Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor de productie van een implanteerbaar systeem voor in vivo chronologische registratie van opgeroepen en spontane elektromyografische potentialen. Het systeem wordt toegepast op het onderzoek naar reinnervation van laryngeale spieren na zenuwletsel.
Abstract
Elektromyografie (EMG) meet de spierrespons op elektrische stimulatie of spontane activiteit van motorische eenheden en speelt een belangrijke rol bij de beoordeling van de neuromusculaire functie. Chronische registratie van EMG activiteit als gevolg van een spier reinnervation status na zenuwletsel is beperkt, als gevolg van de invasieve aard van de traditionele EMG opnametechnieken. In dit verband is een implanteerbaar systeem ontworpen voor langdurige, in vivo EMG-opname en zenuwstimulatie. Het is toegepast en getest in een studie over reinnervation van laryngeale spieren. Dit systeem bestaat uit 1) twee bipolaire elektrode zenuwmanchetten en leidt voor het stimuleren van elk van de twee zenuwen: de terugkerende laryngeale zenuw (RLN) en interne tak van de superieure laryngeale zenuw (SLN); 2) twee EMG-opnameelektroden en -leads voor elk van de twee laryngeale spieren: achterste cricoarytenoïde (PCA) spier en thyroarytenoid-laterale cricoarytenoid (TA-LCA) spiercomplex; en 3) een huidrecipiënt die alle geïmplanteerde loodklemmen met behulp van een verbindingskabel met een externe opnamevoorversterker en stimulator met elkaar in contact ziet. De draadkabels zijn Teflon-gecoate, multi-filament, type 316 roestvrij staal. Ze zijn opgerold en kunnen zich uitstrekken tijdens de beweging van het lichaam van het wakkere dier om loodbreuk en elektrodemigratie te voorkomen. Dit systeem wordt geïmplanteerd tijdens een aseptische operatie. Daarna worden baseline EMG-opnames uitgevoerd voordat de RLN wordt doorgesneden in de tweede operatie om spierreinnervatie te bestuderen. Gedurende de studie worden meerdere fysiologische sessies uitgevoerd in het verdoofde dier om opgeroepen en spontane EMG-activiteit te verkrijgen die de reinnervation-status van laryngeale spieren weerspiegelt. Het systeem is compact, vrij van infectie in de loop van de studie, en zeer duurzaam. Dit implanteerbare systeem kan een betrouwbaar platform bieden voor onderzoek waarin langdurige opname of zenuwstimulatie nodig is bij een verdoofd of vrij bewegend dier.
Introduction
EMG-opname is een handige techniek voor het meten van elektrische activiteit geproduceerd door een skeletspier wanneer geactiveerd door elektrische stimulatie van de zenuw of spontane afvuren van de motorische eenheden. Monitoring EMG signalen kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van neuromusculaire transmissie en spier biomechanica1. EMG-opname speelt ook een belangrijke rol bij het karakteriseren van de kwaliteit en omvang van spierreinnervatie na zenuwletsel2,3,4,5. Meerdere EMG-opnames over de gehele periode van reinnervation kunnen echter niet worden bereikt door een invasieve aanpak. Daarom zijn implanteerbare apparaten ontworpen en ontwikkeld voor herhaalde, chronische stimulatie en opname in neuromusculaire systemen6,7,8,9,10,11,12,13. Het doel van dit document is het beschrijven van een protocol voor de productie en implantatie van een stabiel systeem voor het verkrijgen van betrouwbare chronologische EMG-gegevens uit het strottenhoofd.
Dit systeem wordt hier toegepast op de studie van laryngeale spierreinnervation. Een kort overzicht van het strottenhoofd is voorzien voor oriëntatie (Figuur 1). Een nauwkeurige coördinatie tussen sensorische en motorische componenten is essentieel voor een goede spierbeweging tijdens ademhaling, voicing en luchtwegbescherming. De PCA spier, gelegen in het achterste strottenhoofd, is de enige ontvoerder van de vocale vouw. Deze spier wordt spontaan geactiveerd tijdens inspiratie om het glottale gebied voor inademing te verhogen. Het TA-LCA complex is de belangrijkste adductor van de vocale vouw. Activering van dit spiercomplex samen met een andere adductor (d.w.z. de interarytenoïde spier) medialize de vouw voor trilling en geluidsproductie en sluit de vouw voor luchtwegbescherming tijdens het slikken.
Bovendien, motorneuron vezels innervate zowel ontvoerder en adductor spieren in de RLN. De ontvoerder en adductor spieren kunnen worden onderscheiden op basis van motor eenheid samenstelling14,15. De PCA spier vertoont verhoogde vuren tijdens hypercapische en / of hypoxische omstandigheden16 als gevolg van de aanwezigheid van inspiratory motor eenheden. Reflex glottische sluiting (RGC) motoreenheden, die de glottis reflexief sluiten door activering van sensorische receptoren binnen het laryngeale slijmvlies, is daarentegen aanwezig in het TA-LCA spiercomplex. De interne tak van de superieure laryngeale zenuw (SLN) draagt de afferente vezels van sensorische receptoren in het strottenhoofd17. Hoewel voicing is in de eerste plaats een adductor functie, zowel ontvoerder en adductor motor eenheden zijn betrokken bij deze hoog ontwikkelde laryngeal gedrag.
Figuur 1: Anatomie van het strottenhoofd. De componenten van dit implanteerbare systeem worden ook weergegeven. SLN = superieure laryngeale zenuw; RLN = terugkerende laryngeale zenuw; PCA = achterste cricoarytenoïde spier; TA-LCA = thyroarytenoid-laterale cricoarytenoid spiercomplex; DBS = diepe hersenstimulatie. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming van Wiley27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Letsel aan de RLN kan resulteren in vocale plooi verlamming (VFP), die zowel ontvoeren en adducting functies als gevolg van laryngeale spierdenervation14,18,19compromitteert . Vervolgens, regeneratie van RLN zenuwvezels en reinnervation van spieren komt vaak voor. Echter, reinnervation is een willekeurig proces en resulteert in verkeerd gerichte, ongepaste spier heraansluiting in de meeste gevallen. Dit wordt synkinese genoemd, waarbij spontane activering van ontvoerder en adductorantagonisten defect is en ineffectieve of zelfs paradoxale beweging van de vocale plooien14,19,20,21produceert . Bij synkinese is de kritieke functie die verloren gaat vocale vouwontvoering, wat resulteert in onvoldoende ventilatie. Hoewel er voortdurende pogingen zijn om laryngealsynkinese te behandelen door ofwel 1) glottische sluiting te blokkeren met Botox22,23 of 2) die de glottische opening elektrisch stimuleren met een implanteerbare pacemaker24,25, is er geen klinische interventie die synkinese26op betrouwbare wijze voorkomt. Er zijn echter aanwijzingen dat elektrische conditionering van de PCA-spier tijdens reinnervation op een lage frequentie de juiste neuromusculaire heraansluiting bevordert en synkinese minimaliseert. Momenteel worden studies uitgevoerd om de onderliggende mechanismen op te helderen2.
