Presentert her er en protokoll for produksjon av et implanterbart system for in vivo kronologisk registrering av fremkalt og spontanelektromyografisk potensial. Systemet brukes på undersøkelse av reinnervation av strupemuskulaturen etter nerveskade.
Elektromyografi (EMG) måler muskelresponsen på elektrisk stimulering eller spontan aktivitet av motorenheter og spiller en viktig rolle i vurderingen av nevromuskulær funksjon. Kronisk registrering av EMG-aktivitet som gjenspeiler en muskels reinnervation status etter nerveskade har vært begrenset, på grunn av den invasive naturen til tradisjonelle EMG opptaksteknikker. I denne forbindelse er et implanterbart system designet for langsiktig, in vivo EMG-opptak og nervestimulering. Det har blitt brukt og testet i en studie på reinnervation av strupemuskulaturen. Dette systemet består av 1) to bipolare elektrode nerve mansjetter og fører for å stimulere hver av to nerver: den tilbakevendende laryndeal nerve (RLN) og indre gren av overlegen laryngeal nerve (SLN); 2) to EMG opptak elektroder og fører for hver av de to laryngeal muskler: bakre cricoarytenoid (PCA) muskel og thyroarytenoid-lateral cricoarytenoid (TA-LCA) muskel kompleks; og 3) en hudbeholder som krysser alle implanterte blyterminaler til en ekstern opptaksforforsterker og stimulator ved hjelp av en tilkoblingskabel. Ledningsledningene er Teflon-belagt, multi-filament, type 316 rustfritt stål. De er kveilet og kan strekke seg under kroppsbevegelse av det våkne dyret for å forhindre blybrudd og elektrodemigrasjon. Dette systemet implanteres under en aseptisk kirurgi. Etterpå utføres Baseline EMG-opptak før RLN er transected i den andre operasjonen for å studere muskelreinnervation. Gjennom hele studien utføres flere fysiologiske økter i det bedøvede dyret for å oppnå fremkalt og spontan EMG-aktivitet som gjenspeiler reinnervation status av larynde muskler. Systemet er kompakt, uten infeksjon i løpet av studien, og svært holdbar. Dette implanterbare systemet kan gi en pålitelig plattform for forskning der langsiktig opptak eller nervestimulering er nødvendig i et bedøvet eller fritt bevegelig dyr.
EMG-opptak er en nyttig teknikk for måling av elektrisk aktivitet produsert av en skjelettmuskulatur når den aktiveres ved elektrisk stimulering av nerve eller spontan avfyring av motorenhetene. Overvåking Av EMG-signaler kan brukes til vurdering av nevromuskulær overføring og muskelbiomekanikk1. EMG-opptak spiller også en viktig rolle i å karakterisere kvaliteten og omfanget av muskelreinnervation etter nerveskade2,3,4,5. Flere EMG-opptak i hele perioden med reinnervation kan imidlertid ikke oppnås ved en invasiv tilnærming. Derfor er implanterbare enheter designet og utviklet for gjentatt, kronisk stimulering og opptak i nevromuskulære systemer6,,7,8,9,10,11,12,13. Målet med dette papiret er å beskrive en protokoll for produksjon og implantasjon av et stabilt system for å skaffe pålitelige kronologiske EMG-data fra strupehodet.
Dette systemet brukes her til studiet av laryngeal muskelreinnervation. En kort oversikt over strupehodet er gitt for orientering (Figur 1). En nøyaktig koordinering mellom sensoriske og motoriske komponenter er avgjørende for riktig muskelbevegelse under åndedrett, voicing og luftveisbeskyttelse. PCA-muskelen, som ligger i det bakre strupehodet, er den eneste bortføreren av vokalfolden. Denne muskelen aktiveres spontant under inspirasjon for å øke glottalområdet for innånding. TA-LCA-komplekset er den viktigste adductoren til vokalfolden. Aktivering av dette muskelkomplekset sammen med en annen adductor (dvs. interarytenoid muskel) medialize folden for vibrasjon og lydproduksjon og lukk folden for luftveisbeskyttelse under svelging.
I tillegg, motor neuron fibre innervate både abductor og adductor muskler i RLN. Bortføreren og adductor musklene kan skilles basert på motorenhet sammensetning14,15. PCA-muskelen viser økt avfyring under hyperkapnisk og/eller hypoksiske forhold16 på grunn av tilstedeværelsen av inspiratoriske motorenheter. Refleksglottisk lukking (RGC) motorenheter, som lukker glottisrefleksivt gjennom aktivering av sensoriske reseptorer i laryneal slimhinnen, er til stede i TA-LCA muskelkompleks. Den indre grenen av den overlegne laryngeal nerven (SLN) bærer de afferent fibrene av sensoriske reseptorer i strupehodet17. Selv om voicing er først og fremst en adductor funksjon, både abductor og adductor motor enheter er involvert i denne svært utviklet laryngeal atferd.
