. Em uma aplicação em que a ancoragem externa não é necessária ou realizada, a farpa do eletrodo por si só pode servir como âncora. Nesse caso, o fio de aço inoxidável revestido de Teflon pode ser preferível ao fio multifilamento, tendo em vista sua maior resistência à tração, proporcionando uma barb que é mais estável no tecido. No entanto, deve-se notar que os fios multifilamentos podem ser menos propensos à quebra. Uma estratégia alternativa para a fabricação e montagem do recipiente de pele é a impressão 3D usando polímeros biocompatíveis (por exemplo, MED610 da Stratasys). Isso pode simplificar o processo de fabricação.
Após a cirurgia de implantação e recuperação do animal, são realizadas sessões fisiológicas com as RLNs ainda intactas para obter dados de linha de base. Durante uma sessão, a ausência de sinais EMG de um músculo laríngeo pode ocorrer após a estimulação rln. Para solucionar problemas da causa(Tabela 1),deve-se primeiro determinar se o movimento da dobra vocal está presente. Se ele estiver presente, isso significa que o nervo é efetivamente ativado pela braçadeira, mas há um problema com o chumbo EMG. Nesta situação, os usuários devem olhar melhor para o artefato de estímulo EMG. Se o artefato EMG estiver ausente, provavelmente haverá uma descontinuidade na entrada EMG para o pré-amplificador. O ruído de sessenta ciclos também estará presente e grande em amplitude. Se o artefato for grande, desviar de um pino de estímulo para o pino de gravação pode ser responsável por saturar o pré-amplificador do canal e obliterar a resposta do EMG. Se o artefato estiver normal, então o chumbo EMG provavelmente se deslocou do músculo e não pode detectar sua atividade. Por outro lado, se o movimento da dobra vocal está ausente, então o nervo não está sendo ativado. Se o artefato estiver ausente, pode haver uma descontinuidade no circuito de estimulação, impedindo a ativação do nervo. Se o artefato parecer normal, o nervo pode ter sido ferido durante a cirurgia de implante ou o manguito pode ter migrado para fora do nervo. Uma estratégia semelhante pode ser aplicada para solucionar problemas da causa de sinais EMG ausentes durante a estimulação SLN.
| Nervo estimulado | Músculo saudoso | Movimento da dobra vocal ipsilateral | Artefato de estímulo | Causas |
| RLN | PCA e/ou TA-LCA | Sim | Ausente (ruído de 60 ciclos presente) | Descontinuidade na entrada EMG ao pré-amplificador (por exemplo, chumbo, pino, cabo); |
| Grande | Conversa cruzada entre stim e pinos de gravação no recipiente | |||
| Normal | Deslocamento do eletrodo EMG | |||
| Não | Ausente | Descontinuidade no circuito de estimulação | ||
| Normal | 1. Lesão RLN; 2. Luxação da braçadeira | |||
| Sln | TA-LCA | Sim | Ausente (ruído de 60 ciclos presente) | Descontinuidade na entrada EMG ao pré-amplificador (por exemplo, chumbo, pino, cabo); |
| Grande | Conversa cruzada entre stim e pinos de gravação no recipiente | |||
| Normal | Deslocamento do eletrodo EMG | |||
| Não | Ausente | Descontinuidade no circuito de estimulação | ||
| Normal | 1. Lesão SLN ou RLN; 2. Luxação da braçadeira |
Tabela 1: Guia de solução de problemas.
Deve-se mencionar que existem duas pequenas limitações na aplicação atual desta tecnologia. Primeiro, a dobra súbita do pino feminino durante a inserção no recipiente ocorreu em vários casos. Felizmente, os pinos podem ser endireitados e inseridos em seus orifícios com sucesso. Se o dano do pino for irreparável, o chumbo e todo o seu componente precisam ser substituídos. Portanto, os componentes de backup devem estar prontamente disponíveis antes da cirurgia. Em segundo lugar, o tempo necessário para completar a implantação cirúrgica é longo (~10 h). A longa duração reflete parcialmente o grande número de componentes de estimulação e recodificação necessários para este estudo: quatro nervos, quatro músculos, um recipiente e um IPG. Se forem necessários menos componentes usando esta tecnologia, o tempo de implantação deve ser significativamente reduzido (por exemplo, o modelo de língua de rato28).