De focus van dit artikel is het beschrijven van een eenvoudig en goedkoop implanteerbaar systeem voor chronische zenuwstimulatie en EMG-opname. Dit systeem kan worden gebruikt om de effecten van lage frequentie elektrische conditionering van de PCA spier op de specificiteit van de daaropvolgende reinnervation te onderzoeken. EMG signalen verkregen door dit systeem kan de kwaliteit en kwantiteit van laryngeale spier reinnervation na verloop van tijd weerspiegelen.
Protocol
Deze studie is goedgekeurd door de institutional animal care and use committee (IACUC) van De Universiteit van Vanderbilt en werd uitgevoerd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Dit systeem omvat vijf implanteerbare componenten en één externe kabel.
1. Twee bipolaire RLN Stimulus Electrode Cuffs, elk met paar opgerolde looddraden en eindpins
- Gebruik teflon-gecoate, multi-filament, type 316 roestvrij staaldraad (met een geïsoleerde diameter van 0,0078" of 0,198 mm) voor elke manchetlooddraad. Snijd een draadlengte van 70 cm door en spoel het in een 12 cm lange veer met behulp van een oprolinrichting of verkrijg geprefabriceerde opgerolde kabels. Strek indien nodig de veer uit om de lengte voor elke implantaatlocatie te vergroten. Laat de uiteinden van de opgerolde leads recht op 3 mm en 10 mm lengtes en deisoleer ze.
- Soldeer een vergulde koperen vrouwelijke pin op het 3 mm uiteinde van het opgerolde lood.
- Om de zenuwmanchet voor te bereiden, knip tudoort een 5 mm segment siliconenbuis (OD = 0,156", ID = 0,094"; of OD = 3,96 mm, ID = 2,39 mm) uit een rol van de slang.
- Om een lood in de buis te plaatsen, gebruik een 25 G hypodermische naald om door de slangwand 1.5 mm van het eind en van-centrum dicht bij de binnenmuur te doorboren. Vul het uiteinde van 10 mm van het lood in de punt van de naald. Trek de naald in om het ontgeïsoleerde gedeelte in de buis te deponeren. Buig het kale draaduiteinde buiten de buis terug en draai op het lood op het punt van binnenkomst in de buis.
LET OP: Gebruik een werkende microscoop om deze stappen uit te voeren. Een sonde kan in de buis worden geplaatst om de draad tegen de binnenwand te buigen. Het doel is om het kale gedeelte van de draad te positioneren, zodat stimuli aan de zenuw kunnen worden geleverd zonder mechanische schade aan de zenuw te riskeren. - Plaats het tweede lood 1,5 mm van het andere uiteinde van de buis met dezelfde procedure. Lijn het ingangspunt af op dat van de eerste lead. Doorboor de muur met de naald, zodat het kale gedeelte van de draad wordt afgezet in de buurt van de binnenwand tegenover het eerste lood.
LET OP: Kijkend naar beneden de buis, moeten de twee stimulus elektroden vormen een 45 ° "V" vorm, die de zenuw eenmaal op zijn plaats zal straddle en zorgen voor de huidige levering door de zenuw van anode tot kathode. - Maak een S-vormige spleet in de buiswand tegenover de elektrode punten van binnenkomst met behulp van een paar gebogen schaar.
LET OP: De spiraalvormige lippen van de manchet kunnen vervolgens worden geopend om de zenuw binnen te situeren tussen de elektroden tijdens de operatie. - Steek een lengte van 6-0 monofilament, niet opneembare hechting in de manchetwand aan elk uiteinde met behulp van een gebogen microchirurgische naald voor de uiteindelijke beveiliging van de manchet rond de zenuw.
- Breng medische kwaliteit type-A siliconen gel om alle blootgestelde kale draad opnieuw te isoleren buiten de manchet.
2. Twee bipolaire SLN Stimulus Electrode Cuffs, elk met paar opgerolde looddraden en eindpins
- Monteer de SLN stimulus elektrodemanchet op dezelfde manier als de RLN stimulus elektrode cuff. Gebruik echter de buis met een kleinere diameter (OD = 0,125", ID = 0,062"; of OD = 3,18 mm, ID = 1,57 mm), omdat de zenuw kleiner is in diameter.
3. Twee PCA-spier-EMG-opnameelektroden, elk met coiled leaddraad en terminalpin
- Monteer een opgerold lood voor de PCA spierelektrode zoals gedaan in stap 1.1.
- Soldeer een vrouwelijke pin op de leiding zoals gedaan in stap 1.2.
- Plaats het 10 mm uiteinde van de PCA-spierlood in de punt van een elektrode met diepe hersenstimulatie (DBS) met dezelfde strategie voor het inbrengen van naaldlood in een manchet (stap 1.4). Buig het uiteinde van het lood om een haak te vormen en clip het tot een totaal van 5 mm opnamelengte.
LET OP: In deze toepassing worden de PCA-spier en de reinnervating zenuwterminals blootgesteld aan elektrische conditionering. Stimuli worden gegenereerd door een implanteerbare pulsgenerator (IPG) en geleverd aan de laryngeale spier via een DBS-elektrode (Figuur 1, inset). Dit systeem is aangepast van therapeutische hersenstimulatie (bijvoorbeeld de ziekte van Parkinson). De DBS-elektrode wordt in een submusculaire zak geplaatst en op zijn plaats verankerd. Als er geen technologie voor elektrische conditionering van de spier nodig is, kan de PCA EMG-elektrode direct in de spier worden ingebracht en door de haak worden verankerd.
4. Twee TA-LCA Spiercomplex EMG Recording Elektroden, elk met coiled lead wire en terminal pin
- Monteer een opgerold lood voor de TA-LCA spierelektrode zoals gedaan in stap 1.1.
- Soldeer een vrouwelijke pin op de leiding zoals gedaan in stap 1.2.
- Accijnt een rechthoekig stuk gebreid polyestertransplantaat van 5 mm x 10 mm uit. Maak een gat in het midden van het gaas met een 20 G hypodermische naald. Introduceer het 10 mm uiteinde van het lood in het gat met een extra 3 mm spoel die voorbij het gat uitsteekt. Breng het lood aan op het gaas met behulp van 6-0 monofilament, niet-absorbeerbare hechting.