Figur 1: Anatomi av strupehodet. Komponentene i dette implanterbare systemet vises også. SLN = overlegen strupenerven; RLN = tilbakevendende laryndenerve; PCA = posterior cricoarytenoid muskel; TA-LCA = thyroarytenoid-lateral cricoarytenoid muskelkompleks; DBS = dyp hjernestimulering. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra Wiley27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Skade på RLN kan resultere i vokal fold lammelse (VFP), som kompromisser både bortføre og adducting funksjoner på grunn av laryngeal muskel denervation14,18,19. Deretter oppstår regenerering av RLN nervefibre og reinnervation av muskler vanligvis. Men, reinnervation er en tilfeldig prosess og resulterer i feilsendt, upassende muskel reconnection i de fleste tilfeller. Dette kalles synkinesis, der spontan aktivering av abductor og adductor antagonister er feil og produserer ineffektiv eller paradoksal bevegelse av vokalfolder14,19,20,21. Med synkinesis er den kritiske funksjonen som går tapt vokal fold bortføring, noe som resulterer i utilstrekkelig ventilasjon. Selv om det er pågående forsøk på å behandle laryngeal synkinesis ved enten 1) blokkerer glottisk lukking med Botox22,23 eller 2) elektrisk stimulere glottisk åpning med en implanterbar pacemaker24,25, det er ingen klinisk intervensjon som pålitelig hindrer synkinesis26. Det er imidlertid bevis for at elektrisk kondisjonering av PCA-muskelen under reinnervation ved lav frekvens fremmer passende nevromuskulær tilkobling og minimerer synkinesis fra å skje. Studier utføres for tiden for å belyse de underliggende mekanismene2.
Fokuset i dette papiret er å beskrive et enkelt og billig implanterbart system for kronisk nervestimulering og EMG-opptak. Dette systemet kan brukes til å undersøke effekten av lavfrekvent elektrisk kondisjonering av PCA muskel en spesifisitet av sin påfølgende reinnervation. EMG-signaler oppnådd av dette systemet kan gjenspeile kvaliteten og kvantiteten av laryngeal muskelreinnervation over tid.
Dette papiret beskriver trinnene som kreves i produksjonen av et nytt, økonomisk og implanterbart system for stimulering av strupenerver og registrering av EMG-svar fra strupemuskulatur på lang sikt. Protokollen er ukomplisert og kan produsere et implantat som er kompakt nok til å bli utnyttet i et dyr så lite som en rotte. Det er flere kritiske skritt som bør vektlegges. For det første bør blyledninger kveiles forsiktig og jevnt for å forhindre blyde-isolasjon, kinking eller brudd. Hvis en kveilemaskin ikke er tilgjengelig, kan prefabrikkerte kveilet ledninger fås kommersielt. For det andre er strategien om å sette inn blyledninger i et silikonrør for å danne en “V” som strekker seg over nerven, avgjørende for å fremme dagens levering gjennom nerven inne i mansjetten. Hvis begge ledningene er plassert på samme side av røret, kan det oppstå shunting av strøm mellom elektroder. Det er også viktig at ledningene er plassert mot rørindreveggen for å unngå muligheten for skiveskade på nerven.
Tredje, under implantasjonsoperasjonen, bør strupenervene dissekeres nøye for å forhindre skade. På det senere implantasjonsstadiet, når du setter pinner inn i beholderen, bør kraften påføres pinnen i justering til hullet for å forhindre plutselig bøyning av pinens hode. Deretter bør beinsement distribueres grundig på beholderbunnen for fullstendig isolasjon og forebygging av krysstilkog mellom kanaler. Til slutt er forebygging av infeksjon avgjørende for å sikre integriteten til implantatsystemet over tid. Det kan oppnås ved en kombinasjon av flere manøvrer: tillegg av et skjørt til beholderen, administrasjon av antibiotika, daglig rengjøring av såret og beholderen med vevskompatibel antiseptisk løsning, og plassering av dummy mannlige pinner i de kvinnelige pinnene på beholderen for å holde dem rene av rusk mellom øktene.
