Summary
Presentato qui è un protocollo per la produzione di un sistema impiantabile per la registrazione cronologica in vivo di potenziali elettromiografici evocati e spontanei. Il sistema viene applicato allo studio della reinnervazione dei muscoli lariangici in seguito a lesioni nervose.
Abstract
L'elettromiografia (EMG) misura la risposta muscolare alla stimolazione elettrica o all'attività spontanea delle unità motorie e svolge un ruolo importante nella valutazione della funzione neuromuscolare. La registrazione cronica dell'attività EMG che riflette lo stato di reinnervazione di un muscolo dopo lesioni nervose è stata limitata, a causa della natura invasiva delle tecniche di registrazione EMG tradizionali. A questo proposito, un sistema impiantabile è progettato per la registrazione EMG a lungo termine in vivo e la stimolazione nervosa. È stato applicato e testato in uno studio sulla reinnervazione dei muscoli larngei. Questo sistema è costituito da 1) due polsini nervosi elettrodi bipolari e porta per stimolare ciascuno dei due nervi: il nervo lacrimale ricorrente (RLN) e il ramo interno del nervo lacrimale superiore (SLN); 2) due elettrodi di registrazione EMG e cavi per ciascuno dei due muscoli lacrimali: muscolo cricoarytenoide posteriore (PCA) e cricoarytenoide tiroaryiteico-laterale (TA-LCA) complesso muscolare; e 3) un recipiente cutaneo che interfaccia tutti i terminali di piombo impiantati a un preamplificatore di registrazione esterno e stimolatore utilizzando un cavo di connessione. I cavi metallici sono rivestiti in teflon, multifilamento, tipo 316 acciaio inossidabile. Essi sono bobine e possono allungarsi durante il movimento del corpo dell'animale sveglio per prevenire la rottura di piombo e la migrazione degli elettrodi. Questo sistema viene impiantato durante un intervento chirurgico asettico. Successivamente, le registrazioni EMG di base vengono eseguite prima che il RLN venga transected nel secondo intervento chirurgico per studiare la reinnervazione muscolare. Durante lo studio, vengono condotte più sessioni fisiologiche nell'animale anestesizzato per ottenere un'attività EMG evocata e spontanea che riflette lo stato di reinnervazione dei muscoli lagrassi. Il sistema è compatto, privo di infezioni nel corso dello studio e altamente durevole. Questo sistema impiantabile può fornire una piattaforma affidabile per la ricerca in cui è necessaria la registrazione a lungo termine o la stimolazione nervosa in un animale anestesizzato o liberamente in movimento.
Introduction
La registrazione EMG è una tecnica utile per misurare l'attività elettrica prodotta da un muscolo scheletrico quando attivata dalla stimolazione elettrica del suo nervo o dalla cottura spontanea delle sue unità motorie. Il monitoraggio dei segnali EMG può essere utilizzato per la valutazione della trasmissione neuromuscolare e della biomeccanica muscolare1. La registrazione EMG svolge anche un ruolo importante nel caratterizzare la qualità e la grandezza della reinnervazione muscolare dopo lesioni nervose2,3,4,5.5 Tuttavia, più registrazioni EMG durante l'intero periodo di reinnervation non possono essere raggiunte con un approccio invasivo. Pertanto, i dispositivi impiantabili sono stati progettati e sviluppati per la stimolazione e la registrazione cronica ripetute e croniche nei sistemineuromuscolari 6,7,8,9,10,11,12,13. Lo scopo di questo documento è descrivere un protocollo per la produzione e l'impianto di un sistema stabile per ottenere dati EMG cronologici affidabili dalla larynx.
Questo sistema viene applicato qui allo studio della reinnervazione muscolare lassongeale. Viene fornita una breve panoramica della larynx per l'orientamento (Figura 1). Una coordinazione precisa tra componenti sensoriali e motori è essenziale per un corretto movimento muscolare durante la respirazione, la voce e la protezione delle vie aeree. Il muscolo PCA, situato nella laricenben, è l'unico adduttore della piega vocale. Questo muscolo viene attivato spontaneamente durante l'ispirazione per aumentare l'area glottale per l'inalazione. Il complesso TA-LCA è il principale adduttore della piega vocale. L'attivazione di questo complesso muscolare insieme a un altro adduttore (cioè il muscolo interarytenoide) medializza la piega per la produzione di vibrazioni e suoni e chiude la piega per la protezione delle vie aeree durante la deglutizione.
Inoltre, le fibre del motoneurone innervano sia i muscoli del rapitore che dell'adduttore nella RLN. I muscoli del rapitore e dell'adduttore possono essere distinti in base alla composizione dell'unità motoria14,15. Il muscolo PCA mostra un aumento della cottura durante le condizioni ipercapniche e/o ipossiche16 a causa della presenza di unità motorie ispiratrici. Al contrario, le unità motorie di chiusura glottica riflesso (RGC), che chiudono la glottide in modo riflessivo attraverso l'attivazione di recettori sensoriali all'interno della mucosa lacrimale, sono presenti nel complesso muscolare TA-LCA. Il ramo interno del nervo larifica superiore (SLN) trasporta le fibre afferenti dei recettori sensoriali nella larynx17. Anche se la voce è principalmente una funzione adduttrice, sia le unità motorie dell'adduttore che dell'adduttore sono coinvolte in questo comportamento lacrimale altamente evoluto.