LET OP: Dit stuk gaas zal worden gebruikt om de elektrode te verankeren leiden tot het schildklierkraakbeen boven het spiercomplex. - Buig het uiteinde van het lood om een haak te vormen en clip het tot een totaal van 5 mm opnamelengte.
5. Huidrecipiënt voor interfacing verbindingen tussen elektroden en externe apparatuur
- Gebruik een enkele rij vrouwelijke pin streep connector om de recipiënt te maken. Snijd twee stukken (elk 17,5 mm lang) van de strip, elk met acht pin gaten. Eerst, ruw de externe oppervlakken van elk stuk met schuurpapier, dan lijm ze samen met fenol in een rookkap om een dubbele rij connector te maken. Plaats de connector gedurende 30 min in 60-80 °C water in een rookkap om lijmverharding mogelijk te maken.
LET OP: Dit montageformaat met dubbele rij biedt gemak bij de toewijzing van gaatjes voor links- versus rechtselektroden. - Snijd een stuk van 25,6 mm lengte van de strip om de voorplaat van de connector te maken (het gedeelte dat buiten de implantaatplaats uitsteekt voor huidverankering). Snijd een rechthoekig gat van 5,4 x 17,4 mm in het midden van de voorplaat met een scalpel.
- Plaats de dubbele rij connector in het rechthoekige gat van de voorplaat totdat deze is gespoeld met het oppervlak van de voorplaat zonder uitsteeksel. Als de connector niet in het rechthoekige gat van de voorplaat past, kan het gat enigszins worden vergroot met een bestand. Omdat de verbindingsgaten niet symmetrisch zijn, plaatst u de connectorrand met de gaten met de grotere diameter in de voorplaat.
LET OP: Als gevolg hiervan zal een vrouwelijke pin ingevoegd in de tegenovergestelde rand van de connector met de kleinere diameter gat vastte en vergrendelen op zijn plaats. - Gebruik fenol om de connector en de voorplaat aan elkaar te lijmen. Plaats de montage in 60-80 °C water in een rookkap gedurende 30 min om lijmverharding mogelijk te maken.
- Boor een gat van 1,3 mm in elke hoek van de voorplaat en aan elke kant van de voorplaat halverwege de uiteinden voor een totaal van zes gaten.
LET OP: Deze gaten zullen worden gebruikt om de uiteindelijke huidrecipiënt op de plaats van het implantaat te hechten. - Snijd een buis van 15 mm lang gebreide polyester graft om de montage onder de voorplaat te omringen, waardoor de assemblage biocompatibel is. Om de buis aan de montage vast te zetten, gebruikt u een injectienaald om roestvrijstalen draden door de muur te rijgen op drie even gespreide posities (elk 3,8 mm uit elkaar) langs de lengte.
- Plaats even gespreide inkepingen in elke hoek van de connector om de draden tegen het montageoppervlak te verankeren. Draai de uiteinden van elke draad met een tang om de buis aan de assemblage te cinch om een rok te vormen.
- Maak een permanente markering op de polyester patch aan de ene kant van de recipiënt.
LET OP: Gebruik dit merk voor oriëntatie om het rostral uiteinde van de recipiënt te identificeren tijdens de implantaatchirurgie. In de rostral-tot-caudaalrichting moet de volgende pin-elektrodetoewijzing voor elk van de twee rijen (links en rechts) als volgt zijn: PCA EMG, TA-LCA EMG, leeg gat, leeg gat, RLN-anode, RLN-kathode, SLN-anode en SLN-kathode.
6. Externe verbindingskabel voor opname voorversterker en stimulator
LET OP: Een kabel wordt gebruikt voor het maken van verbindingen tussen de geïmplanteerde huidrecipiënt en externe apparatuur tijdens zenuwstimulatie-EMG opnamesessies (secties 8 en 10). Het bestaat uit 12 geïsoleerde draden die eindigen met mannelijke pinnen om in vrouwelijke pinnen in de huidrecipiënt te steken. Deze kabel bestaat uit twee delen: een EMG opname plug en zenuwstimulatie draden. Een opname plug is nodig om laagspanning EMG signalen te isoleren van hogere spanning stimulus artefacten uitstralen van stimulus pinnen. Om dezelfde reden worden twee gaten in elke rij van de huidrecipiënt onbezet gelaten om opnamepennen van stimulatiepennen te scheiden.
- Gebruik een mannelijke stripconnector (dezelfde lengte en breedte, maar de helft van de hoogte van een vrouwelijke connector) om de EMG-opnameplug te maken. Snijd het in twee stukken, elk met slechts twee gaten. Breng de twee stukken met behulp van fenol lijm met dezelfde aanpak om de dubbele rij connector in de huid recipiënt (stap 5.1). Neem de vier EMG-opnamedraden in de kabel en steek hun terminalmannelijke pinnen in elk van de vier gaten totdat ze op hun plaats vergrendelen met de uiteinden die voorbij de striprand uitsteken.
- Gebruik botcement om de bovenkant van de stekker te verzegelen om draad-pin-verbindingen te isoleren.
- Gebruik de resterende acht draden in de kabel eindigend in mannelijke pinnen om individuele verbindingen met de zenuwstimulatie manchetten te maken via hun vrouwelijke pinnen.
7. Eerste implantaatchirurgie
- Verkrijg een 1-2 jaar oude, 20-25 kg canine van beide geslachten van een erkende boerderij. Acclimatiseer het dier vóór aseptische implantaatchirurgie. Autoclave alle apparatuur voor de operatie. Houd voedsel in voor 10-12 uur voor de operatie.
- Bereid het dier voor op een operatie.
- Scheer het hoofd en de hals van het dier en reinig de huid met alcohol en betadine scrub oplossing. Verdoven van het dier door intraveneuze injectie van 2-4 mg/kg tiletamine en zolazepam combinatie, gevolgd door 3% isofluraan in zuurstof door intubatie.
- Leg het dier op een operatietafel met een verwarmingskussen in supine positie en chirurgisch draperen het dier. Monitor de hartslag van het dier, de ademhalingsfrequentie, de lichaamstemperatuur en de zuurstofverzadiging gedurende de hele operatie om fysiologische stabiliteit te garanderen bij een matig anesthesievlak.
- Maak een midline nek incisie van de schildklier inkeping naar manubrium. Ontleed de luchtpijp vrij van de slokdarm en bloot de inferieure rand van de cricoid kraakbeen.
- Plaats de stimulusmanchet op elk van de bilaterale snons en RLNs. Sluit de lippen van elke manchet met behulp van de meegeleverde hechtingen.