Protokollen har vist seg vellykket i denne hundestrupemodellen. Noen endringer eller alternative strategier kan imidlertid vurderes for andre applikasjoner. Deisolerte sensingsspissene til PCA- og TA-LCA EMG-elektrodene er for eksempel forankret i musklene med et eksternt middel – enten polyestertransplantatet eller DBS-elektroden. I et program der ekstern forankring ikke er nødvendig eller utført, kan elektrodens barb alene tjene som anker. I et slikt tilfelle kan Teflon-belagt, rustfritt stål, monofilamenttråd være å foretrekke fremfor multifilamenttråd i lys av sin større strekkfasthet, noe som gir en barb som er mer stabil i vev. Det bør imidlertid bemerkes at multifilamentledninger kan være mindre utsatt for brudd. En alternativ strategi for fabrikasjon og montering av hudbeholderen er å 3D-print ved hjelp av biokompatible polymerer (f.eks. MED610 av Stratasys). Dette kan forenkle produksjonsprosessen.
Etter implantasjonskirurgi og gjenoppretting av dyret utføres fysiologiske økter med RLNene fortsatt intakt for å oppnå baselinedata. I løpet av en økt kan fravær av EMG-signaler fra en laryngeal muskel oppstå etter RLN-stimulering. For å feilsøke årsaken (Tabell 1),bør det først avgjøres om vokalfoldbevegelse er til stede. Hvis det er til stede, betyr dette at nerven effektivt aktiveres av mansjetten, men det er et problem med EMG-ledningen. I denne situasjonen bør brukerne videre se på EMG stimulus artefakten. Hvis EMG-artefakten er fraværende, er det sannsynligvis en diskontinuitet i EMG-inngangen til forforsterkeren. Seksti-syklus støy vil også være til stede og stor i amplitude. Hvis artefakten er stor, kan shunting fra en stimulanspin til opptakspinnen være ansvarlig for å mette kanalforforsterkeren og utslette EMG-responsen. Hvis artefakten er normal, har EMG-ledningen sannsynligvis forstuet seg fra muskelen og kan ikke oppdage aktiviteten. På den annen side, hvis vokalfoldbevegelsen er fraværende, blir ikke nerven aktivert. Hvis artefakten er fraværende, kan det være en diskontinuitet i stimuleringskretsen, og forhindrer nerveaktivering. Hvis artefakten ser normal ut, kan nerven ha blitt skadet under implantatkirurgi eller mansjetten kan ha migrert av nerven. En lignende strategi kan brukes for å feilsøke årsaken til fraværende EMG-signaler under SLN-stimulering.
Stimulert nerve | Målmuskler(er) | Ipsilateral vokal fold bevegelse | Stimulus artefakt | Årsaker |
RLN (andre er i seg selv | PCA og/eller TA-LCA | ja | Fraværende (60-syklus støy til stede) | Seponering i EMG-inngangen til forforsterkeren (f.eks. bly, pin, kabel); |
Store | Krysssnakk mellom stim og opptakspinner på beholderen | |||
Normal | Forvridning av EMG-elektrode | |||
nei | Fraværende | Seponering i stimuleringskrets | ||
Normal | 1. RLN skade; 2. Forvridning av mansjetter | |||
SLN (andre er i seg selv | Ta-LCA (andre er i seg selv) | ja | Fraværende (60-syklus støy til stede) | Seponering i EMG-inngangen til forforsterkeren (f.eks. bly, pin, kabel); |
Store | Krysssnakk mellom stim og opptakspinner på beholderen | |||
Normal | Forvridning av EMG-elektrode | |||
nei | Fraværende | Seponering i stimuleringskrets | ||
Normal | 1. SLN- eller RLN-skade; 2. Forvridning av mansjetter |
Tabell 1: Feilsøkingsveiledning.
Det bør nevnes at det er to mindre begrensninger i dagens anvendelse av denne teknologien. Først har plutselig bøyning av den kvinnelige pinnen under innsetting i beholderen forekommet i flere tilfeller. Heldigvis kan pinnene rettes og settes inn i hullene med hell. Hvis pinskade er uopprettelig, må ledningen og hele komponenten skiftes ut. Derfor bør reservekomponenter være lett tilgjengelige før operasjonen. For det andre er tiden det tar å fullføre kirurgisk implantasjon lang (~ 10 h). Den lange varigheten gjenspeiler delvis det store antallet stimulerings- og omkodingskomponenter som kreves for denne studien: fire nerver, fire muskler, en beholder og en IPG. Hvis det kreves færre komponenter ved bruk av denne teknologien, bør implantasjonstiden reduseres betydelig (f.eks. rottetungemodellen28).