Figura 1: Anatomia della lassocia. Vengono visualizzati anche i componenti di questo sistema impiantabile. SLN - nervo lastare superiore; RLN - nervo laryngeale ricorrente; PCA - muscolo cricoarytenoide TA-LCA - complesso muscolare cricoarytenoideo-laterale della tiroarytenoia; DBS - stimolazione cerebrale profonda. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso di Wiley27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Lesioni alla RLN possono provocare paralisi di piega vocale (VFP), che compromette sia le funzioni di rapimento e addducting a causa di denervazione muscolare largrefica14,18,19. Successivamente, si verifica comunemente la rigenerazione delle fibre nervose RLN e la reinnervazione dei muscoli. Tuttavia, la riinnervazione è un processo casuale e si traduce in un'inappropriata riconnessione muscolare errata nella maggior parte dei casi. Questo è indicato come sicinesi, in cui l'attivazione spontanea di adduttori e antagonisti adduttori è difettosa e produce movimento inefficace o addirittura paradossale delle pieghe vocali14,19,20,21. Con la sicinesi, la funzione critica che si perde è il rapimento di piegatura vocale, con conseguente ventilazione inadeguata. Anche se ci sono tentativi in corso di trattare la silecinesi laringea da 1) bloccando la chiusura galitica con Botox22,23 o 2) stimolando elettricamente l'apertura glottica con un pacemaker impiantabile24,25, non vi è alcun intervento clinico che previene in modo affidabile la sinosi26. Tuttavia, ci sono prove che l'elettricità condizionata del muscolo PCA durante la reinnervazione a bassa frequenza promuove un'adeguata riconnessione neuromuscolare e riduce al minimo la sinosi sinossi. Attualmente sono in corso studi per chiarire i meccanismi sottostanti2.
L'obiettivo di questo documento è descrivere un sistema impiantabile semplice e poco costoso per la stimolazione nervosa cronica e la registrazione EMG. Questo sistema può essere utilizzato per studiare gli effetti del condizionamento elettrico a bassa frequenza del muscolo PCA sulla specificità della sua successiva reinnervation. I segnali EMG ottenuti da questo sistema possono riflettere la qualità e la quantità di reinnervazione muscolare laringea nel tempo.
Protocol
Questo studio è stato approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di Vanderbilt ed è stato condotto in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Questo sistema comprende cinque componenti impiantabili e un cavo esterno.
1. Due polpe bipolari RLN Stimulus Electrode, ognuna con coppia di fili di piombo a bobina e pin terminali
- Utilizzare il filo in acciaio inossidabile in teflon, rivestito in teflon, di tipo 316 (con diametro isolato di 0,0078" o 0,198 mm) per ogni filo di piombo del bracciale. Tagliare una lunghezza di 70 cm di filo e coglierlo in una molla lunga 12 cm utilizzando un dispositivo di bobina o procurarsi cavi a bobina prefabbricati. Se necessario, allungare la molla per aumentarne la lunghezza per ogni sito dell'impianto. Lasciare le estremità dei cavi arrotolati direttamente a 3 mm e 10 mm di lunghezza e desituirli.
- Solder un pin femmina di rame placcato oro sull'estremità di 3 mm del piombo a bobina.
- Per preparare il bracciale nervoso, tagliare un segmento di 5 mm di tubo in silicone (OD - 0,156", ID - 0,094"; o OD - 3,96 mm, ID 2,39 mm) da un rotolo del tubo.
- Per inserire un piombo nel tubo, utilizzare un ago ipodermico da 25 G per perforare attraverso la parete del tubo 1,5 mm dall'estremità e fuori dal centro vicino alla parete interna. Riempire l'estremità di 10 mm del piombo nella punta dell'ago. Ritirare l'ago per depositare la porzione deinsulata nel tubo. Piegare indietro l'estremità del filo nudo all'esterno del tubo e ruotare sul piombo nel suo punto di ingresso nel tubo.
NOT: Utilizzare un microscopio operativo per eseguire questi passaggi. Una sonda può essere posizionata nel tubo per curvare il filo contro la parete interna. L'obiettivo è quello di posizionare la parte nuda del filo in modo che gli stimoli possano essere consegnati al nervo senza rischiare danni meccanici al nervo. - Inserire il secondo piombo 1,5 mm dall'estremità opposta del tubo utilizzando la stessa procedura. Allineare il punto di ingresso a quello del primo lead. Forare la parete con l'ago in modo che la parte nuda del filo si deposita vicino alla parete interna di fronte al primo piombo.
NOT: Guardando il tubo in basso, i due elettrodi di stimolo dovrebbero formare una forma a "V" di 45 gradi, che a cavallo del nervo una volta in posizione e assicurerà la consegna corrente attraverso il nervo dall'anodo al catodo. - Crea una fessura a forma di S nella parete del tubo di fronte ai punti di ingresso dell'elettrodo utilizzando un paio di forbici curve.
NOT: Le labbra a spirale del bracciale possono quindi essere aperte per collocare il nervo all'interno tra gli elettrodi durante l'intervento chirurgico. - Inserire una lunghezza di 6-0 monofilamento, sutura non assorbibile nella parete del polsino ad ogni estremità utilizzando un ago microchirurgico curvo per la chiusura finale del bracciale intorno al nervo.
- Applicare un gel di silicone di tipo un gel in silicone di grado medico per riassumere tutti i fili nudi esposti all'esterno del bracciale.
2. Due cuffie bipolari SLN Stimulus Electrode, ognuna con coppia di fili di piombo a bobina e pin terminali
- Assemblare il bracciale dell'elettrodo di stimolo SLN allo stesso modo del bracciale dell'elettrodo di stimolo RLN. Tuttavia, utilizzare il tubo di diametro più piccolo (OD - 0,125", ID - 0,062"; o OD - 3,18 mm, ID - 1,57 mm), perché il nervo ha un diametro minore.
3. Due elettrodi di registrazione EMG muscolari PCA, ciascuno con filo di piombo a bobina e Terminal Pin
- Assemblare un piombo arrotolato per l'elettrodo muscolare PCA come fatto al punto 1.1.
- Spuntare una spilla femminile sul piombo come fatto nel passaggio 1.2.
- Inserire l'estremità di 10 mm del piombo muscolare PCA nella punta di un elettrodo di stimolazione cerebrale profonda (DBS) utilizzando la stessa strategia per l'inserimento dell'ago-piombo in un bracciale (passaggio 1.4). Piegare l'estremità del piombo per formare un gancio e clip per fornire un totale di 5 mm lunghezza di registrazione.