- Maak een kraakbeen venster met een biopsie punch (4 mm in diameter) aan het voorste oppervlak van het schildklierkraakbeen aan elke kant. Leg de laterale aspecten van beide TA-LCA spiercomplexen bloot. Plaats de EMG-opnameelektroden in de TA-LCA-spiercomplexen met behulp van een 23 G-naald door de weerhaak in de punt van de naald te plaatsen. Hecht de elektrode polyester pleister op kraakbeen.
- Plaats de DBS-elektrode samen met zijn bijbehorende haakdraad EMG-opnameelektrode onder de PCA-spier aan elke kant. Gebruik een endoscoop om te bevestigen dat stimulatie vocale vouw ontvoering voor elk kanaal produceert. Veranker de DBS-elektroden aan het cricoidkraakbeen met 4-0 niet-absorbeerbare hechtingen.
- Steek alle draadkabels van de zenuwstimulatie-EMG-opnameelektroden in de recipiënt via hun vrouwelijke pinnen. Druk de pinnen in gaten met een invoeggereedschap gevormd uit een hemostat. Verzegel het inferieure oppervlak van de recipiënt om loodpinverbindingen te isoleren met behulp van botcement.
- Na de cementverhardingen, plaats de recipiënt aan het rostral einde van de middellijn incisie door de huid en hechten aan onderhuidse weefsels via zijn polyester rok. Bevestig de huidrand aan de recipiënt door hechtingen die door de gaten in de voorplaat gaan.
LET OP: Een kaak van de hemostat heeft een einde spleet leidt tot een counter-sink gat. De looddraad kan door de gleuf in het gat worden geplaatst en de tegengootsteen tegen het hoofd van de pin worden geplaatst. De tweede kaak wordt aan de andere kant van de recipiënt geplaatst. Knijpen de hemostat drukt de pin in de respectieve recipiënt gat.
- Na de cementverhardingen, plaats de recipiënt aan het rostral einde van de middellijn incisie door de huid en hechten aan onderhuidse weefsels via zijn polyester rok. Bevestig de huidrand aan de recipiënt door hechtingen die door de gaten in de voorplaat gaan.
- Maak een incisie op de linkernek om de trapeziusspier bloot te leggen. Voer dissectie uit om een submusculaire zak te maken voor plaatsing van de implanteerbare pulsgenerator. Tunnel elke DBS lood onderhuids naar de nek incisie voor het inbrengen in de IPG.
- Sluit alle chirurgische wonden met hechtingen. Houd het dier nauwlettend in de gaten tot het volledige herstel van de operatie.
- Geef postoperatieve pijnstillers (bijvoorbeeld buprenorfine: 0,01–0,02 mg/kg) routinematig voor maximaal 48 uur. Antibiotica (bijvoorbeeld cefpodoxime: 10 mg/kg) gedurende ten minste 3 dagen mondeling aan het dier toedienen. Huis het dier daarna afzonderlijk voor de hele studie, en beperk de oefening gedurende een periode van 10 dagen om een normale wondgenezing en stabilisatie van het geïmplanteerde apparaat mogelijk te maken.
LET OP: De huidrecipiënt moet dagelijks worden gereinigd met weefselcompatibele antiseptische oplossing. Bovendien moeten dummy mannelijke pinnen routinematig in de vrouwelijke pinnen van de huidrecipiënt worden geplaatst, behalve tijdens de EMG-opnamesessies. Deze manoeuvre voorkomt de ophoping van vuil in de recipiënt, maakt het mogelijk effectieve verbindingen te maken met de externe kabel, en infectie te voorkomen.
8. Zenuwstimulatie-EMG Recording Sessions bij baseline
LET OP: Voer deze sessies 2x-3x na de implantaatchirurgie (sectie 7) en vóór zenuwtranssectiechirurgie (sectie 9) uit om emg-signalen te verkrijgen bij aanvang wanneer de bilaterale RLN's intact zijn. Pas het volgende protocol toe tijdens een standaard opnamesessie zenuwstimulatie-EMG (secties 8 en 10).
- Houd voedsel achter voor de procedure voor 10-12 uur. Verdoven het dier met tiletamine en zolazepam combinatie (initiële beladingsdosis 2-4 mg/kg door intraveneuze injectie, dan handhaven met 0,4 mg/kg per uur via een i.v. lijn). Plaats het dier op een verwarmingskussen in supine positie en houd het dier in een matig vlak van anesthesie. Controleer de vitale functies van het dier tijdens de procedure zoals beschreven in stap 7.2.
- Plaats een nulgraads stijve endoscoop met een aangesloten CCD-videocamera door een laryngoscoop om vocale vouwbewegingen op het niveau van de glottis te visualiseren.
- Interface de externe kabel die verbinding maakt met het lab stimulator en EMG voorversterkers aan de huid recipiënt via de stekker en pinnen. Sluit de uitgangen van de voorversterkers aan op een apparaat voor gegevensverwerving en/of een oscilloscoop om EMG-signalen weer te geven, op te nemen en te meten.
- Lever stimuli (enkele vierkante golf pulsen, 0,1-0,5 ms duur, 0,5-2,0 mA amplitude) aan de linker en rechter RLNs, respectievelijk, op te nemen opgeroepen EMG reacties van bilaterale TA-LCA complexen en PCA spieren onder elke aandoening.
- Lever stimuli (single square-wave pulsen, 0,1-0,5 ms duur, 0,5-2,0 mA amplitude) aan de linker en rechter SN' respectievelijk, om opgeroepen EMG reacties van bilaterale TA-LCA complexen en PCA spieren onder elke aandoening op te nemen.
- Lever CO2 gemengd met ruimtelucht door de mond van het dier om hypercapnie te induceren en de ademhalingsinspanning van het dier te verhogen. Beperk de blootstelling tot 1 min, waarbij de maximale inspiratory motor unit werving zal plaatsvinden. Neem spontane EMG-activiteiten op van TA-LCA-complexen en PCA-spieren onder deze hypercapische aandoening.
- Controleer het dier tot volledig herstel van anesthesie en breng het dier terug naar de faciliteit.
9. Tweede operatie voor zenuwtranssectie en anastomose
- Voer de tweede operatie uit 10-14 dagen na de eerste operatie. Houd voedsel in voor 10-12 uur voor de operatie.
- Het dier verdoven, draperen en controleren van vitale functies intraoperatief met behulp van de techniek beschreven in stap 7.2.
- Verwijder de hechtingen en heropen de middellijn incisie door stompe dissectie waar mogelijk. Voorkom schade aan de vorige implantatie tijdens de dissectie. Ontmasker de bilaterale RLN's door dissectie. Isoleer, transect en anastomose elke zenuw met 7-0 monofilament, niet-absorbeerbare hechtingen om bilaterale laryngeale verlamming te induceren.
