Presenteras här är ett protokoll för tillverkning av ett implanterbart system för in vivo kronologisk registrering av framkallat och spontana elektromyografiska potentialer. Systemet tillämpas på undersökningen av reinnervation av laryngeal muskler efter nervskada.
Elektromyografi (EMG) mäter muskelresponsen på elektrisk stimulering eller spontan aktivitet hos motorenheter och spelar en viktig roll vid bedömningen av neuromuskulär funktion. Kronisk inspelning av EMG aktivitet återspeglar en muskel reinnervation status efter nervskada har begränsats, på grund av den invasiva karaktären av traditionella EMG inspelningstekniker. I detta avseende är ett implanterbart system utformat för långsiktig, in vivo EMG-registrering och nervstimulering. Det har tillämpats och testats i en studie om reinnervation av laryngeal muskler. Detta system består av 1) två bipolära elektrodnervmanschetter och leder för att stimulera var och en av två nerver: den återkommande laryngeal nerv (RLN) och inre gren av den överlägsna laryngeal nerv (SLN); 2) två EMG inspelning elektroder och leder för var och en av de två laryngeal muskler: bakre cricoarytenoid (PCA) muskel och thyroarytenoid-laterala cricoarytenoid (TA-LCA) muskelkomplex; och 3) ett huduttag som samverkar alla implanterade blyterminaler till en extern förförstärkare och stimulator med hjälp av en anslutningskabel. Trådledningarna är Teflon-belagda, multi-filament, typ 316 rostfritt stål. De lindas och kan sträcka under kroppens rörelse av det vakna djuret för att förhindra blybrytning och elektrodmigration. Detta system implanteras under en aseptisk operation. Därefter utförs EMG-inspelningar vid baslinjen innan RLN transekteras vid den andra operationen för att studera muskelåternervation. Under hela studien utförs flera fysiologiska sessioner i det sövda djuret för att erhålla framkallad och spontan EMG-aktivitet som återspeglar reinnervation status laryngeal muskler. Systemet är kompakt, utan infektion under studiens gång och mycket hållbart. Detta implanterbara system kan ge en tillförlitlig plattform för forskning där långsiktig registrering eller nervstimulering krävs i ett sövt eller fritt rörligt djur.
EMG-inspelning är en användbar teknik för att mäta elektrisk aktivitet som produceras av en skelettmuskulatur när den aktiveras genom elektrisk stimulering av dess nerv eller spontan bränning av dess motorenheter. Övervakning av EMG-signaler kan användas för bedömning av neuromuskulär transmission och muskelbiomekanik1. EMG-inspelning spelar också en viktig roll i karakteriseringen av kvaliteten och omfattningen av muskelåterventering efter nervskada2,,3,,4,5. Flera EMG-inspelningar under hela perioden av återinsättning kan dock inte uppnås genom en invasiv metod. Därför har implanterbara enheter utformats och utvecklats för upprepad, kronisk stimulering och registrering i neuromuskulära system6,,7,,8,9,10,11,12,13. Syftet med detta dokument är att beskriva ett protokoll för tillverkning och implantation av ett stabilt system för att erhålla tillförlitliga kronologiska EMG-data från struphuvudet.
Detta system tillämpas här på studiet av laryngeal muskel reinnervation. En kort översikt över struphuvudet ges för orientering (figur 1). En exakt samordning mellan sensoriska och motoriska komponenter är avgörande för korrekt muskelrörelse under andning, fakturering och luftvägsskydd. PCA muskeln, som ligger i den bakre struphuvudet, är den enda kidnappare av stämbanden. Denna muskel aktiveras spontant under inspiration för att öka glottal område för inandning. TA-LCA-komplexet är den stora adductor av vocal fold. Aktivering av denna muskel komplex tillsammans med en annan adductor (dvs. interarytenoid muskeln) medialize luckan för vibrationer och ljudproduktion och stänga luckan för luftvägarna skydd under sväljning.
Dessutom, motor neuron fibrer innervate både kidnappare och adductor muskler i RLN. Kidnappar- och adductormusklerna kan urskiljas baserat på motorenhetens sammansättning14,15. PCA muskeln uppvisar ökad bränning under hypercapnic och/eller hypoxic villkor16 på grund av förekomsten av inandningsledning motorenheter. Däremot reflex glottic stängning (RGC) motorenheter, som stänger glottis reflexively genom aktivering av sensoriska receptorer inom laryngeal slemhinnan, finns i TA-LCA muskelkomplex. Den inre grenen av den överlägsna struphuvudet nerv (SLN) bär afferent fibrer av sensoriska receptorer i struphuvudet17. Även om fakturering är främst en adductor funktion, både kidnappare och adductor motorenheter är inblandade i denna högt utvecklade laryngeal beteende.