NOT: In questa applicazione, il muscolo PCA e i suoi terminali nervosi reinnervanti sono esposti al condizionamento elettrico. Gli stimoli sono generati da un generatore di impulsi impiantabile (IPG) e consegnati al muscolo laideo attraverso un elettrodo DBS (Figura 1, insetto). Questo sistema è adattato dalla stimolazione cerebrale terapeutica (ad esempio, il morbo di Parkinson). L'elettrodo DBS verrà inserito in una tasca submuscolare e ancorato in posizione. Se la tecnologia per il condizionamento elettrico del muscolo non è necessaria, l'elettrodo PCA EMG può essere inserito direttamente nel muscolo e ancorato dal suo gancio.
4. Due TA-LCA Muscle Complex EMG Recording Electrodes, ognuno con Coiled Lead Wire e Terminal Pin
- Assemblare un piombo arrotolato per l'elettrodo muscolare TA-LCA come fatto al passaggio 1.1.
- Spuntare una spilla femminile sul piombo come fatto nel passaggio 1.2.
- Accisa un pezzo rettangolare di innesto di poliestere a maglia da 5 mm x 10 mm. Fare un buco al centro della mesh con un ago ipodermico 20 G. Introdurre l'estremità di 10 mm del piombo nel foro con altri 3 mm di bobina sporgenti oltre il foro. Apporre il piombo alla rete utilizzando 6-0 monofilamento, sutura non assorbibile.
NOT: Questo pezzo di rete verrà utilizzato per ancorare l'elettrodo che conduce alla cartilagine tiroidea sovrastante il complesso muscolare. - Piegare l'estremità del piombo per formare un gancio e clip per fornire un totale di 5 mm lunghezza di registrazione.
5. Ricetta della pelle per connessioni di interfacciamento tra elettrodi e apparecchiature esterne
- Utilizzare una singola fila connettore a strisce perno femminile per fare il recipiente. Tagliare due pezzi (ciascuno di 17,5 mm di lunghezza) dalla striscia, ciascuno contenente otto fori perno. In primo luogo, sgrossare le superfici esterne di ogni pezzo con carta vetrata, quindi incollarle insieme al fenolo in un cofano fumato per creare un connettore a doppia fila. Collocare il connettore in acqua a 60-80 gradi centigradi in un cofano di fumi per 30 min per consentire l'indurimento della colla.
NOT: Questo formato di assemblaggio a doppia fila fornirà comodità nell'assegnazione di fori per elettrodi sinistra contro lato destro. - Tagliare un pezzo di lunghezza di 25,6 mm dalla striscia per fare la piastra frontale del connettore (la porzione che sporgerà all'esterno del sito dell'impianto per l'ancoraggio della pelle). Tagliare un foro rettangolare di 5,4 mm x 17,4 mm al centro della piastra con un bisturi.
- Posizionare il connettore a doppia fila all'interno del foro rettangolare della piastra fino a quando non viene lavato con la superficie della piastra senza sporgenza. Se il connettore non rientra nel foro rettangolare della piastra, il foro può essere leggermente ingrandito con un file. Poiché i fori del connettore non sono simmetrici, inserire il bordo del connettore con i fori di diametro maggiore nella piastra frontale.
NOT: Di conseguenza, un perno femminile inserito nel bordo opposto del connettore con il foro di diametro più piccolo si blocca e si blocca in posizione. - Utilizzare il fenolo per incollare il connettore e la piastra facciale insieme. Collocare l'assemblaggio in acqua a 60-80 gradi centigradi in un cappuccio per fumi per 30 min per consentire l'indurimento della colla.
- Forare un foro di 1,3 mm ad ogni angolo della piastra frontale e su ogni lato della piastra frontale a metà strada dalle estremità per un totale di sei fori.
NOT: Questi fori saranno utilizzati per suturare il recipiente finale della pelle nel sito dell'impianto. - Tagliare un tubo di lunghezza di 15 mm di innesto di poliestere lavorato a maglia per circondare l'assieme sotto la piastra frontale, rendendo l'assemblaggio biocompatibile. Per fissare il tubo all'assieme, utilizzare un ago ipodermico per infilare fili di acciaio inossidabile attraverso la parete in tre posizioni equamente distanziate (ciascuna 3,8 mm di distanza) lungo la sua lunghezza.
- Posizionare tacche equidistanti in ogni angolo del connettore per ancorare i fili alla superficie dell'assieme. Ruotare le estremità di ogni filo con un paio di pinze per stringere il tubo all'assemblaggio per formare una gonna.
- Lasciare un segno permanente sulla macchia di poliestere ad un'estremità del recipiente.
NOT: Utilizzare questo segno per l'orientamento per identificare l'estremità rostrale del recipiente durante l'intervento chirurgico. Nella direzione rostrale a caudale, la seguente assegnazione di elettrodi pin per ciascuna delle due righe (lato sinistro e lato destro) dovrebbe essere la seguente: PCA EMG, TA-LCA EMG, buco vuoto, buco vuoto, anodo RLN, catodo RLN, anodo SLN e catodo SLN.
6. Cavo di collegamento esterno per la registrazione Preamplificatore e Stimolatore
NOT: Un cavo viene utilizzato per effettuare collegamenti tra il recipiente cutaneo impiantato e le apparecchiature esterne durante le sessioni di stimolazione nervosa-EMG (sezioni 8 e 10). È composto da 12 fili isolati che terminano con perni maschili da inserire nei perni femminili nel recipiente cutaneo. Questo cavo è costituito da due parti: un tappo di registrazione EMG e fili di stimolazione nervosa. Una spina di registrazione è necessaria per isolare i segnali EMG a bassa tensione da artefatti di stimolo ad alta tensione che irradiano da pin di stimolo. Per lo stesso motivo, due fori in ogni fila del recipiente cutaneo vengono lasciati liberi per separare i perni di registrazione dai perni di stimolazione.