- Irrigeren de nek incisie met steriele zouthoudende en gentamycine antibioticum. Sluit de gespierde en onderhuidse weefsels met behulp van 3-0 absorbeerbare hechtingen. Sluit de huid met 3-0 niet-absorbeerbare monofilament hechtingen.
- Houd het dier nauwlettend in de gaten tot het volledige herstel van de operatie.
- Zorg voor pijnstillers (bijvoorbeeld buprenorfine: 0,01–0,02 mg/kg) routinematig tot 48 uur postoperatief. Geef antibiotica (bijvoorbeeld cefpodoxime: 10 mg/kg) gedurende ten minste 3 dagen mondeling aan het dier. Beperk het dier van de oefening voor een periode van 10 dagen om een normale wondgenezing mogelijk te maken.
10. Zenuwstimulatie-EMG-opnamesessies na bilaterale RLN-verwondingen
- Voer deze sessies 1x per week uit gedurende de eerste 3 maanden en daarna tweewekelijks. Volg het protocol beschreven in sectie 8 voor deze sessies.
Representative Results
Voorbeelden van de componenten worden weergegeven in figuur 2. Van links naar rechts in figuur 2A zijn de zenuw stimulus manchet, TA-LCA opname elektrode, PCA opname elektrode, en huid interface recipiënt, respectievelijk. De relatieve grootte van deze componenten kan worden gewaardeerd. De huidrecipiënt (figuur 2B) heeft twee rijen gaten waarin de vrouwelijke pinnen aan het einde van elke opgerolde draad (figuur 2D) worden ingevoegd. Ze worden tijdens de implantatieoperatie tegenover de voorplaat (pijl) geplaatst. De recipiënt heeft een polyester rok (Figuur 2C) bevestigd aan de connector zijwanden. Deze rok is ontworpen om de recipiënt in positie te verankeren door bindweefselinfiltratie. Elke Teflon-gecoate roestvrijstalen EMG lood (figuur 2E) wordt gedeisd (5 mm) aan de punt om een haakvormige elektrode te vormen voor spieropname. De stimulatie manchet heeft twee elektroden schroefdraad tegen de binnenste manchetwand. Ze worden gescheiden door een afstand van 2 mm (Figuur 2F) en vormen een "V" vorm (Figuur 2G) om de huidige levering over de zenuw te garanderen.
Figuur 2: Onderdelen van het implantaatsysteem. (A) Van links naar rechts is de zenuw stimulus manchet, TA-LCA opname elektrode, PCA opname elektrode, en huid interface recipiënt, respectievelijk. (B) De huidrecipiënt met twee rijen gaten. (C) De recipiënt met een polyester rok bevestigd aan de connector zijwanden. (D) Opgerold emg-lood met vrouwelijke pinnen die in B. (E) tefloncoated roestvrij stalen EMG-lood bevat, wordt aan de punt ont-oedert (5 mm) om een haakvormige elektrode voor spieropname te vormen. (F) De stimulatie manchet heeft twee elektroden schroefdraad tegen de binnenste manchetwand, die worden gescheiden door 2 mm. (G) "V" vormvorming van elektroden om de huidige levering over de zenuw te garanderen. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 toont de geïmplanteerde huidrecipiënt en hoe de kabel van externe apparatuur is gekoppeld aan de recipiënten. Opgemerkt moet worden dat dummy mannelijke pinnen (niet getoond) worden ingevoegd in de vrouwelijke pinnen van de recipiënt om ze vrij van puin tussen de opnamesessies.
Figuur 3: Huidrecipiënt en interfacekabel. (A) De geïmplanteerde huidrecipiënt op de voorste hals zonder dummy mannelijke pinnen wordt getoond. (B) De afbeelding toont hoe de stimulus pinnen en EMG opnameplug (pijl) van de kabel van externe apparatuur is aangesloten op de recipiënt tijdens een zenuwstimulatie-EMG opnamesessie. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 toont een EMG-opname van een van de basislijnsessies met de LAN's intact.
Figuur 4: EMG-opnames van laryngeale spieren met normale innervatie. (A) Voorbeeld opname van de PCA spier waar RLN stimulatie produceert een stimulus artefact (pijl), gevolgd door een grote opgeroepen EMG potentieel. (B) Voorbeeld opname van de TA-LCA spiercomplex, waarin SLN stimulatie produceert een stimulus artefact (pijl). Hier vertegenwoordigd is (a) een korte latentie monosynaptische spierrespons en (b) een langere latentie polysynaptische RGC respons. (C) Uitbarstingen (pijlen) van spontane EMG activiteit geregistreerd van de PCA spier tijdens normale inspiraties. dD) Toename van de inspiratory EMG-activiteit in de loop van de CO2-levering. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
In een opname van de PCA spier (Figuur 4A), RLN stimulatie produceert een stimulus artefact (pijl), gevolgd door een grote opgeroepen EMG potentieel. De maximale RLN-opgeroepen reacties bieden een goede index van de totale omvang van de normale innervatie en het niveau van reinnervation na de daaropvolgende neurorrhaphy, ongeacht het type motoreenheid. Dit is waar omdat de RLN zenuwvezels van zowel inspiratory en reflex glottic sluiting (RGC) motoreenheden bevat. RLN stimulatie werft beide soorten eenheden. Opgeroepen EMG motoreenheid activiteit wordt gecorrigeerd en geïntegreerd over een periode van 20 ms om een kwantitatieve maatregel van spierinnervatie te verkrijgen.
In een opname van het TA-LCA spiercomplex (Figuur 4B), SLN stimulatie produceert een stimulus artefact (pijl). Dit artefact wordt gevolgd door een monosynaptische spierrespons met korte latentie (a) en een langer latentie polysynaptische RGC-respons (b). Het potentieel (a) is een directe reactie van de cricothyroid spier, omdat deze spier wordt binnengevated door de nabijgelegen externe tak van de SLN. Verdwaalde activering van deze tak komt vaak voor tijdens zenuwmanchetstimulatie van de interne tak om de RGC-respons te activeren. Het cricothyroid potentieel wordt geregistreerd door de TA-LCA elektrode, omdat deze spier zich in de buurt van het complex bevindt. Eerdere studies hebben aangetoond dat het cricothyroid potentieel opgeroepen door interne branch stimulatie selectief kan worden afgeschaft door het doordelen van de externe tak van de SLN (Zealear, ongepubliceerde waarnemingen). De maximale SLN-opgeroepen EMG reacties weerspiegelen de omvang van de natuurlijke innervatie van de TA-LCA complex door middel van haar RGC sensorische-motorroute. Voorafgaand aan RLN neurorrhaphy, er is geen RGC innervatie van de PCA spier, dus geen SLN potentieel moet worden gedetecteerd van deze spier. Na zenuwtranssectie en reparatie weerspiegelen SLN-opgeroepen potentialen de hoeveelheid correcte RGC-reinnervation van het TA-LCA-complex en onjuiste RGC-reinnervation van de PCA-spier. De RGC-activiteit wordt gekwantificeerd door rectificatie en integratie over een periode van 20 ms om de gehele RGC-golfvorm vast te leggen.