Figur 1: Struphuvudets anatomi. Komponenterna i detta implanterbara system visas också. SLN = överlägsen laryngeal nerv; RLN = återkommande laryngeal nerv; PCA = bakre cricoarytenoid muskel; TA-LCA = thyroarytenoid-laterala cricoarytenoid muskelkomplex; DBS = djup hjärnstimulering. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från Wiley27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Skada på RLN kan resultera i vocal fold förlamning (VFP), vilket äventyrar både bortförande och adducting funktioner på grund av laryngeal muskel denervation14,18,19. Därefter uppstår regenerering av RLN nervfibrer och reinnervation av muskler ofta. Dock är reinnervation en slumpmässig process och resulterar i missriktad, olämplig muskel återanslutning i de flesta fall. Detta kallas synkinesis, där spontan aktivering av kidnappare och adductor antagonister är felaktig och producerar ineffektiva eller till och med paradoxala rörelse av vokala veck14,19,20,21. Med synkinesis är den kritiska funktionen som går förlorad vocal fold abduction, vilket resulterar i otillräcklig ventilation. Även om det pågår försök att behandla laryngeal synkinesi genom att antingen 1) blockera glottic stängning med Botox22,23 eller 2) elektriskt stimulera den glottiska öppningen med en implanterbar pacemaker24,25, det finns ingen klinisk intervention som tillförlitligt förhindrar synkinesis26. Det finns dock bevis för att elektrisk konditionering av PCA muskeln under reinnervation vid en låg frekvens främjar lämpliga neuromuskulära återanslutning och minimerar synkinesi från att hända. Studier pågår för närvarande för att klargöra de underliggande mekanismerna2.
Fokus för detta dokument är att beskriva ett enkelt och billigt implanterbart system för kronisk nervstimulering och EMG-inspelning. Detta system kan användas för att undersöka effekterna av lågfrekvent elektrisk konditionering av PCA muskeln på specificiteten i dess efterföljande reinnervation. EMG-signaler som erhålls genom detta system kan återspegla kvaliteten och kvantiteten av laryngeal muskel reinnervation över tiden.
Detta dokument beskriver de steg som krävs vid tillverkning av en ny, ekonomisk och implanterbara system för stimulering av laryngeal nerver och registrering av EMG svar från laryngeal muskler på lång sikt. Protokollet är okomplicerat och kan producera ett implantat som är kompakt nog att användas i ett djur så litet som en råtta. Det finns flera kritiska steg som bör betonas. Först bör blyledningar lindas noggrant och jämnt för att förhindra bly avisolering, kinking eller brott. Om det inte finns någon spolemaskin kan prefabricerade lindade ledningar erhållas kommersiellt. För det andra är strategin att sätta in blytrådar i ett silikonrör för att bilda ett “V” som sträcker sig över nerven avgörande för att främja nuvarande leverans genom nerven inuti manschetten. Om båda ledningarna placeras på samma sida av röret, kan växling av ström mellan elektroderna uppstå. Det är också viktigt att ledningarna är placerade mot rörets innervägg för att undvika risken för skiva skada på nerven.
För det tredje, under implantation kirurgi, laryngeal nerver bör dissekeras noggrant för att förhindra skador. I det senare skedet av implantationen, när du sätter in stiften i kärlet, bör kraft appliceras på stiftet i linje med hålet för att förhindra plötslig böjning av stiftets huvud. Därefter bör bencement fördelas noggrant på kärlets botten för fullständig isolering och förebyggande av överhörning mellan kanaler. Slutligen är förebyggande av infektion avgörande för att säkerställa implantatsystemets integritet över tiden. Det kan uppnås genom en kombination av flera manövrar: tillägg av en kjol till kärlet, administrering av antibiotika, daglig rengöring av såret och kärlet med vävnadskompatibla antiseptisk lösning, och placering av dummy manliga stift i kärlets kvinnliga stift för att hålla dem rena från skräp mellan sessionerna.