Denne teknologiske tilnærmingen introduserer flere funksjoner som har fordel over eksisterende metoder. Kveiking av blyledninger er den mest nye og viktige funksjonen i dette systemet. Kveilet fører er ikke allment tilgjengelig for ikke-kommersielle dyr eksperimentering til tross for de mange fordelene de gir. En kveilet bly kan utvides til ønsket lengde under implantasjon. Videre vil det strekke seg i det våkne, bevegelige dyret for å forhindre forvridning av elektrodespissen eller ledningsbrudd etter implantasjon. Denne funksjonen sikrer levetiden til implantatet og stabil nervestimulering og muskelopptak på lang sikt. Videre forhindrer det å legge til et vevkompatibel skjørt rundt beholderen eksponering av såret til denne fremmedlegemen og fremmer normal fibrose og sårheling i fravær av infeksjon. Tidligere studier uten dette skjørtet resulterte i tidlig infeksjon og for tidlig avslutning av eksperimentet. Til slutt er dette implantatsystemet kompakt og flerkanals, slik at effektive datainnhenting fra mange nevromuskulære strukturer i dyremodeller av forskjellig størrelse.
Denne tekniske tilnærmingen er tilpasset og vellykket oversatt til en rottemodell. Denne studien ble designet for å undersøke effekten av elektrisk kondisjonering i å forebygge tunge muskelatrofi og dysfunksjon i den aldrende rotte. Hypoglossal nervene ble implantert med mansjettelektrodene for kondisjonering og tungen implantert med EMG-opptakselektrodene28. Denne teknologien kan også benyttes i andre forskningsapplikasjoner. Som en forlengelse av den nåværende protokollen i hundestrupestrupe, blir effekten av elektrisk kondisjonering på å fremme selektiv reinnervation for tiden studert i kaninansiktsmuskler. Denne studien kan gi et grunnlag for forebygging av ansiktssynkinese hos pasienter med Bells parese, en vanlig og ødeleggende medisinsk tilstand. En endelig potensiell bruk av denne teknologien er å stimulere og registrere fra våkne, fritt bevegelige dyr. I dag er slike data innhentet via ekstern kabel fra våken, uhemmet rotter28. I fremtiden kan dette økonomiske systemet også kombineres med ekstern opptaksstimuleringsteknologi (f.eks. telemetri) for å aktivere eller undersøke nevromuskulære systemer trådløst.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Hongmei Wu for hennes bidrag til dyrepleie og datainnsamling gjennom hele studien. Vi takker Amy Nunnally, Jamie Adcock og Phil Williams for deres hjelp med sterile operasjoner. Kompetansen og engasjementet til de ansatte ved Vanderbilt University Animal Care Facility var uvurderlig. Denne forskningen ble støttet av NIH-stipendet U01DC016033.
20 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305175 | |
23 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305145 | |
25 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305125 | |
3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL | Ethicon | J219H | |
3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8684G | |
4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8871H | |
6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene | Ethicon | 8805 | |
7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | M8735 | |
Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98% | ACROS | code 194790100 | for dilution of modical adhesive silicone |
Bone cement | Zimmer | 1102-16 | 20g powder 10ml liquid |
Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1ml) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd | 12496-0757-1 | |
CCD video camera attached to the endoscope | Sony | MCC500MD | |
Cefpodoxime (Simplicef 100mg tablets) | Zoetis | 5228 | |
Data acquisition device , PowerLab 16/35 | ADInstruments, Inc | 5761-E | |
Deep-brain stimulation (DBS) electrodes | Abbott | 6172ANS | |
Digital oscilloscope | Tektronix | DPO71304SX | |
Implantable pulse generator (IPG), Infinity | Abbott | 6660ANS | |
Knitted polyester graft | Meadox Medical Inc | 92220 | 20mm in diameter |
Medical Grade Polyethylene Micro Tubing | Amazon.com | BB31695-PE/13-10 | OD 0.156", ID 0.094" |
Metal female pin | Allied Electronics & Automation | 220-S02-100 | |
Metal male pin | CDM electronics | 220-p02-1 | |
Prefabricated coiled leads | Medical innovations Inc. | ||
Silastic Laboratory Tubing | Cole-Parmer | 2415569 | OD 0.125", ID 0.062" |
Silastic Medical Adhesive Silicone | Dow corning | Type A, 2 oz | |
Stainless steel monofilament wire | The Harris Products Group | type 316 | 0.008" (coated), 0.005" (bare) |
Sterile Disposable Biopsy Punch (4mm) | Sklar Instruments | 96-1146 | |
Strip connector | CDM electronics | 2.6 x 11.6 x 101.5 mm | single row, round, through hole |
Teflon-coated multi-filament stainless steel wire | Medwire | Part 316, ss7/44T | |
Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol – 5mL | Zoetis | 004866 | |
Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan – 1 Gal. | Zoetis | 540561 | |
Zero-degree rigid endoscope | Karl Storz | 8712AA |