- Per effettuare la spina di registrazione EMG, utilizzare un connettore a strisce maschile (stessa lunghezza e larghezza, ma la metà dell'altezza di un connettore femminile). Tagliarlo in due pezzi, ciascuno contenente solo due fori. Apporre i due pezzi utilizzando l'adesivo fenolo utilizzando lo stesso approccio per rendere il connettore a doppia fila nel recipiente cutaneo (passaggio 5.1). Prendere i quattro fili di registrazione EMG nel cavo e inserire i loro perni maschi terminali in ciascuno dei quattro fori fino a quando non si bloccano in posizione con le punte sporgenti oltre il bordo della striscia.
- Utilizzare cemento osseo per sigillare la parte superiore della spina per isolare le giunzioni wire-pin.
- Utilizzare i restanti otto fili nel cavo che terminano nei perni maschili per effettuare connessioni individuali ai polsini di stimolazione nervosa tramite i loro perni femminili.
7. Prima Chirurgia Dell'Impianto
- Ottieni un bambino di 1-2 anni, 20-25 kg canino di entrambi i sessi da una fattoria autorizzata. Acclimatare l'animale prima della chirurgia dell'impianto asettico. Autoclave tutte le attrezzature prima dell'intervento chirurgico. Trattenere il cibo per 10-12 h prima dell'intervento.
- Preparare l'animale per l'intervento chirurgico.
- Rasare la testa e il collo dell'animale e pulire la pelle con alcool e soluzione di scrub betadine. Anestetizzare l'animale mediante iniezione endovenosa di 2-4 mg/kg di tiletamina e zolazepam combinazione, seguita da 3% isoflurane in ossigeno attraverso l'intubazione.
- Posizionare l'animale su un tavolo operatorio con un pad di riscaldamento in posizione supina e drappeggiare chirurgicamente l'animale. Monitorare la frequenza cardiaca dell'animale, la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e la saturazione di ossigeno almeno ogni 15 min durante l'intervento chirurgico per garantire la stabilità fisiologica in un piano moderato di anestesia.
- Fare un'incisione del collo midline dalla tacca tiroidea al manubrio. Dissezionare la trachea libera dall'esofago ed esporre il bordo inferiore della cartilagine cricoide.
- Posizionare il bracciale di stimolo su ciascuna delle SLN bilaterali e RLN. Chiudere le labbra di ciascun bracciale utilizzando le suture chiuse.
- Fare una finestra della cartilagine con un punzone biopsia (4 mm di diametro) sulla superficie anteriore della cartilagine tiroidea su ogni lato. Esporre gli aspetti laterali di entrambi i complessi muscolari TA-LCA. Inserire gli elettrodi di registrazione EMG nei complessi muscolari TA-LCA utilizzando un ago da 23 G inserendo la barra nella punta dell'ago. Suturare il cerotto in poliestere elettrodo sulla cartilagine.
- Posizionare l'elettrodo DBS insieme all'elettrodo di registrazione EMG a filo-gancio compagno sotto il muscolo PCA su ciascun lato. Utilizzare un endoscopio per confermare che la stimolazione produce il rapimento di piega vocale per ogni canale. Ancorare gli elettrodi DBS alla cartilagine cricoide di 4-0 suture non assorbibili.
- Inserire tutti i cavi della stimolazione nervosa-EMG registrazione elettrodi nel recipiente attraverso i loro perni femminili. Premere i perni in fori con uno strumento di inserimento modellato da un emotoma. Sigillare la superficie inferiore del recipiente per isolare le giunzioni piombo-pin utilizzando cemento osseo.
- Dopo che il cemento si indurisce, posizionare il recipiente all'estremità rostrale dell'incisione mediana attraverso la pelle e suturarlo ai tessuti sottocutanei attraverso la sua gonna in poliestere. Fissare il bordo della pelle al recipiente da suture che passano attraverso i fori nella piastra.
NOT: Una mascella dell'emofuta ha una scissione finale che porta ad un foro di contro-lavandino. Il filo di piombo può essere posizionato attraverso la scissione nel foro e il contro-sink posizionato contro la testa del perno. La seconda mascella è posta sul lato opposto del recipiente. Spremere l'emotomatto preme il perno nel rispettivo foro del recipiente.
- Dopo che il cemento si indurisce, posizionare il recipiente all'estremità rostrale dell'incisione mediana attraverso la pelle e suturarlo ai tessuti sottocutanei attraverso la sua gonna in poliestere. Fissare il bordo della pelle al recipiente da suture che passano attraverso i fori nella piastra.
- Fare un'incisione sul collo sinistro per esporre il muscolo trapezio. Eseguire la dissezione per creare una tasca submuscolare per il posizionamento del generatore di impulsi impiantabile. Tunnel ogni DBS piombo sottocutaneo all'incisione del collo per l'inserimento nel IPG.
- Chiudere tutte le ferite chirurgiche con le suture. Monitorare l'animale da vicino fino al pieno recupero dall'intervento chirurgico.
- Fornire regolarmente analgesici postoperatorie (ad esempio, buprenorfina: 0,01–0,02 mg/kg) per un massimo di 48 h. Somministrato antibiotici (ad esempio, cefpodoxime: 10 mg/kg) oralmente all'animale per almeno 3 giorni. Casa l'animale da allora in seguito per tutto lo studio, e limitare l'esercizio per un periodo di 10 giorni per consentire la normale guarigione della ferita e la stabilizzazione del dispositivo impiantato.
NOT: Il recipiente cutaneo deve essere pulito quotidianamente con una soluzione antisettica compatibile con i tessuti. Inoltre, i perni maschili fittizi devono essere inseriti nei perni femminili del recipiente cutaneo regolarmente tranne durante le sessioni di registrazione EMG. Questa manovra eviterà l'accumulo di detriti nel recipiente, permetterà di stabilire connessioni efficaci con il cavo esterno e previene l'infezione.