Protokollet har visat sig vara framgångsrikt i denna hund laryngeal modell. Vissa ändringar eller alternativa strategier kan dock övervägas för andra tillämpningar. Till exempel är de avinsulerade avkänningstipsen på PCA- och TA-LCA EMG-elektroderna förankrade i musklerna med ett externt medel, antingen polyestertransplantatet eller DBS-elektroden. I ett program där extern förankring inte behövs eller utförs, kan taggningen av elektroden ensam fungera som ankare. I ett sådant fall kan Teflon-belagda, rostfritt stål, monofilamenttråd vara att föredra framför multifilamenttråd med tanke på dess större draghållfasthet, vilket ger en hulling som är mer stabil i vävnad. Det bör dock noteras att multifilament trådar kan vara mindre benägna att bryta. En alternativ strategi för tillverkning och montering av hudbehållaren är att 3D-printa med hjälp av biokompatibla polymerer (t.ex. Detta kan förenkla tillverkningsprocessen.
Efter implantationskirurgi och återhämtning av djuret utförs fysiologiska sessioner med RLNs fortfarande intakt för att erhålla baslinjedata. Under en session kan frånvaro av EMG-signaler från en laryngealmuskel uppstå efter RLN-stimulering. För att felsöka orsaken (tabell 1) bör det först avgöras om det finns en sångviksrörelse. Om det är närvarande, innebär detta att nerven effektivt aktiveras av manschetten, men det finns ett problem med EMG-ledningen. I denna situation bör användarna titta vidare på EMG stimulans artefakt. Om EMG-artefakten saknas, finns det sannolikt en diskontinuitet i EMG-indata till förförstärkaren. Sextio-cykel buller kommer också att vara närvarande och stor i amplitud. Om artefakten är stor, kan växling från en stimulans stift till inspelningen stift vara ansvarig för mätta kanalen förförstärkare och utplåna EMG svar. Om artefakten är normal, då EMG-ledningen har sannolikt ur led från muskeln och kan inte upptäcka dess aktivitet. Å andra sidan, om den vokala vikningsrörelsen är frånvarande, aktiveras inte nerven. Om artefakten är frånvarande, kan det finnas en diskontinuitet i stimulering kretsen, förhindra nervaktivering. Om artefakten verkar normal, kan nerven ha skadats under implantatkirurgi eller manschetten kan ha migrerat från nerven. En liknande strategi kan användas för att felsöka orsaken till frånvarande EMG-signaler under SLN-stimulering.
Stimulerad nerv | Målmuskler | Ipsilateral vocal fold rörelse | Stimulus artefakt | Orsakar |
Rln | Partnerskaps- och samarbets- och/eller samarbets- | Ja | Frånvarande (60-cykel buller närvarande) | Avbrott i EMG-ingången till förförstärkare (t.ex. bly, stift, kabel); |
Stora | Korssamtal mellan stim och inspelningsstift vid kärlet | |||
Normal | Förskjutning av ELEKTROD för EMG | |||
Nej | Frånvarande | Avbrott i stimuleringskretsen | ||
Normal | 1. RLN skada; 2. Manschett förskjutning | |||
Sln | TA-LCA | Ja | Frånvarande (60-cykel buller närvarande) | Avbrott i EMG-ingången till förförstärkare (t.ex. bly, stift, kabel); |
Stora | Korssamtal mellan stim och inspelningsstift vid kärlet | |||
Normal | Förskjutning av ELEKTROD för EMG | |||
Nej | Frånvarande | Avbrott i stimuleringskretsen | ||
Normal | 1. SLN- eller RLN-skada. 2. Manschett förskjutning |
Tabell 1: Felsökningsguide.
Det bör nämnas att det finns två mindre begränsningar i den nuvarande tillämpningen av denna teknik. Först har plötslig böjning av den kvinnliga stiftet under insättning i kärlet inträffat i flera fall. Lyckligtvis kan stiften rätas ut och införas i sina hål framgångsrikt. Om stiftskador är irreparabla måste sladden och hela dess komponent bytas ut. Därför bör backup komponenter vara lätt tillgängliga före operationen. För det andra är den tid som krävs för att slutföra den kirurgiska implantationen lång (~ 10 h). Den långa varaktigheten återspeglar delvis det stora antalet stimulering och omkodning komponenter som krävs för denna studie: fyra nerver, fyra muskler, ett kärl, och en IPG. Om färre komponenter krävs med hjälp av denna teknik bör implantationstiden minskas avsevärt (t.ex. råtttungan modell28).