Essa abordagem tecnológica introduz vários recursos que têm vantagem sobre os métodos existentes. O entalo dos fios de chumbo é a característica mais nova e importante deste sistema. Os condutores enrolados não são comumente disponíveis para experimentação animal não comercial, apesar dos muitos benefícios que proporcionam. Um chumbo enrolado pode ser expandido para o comprimento desejado durante a implantação. Além disso, ele se esticará na hora acordada, movendo o animal para evitar a luxação da ponta do eletrodo ou quebra do fio após a implantação. Esta característica garante a longevidade do implante e estimulação nervosa estável e registro muscular a longo prazo. Além disso, adicionar uma saia compatível com tecido ao redor do recipiente previne a exposição da ferida a este corpo estranho e promove a fibrose normal e a cicatrização da ferida na ausência de infecção. Estudos anteriores sem essa saia resultaram em infecção precoce e término prematuro do experimento. Por fim, este sistema de implante é compacto e multicanalizado, permitindo a aquisição efetiva de dados de inúmeras estruturas neuromusculares em modelos animais de vários tamanhos.
Esta abordagem técnica foi adaptada e traduzida com sucesso para um modelo de rato. Este estudo foi projetado para investigar o efeito do condicionamento elétrico na prevenção da atrofia muscular da língua e disfunção no rato envelhecido. Os nervos hipoglossais foram implantados com os eletrodos da braçadeira para condicionamento e a língua implantada com os eletrodos de gravação EMG28. Essa tecnologia também pode ser utilizada em outras aplicações de pesquisa. Como uma extensão do protocolo atual na laringe canina, os efeitos do condicionamento elétrico na promoção da reinervação seletiva estão atualmente sendo estudados em músculos faciais de coelho. Este estudo pode fornecer uma base para a prevenção da sincinese facial em pacientes com paralisia de Bell, uma condição médica comum e debilitante. Um uso potencial final desta tecnologia é estimular e registrar a partir de animais acordados e livremente em movimento. Atualmente, tais dados foram obtidos via cabo externo de ratos acordados e sem restrições28. No futuro, esse sistema econômico também pode ser combinado com a tecnologia remota de estimulação de gravação (por exemplo, telemetria) para ativar ou sondar sistemas neuromusculares sem fio.
Disclosures
Dr. David Zealear está comercializando esta tecnologia implantável, estimulação nervosa-EMG para uma variedade de sistemas neuromusculares e modelos animais.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Hongmei Wu por sua contribuição para o cuidado com os animais e coleta de dados ao longo do estudo. Agradecemos a Amy Nunnally, Jamie Adcock e Phil Williams pela ajuda com cirurgias estéreis. A experiência e dedicação da equipe do Centro de Cuidados Animais da Universidade vanderbilt foi inestimável. Esta pesquisa foi apoiada pela bolsa NIH U01DC016033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305175 | |
| 23 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305145 | |
| 25 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305125 | |
| 3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL | Ethicon | J219H | |
| 3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8684G | |
| 4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8871H | |
| 6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene | Ethicon | 8805 | |
| 7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | M8735 | |
| Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98% | ACROS | code 194790100 | for dilution of modical adhesive silicone |
| Bone cement | Zimmer | 1102-16 | 20g powder 10 mL liquid |
| Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1 mLl) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd | 12496-0757-1 | |
| CCD video camera attached to the endoscope | Sony | MCC500MD | |
| Cefpodoxime (Simplicef 100 mg tablets) | Zoetis | 5228 | |
| Data acquisition device , PowerLab 16/35 | ADInstruments, Inc | 5761-E | |
| Deep-brain stimulation (DBS) electrodes | Abbott | 6172ANS | |
| Digital oscilloscope | Tektronix | DPO71304SX | |
| Implantable pulse generator (IPG), Infinity | Abbott | 6660ANS | |
| Knitted polyester graft | Meadox Medical Inc | 92220 | 20 mm in diameter |
| Medical Grade Polyethylene Micro Tubing | Amazon.com | BB31695-PE/13-10 | OD 0.156", ID 0.094" |
| Metal female pin | Allied Electronics & Automation | 220-S02-100 | |
| Metal male pin | CDM electronics | 220-p02-1 | |
| Prefabricated coiled leads | Medical innovations Inc. | ||
| Silastic Laboratory Tubing | Cole-Parmer | 2415569 | OD 0.125", ID 0.062" |
| Silastic Medical Adhesive Silicone | Dow corning | Type A, 2 oz | |
| Stainless steel monofilament wire | The Harris Products Group | type 316 | 0.008" (coated), 0.005" (bare) |
| Sterile Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Sklar Instruments | 96-1146 | |
| Strip connector | CDM electronics | 2.6 x 11.6 x 101.5 mm | single row, round, through hole |
| Teflon-coated multi-filament stainless steel wire | Medwire | Part 316, ss7/44T | |
| Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol - 5 mL | Zoetis | 004866 | |
| Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan - 1 Gallon | Zoetis | 540561 | |
| Zero-degree rigid endoscope | Karl Storz | 8712AA |
References
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