8. Sessioni di registrazione EMG di stimolazione nervosa al basale
NOT: Eseguire queste sessioni 2x–3x dopo l'intervento chirurgico di impianto (sezione 7) e prima dell'intervento di transezione nervosa (sezione 9) per ottenere segnali EMG di base quando le RLN bilaterali sono intatte. Applicare il seguente protocollo durante una sessione di registrazione EMG di stimolazione nervosa standard (sezioni 8 e 10).
- Trattenere il cibo prima della procedura per 10-12 h. Anestetizzare l'animale con tiletamina e combinazione zolazepam (dose di carico iniziale 2-4 mg/kg mediante iniezione endovenosa, quindi mantenere con 0,4 mg/kg all'ora tramite una linea i.v.). Posizionare l'animale su un cuscinetto di riscaldamento in posizione supina e mantenere l'animale in un piano moderato di anestesia. Monitorare i segni vitali dell'animale durante la procedura come descritto al punto 7.2.
- Inserire un endoscopio rigido di grado zero con una videocamera CCD collegata attraverso un largoscopio per visualizzare il movimento di piegatura vocale a livello della glottide.
- Interfaccia il cavo esterno che si collega allo stimolatore di laboratorio e ai preamplificatori EMG al recipiente cutaneo tramite la spina e i perni. Collegare le uscite dei preamplificatori a un dispositivo di acquisizione dati e/o a un oscilloscopio per visualizzare, registrare e misurare i segnali EMG.
- Fornire stimoli (impulsi a onde quadrate, 0,1–0,5 ms di durata, ampiezza di 0,5-2,0 mA) alle RLN sinistra e destra, rispettivamente, per registrare le risposte EMG evocate da complessi TA-LCA bilaterali e muscoli PCA in ogni condizione.
- Fornire stimoli (impulsi a onde quadrate, 0,1–0,5 ms di durata, ampiezza di 0,5-2,0 mA) agli SLN sinistro e destro, rispettivamente, per registrare le risposte EMG evocate da complessi TA-LCA bilaterali e muscoli PCA in ogni condizione.
- Fornire CO2 mescolato con aria ambiente attraverso la bocca dell'animale per indurre ipercapnia e aumentare lo sforzo respiratorio dell'animale. Limitare l'esposizione a 1 min, durante il quale si verificherà il reclutamento massimo di unità motorie inspiratorie. Registrare le attività EMG spontanee di complessi TA-LCA e muscoli PCA in questa condizione ipercapnica.
- Monitorare l'animale fino al pieno recupero dall'anestesia e riportare l'animale alla struttura.
9. Seconda chirurgia per la transezione nervosa e Anastomosi
- Eseguire il secondo intervento chirurgico 10–14 giorni dopo il primo intervento chirurgico. Trattenere il cibo per 10-12 h prima dell'intervento chirurgico.
- Anestesizzare l'animale, drappeggiare e monitorare i segni vitali intraoperatori utilizzando la tecnica descritta nel passaggio 7.2.
- Rimuovere le suture e riaprire l'incisione della linea mediana per dissezione smussata quando possibile. Evitare danni all'impianto precedente durante la dissezione. Esporre le RLN bilaterali attraverso la dissezione. Isolare, transetto e anastomoizzare ogni nervo con 7-0 monofilamento, suture non assorbibili per indurre la paralisi lacrimale bilaterale.
- Irrigare l'incisione del collo con sterile saline e gentamicino antibiotico. Chiudere i tessuti muscolari e sottocutanei utilizzando suture assorbibili 3-0. Chiudere la pelle con 3-0 suture monofilamento non assorbibili.
- Monitorare attentamente l'animale fino al pieno recupero dall'intervento chirurgico.
- Fornire regolarmente analgesici (ad es. buprenorfina: 0,01–0,02 mg/kg) fino a 48 ore su postoperatorio. Dare antibiotici (ad esempio, cefpodoxime: 10 mg/kg) oralmente all'animale per almeno 3 giorni. Limitare l'animale dall'esercizio fisico per un periodo di 10 giorni per consentire la normale guarigione della ferita.
10. Sessioni di registrazione EMG di stimolazione nervosa a seguito di lesioni RLN bilaterali
- Eseguire queste sessioni 1x a settimana durante i primi 3 mesi, quindi bisettimanale in seguito. Seguire il protocollo descritto nella sezione 8 per queste sessioni.
Representative Results
Esempi dei componenti sono illustrati nella Figura 2. Da sinistra a destra nella Figura 2A sono rispettivamente il bracciale per lo stimolo nervoso, l'elettrodo di registrazione TA-LCA, l'elettrodo di registrazione PCA e il recipiente dell'interfaccia cutanea. La dimensione relativa di questi componenti può essere apprezzata. Il recipiente cutaneo (Figura 2B) ha due file di fori in cui vengono inseriti i perni femminili alla fine di ogni filo a catena (Figura 2D). Essi sono inseriti di fronte alla piastra facciale (freccia) durante l'intervento di impianto. Il recipiente ha una gonna in poliestere (Figura 2C) attaccata alle sue pareti laterali del connettore. Questa gonna è progettata per ancorare il recipiente in posizione da infiltrazioni di tessuto connettivo. Ogni piombo EMG in acciaio inossidabile rivestito in Teflon (Figura 2E) viene deinisolateed (5 mm) sulla punta per formare un elettrodo a forma di gancio per la registrazione muscolare. Il bracciale di stimolazione ha due elettrodi filettati contro la parete interna del polsino. Essi sono separati da una distanza di 2 mm (Figura 2F) e formano una forma "V" (Figura 2G) per garantire la consegna corrente attraverso il nervo.