Denna tekniska metod introducerar flera funktioner som har fördel jämfört med befintliga metoder. Spolningen av blytrådar är det mest nya och viktiga inslaget i detta system. Coiled leder är inte allmänt tillgängliga för icke-kommersiella djurförsök trots de många fördelar de ger. En lindad ledning kan utökas till önskad längd under implantation. Vidare kommer det att sträcka sig i vaken, flytta djuret för att förhindra förskjutning av elektrodspetsen eller trådbrott efter implantation. Denna funktion säkerställer livslängd implantatet och stabil nervstimulering och muskelinspelning på lång sikt. Dessutom, lägga till en vävnad kompatibel kjol runt kärlet förhindrar exponering av såret till denna främmande kropp och främjar normal fibros och sårläkning i avsaknad av infektion. Tidigare studier utan denna kjol resulterade i tidig infektion och för tidig uppsägning av experimentet. Slutligen är detta implantatsystem kompakt och flerkanaligt, vilket möjliggör effektiv datainsamling från många neuromuskulära strukturer i djurmodeller av olika storlek.
Denna tekniska metod har anpassats och framgångsrikt översatts till en råtta modell. Denna studie har utformats för att undersöka effekten av elektrisk konditionering för att förhindra tungan muskelatrofi och dysfunktion i den åldrande råtta. Hypoglossal nerverna var implanteras med manschetten elektroder för konditionering och tungan implanteras med EMG inspelning elektroder28. Denna teknik kan också användas i andra forskningsapplikationer. Som en förlängning av det nuvarande protokollet i hund struphuvudet, effekterna av elektrisk konditionering på att främja selektiv reinnervation studeras för närvarande i kanin ansiktsmusklerna. Denna studie kan ge en grund för förebyggande av ansiktssynkinesi hos patienter med Bells pares, ett vanligt och försvagande medicinskt tillstånd. En slutlig potentiell användning av denna teknik är att stimulera och spela in från vaken, fritt rörliga djur. För närvarande har sådana data erhållits via extern kabel från vaken, ohämmad råttor28. I framtiden kan detta ekonomiska system också kombineras med fjärrinspelningsstimuleringsteknik (t.ex. telemetri) för att aktivera eller sondera neuromuskulära system trådlöst.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Dr Hongmei Wu för hennes bidrag till djurvård och datainsamling under hela studien. Vi tackar Amy Nunnally, Jamie Adcock och Phil Williams för deras hjälp med sterila operationer. Expertisen och engagemanget hos personalen vid Vanderbilt University Animal Care Facility var ovärderlig. Denna forskning stöddes av NIH-stipendiet U01DC016033.
20 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305175 | |
23 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305145 | |
25 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305125 | |
3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL | Ethicon | J219H | |
3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8684G | |
4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8871H | |
6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene | Ethicon | 8805 | |
7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | M8735 | |
Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98% | ACROS | code 194790100 | for dilution of modical adhesive silicone |
Bone cement | Zimmer | 1102-16 | 20g powder 10ml liquid |
Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1ml) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd | 12496-0757-1 | |
CCD video camera attached to the endoscope | Sony | MCC500MD | |
Cefpodoxime (Simplicef 100mg tablets) | Zoetis | 5228 | |
Data acquisition device , PowerLab 16/35 | ADInstruments, Inc | 5761-E | |
Deep-brain stimulation (DBS) electrodes | Abbott | 6172ANS | |
Digital oscilloscope | Tektronix | DPO71304SX | |
Implantable pulse generator (IPG), Infinity | Abbott | 6660ANS | |
Knitted polyester graft | Meadox Medical Inc | 92220 | 20mm in diameter |
Medical Grade Polyethylene Micro Tubing | Amazon.com | BB31695-PE/13-10 | OD 0.156", ID 0.094" |
Metal female pin | Allied Electronics & Automation | 220-S02-100 | |
Metal male pin | CDM electronics | 220-p02-1 | |
Prefabricated coiled leads | Medical innovations Inc. | ||
Silastic Laboratory Tubing | Cole-Parmer | 2415569 | OD 0.125", ID 0.062" |
Silastic Medical Adhesive Silicone | Dow corning | Type A, 2 oz | |
Stainless steel monofilament wire | The Harris Products Group | type 316 | 0.008" (coated), 0.005" (bare) |
Sterile Disposable Biopsy Punch (4mm) | Sklar Instruments | 96-1146 | |
Strip connector | CDM electronics | 2.6 x 11.6 x 101.5 mm | single row, round, through hole |
Teflon-coated multi-filament stainless steel wire | Medwire | Part 316, ss7/44T | |
Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol – 5mL | Zoetis | 004866 | |
Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan – 1 Gal. | Zoetis | 540561 | |
Zero-degree rigid endoscope | Karl Storz | 8712AA |