In (Figuur 4C) worden uitbarstingen (pijlen) van spontane EMG-activiteit geregistreerd van de PCA-spier tijdens normale inspiraties. Deze inspiratory EMG-activiteit neemt2 toe in de loop van de CO 2-levering, zoals blijkt uit (Figuur 4D) bij een lagere veegsnelheid. Spontane PCA EMG activiteit biedt een goede schatting van de omvang van de normale innervatie van deze spier door zijn oorspronkelijke inspiratory motoneuronen. Er is geen inspiratory innervation van het complex van TA-LCA, zodat zouden geen inspiratory potentials van deze spieren moeten worden ontdekt. Dit komt omdat alleen inspiratory motor eenheden zijn betrokken bij het ontvoeren van de vocale vouw bij maximale inspiratory inspanning in het verdoofde dier. Na zenuwtranssectie en reparatie weerspiegelen spontane inspiratory potentials de omvang van de juiste reinnervation van de PCA-spier en de omvang van onjuiste reinnervation van het TA-LCA-complex. Opnames van inspiratory EMG activiteit worden versterkt, gecorrigeerd, en geïntegreerd over een periode van 8 s.
Discussion
Dit artikel beschrijft de stappen die nodig zijn bij de productie van een nieuw, economisch en implanteerbaar systeem voor stimulatie van laryngeale zenuwen en het registreren van EMG reacties van laryngeale spieren op lange termijn. Het protocol is ongecompliceerd en kan een implantaat produceren dat compact genoeg is om te worden gebruikt in een dier zo klein als een rat. Er zijn verschillende kritische stappen die moeten worden benadrukt. Ten eerste moeten looddraden zorgvuldig en gelijkmatig worden opgerold om ontsmeting, knik of breuk van lood te voorkomen. Als een coiling machine niet beschikbaar is, kunnen geprefabriceerde opgerolde kabels commercieel worden verkregen. Ten tweede, de strategie van het invoegen van looddraden in een siliconen buis om een "V" dat de zenuw straddles vormt is van cruciaal belang om de huidige levering te bevorderen door de zenuw in de manchet. Als beide looden aan dezelfde kant van de buis worden geplaatst, kan er op stroom tussen elektroden worden gejaagd. Het is ook belangrijk dat de leads tegen de binnenwand van de buis worden geplaatst om de mogelijkheid van snijletsel aan de zenuw te voorkomen.
Ten derde moeten tijdens de implantatieoperatie laryngeale zenuwen zorgvuldig worden ontleed om schade te voorkomen. In het latere stadium van implantatie, bij het inbrengen van pinnen in de recipiënt, moet kracht worden uitgeoefend op de pin in de uitlijning van het gat om plotselinge buiging van het hoofd van de pin te voorkomen. Vervolgens moet botcement grondig worden verdeeld over de recipiëntbodem voor volledige isolatie en preventie van kruisbestuiving tussen kanalen. Ten slotte is preventie van infectie van cruciaal belang om de integriteit van het implantaatsysteem na verloop van tijd te waarborgen. Het kan worden bereikt door een combinatie van verschillende manoeuvres: toevoeging van een rok aan de recipiënt, toediening van antibiotica, dagelijkse reiniging van de wond en recipiënt met weefsel-compatibele antiseptische oplossing, en plaatsing van dummy mannelijke pinnen in de vrouwelijke pinnen van de recipiënt om ze schoon te houden van puin tussen de sessies.
Het protocol is bewezen succesvol in deze hond laryngeal model. Sommige wijzigingen of alternatieve strategieën kunnen echter in aanmerking worden genomen voor andere toepassingen. Zo worden de ongeïsoleerde sensoruiteinden van de PCA- en TA-LCA EMG-elektroden in de spieren verankerd door een externe middel- ofwel de polyestergraft of de DBS-elektrode. In een toepassing waarin externe verankering niet nodig is of uitgevoerd, kan de weerhaak van de elektrode alleen dienen als anker. In een dergelijk geval kan teflongecoate, roestvrij staal, monofilamentdraad de voorkeur hebben boven multifilamentdraad, gezien de grotere treksterkte, waardoor een weerhaak wordt geboden die stabieler is in weefsel. Er moet echter worden opgemerkt dat multifilamentdraden minder gevoelig kunnen zijn voor breuk. Een alternatieve strategie voor de fabricage en montage van de huidrecipiënt is om 3D-printen met behulp van biocompatibele polymeren (bijvoorbeeld MED610 door Stratasys). Dit kan het productieproces vereenvoudigen.
Na implantatiechirurgie en herstel van het dier worden fysiologische sessies uitgevoerd met de RLN's die nog intact zijn om basisgegevens te verkrijgen. Tijdens een sessie kan afwezigheid van EMG-signalen van een laryngeale spier optreden na RLN-stimulatie. Om de oorzaak op te lossen(tabel 1),moet eerst worden bepaald of vocale vouwbeweging aanwezig is. Als het aanwezig is, betekent dit dat de zenuw effectief wordt geactiveerd door de manchet, maar er is een probleem met het EMG-lood. In deze situatie moeten gebruikers verder kijken naar de EMG stimulus artefact. Als het EMG-artefact afwezig is, is er waarschijnlijk een discontinuïteit in de EMG-ingang voor de voorversterker. Zestig-cyclus lawaai zal ook aanwezig zijn en groot in amplitude. Als het artefact groot is, kan het rangeren van een stimuluspin naar de opnamepin verantwoordelijk zijn voor het verzadigen van de kanaalvoorversterker en het uitwissen van de EMG-respons. Als het artefact normaal is, dan is de EMG lood heeft waarschijnlijk ontwricht van de spier en kan de activiteit niet detecteren. Aan de andere kant, als de vocale plooi beweging afwezig is, dan is de zenuw niet wordt geactiveerd. Als het artefact afwezig is, kan er een discontinuïteit in het stimulatiecircuit zijn, waardoor zenuwactivering wordt voorkomen. Als het artefact normaal lijkt, kan de zenuw gewond zijn geraakt tijdens een implantaatoperatie of de manchet kan van de zenuw zijn gemigreerd. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast om de oorzaak van afwezige EMG-signalen op te lossen tijdens sln-stimulatie.