Figura 2: Componenti del sistema implantare. (A) Da sinistra a destra si registrano rispettivamente il bracciale per lo stimolo nervoso, l'elettrodo di registrazione TA-LCA, l'elettrodo di registrazione PCA e il recipiente dell'interfaccia cutanea. (B) Il recipiente cutaneo che mostra due file di fori. (C) Il recipiente che mostra una gonna in poliestere attaccato alle sue pareti laterali del connettore. (D) Il filo coilizzato contenente perni femminili da inserire in B. (E) Il piombo EMG in acciaio inossidabile rivestito in teflon è deinisolateed (5 mm) sulla punta per formare un elettrodo a forma di gancio per la registrazione muscolare. (F) Il bracciale di stimolazione ha due elettrodi filettati contro la parete interna del polsino, separati da 2 mm. (G) forma "V" della formazione di elettrodi per garantire la consegna corrente attraverso il nervo. Questa cifra è stata modificata con il permesso27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La figura 3 mostra il recipiente cutaneo impiantato e come il cavo proveniente da apparecchiature esterne è interfacciato ai recipienti. Va notato che i perni maschili fittizi (non mostrati) vengono inseriti nei perni femminili del recipiente per tenerli liberi da detriti tra le sessioni di registrazione.
Figura 3: Recipiente cutaneo e cavo di interfaccia. (A) Viene mostrato il recipiente della pelle impiantato sul collo anteriore senza perni maschili fittizi. (B) L'immagine mostra come i pin di stimolo e la spina di registrazione EMG (freccia) del cavo da apparecchiature esterne si interfacciano al recipiente durante una sessione di registrazione EMG di stimolazione nervosa. Questa cifra è stata modificata con il permesso27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 Mostra una registrazione EMG da una delle sessioni di base con le RLN intatte.
Figura 4: Registrazioni EMG da muscoli laici con innervazione normale. (A) Esempio di registrazione dal muscolo PCA in cui la stimolazione RLN produce un artefatto di stimolo (freccia) seguito da un grande potenziale EMG evocato. (B) Esempio di registrazione del complesso muscolare TA-LCA, in cui la stimolazione SLN produce un artefatto di stimolo (freccia). Qui è rappresentato (un) una risposta muscolare monossinaptica a bassa latenza e (b) una risposta RGC polissinaptica a latenza più lunga. (C) Esplosioni (frecce) di attività EMG spontanea registrata dal muscolo PCA durante le normali ispirazioni. (D) Aumento dell'attività eMG inspiratoria nel corso della consegna di CO2. Questa cifra è stata modificata con il permesso27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
In una registrazione dal muscolo PCA (Figura 4A), la stimolazione RLN produce un artefatto di stimolo (freccia) seguito da un grande potenziale EMG evocato. Le risposte massime evocate da RLN forniscono un buon indice della grandezza complessiva dell'innervazione normale e del livello di reinnervazione dopo la successiva neurorrhaphy, indipendentemente dal tipo di unità motoria. Questo è vero perché il RLN contiene fibre nervose di unità motorie di chiusura glottica riflessiva e riflessa (RGC). La stimolazione RLN recluta entrambi i tipi di unità. L'attività evocata dell'unità motoria EMG viene rettificata e integrata in un periodo di tempo di 20 ms per ottenere una misura quantitativa dell'innervazione muscolare.
In una registrazione dal complesso muscolare TA-LCA (Figura 4B), la stimolazione SLN produce un artefatto di stimolo (freccia). Questo artefatto è seguito da una risposta muscolare monossinaptica a breve latenza (a) e risposta RGC polissinaptica a latenza più lunga (b). Il potenziale (a) è una risposta diretta dal muscolo cricotiroide, perché questo muscolo è innervato dal ramo esterno vicino del SLN. L'attivazione randagio di questo ramo si verifica comunemente durante la stimolazione del bracciale nervoso del ramo interno per attivare la risposta RGC. Il potenziale cricotiroide è registrato dall'elettrodo TA-LCA, in quanto questo muscolo si trova vicino al complesso. Studi precedenti hanno dimostrato che il potenziale cricotiroide evocato dalla stimolazione interna del ramo può essere abolito selettivamente sezionando il ramo esterno del SLN (Osservazioni inedite). Le risposte EMG massime evocate da SLN riflettono la grandezza dell'innervazione naturale del complesso TA-LCA attraverso il suo percorso sensoriale-motorio RGC. Prima di RLN neurorrhaphy, non c'è nessun innervazione RGC del muscolo PCA, quindi nessun potenziale SLN dovrebbe essere rilevato da questo muscolo. A seguito della transezione e riparazione del nervo, i potenziali evocati da SLN riflettono la quantità di corretta reinnervazione RGC del complesso TA-LCA e la reinnervazione errata di RGC del muscolo PCA. L'attività RGC è quantificata dalla rettifica e dall'integrazione in un periodo di tempo di 20 ms per catturare l'intera forma d'onda RGC.
In (Figura 4C), le esplosioni (frecce) di attività EMG spontanea vengono registrate dal muscolo PCA durante le normali ispirazioni. Questa attività EMG inspiratoria aumenta nel corso della consegna di CO2, come mostrato nellaFigura 4D) a una velocità di sweep più lenta. L'attività spontanea di PCA EMG fornisce una buona stima della grandezza della normale innervazione di questo muscolo dai suoi motoneuroni inspiratori originali. Non c'è annotatore il complesso TA-LCA, quindi non devono essere rilevati potenziali inspiratori da questi muscoli. Questo perché solo le unità motorie ispiratrici sono coinvolte nel rapimento della piega vocale al massimo sforzo inspiratorio nell'animale anestesizzato. A seguito della transezione e riparazione del nervo, i potenziali inspiratori spontanei riflettono la grandezza della corretta reinnervazione del muscolo PCA e la grandezza di una reinnervazione errata del complesso TA-LCA. Le registrazioni dell'attività EMG inspiratoria vengono amplificate, rettificate e integrate in un periodo di tempo di 8 s.
Discussion
Questo documento descrive i passi necessari nella produzione di un nuovo sistema, economico e impiantabile per la stimolazione dei nervi laici e la registrazione delle risposte EMG dai muscoli laici a lungo termine. Il protocollo è semplice e può produrre un impianto abbastanza compatto da essere utilizzato in un animale piccolo come un ratto. Ci sono diversi passaggi critici che dovrebbero essere sottolineati. In primo luogo, i fili di piombo devono essere avallati con attenzione e uniformemente per evitare il de-isolamento del piombo, la piegatura o la rottura. Se non è disponibile una macchina di aculatura, è possibile ottenere cavi a bobina prefabbricati in commercio. In secondo luogo, la strategia di inserire fili di piombo in un tubo di silicone per formare una "V" che attraversa il nervo è fondamentale per promuovere la consegna corrente attraverso il nervo all'interno del bracciale. Se entrambi i cavi sono posizionati sullo stesso lato del tubo, può verificarsi uno spegnimento della corrente tra gli elettrodi. È anche importante che i cavi siano posizionati contro la parete interna del tubo per evitare la possibilità di lesione fetta al nervo.
In terzo luogo, durante l'intervento di impianto, i nervi laici devono essere sezionati con attenzione per prevenire danni. Nella fase successiva dell'impianto, quando si inseriscono i perni nel recipiente, la forza deve essere applicata al perno in allineamento al suo foro per evitare una flessione improvvisa della testa del perno. Successivamente, il cemento osseo deve essere distribuito accuratamente sul fondo del recipiente per un completo isolamento e la prevenzione del crosstalk tra i canali. Infine, la prevenzione dell'infezione è fondamentale per garantire l'integrità del sistema implantare nel tempo. Può essere raggiunto da una combinazione di diverse manovre: l'aggiunta di una gonna al recipiente, la somministrazione di antibiotici, la pulizia quotidiana della ferita e del recipiente con soluzione antisettica compatibile con i tessuti e il posizionamento dei perni maschili fittizi nei perni femminili del recipiente per tenerli puliti dai detriti tra le sessioni.
Il protocollo si è dimostrato di successo in questo modello laricanea cane. Tuttavia, alcune modifiche o strategie alternative possono essere prese in considerazione per altre applicazioni. Ad esempio, le punte di rilevamento deisolateed degli elettrodi PCA e TA-LCA EMG sono ancorate nei muscoli da un mezzo esterno: l'innesto in poliestere o l'elettrodo DBS. In un'applicazione in cui l'ancoraggio esterno non è necessario o eseguito, la barra dell'elettrodo da sola può servire come ancoraggio. In tal caso, l'acciaio inossidabile in tflon, il filo monofilo può essere preferibile al filo multifilament in considerazione della sua maggiore forza di tensione, fornendo una barra più stabile nel tessuto. Tuttavia, va notato che i fili multifilamento possono essere meno inclini alla rottura. Una strategia alternativa alla fabbricazione e all'assemblaggio del recipiente cutaneo è la stampa 3D con polimeri biocompatibili (ad esempio, MED610 di Stratasys). Questo può semplificare il processo di produzione.
Dopo l'intervento di impianto e il recupero dell'animale, le sessioni fisiologiche sono condotte con le RLN ancora intatte per ottenere i dati di base. Durante una sessione, l'assenza di segnali EMG da un muscolo laideo può verificarsi dopo la stimolazione RLN. Per risolvere la causa (Tabella 1), è necessario innanzitutto determinare se è presente il movimento della piega vocale. Se è presente, questo significa che il nervo è effettivamente attivato dal bracciale, ma c'è un problema con il piombo EMG. In questo caso, gli utenti devono esaminare ulteriormente l'elemento di stimolo EMG. Se l'elemento EMG è assente, è probabile che vi sia una discontinuità nell'input EMG per il preamplificatore. Sarà presente anche un rumore a sessanta cicli e grande ampiezza. Se il manufatto è di grandi dimensioni, lo smistamento da un perno di stimolo al perno di registrazione può essere responsabile della saturazione del preamplificatore di canale e dell'anittinare la risposta EMG. Se l'artefatto è normale, il piombo EMG è probabilmente dislocato dal muscolo e non è in grado di rilevare la sua attività. D'altra parte, se il movimento di piegatura vocale è assente, il nervo non viene attivato. Se il manufatto è assente, ci può essere una discontinuità nel circuito di stimolazione, impedendo l'attivazione del nervo. Se l'artefatto sembra normale, il nervo potrebbe essere stato ferito durante l'intervento chirurgico all'impianto o il bracciale potrebbe essere migrato dal nervo. Una strategia simile può essere applicata per risolvere la causa dei segnali EMG assenti durante la stimolazione SLN.
| Nervo stimolato | Muscolo/i bersaglio | Movimento di piegatura vocale ipsilaterale | Artefatto di stimolo | Cause |
| Numero di proprietà del sistema | PCA e/o TA-LCA | Sì | Assente (rumore a 60 cicli presenti) | Discontinuità nell'ingresso EMG al preamplificatore (ad es. piombo, perno, cavo); |
| Grande | Cross-talk tra stim e perni di registrazione al recipiente | |||
| Normale | Dislocazione dell'elettrodo EMG | |||
| No | Assente | Discontinuità nel circuito di stimolazione | ||
| Normale | 1. lesione RLN; 2. Dislocazione del bracciale | |||
| SLN (SLN) | TA-LCA | Sì | Assente (rumore a 60 cicli presenti) | Discontinuità nell'ingresso EMG al preamplificatore (ad es. piombo, perno, cavo); |
| Grande | Cross-talk tra stim e perni di registrazione al recipiente | |||
| Normale | Dislocazione dell'elettrodo EMG | |||
| No | Assente | Discontinuità nel circuito di stimolazione | ||
| Normale | 1. Lesioni SLN o RLN; 2. Dislocazione del bracciale |
Tabella 1: Guida alla risoluzione dei problemi.