| Gestimuleerde zenuw | Doelspier(en) | Ipsilaterale vocale plooibeweging | Stimulus artefact | Oorzaken |
| RLN RLN | PCA en/of TA-LCA | Ja | Afwezig (60-cyclus geluid aanwezig) | Discontinuïteit in de EMG-ingang naar voorversterker (bijv. lood, pin, kabel); |
| Grote | Cross-talk tussen stim en opname pennen op de recipiënt | |||
| Normale | Dislocatie van EMG-elektrode | |||
| № | Afwezig | Discontinuïteit in stimulatiecircuit | ||
| Normale | 1. RLN-letsel; 2. Manchetdlocatie | |||
| Sln | TA-LCA | Ja | Afwezig (60-cyclus geluid aanwezig) | Discontinuïteit in de EMG-ingang naar voorversterker (bijv. lood, pin, kabel); |
| Grote | Cross-talk tussen stim en opname pennen op de recipiënt | |||
| Normale | Dislocatie van EMG-elektrode | |||
| № | Afwezig | Discontinuïteit in stimulatiecircuit | ||
| Normale | 1. letsel van SLN of RLN; 2. Manchetdlocatie |
Tabel 1: Handleiding voor probleemoplossing.
Er moet worden vermeld dat er twee kleine beperkingen zijn in de huidige toepassing van deze technologie. Ten eerste, plotselinge buigen van de vrouwelijke pin tijdens het inbrengen in de recipiënt heeft plaatsgevonden in verschillende gevallen. Gelukkig kunnen de pinnen met succes worden rechtgetrokken en in hun gaten worden gestoken. Als de pinschade onherstelbaar is, moeten het lood en het volledige onderdeel worden vervangen. Daarom moeten back-upcomponenten direct beschikbaar zijn voor de operatie. Ten tweede is de tijd die nodig is om de chirurgische implantatie te voltooien lang (~ 10 uur). De lange duur weerspiegelt gedeeltelijk het grote aantal stimulatie- en hercoderingscomponenten die nodig zijn voor deze studie: vier zenuwen, vier spieren, een recipiënt en een IPG. Als er minder componenten nodig zijn met behulp van deze technologie, moet de implantatietijd aanzienlijk worden verkort (bijvoorbeeld het rattongmodel28).
Deze technologische aanpak introduceert verschillende functies die voordeel hebben ten opzichte van bestaande methoden. Het oprollen van looddraden is het meest nieuwe en belangrijke kenmerk van dit systeem. Opgerolde leads zijn niet algemeen beschikbaar voor niet-commerciële dierproeven, ondanks de vele voordelen die ze bieden. Een opgerold lood kan tijdens de implantatie worden uitgebreid tot de gewenste lengte. Verder zal het zich uitstrekken in het wakkere, bewegende dier om dislocatie van de elektrodetip of draadbreuk na implantatie te voorkomen. Deze functie zorgt voor een lange levensduur van het implantaat en stabiele zenuwstimulatie en spieropname op lange termijn. Bovendien voorkomt het toevoegen van een weefselcompatibele rok rond de recipiënt blootstelling van de wond aan dit vreemde lichaam en bevordert het normale fibrose en wondgenezing bij afwezigheid van infectie. Eerdere studies zonder deze rok resulteerden in vroegtijdige infectie en voortijdige beëindiging van het experiment. Ten slotte is dit implantaatsysteem compact en multi-gekanaliseerd, waardoor effectieve gegevensverwerving mogelijk is van talrijke neuromusculaire structuren in diermodellen van verschillende grootte.
Deze technische aanpak is aangepast en succesvol vertaald naar een rattenmodel. Deze studie werd ontworpen om het effect van elektrische conditionering bij het voorkomen van tong spieratrofie en disfunctie in de veroudering rat te onderzoeken. De hypoglossal zenuwen werden geïmplanteerd met de manchet elektroden voor conditionering en de tong geïmplanteerd met de EMG opname elektroden28. Deze technologie kan ook worden gebruikt in andere onderzoekstoepassingen. Als een uitbreiding van het huidige protocol in het hondenstrottenhoofd, de effecten van elektrische conditionering op het bevorderen van selectieve reinnervation worden momenteel bestudeerd in konijnen gezichtsspieren. Deze studie kan een basis vormen voor de preventie van gezichtssynkinese bij patiënten met Bell's parese, een veel voorkomende en slopende medische aandoening. Een laatste potentieel gebruik van deze technologie is het stimuleren en registreren van wakkere, vrij bewegende dieren. Op dit moment zijn dergelijke gegevens verkregen via externe kabel van wakkere, ongebreidelde ratten28. In de toekomst kan dit economische systeem ook worden gecombineerd met externe opnamestimulatietechnologie (bijvoorbeeld telemetrie) om neuromusculaire systemen draadloos te activeren of te sonteren.
Disclosures
Dr. David Zealear is de marketing van deze implanteerbare, zenuwstimulatie-EMG technologie voor een verscheidenheid van neuromusculaire systemen en dierlijke modellen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Hongmei Wu voor haar bijdrage aan de verzorging van dieren en het verzamelen van gegevens tijdens het onderzoek. Wij danken Amy Nunnally, Jamie Adcock, en Phil Williams voor hun hulp met steriele operaties. De expertise en toewijding van het personeel van de Vanderbilt University Animal Care Facility was van onschatbare waarde. Dit onderzoek werd ondersteund door NIH grant U01DC016033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305175 | |
| 23 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305145 | |
| 25 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305125 | |
| 3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL | Ethicon | J219H | |
| 3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8684G | |
| 4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8871H | |
| 6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene | Ethicon | 8805 | |
| 7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | M8735 | |
| Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98% | ACROS | code 194790100 | for dilution of modical adhesive silicone |
| Bone cement | Zimmer | 1102-16 | 20g powder 10 mL liquid |
| Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1 mLl) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd | 12496-0757-1 | |
| CCD video camera attached to the endoscope | Sony | MCC500MD | |
| Cefpodoxime (Simplicef 100 mg tablets) | Zoetis | 5228 | |
| Data acquisition device , PowerLab 16/35 | ADInstruments, Inc | 5761-E | |
| Deep-brain stimulation (DBS) electrodes | Abbott | 6172ANS | |
| Digital oscilloscope | Tektronix | DPO71304SX | |
| Implantable pulse generator (IPG), Infinity | Abbott | 6660ANS | |
| Knitted polyester graft | Meadox Medical Inc | 92220 | 20 mm in diameter |
| Medical Grade Polyethylene Micro Tubing | Amazon.com | BB31695-PE/13-10 | OD 0.156", ID 0.094" |
| Metal female pin | Allied Electronics & Automation | 220-S02-100 | |
| Metal male pin | CDM electronics | 220-p02-1 | |
| Prefabricated coiled leads | Medical innovations Inc. | ||
| Silastic Laboratory Tubing | Cole-Parmer | 2415569 | OD 0.125", ID 0.062" |
| Silastic Medical Adhesive Silicone | Dow corning | Type A, 2 oz | |
| Stainless steel monofilament wire | The Harris Products Group | type 316 | 0.008" (coated), 0.005" (bare) |
| Sterile Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Sklar Instruments | 96-1146 | |
| Strip connector | CDM electronics | 2.6 x 11.6 x 101.5 mm | single row, round, through hole |
| Teflon-coated multi-filament stainless steel wire | Medwire | Part 316, ss7/44T | |
| Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol - 5 mL | Zoetis | 004866 | |
| Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan - 1 Gallon | Zoetis | 540561 | |
| Zero-degree rigid endoscope | Karl Storz | 8712AA |
References
- Wikipedia contributors. Electromyography. Wikipedia, The Free Encyclopedia. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Electromyography (2019).