Va ricordato che ci sono due limitazioni minori nell'attuale applicazione di questa tecnologia. In primo luogo, la flessione improvvisa del perno femminile durante l'inserimento nel recipiente si è verificata in diversi casi. Fortunatamente, i perni possono essere raddrizzati e inseriti con successo nei loro fori. Se il danno del perno è irreparabile, il piombo e l'intero componente devono essere sostituiti. Pertanto, i componenti di backup devono essere prontamente disponibili prima dell'intervento chirurgico. In secondo luogo, il tempo necessario per completare l'impianto chirurgico è lungo (10 h). La lunga durata riflette parzialmente il gran numero di componenti di stimolazione e ricodifica necessari per questo studio: quattro nervi, quattro muscoli, un recipiente e un IPG. Se si richiede un minor numero di componenti utilizzando questa tecnologia, il tempo di impianto dovrebbe essere significativamente ridotto (ad esempio, il modello di lingua del ratto28).
Questo approccio tecnologico introduce diverse funzionalità che hanno un vantaggio rispetto ai metodi esistenti. L'accologgiamento dei fili di piombo è la caratteristica più nuova e importante di questo sistema. I cavi in bobina non sono comunemente disponibili per la sperimentazione animale non commerciale, nonostante i numerosi vantaggi che forniscono. Un piombo a bobina può essere espanso alla lunghezza desiderata durante l'impianto. Inoltre, si allungherà nel risveglio, spostando l'animale per prevenire la dislocazione della punta dell'elettrodo o la rottura del filo dopo l'impianto. Questa caratteristica garantisce la longevità dell'impianto e la stimolazione nervosa stabile e la registrazione muscolare a lungo termine. Inoltre, l'aggiunta di una gonna compatibile con il tessuto intorno al recipiente previene l'esposizione della ferita a questo corpo estraneo e promuove la fibrosi normale e la guarigione della ferita in assenza di infezione. Studi precedenti senza questa gonna hanno provocato un'infezione precoce e terminazioni premature dell'esperimento. Infine, questo sistema di impianto è compatto e multicanale, consentendo un'efficace acquisizione dei dati da numerose strutture neuromuscolari in modelli animali di varie dimensioni.
Questo approccio tecnico è stato adattato e tradotto con successo in un modello di ratto. Questo studio è stato progettato per studiare l'effetto del condizionamento elettrico nella prevenzione dell'atrofia muscolare della lingua e della disfunzione nel ratto di invecchiamento. I nervi ipoglossali sono stati impiantati con gli elettrodi del polsino per il condizionamento e la lingua impiantata con gli elettrodi di registrazione EMG28. Questa tecnologia può essere utilizzata anche in altre applicazioni di ricerca. Come estensione dell'attuale protocollo nella laricenx canina, gli effetti dell'elettrico condizionamento sulla promozione della reinnervazione selettiva sono attualmente allo studio nei muscoli facciali del coniglio. Questo studio può fornire una base per la prevenzione della sinersi facciale in pazienti con paralisi di Bell, una condizione medica comune e debilitante. Un potenziale uso finale di questa tecnologia è quello di stimolare e registrare da svegli, animali liberamente in movimento. Attualmente, tali dati sono stati ottenuti tramite cavo esterno da ratti svegli e sfrenati28. In futuro, questo sistema economico può anche essere combinato con la tecnologia di stimolazione della registrazione remota (ad esempio, telemetria) per attivare o sondare i sistemi neuromuscolari in modalità wireless.
Disclosures
Il Dr. David Ealear sta commercializzando questa tecnologia EMG di stimolazione nervosa impiantabile per una varietà di sistemi neuromuscolari e modelli animali.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la Dott.ssa Hongmei Wu per il suo contributo alla cura degli animali e alla raccolta dei dati durante tutto lo studio. Ringraziamo Amy Nunnally, Jamie Adcock e Phil Williams per il loro aiuto con interventi chirurgici sterili. L'esperienza e la dedizione del personale del Vanderbilt University Animal Care Facility è stata inestimabile. Questa ricerca è stata supportata dalla sovvenzione NIH U01DC016033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305175 | |
| 23 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305145 | |
| 25 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305125 | |
| 3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL | Ethicon | J219H | |
| 3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8684G | |
| 4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8871H | |
| 6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene | Ethicon | 8805 | |
| 7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | M8735 | |
| Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98% | ACROS | code 194790100 | for dilution of modical adhesive silicone |
| Bone cement | Zimmer | 1102-16 | 20g powder 10 mL liquid |
| Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1 mLl) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd | 12496-0757-1 | |
| CCD video camera attached to the endoscope | Sony | MCC500MD | |
| Cefpodoxime (Simplicef 100 mg tablets) | Zoetis | 5228 | |
| Data acquisition device , PowerLab 16/35 | ADInstruments, Inc | 5761-E | |
| Deep-brain stimulation (DBS) electrodes | Abbott | 6172ANS | |
| Digital oscilloscope | Tektronix | DPO71304SX | |
| Implantable pulse generator (IPG), Infinity | Abbott | 6660ANS | |
| Knitted polyester graft | Meadox Medical Inc | 92220 | 20 mm in diameter |
| Medical Grade Polyethylene Micro Tubing | Amazon.com | BB31695-PE/13-10 | OD 0.156", ID 0.094" |
| Metal female pin | Allied Electronics & Automation | 220-S02-100 | |
| Metal male pin | CDM electronics | 220-p02-1 | |
| Prefabricated coiled leads | Medical innovations Inc. | ||
| Silastic Laboratory Tubing | Cole-Parmer | 2415569 | OD 0.125", ID 0.062" |
| Silastic Medical Adhesive Silicone | Dow corning | Type A, 2 oz | |
| Stainless steel monofilament wire | The Harris Products Group | type 316 | 0.008" (coated), 0.005" (bare) |
| Sterile Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Sklar Instruments | 96-1146 | |
| Strip connector | CDM electronics | 2.6 x 11.6 x 101.5 mm | single row, round, through hole |
| Teflon-coated multi-filament stainless steel wire | Medwire | Part 316, ss7/44T | |
| Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol - 5 mL | Zoetis | 004866 | |
| Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan - 1 Gallon | Zoetis | 540561 | |
| Zero-degree rigid endoscope | Karl Storz | 8712AA |
References
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