- Zealear, D. L., et al. Stimulation of denervated muscle promotes selective reinnervation, prevents synkinesis, and restores function. The Laryngoscope. 124 (5), 180-187 (2014).
- Gaweł, M. Electrodiagnostics: MUNE and MUNIX as methods of estimating the number of motor units - biomarkers in lower motor neurone disease. Neurologia i neurochirurgia polska. 53 (4), 251-257 (2019).
- Foerster, G., Mueller, A. H. Laryngeal EMG: Preferential damage of the posterior cricoarytenoid muscle branches especially in iatrogenic recurrent laryngeal nerve lesions. Laryngoscope. 128 (5), 1152-1156 (2018).
- Lin, R. J., Smith, L. J., Munin, M. C., Sridharan, S., Rosen, C. A. Innervation status in chronic vocal fold paralysis and implications for laryngeal reinnervation. Laryngoscope. 128 (7), 1628-1633 (2018).
- Koh, T. J., Leonard, T. R. An implantable electrical interface for in vivo studies of the neuromuscular system. Journal of Neuroscience Methods. 70 (1), 27-32 (1996).
- Grimonprez, A., et al. A Preclinical Study of Laryngeal Motor-Evoked Potentials as a Marker Vagus Nerve Activation. International Journal of Neural Systems. 25 (8), 1550034 (2015).
- Haidar, Y. M., et al. Selective recurrent laryngeal nerve stimulation using a penetrating electrode array in the feline model. The Laryngoscope. 128 (7), 1606-1614 (2018).
- Kneisz, L., Unger, E., Lanmüller, H., Mayr, W. In Vitro Testing of an Implantable Wireless Telemetry System for Long-Term Electromyography Recordings in Large Animals. Artificial Organs. 39 (10), 897-902 (2015).
- Inzelberg, L., Rand, D., Steinberg, S., David-Pur, M., Hanein, Y. A Wearable High-Resolution Facial Electromyography for Long Term Recordings in Freely Behaving Humans. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Horn, K. M., Pong, M., Batni, S. R., Levy, S. M., Gibson, A. R. Functional specialization within the cat red nucleus. Journal of Neurophysiology. 87 (1), 469-477 (2002).
- Larson, C. R., Kistler, M. K. The relationship of periaqueductal gray neurons to vocalization and laryngeal EMG in the behaving monkey. Experimental Brain Research. 63 (3), 596-606 (1986).
- Zealear, D., Larson, C. A Microelectrode Study of Laryngeal Motoneurons in the Nucleus Ambiguus of the Awake Vocalizing Monkey. Vocal Fold Physiology Volume. 2, 229-238 (1988).
- Zealear, D. L., Billante, C. R.
- Zealear, D. L., et al. Electrical Stimulation of a Denervated Muscle Promotes Selective Reinnervation by Native Over Foreign Motoneurons. Journal of Neurophysiology. 87 (4), 2195-2199 (2002).
- Insalaco, G., Kuna, S. T., Cibella, F., Villeponteaux, R. D. Thyroarytenoid muscle activity during hypoxia, hypercapnia, and voluntary hyperventilation in humans. Journal of Applied Physiology. 69 (1), 268-273 (1990).
- Ludlow, C. L., Van Pelt, F., Koda, J. Characteristics of Late Responses to Superior Laryngeal Nerve Stimulation in Humans. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (2), 127-134 (1992).
- Li, Y., et al. Comparison of Ventilation and Voice Outcomes between Unilateral Laryngeal Pacing and Unilateral Cordotomy for the Treatment of Bilateral Vocal Fold Paralysis. ORL. 75 (2), 68-73 (2013).
- Mueller, A. H. Laryngeal pacing for bilateral vocal fold immobility. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (6), 439-443 (2011).
- Crumley, R. L.
- Hydman, J., Mattsson, P. Collateral reinnervation by the superior laryngeal nerve after recurrent laryngeal nerve injury. Muscle & Nerve. 38 (4), 1280-1289 (2008).
- Marie, J. P., Navarre, I., Lerosey, Y., Magnier, P., Dehesdin, D., Andrieu Guitrancourt, J. Bilateral laryngeal movement disorder and synkinesia: value of botulism toxin. Apropos of a case. Rev Laryngol Otol Rhinol (Bord). 119 (4), 261-264 (1998).
- Zealear, D. L., Billante, C. R., Sant’anna, G. D., Courey, M. S., Netterville, J. L. Electrically stimulated glottal opening combined with adductor muscle botox blockade restores both ventilation and voice in a patient with bilateral laryngeal paralysis. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (6), 500-506 (2002).
- Zealear, D. L., et al. Reanimation of the paralyzed human larynx with an implantable electrical stimulation device. Laryngoscope. 113 (7), 1149-1156 (2003).
- Mueller, A. H., et al. Laryngeal pacing via an implantable stimulator for the rehabilitation of subjects suffering from bilateral vocal fold paralysis: A prospective first-in-human study. Laryngoscope. 126 (8), 1810-1816 (2016).
- Li, Y., Garrett, G., Zealear, D. Current Treatment Options for Bilateral Vocal Fold Paralysis: A State-of-the-Art Review. Clinical and Experimental Otorhinolaryngology. 10 (3), 203-212 (2017).
- Li, Y., Huang, S., Zealear, D. An implantable system for In Vivo chronic electromyographic study in the larynx. Muscle & Nerve. 55 (5), 706-714 (2017).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle & Nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
